Αφηρημένο

τροπομυοσίνη σχετίζονται κινάσης του υποδοχέα Β (TrkB) σηματοδότησης, διεγείρεται από νευροτροφικός παράγοντας (BDNF) συνδέτη προερχόμενο από τον εγκέφαλο, προωθεί την εξέλιξη του όγκου, και σχετίζεται με την κακή πρόγνωση διαφόρων κακοηθειών. Επιδιώξαμε να εξετάσει την κλινική σημασία της έκφρασης /TrkB BDNF στον καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) ιστούς, προγνωστική αξία του σε ασθενείς με CRC και του θεραπευτικού δυναμικού

in vitro

και

in vivo

. Διακόσια είκοσι τρία δείγματα ασθενών CRC χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των επιπέδων τόσο BDNF και TrkB mRNA. Η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών σε πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους τους ερευνήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. κυτταρικές σειρές CRC και ανασυνδυασμένο BDNF και Κ252 & (ένας εκλεκτικός αναστολέας φαρμακολογική παν-Trk) χρησιμοποιήθηκαν για

in vitro

κυτταρική βιωσιμότητα, τη μετανάστευση, εισβολή, anoikis αντίσταση και

in vivo

περιτοναϊκή δοκιμασίες μετάσταση. Tissue BDNF mRNA συνδέθηκε με το ήπαρ και την περιτοναϊκή μετάσταση. Tissue TrkB mRNA συσχετίστηκε επίσης με μετάσταση στους λεμφαδένες. Η συν-έκφραση του BDNF και TrkB συνδέθηκε με το ήπαρ και την περιτοναϊκή μετάσταση. Οι ασθενείς με υψηλότερη BDNF, TrkB, και συν-έκφραση του BDNF και TrkB είχαν σημαντικά κακή πρόγνωση. BDNF αυξημένη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, εισβολή και ανέστειλαν anoikis στις TrkB-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν CRC. Οι επιδράσεις αυτές καταστέλλονται από K252a. Σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με DLD1 συν-εκφράζουν BDNF και TrkB, και στη συνέχεια κατεργάζεται με K252a, περιτοναϊκή μεταστατικών οζιδίων βρέθηκε να είναι μειωμένη, σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου. BDNF σηματοδότηση /TrkB μπορεί έτσι να είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία περιτοναϊκή καρκινωμάτωση που προκύπτουν από καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Tanaka Κ, Okugawa Υ, Toiyama Υ, Inoue Υ, Saigusa S, Kawamura Μ, et al. (2014) προερχόμενο από τον εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας (BDNF) προκληθείσα τροπομυοσίνη-Σχετικές κινάσης Β (Trk Β) Σηματοδοσίας είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για περιτοναϊκή Καρκινωμάτωση που προκύπτουν από τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (5): e96410. doi: 10.1371 /journal.pone.0096410

Επιμέλεια: Vincenzo Coppola, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Οκτ 2013? Δεκτές: 7 Απρίλη 2014? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2014

Copyright: © 2014 Tanaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (KAKENHI 24.591.972 σε ΥΙ, και 25.462.051 σε SS). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η εξαιρετική πρόοδος στην θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου (mCRC) έχει ιδρυθεί για τις πρόσφατες χημειοθεραπείες συνδυασμό πολλαπλών φαρμάκων, τα οποία παράγουν τώρα μέσους χρόνους επιβίωσης άνω των 20 μηνών [1]. Ωστόσο, περιτοναϊκή καρκινωμάτωση (PC) μπορούν να προκύψουν από CRC. PC συνδέεται με εξαιρετικά φτωχή επιβίωση, και πολύ λίγα θεραπευτική ή καταπραϋντική θεραπείες είναι διαθέσιμες [2]. Έτσι, μια καλύτερη κατανόηση των μοριακών και των βιολογικών συμπεριφορών της PC που προκύπτουν από την CRC απαιτείται επειγόντως να διευκολύνει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Brain-προερχόμενο νευροτροφικό παράγοντα (BDNF) είναι ένα μέλος της νευροτροφίνης ( NT) οικογένεια. BDNF παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την επισκευή του νευρικού συστήματος [3]. Συνδέεται με δύο μεγάλες υποδοχέων του, η τροπομυοσίνη σχετίζεται κινάσης του υποδοχέα Β (TrkB) με υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση, και ρ75 υποδοχέα παν-NT (ρ75

NTR) με χαμηλή συγγένεια [4]. Η σύνδεση του BDNF να TrkB οδηγεί στην αυτοφωσφορυλίωση του τυροσίνες στο ενδοκυτταρικό πεδίο με την ενεργοποίηση του κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης όπως RAS /ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [4], [5]. BDNF συνδέεται επίσης p75 υποδοχέα χαμηλής συγγένειας

NTR που ασκεί διάφορες λειτουργίες όπως η ρύθμιση της επιβίωσης και της διαφοροποίησης των κυττάρων κατά τη διάρκεια της νευρωνικής ανάπτυξης [6].

