PLoS One: Ενεργοποίηση της RhoB μονοπάτι σηματοδότησης με β θυρεοειδούς ορμονικούς υποδοχείς σε κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς


Αφηρημένο

υποδοχέων των θυρεοειδικών ορμονών (TR) μεσολαβεί τις κρίσιμες επιδράσεις των θυρεοειδικών ορμονών (Τ3) στην κυτταρική ανάπτυξη, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Μειωμένη έκφραση ή αδρανοποίησης σωματικές μεταλλάξεις του TRs έχουν βρεθεί σε ανθρώπινους καρκίνους του ήπατος, του μαστού, του πνεύμονα, και του θυρεοειδούς. Οι μηχανισμοί του TR-συνδέονται καρκινογένεση δεν είναι ακόμα σαφής. Για να διαπιστωθεί η λειτουργία του ΤΡβ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του θυρεοειδούς, κατασκευάσαμε ένα ανασυνδυασμένο φορέα αδενοϊού, AdTRβ, το οποίο εκφράζει την ανθρώπινη TRβ1 cDNA. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς στην οποία τα επίπεδα πρωτεΐνης ΤΡβ ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με άθικτους ιστούς θυρεοειδούς μολύνθηκαν με AdTRβ και η λειτουργία του ΤΡβ στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση αναλύθηκε. Ligand δεσμευμένο επαγόμενη ΤΡβ HDAC1 και HDAC3 διαστάσεως από, και ακετυλίωση ιστονών που συνδέονται με τον υποκινητή της RhoB και ενίσχυσε την έκφραση των RhoB mRNA και πρωτεΐνης. Σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα, αναστολέα Τ3 και τρανσφεράσης του φαρνεσυλίου (FTI) -Θεραπεία προκάλεσε την κατανομή της RhoB στην κυτταρική μεμβράνη και ενίσχυσε την αφθονία των ενεργών GTP-δεσμευμένη RhoB. Αυτή η πρωτεΐνη RhoB οδήγησε σε ρ21 που σχετίζεται με διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G0 /G1, μετά την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή. Αντιστρόφως, μειώνοντας την κυτταρική RhoB από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA knockdown στο AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα οδήγησε σε αρνητική ρύθμιση των ρ21 και ανέστειλε διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Η ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου BHP18-21v

σε

vivo

ανεστάλη σημαντικά με ένεση AdTRβ με FTIs-θεραπεία, σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων του ιού ένεση. Αυτό το μονοπάτι μυθιστόρημα σηματοδότησης ενεργοποιείται από συνδέτη δεσμεύεται ΤΡβ παρέχει ενδείξεις για πιθανούς μηχανισμούς του πολλαπλασιασμού και της εισβολής του καρκίνου του θυρεοειδούς και μπορεί να παρέχει νέων θεραπευτικών στόχων για καρκίνο του θυρεοειδούς

Παράθεση:. Ichijo S, Furuya F, Shimura Η, Hayashi Υ, Takahashi Κ, Κ Ohta, et al. (2014) Η ενεργοποίηση της RhoB μονοπάτι σηματοδότησης με β Θυροειδικού υποδοχέα σε κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς. PLoS ONE 9 (12): e116252. doi: 10.1371 /journal.pone.0116252

Επιμέλεια: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 12, Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 5 Δεκ 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 Ichijo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από JSPs KAKENHI (Grant Αριθμός 24591359). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποδοχείς θυρεοειδούς ορμόνης (TRs) είναι εξαρτώμενη από συνδετήρα παράγοντες μεταγραφής που προκαλούν τις δράσεις της ορμόνης του θυρεοειδούς (Τ3) στην κυτταρική ανάπτυξη, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Δύο γονίδια του ανθρώπου TR, thrA και thrB που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα, κωδικοποιούν Τ3 δέσμευσης ισομορφές (TRα1, β1, β2, β3 και) που εκφράζονται σε ένα ιστών και την ανάπτυξη με τρόπο που εξαρτάται [1]. Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν γίνει σημαντικές πρόοδοι στην κατανόηση των δράσεων TR στη διατήρηση της