Παρά το γεγονός ότι τόσο TrkB και p75

NTR που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, την επιβίωση και την απόπτωση των νευρωνικών και μη νευρωνικών όγκων [7], [8], p75

NTR προτίμηση δρα ως αλληλεπιδρώντας εταίρος της TrkB, διαμορφώνει την ενεργοποίηση TrkB από BDNF, και τις επιρροές prosurvival επίδραση από BDNF /TrkB σηματοδότηση [ ,,,0],9].

BDNF /TrkB σηματοδότηση έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου, μετάσταση, και την απόκριση στη χημειοθεραπεία σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες όπως το νευροβλάστωμα [10], των ωοθηκών [11], κεφαλής και λαιμού [12 ], του πνεύμονα [13], ηπατοκυτταρικό [14], παγκρεατικό [15], της ουροδόχου κύστης [16], του προστάτη [17], του πολλαπλού μυελώματος [18], και του όγκου του μαστού [19]. TrkB έχει αποδειχθεί επίσης για την προώθηση της αντίστασης σε anoikis (μια μορφή της απόσπασης επαγόμενη απόπτωση) [20], και με τον τρόπο αυτό να προσδώσουν μεταστατικές ιδιότητες ή επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [21], [22]. Σε αντίθεση με το ρόλο της TrkB στον καρκίνο, ρ75

NTR φαίνεται να έχει λειτουργίες καταστολής όγκου είτε προαγωγής όγκων ή σύμφωνα με τους τύπους όγκων [8]

Προηγουμένως, μελέτες στο εργαστήριο μας αποκάλυψαν.: μια συσχέτιση μεταξύ της εξέλιξης TrkB επίπεδα όγκου και η πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου [23]? η σύνδεση των TrkB με την αντίσταση στην χημειοθεραπεία σε καρκίνο του οισοφάγου [24]? και η συμμετοχή TrkB στην ΕΜΤ του καρκίνου του παχέος εντέρου [25]. Πιο πρόσφατα, έχουμε επιδείξει την εμπλοκή του μονοπατιού /TrkB BDNF στην πρόοδο του όγκου σε γαστρικό καρκίνο [26].

Όσον αφορά τη /TrkB σηματοδότηση BDNF σε CRC, BDNF ή TrkB υπερεκφράστηκε σε δύο κλινικές όγκου δείγματα και συνδέονται με επιθετική φαινοτύπους όγκου [27] – [30].

In vitro

μελέτες έδειξαν ότι η σηματοδότηση BDNF /TrkB είχε εμπλακεί σε πολλαπλασιαστικές ή επεμβατική ιδιότητες [27] – [30], και την αποτελεσματικότητα ή την αντίσταση του cetuximab αντι-επιδερμικού μονοκλωνικό αντίσωμα υποδοχέα αυξητικού παράγοντα [31] ή gastrin- πεπτίδιο απελευθέρωσης υποδοχέα [32]. Οι γραμμές αυτές του αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι ο BDNF σηματοδότηση /TrkB προάγει την εξέλιξη του όγκου, που οδηγεί σε κακή πρόγνωση για διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες, και ότι έχει αναδειχθεί ως ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο [33], [34].

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει: η συσχέτιση μεταξύ BDNF έκφρασης /TrkB και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές σε μια σειρά ανθρώπινων ιστών CRC? Η προγνωστική αξία του BDNF /TrkB σηματοδότησης σε ασθενείς CRC? και θεραπευτικές δυνατότητες της in vitro και in vivo.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review και την Τοπική Επιτροπή Δεοντολογίας της το Πανεπιστήμιο Mie Graduate School of Medicine (Νο 2126). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς (ενήλικες και οι γονείς των παιδιών) που εντάχθηκαν στην μελέτη.

Τα πειραματικά πρωτόκολλα της in vivo μελέτες εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Ζώων στο Mie Διπλωματούχων Ανωτάτων Σχολών Ιατρική Σχολή.

ασθενείς

Ένα σύνολο 223 ασθενών με CRC, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία στο Τμήμα του γαστρεντερικού και Παιδιατρικής Χειρουργικής στο Πανεπιστήμιο Mie Απόφοιτος της Ιατρικής Σχολής του 2000-2008, ήταν περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη. Οι ασθενείς με ατελή κλινικά δεδομένα, η ανεπαρκής παρακολούθηση ή ανεπαρκή δειγματοληψία ιστού αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Όλοι οι ασθενείς είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου ή του ορθού. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 67 έτη (εύρος: 12-91 έτη). Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 30,6 μήνες (εύρος: 1,5 έως 107,2). Συνολικά 49 ασθενείς πέθαναν από CRC που σχετίζονται με τις αιτίες κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου.

Η σταδιοποίηση έγινε με βάση την κλινική αξιολόγηση και ιστοπαθολογική ανάλυση με τη χρήση της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (UICC) σύστημα TNM στάσης. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν στην μελέτη, σύμφωνα με τις τοπικές κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμική.

συλλογές δειγμάτων

καρκινικούς ιστούς πάγωσαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά την χειρουργική εκτομή και αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η διάγνωση της CRC επιβεβαιώθηκε για όλους τους 223 ασθενείς με βάση κλινικοπαθολογική ευρήματα.

Σύνολο εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA

καρκινικούς ιστούς ήταν κιμά και ομογενοποιείται με Mixer Μύλος MM 300 ομογενοποίησης (Qiagen, Chatsworth , CA, USA). Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy μίνι (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συνετέθη από 5 μg ολικού RNA με ένα τυχαίο αρχικό τεμάχιο εξαμερούς και Superscript αντίστροφη μεταγραφάση III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

σε πραγματικό χρόνο αλύσου πολυμεράσης μεταγραφής αντίδραση ποσοτική αντίστροφη (RT -PCR) και τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης

Ποσοτική PCR (qPCR ανάλυση) διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Τα επίπεδα έκφρασης των μεταγραφών του γονιδίου-στόχου, που μετράται με χρήση ανιχνευτών TaqMan για BDNF (Δοκιμασία ID, Hs00380947_m1) και TrkB (Δοκιμασία ID, Hs00178811_m1), κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH (Δοκιμασία ID, Hs02758991_g1) και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Applied Biosystems StepOne Software (v2. 1).

Η σχετική BDNF και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης TrkB προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη. Η πρότυπη καμπύλη παρήχθη χρησιμοποιώντας ένα 5-πλάσια σειριακή αραίωση qPCR cDNA τυχαίας εκκίνησης Ανθρώπινη Αναφοράς (TAKARA ΒΙΟ INC., Clontech, Japan). Όλες οι πρότυπες καμπύλες γραμμική εντός του εύρους που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση, με ένα αποδεκτό αντίστοιχο συντελεστή συσχέτισης (R

2). Το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου-στόχου υπολογίστηκε από την πρότυπη καμπύλη, και κανονικοποιημένο έναντι GAPDH. Τέλος, το επίπεδο του mRNA του γονιδίου-στόχου εκφράστηκε ως αναλογία σε σχέση με το επίπεδο GAPDH mRNA. Σε πραγματικό χρόνο δοκιμασίες ποσοτική PCR εκτελέστηκαν εις τριπλούν για κάθε δείγμα και η μέση τιμή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό των επιπέδων έκφρασης του mRNA.

Το ενισχυμένο PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά, οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν υπό υπεριώδες φως μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο.

Ανοσοϊστοχημεία

η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Τμήματα πάχους 2-3 μm κόπηκαν από τα σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) τα δείγματα των ασθενών CRC. Μετά αποπαραφίνωση και την αφυδάτωση, τα δείγματα έβρασαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mM κιτρικού νατρίου για 15 λεπτά για να ξεσκεπάσει τα αντιγόνα. Οι τομές στη συνέχεια αποκλείστηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) για 60 λεπτά και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C. Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια Envision (κιτ Envision /HRP, Dako Cytomation, Δανία). Όλες οι τομές με αιματοξυλίνη. Μια κύρια πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι BDNF (H-117, 1:350? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) και ένα πρωτεύον μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι TrkB (1:100? R &? D Systems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν. Οι αρνητικοί έλεγχοι ήταν επίσης εκτελούνται ταυτόχρονα με τον αποκλεισμό της αντίστοιχης πρωτογενούς αντισώματος.

κυτταρικές σειρές CRC

Ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές DLD1, LoVo, SW480, ΗΤ29, και Caco2 ελήφθησαν από το κύτταρο Κέντρο πόρων για Βιοϊατρικής Έρευνας (Πανεπιστήμιο Tohoku, Ιαπωνία). Η δοκιμή ελέγχου ταυτότητας κυτταρική γραμμή έχει πραγματοποιηθεί για αυτές τις κυτταρικές σειρές. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 IU /mL πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C και 5% CO2.

Αντιδραστήρια

η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BDNF αγοράστηκε από την PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) και παρασκευάζονται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BDNF διαλύθηκε σε PBS (10 μg /ml) για τα

in vitro

δοκιμασίες.

Κ252 & αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA, USA) και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C πριν από τη χρήση. K252a διαλύθηκε σε PBS (10 μg /ml) για το

in vitro

και

in vivo

προσδιορισμούς.

Western ανάλυση κηλίδος

Το κύτταρο CRC γραμμές πλύθηκαν σε παγωμένο PBS ενώ στο πιάτο. Ψυχρού ρυθμιστικού λύσης (Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα, ρΗ 7.5, που περιέχει 1% Triton Χ-100) προστέθηκε στη συνέχεια απευθείας στο πιάτο. Τα κύτταρα στη συνέχεια αποξέστηκαν από το πιάτο, συλλέχθηκε και ομογενοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ομογενοποιητή Mixer Μύλος ΜΜ 300 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). 20 μg του λύματος πρωτείνης αναμίχθηκε με ένα ίσο όγκο 2 χ Laemmli ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης που περιέχει 2-μερκαπτοαιθανόλη, και θερμάνθηκε στους 100 ° C για 5 λεπτά. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήγματα βαθμίδωσης πολυακρυλαμιδίου 12,5% περιέχοντος 0,1% SDS, ακολουθούμενη από ημι-ξηρή μεταφορά σε μεμβράνη Immun-Blot PVDF (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Η μεμβράνη στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε με χρήση 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris, ρΗ 7,5, συμπληρωμένο με 0,1% Tween 20 (TBS-T).

Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-TrkB μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού ( R &? D Systems, Foster City, CA, USA) σε αραίωση 1:1000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-BDNF αντίσωμα (Η-117, 1:350? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) σε μια 1:100 αραίωση, και μονοκλωνικά ποντικού αντι-ακτίνης (κλώνος C4) αντίσωμα (ΜΡ Biomedicals, LLC, Solon, ΟΗ, USA) σε αραίωση 1:400 σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ΤΒδ-Τ επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση τρεις φορές σε ΤΒδ-Τ, τα στυπώματα επωάστηκαν με αλκαλική φωσφατάση-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-IgG ποντικού (Promega, Madison, WI, USA) σε 1:200 αραίωση σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ΤΒδ-Τ. Μετά τη θεραπεία με μια ενισχυμένη λύση ανίχνευσης χημειοφωταύγειας, σήματα χημειοφωταύγειας απεικονίστηκαν σε ένα CS Analyzer και AE-6962 φως σύλληψη (ATTO Corp., Tokyo, Japan).

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Για την εκτίμηση χρησιμοποιήθηκαν η επίδραση του BDNF στη βιωσιμότητα των κυττάρων, η μετανάστευση, εισβολή, και αντίσταση anoikis, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BDNF και Κ252 &, ένας εκλεκτικός αναστολέας φαρμακολογική παν-Trk,.

κυτταρική βιωσιμότητα, τη μετανάστευση, εισβολή, και αντίσταση anoikis ήταν σύγκριση μεταξύ των μη-κατεργασμένα κύτταρα (ελέγχου), BDNF-επεξεργασμένα κύτταρα, Κ252 & κατεργασμένα κύτταρα, και K252a που ακολουθείται από BDNF-κατεργασμένα κύτταρα.

η κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα WST-8 [2- (2-μεθοξυ -4-νιτροφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2, 4-δισουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, μονονάτριο άλας] χρωματομετρική δοκιμασία. Τα καρκινικά κύτταρα (5000 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες κυττάρου 96-φρεατίων (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) σε 100 μΐ μέσου καλλιέργειας για 24 ώρες. Μετά από προεπώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Κ252 & (100 ηΜ) ή μέσο χωρίς ορό για 2 ώρες, και στη συνέχεια έλαβαν θεραπεία είτε με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ΒϋΝΡ (100 ng /ml) ή μέσο χωρίς ορό. 48 ώρες αργότερα, το μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με 90 μΙ φρέσκου μέσου που ακολουθείται από την προσθήκη 10 μΙ (Kit Καταμέτρηση κυττάρων, Dojindo Laboratories, Japan) WST-8 διαλύματος αντιδραστηρίου και επωάζονται για 2 ώρες στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα .

η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρωματομετρική σύγκριση με ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας (OD) από έναν αναγνώστη μικροπλάκας (SoftMax, Molecular Devices Corporation, CA, USA) σε ένα μήκος κύματος απορρόφησης 450 nm. Η κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα ελήφθησαν από παρόμοια αποτελέσματα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SE).

δοκιμασία Μετανάστευση

Συρρέοντα κύτταρα καρκίνου ήταν ορό στερηθεί για 48 ώρες. Πληγές δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη πιπέτα 200 μL μετά από προεπώαση με Κ252 & (100 ηΜ) ή μέσο χωρίς ορό για 2 ώρες. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BDNF (100 ng /ml) ή άνευ ορού μέσο προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 46 ώρες. Το κλείσιμο της πληγής αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus IX71 (Όλυμπος, Κέντρο Valley, PA, USA) σε μεγέθυνση 10x. απόσταση μετανάστευσης των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop 9.0.2 λογισμικό και συγκρίθηκαν με τις μετρήσεις βασικής γραμμής. Κάθε ανεξάρτητος πείραμα εκτελέστηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SE.

δοκιμασία εισβολή

Η εισβολή των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας θαλάμους εισβολή Biocoat Matrigel και ένθετα ελέγχου (Becton Dickinson Labware). Ένα σύνολο 50.000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε θαλάμους εισβολή και ελέγχου, και προ-επωάστηκαν με 100 ηΜ K252a ή μέσο χωρίς ορό για 2 ώρες. Σκέτο νωπό μέσο ή με μέσο που περιέχει ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BDNF (100 ng /ml) προστέθηκε στη συνέχεια στις πλάκες σύντροφος Falcon (BD Biosciences, San Jose, CA). Οι θάλαμοι Matrigel εισβολής και ένθετα ελέγχου επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Το μέσο επώασης περιέχει κύτταρα αφαιρέθηκε από το επάνω μέρος του θαλάμου χρησιμοποιώντας μπατονέτες και απαλλαγμένο από ορό μέσο. Οι μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν με αιματοξυλίνη Mayer, η αφυδατωμένη σε αιθανόλη και τοποθετήθηκαν σε υάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης προσδιορίστηκε στη συνέχεια. Κάθε ανεξάρτητος πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE.

Anoikis δοκιμασία

Anoikis, αποκόλληση επαγόμενη απόπτωση, είναι γνωστό ότι προκαλείται όταν τα προσκολλημένα κύτταρα όγκου αναγκάζονται να αναπτυχθούν σε ένα μη-προσκολλημένα μόδας. αντίσταση Anoikis αξιολογήθηκε από την αναλογία των βιώσιμων νεοπλασματικών κυττάρων που πολλαπλασιάζονταν μη προσκολλημένα στα πιάτα με χαμηλή προσκόλληση.

δοκιμασίες

Anoikis πραγματοποιήθηκαν σε έξι φρεατίων Costar Ultra Low Συνημμένο Μικροπλάκες (Corning, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). DLD1, LoVo, και τα κύτταρα SW480 αιωρήθηκαν σε RPMI-1640 με BDNF (100 ng /ml), Κ252 & (100 ηΜ), ή Κ252 & + BDNF σε μία συγκέντρωση 5 × 10

5 κύτταρα /ml, αντίστοιχα. εναιωρήματα κυττάρων τους (2 ml) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα (37 ° C και 5% CO

2).

Μετά την επαγωγή anoikis, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες μικροτίτλου (96 φρεάτια, επίπεδου πυθμένα) σε τελικό όγκο 100 μι μέσου καλλιέργειας ανά φρεάτιο. Για την αξιολόγηση των βιώσιμων κυττάρων όγκου τα οποία πολλαπλασιάστηκαν μη προσκολλημένα σε δίσκους χαμηλής προσκόλλησης, φασματοφωτομετρική απορρόφηση εκάστου φρεατίου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας WST-8 διαλύματος αντιδραστηρίου, όπως περιγράφεται παραπάνω (δοκιμασία τη βιωσιμότητα των κυττάρων). Κάθε ανεξάρτητος πείραμα εκτελέστηκε έξι φορές. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SE

Μετά την επαγωγή anoikis, 5 × 10

5 κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 0,5 ml 1 χ ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης, και αννεξίνης V:. ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη /ιωδιούχου προπιδίου ( PI) επισήμανση εκτελείται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Bio Vision, Mountain View, CA, USA). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της αναλογίας των βιώσιμων ή αποπτωτικά κύτταρα όγκου κάτω από μη-προσκολλημένα κατάσταση ανάπτυξης χρησιμοποιώντας πιάτα χαμηλής προσκόλλησης. Κάθε δείγμα περιείχε 5 × 10

5 κύτταρα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest Pro (BD Biosciences). Βιώσιμα κύτταρα όγκου τα οποία ήταν αρνητικά τόσο για αννεξίνη V και χρώση ΡΙ (κάτω αριστερό τεταρτημόριο) θεωρήθηκαν ως anoikis-ανθεκτικά κύτταρα με μη προσκολλημένα ανάπτυξης. καρκινικά κύτταρα αποπτωτικών που ήταν θετικά για χρώση αννεξίνης V (κάτω δεξιά τεταρτημόριο + άνω δεξιά τεταρτημόριο) θεωρήθηκαν ως κύτταρα anoikis που προκαλείται. Τα κύτταρα όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάλυμα φορμαλίνης 2,5%, χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για απόπτωση που επάγεται από τα κύτταρα. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης βιωσιμότητας των κυττάρων για την αντίσταση anoikis.

In vivo

περιτοναϊκή μετάσταση δοκιμασία

Άντρας γυμνοί ποντικοί (BALB /c) σε 8 εβδομάδων αγοράστηκαν από την Japan SLC Inc. (Shizuoka, Ιαπωνία). Τα πειραματικά πρωτόκολλα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης των Ζώων του Πανεπιστημίου Μίε Graduate School of Medicine. κύτταρα DLD1 (5 × 10

7 κύτταρα /500 μl PBS) ενδοπεριτοναϊκή ένεση για περιτοναϊκή σχηματισμό μεταστατικό. Είτε Κ252 & (500 μg /kg) ή PBS (έλεγχος) ενέθηκε ενδοπεριτοναϊκώς τρεις φορές την εβδομάδα για να εξετάσει την επίδραση του Κ252 & στην περιτοναϊκή σχηματισμό μεταστατικό. Τέσσερις εβδομάδες αργότερα, οι ποντικοί θανατώθηκαν, και στη συνέχεια το μέγεθος και τον αριθμό των μεταστατικών οζιδίων περιτοναϊκής αξιολογήθηκε (κάθε ομάδα? N = 5). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση JMP έκδοση 5 (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (τυπικό σφάλμα). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας chi-square test του Pearson, που επαναλαμβάνεται-μέτρων ανάλυση διακύμανσης ανάλυση (ANOVA), ή t-test ένα ασύζευκτο Student. Αναλογιστική καμπύλες επιβίωσης ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση τεστ log-rank. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση έγιναν με τη χρήση του μοντέλου Cox αναλογικών κινδύνων για τη διερεύνηση των επιπτώσεων των ιστοπαθολογικών και μοριακών παραγόντων (κατάσταση BDNF και έκφραση TrkB) που υπάρχουν στον πρωτογενή δείγμα όγκου στη συνολική επιβίωση (OS). Μεταβλητές που σχετίζονται με την επιβίωση με ένα P-τιμή μικρότερη από 0.05 σε μονοπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν για την πολυπαραγοντική ανάλυση. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Δύο όψεων P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Το επίπεδο BDNF mRNA σε ιστούς CRC

Ο λόγος έκφραση του BDNF mRNA, σε σχέση με. GAPDH, σε ιστούς CRC ήταν 0,122 ± 0,230 (μέση ± SD), κυμαίνεται από 0 έως 1,357. Για σκοπούς στατιστικής ανάλυσης, οι τιμές έκφρασης BDNF mRNA διαχωρίστηκαν μεταξύ τους, όπως χαμηλή ή υψηλή. Μία τιμή αποκοπής για το επίπεδο BDNF mRNA προσδιορίστηκε ως μέγιστη τιμή πρόβλεψης χρησιμοποιώντας ένα λειτουργικό σύστημα που βασίζεται σε χαρακτηριστικό (ROC) ανάλυση καμπύλης δέκτη-λειτουργίας. Εκατόν δύο ασθενείς είχαν υψηλή έκφραση του BDNF mRNA (& gt? 0.037), ενώ 121 ασθενείς είχαν χαμηλή έκφραση του BDNF mRNA. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, το επίπεδο έκφρασης BDNF mRNA σε ιστούς CRC βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με σύγχρονη μετάσταση στο ήπαρ (Ρ = 0,007) και της ταυτόχρονης περιτοναϊκή μετάσταση (Ρ = 0,026). Καμία σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του mRNA BDNF σε ιστούς CRC και οποιεσδήποτε άλλες κλινικοπαθολογικών μεταβλητές.

Η

Το επίπεδο TrkB mRNA σε CRC ιστούς

Σύμφωνα με την TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA), ανιχνευτή TrkB (Δοκιμασία ID, Hs00178811_m1) έχει σχεδιαστεί για να καλύπτουν το εξόνιο 6/7 όρια. Αντίστοιχες εναύσματα ενισχύουν τα θραύσματα που περιέχουν εξόνια 6-7 που κωδικοποιεί το εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα TrkB. Ως εκ τούτου, αυτό το σύνολο εκκινητών και ανιχνευτών ανιχνεύει τόσο το TrkB πλήρους μήκους (TrkB.FL) και το κομμένο TrkB (TrkB.T1) [35].

Η αναλογία έκφραση TrkB mRNA, σε σχέση με την GAPDH, σε CRC ιστούς ήταν 0,054 ± 0,141 (μέση ± SD), κυμαίνεται από 0 έως 1,149. ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε ότι η τιμή αποκοπής για TrkB mRNA ήταν 0.002 (μέγιστη προγνωστική αξία για OS). Εκατόν εβδομήντα ένας ασθενείς είχαν mRNA έκφραση υψηλής TrkB, ενώ 52 ασθενείς είχαν χαμηλή έκφραση TrkB mRNA. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, το επίπεδο TrkB mRNA σε ιστούς CRC βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με λεμφαδένα μετάσταση (Ρ = 0,022). Καμία σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του επιπέδου TrkB mRNA σε ιστούς CRC και οποιεσδήποτε άλλες κλινικοπαθολογικών μεταβλητές.

Συν-έκφραση του BDNF και TrkB σε ιστούς CRC

Ενενήντα τέσσερις ασθενείς έδειξαν τόσο υψηλή BDNF και έκφραση TrkB mRNA. Αυτή η ομάδα ασθενής ταξινομείται ως συν-εκφράζουν τόσο BDNF και TrkB. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η συν-έκφραση του BDNF και TrkB σε ιστούς CRC βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με σύγχρονη μετάσταση στο ήπαρ (Ρ = 0,03) και της ταυτόχρονης περιτοναϊκή μετάσταση (Ρ = 0,013). Καμία σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του επιπέδου TrkB mRNA σε ιστούς CRC και οποιεσδήποτε άλλες κλινικοπαθολογικών μεταβλητές.

Η προγνωστική επίδραση του BDNF, TrkB, και η συν-έκφραση του BDNF και TrkB σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς

το σχήμα 1 δείχνει τις καμπύλες Kaplan-Meier για BDNF (Α), TrkB (Β), και την συν-έκφραση του BDNF και TrkB (C), αντίστοιχα. ασθενείς CRC με υψηλή έκφραση του BDNF mRNA (n = 102) είχαν σημαντικά χειρότερο λειτουργικό σύστημα από ό, τι τα άτομα με χαμηλή έκφραση του BDNF mRNA (n = 121, δοκιμασία log-rank, P = 0.0066). Ομοίως, οι ασθενείς CRC με την έκφραση του mRNA υψηλή TrkB (n = 171) είχαν σημαντικά χειρότερο λειτουργικό σύστημα από ό, τι τα άτομα με χαμηλή έκφραση του mRNA TrkB (n = 52, δοκιμασία log-rank, P = 0.0474). ασθενείς των οποίων οι όγκοι CRC συν-εκφράζεται BDNF και TrkB (n = 94) είχαν σημαντικά χειρότερο λειτουργικό σύστημα από ό, τι εκείνοι με το άλλο μοτίβο έκφρασης (n = 129, τεστ log-rank, P = 0.0348).

(Α ): Σύγκριση μεταξύ της συνολικής επιβίωσης των ομάδων ασθενών με υψηλή έκφραση BDNF mRNA (n = 102) και εκείνες με χαμηλή έκφραση BDNF mRNA (n = 121). (Β): Σύγκριση μεταξύ της συνολικής επιβίωσης των ομάδων ασθενών με υψηλή έκφραση του mRNA TrkB (n = 171) και εκείνες με χαμηλή έκφραση του mRNA TrkB (n = 52). (C): Σύγκριση μεταξύ της συνολικής επιβίωσης των ομάδων ασθενών με υψηλή συν-έκφραση του BDNF και TrkB (n = 94) και εκείνων χωρίς αυτό (n = 129). έκφραση του mRNA TrkB δείχνει τα επίπεδα μεταγραφής mRNA τόσο TrkB.FL και TrkB.T1.

Η

BDNF και η έκφραση της πρωτεΐνης TrkB στον πρωτογενή και μεταστατικούς όγκους

Η ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι η πρωτεΐνη BDNF ( Α, Β) εκφράστηκε στο κυτταρόπλασμα των ανθρώπινων κυττάρων CRC και ότι η πρωτεΐνη TrkB (C, D) εκφράστηκε στον πυρήνα των ανθρώπινων κυττάρων CRC (Σχήμα 2). Σε ασθενείς με αμφότερα πρωτογενή όγκο (A, C) και περιτοναϊκή μεταστατικά οζίδια (Β, D), τα ανθρώπινα κύτταρα CRC στα περιτοναϊκή μεταστατικών οζιδίων εκφράζεται τόσο BDNF και TrkB, όπως εκείνες στο πρωτογενούς όγκου. Επιβεβαιώσαμε ότι αντι TrkB αντίσωμα (R &? D Systems, Foster City, CA, USA) ανιχνεύεται τόσο TrkB.FL και TrkB.T1 με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης Western αποτύπωση χρησιμοποιώντας ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (δεδομένα που δείχνονται στην παρακάτω ενότητα).

οι αντιπροσωπευτικές εικόνες της ανοσο-αντιδραστική πρωτεϊνική έκφραση BDNF και TrkB στην πρωτοβάθμια CRC και περιτοναϊκή μετάσταση εμφανίζονται (αρχική μεγέθυνση: 100 ×). Αντι TrkB αντίσωμα (R & amp? D Systems, Foster City, CA, USA) ανιχνεύονται δύο πρωτεΐνες TrkB.FL και TrkB.T1, η οποία επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western αποτύπωση. (Α): Η ανοσοαντιδραστική πρωτεΐνη BDNF βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων του πρωτεύοντος CRC. (Β): Η ανοσοαντιδραστική πρωτεΐνη BDNF βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων όγκου στην αντίστοιχη περιτοναϊκή μετάσταση. (C): Η ανοσοαντιδραστική πρωτεΐνη TrkB βρίσκεται στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων του πρωτεύοντος CRC. (D): Η ανοσοαντιδραστική πρωτεΐνη TrkB βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων όγκου στην αντίστοιχη περιτοναϊκή μετάσταση. Αυτά τα σχήματα έκφρασης για τις πρωτεΐνες BDNF και TrkB επιβεβαιώθηκαν σε ασθενείς CRC (n = 5) των οποίων η κύρια και η περιτοναϊκή μεταστατικών οζιδίων ήταν διαθέσιμα για ανοσοϊστοχημεία.

Η

Έκφραση των BDNF και TrkB σε κύτταρα in vitro CRC

Όπως φαίνεται από τα παραπάνω αποτελέσματα, τόσο ο BDNF και έκφραση TrkB σε κύτταρα όγκου φαίνεται να εμπλέκεται τόσο στην πρωτογενή και τη μεταστατική εξέλιξη του όγκου σε ανθρώπινο CRC. Για να εξερευνήσετε την εμπλοκή ενός αυτοκρινούς BDNF /TrkB σηματοδότησης σε εξέλιξη CRC, εξετάσαμε πρώτη έκφραση BDNF και TrkB σε 5 κυτταρικές σειρές CRC συμπεριλαμβανομένων Caco2, DLD1, ΗΤ29, LoVo, και SW480.

έκφραση του BDNF mRNA ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές 5 με ανάλυση RT-PCR (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, η έκφραση TrkB mRNA (που περιέχει τόσο TrkB.FL και TrkB.T1) ανιχνεύθηκε σε 3 από τα 5 κυτταρικές σειρές (DLD1, LoVo, και SW480)

(Α):. RT-PCR ανάλυση του επίπεδα BDNF και TrkB mRNA σε CRC κυτταρικές γραμμές Caco2 (λωρίδα: 1), DLD1 (λωρίδα 2), ΗΤ29 (λωρίδα 3), LoVo (λωρίδα: 4), και SW480 (λωρίδα: 5). επιπέδων GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. επίπεδα TrkB mRNA περιέχουν τόσο TrkB.FL και TrkB.T1 mRNA. (Β): κηλίδωση Western ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης BDNF και TrkB σε κυτταρικές γραμμές CRC Caco2 (λωρίδα: 1), DLD1 (λωρίδα 2), ΗΤ29 (λωρίδα 3), LoVo (λωρίδα: 4), και SW480 (λωρίδα: 5). ανιχνεύθηκαν Το πλήρους μήκους TrkB (TrkB.FL, 145 kDa) και το κολοβωμένο TrkB (TrkB.T1, 95 kDa). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η

κηλίδωση Western ανάλυση (Σχήμα 3Β) έδειξαν ότι TrkB.FL (145 kDa) ανιχνεύθηκε σε 3 κυτταρικές σειρές (Caco2, LoVo, και SW480) και εν TrkB .T1 (95 kDa) ανιχνεύθηκε επίσης σε 4 κυτταρικές γραμμές (Caco2, DLD1, LoVo, και SW480). ΗΤ29 έχουν ούτε TrkB.FL ούτε TrkB.T1 πρωτεΐνη. BDNF πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε όλα τα 5 κυτταρικές σειρές, καθώς και την έκφραση του mRNA.

Με βάση τα αποτελέσματα και τα στοιχεία μας από προηγούμενες εκθέσεις, επιλέξαμε 3 κυτταρικές σειρές (DLD1, LoVo, και SW480), που έδειξε τόσο BDNF και TrkB έκφραση του mRNA είτε με TrkB.FL ή TrkB.T1 έκφραση της πρωτεΐνης για περαιτέρω εξέταση.

BDNF αυξάνει κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων CRC TrkB εκφράζουν

για να διερευνήσουν τη δυνατότητα μιας αυτοκρινούς BDNF σηματοδότησης /TrkB βρόχος που συμβαίνουν σε CRC, διερευνήσαμε την επίδραση της BDNF στη βιωσιμότητα των κυττάρων όγκου σε TrkB-κύτταρα που εκφράζουν CRC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, DLD1 (Α), SW480 (Β), και τα κύτταρα LoVo (Γ) το καθένα σε κατεργασία με BDNF (100 ng /ml), Κ252 & (100 ηΜ), ή K252a που ακολουθείται από BDNF επί 48 ώρες. BDNF αύξησε σημαντικά τη βιωσιμότητα αυτών των κυτταρικών γραμμών, σε σύγκριση με μη κατεργασμένους ελέγχους. K252a μείωσε σημαντικά την βιωσιμότητα αυτών των κυτταρικών γραμμών σε σύγκριση με τα μη κατεργασμένα δείγματα αναφοράς. K252a που ακολουθείται από BDNF ανέστειλαν κυτταρικής βιωσιμότητας αυτών των κυτταρικών γραμμών, σε σύγκριση με την αγωγή BDNF ή μη κατεργασμένα δείγματα αναφοράς.

Κύτταρα

BDNF /TrkB εκφράζουν DLD1 (Α), SW480 (Β), και LoVo (C) χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η επίδραση του BDNF, K252a, και του συνδυασμού τους επί της βιωσιμότητας των κυττάρων του όγκου. Κάθε κύτταρο DLD1, LoVo, και SW480 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με BDNF (100 ng /ml), Κ252 & (100 ηΜ), ή K252a που ακολουθείται από BDNF επί 48 ώρες. Εξωγενείς BDNF αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων όγκου σε TrkB-κύτταρα που εκφράζουν CRC, και Κ252 & ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων του όγκου. Τα δεδομένα ελήφθησαν από παρόμοια αποτελέσματα από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *? Ρ & lt?. 0.05

Η

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η εξωγενής BDNF αυξάνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων όγκου σε TrkB-κύτταρα που εκφράζουν CRC, και ότι ο αποκλεισμός των υποδοχέων TrkB μπορεί να παρέχει ένα ισχυρό μέσο για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

BDNF προωθεί τη μετανάστευση στην TrkB-κύτταρα που εκφράζουν CRC

για να εξεταστεί η επίδραση της BDNF στο καρκινικών κυττάρων κινητικότητα, τα κύτταρα DLD1 χρησιμοποιήθηκαν για

in vitro

δοκιμασίες μετανάστευσης. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, BDNF αύξησε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων DLD1, σε σύγκριση με τα μη κατεργασμένα δείγματα αναφοράς. K252a μείωσε την μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων DLD1, η οποία ήταν σχεδόν ταυτόσημα με τα μη επεξεργασμένα δείγματα αναφοράς. K252a που ακολουθείται από BDNF ανέστειλαν την μεταναστευτικά ικανότητα των κυττάρων DLD1, σε σύγκριση με τη θεραπεία BDNF. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Ποσοτική ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης αποδείχθηκε επίσης (Σχήμα 5Β).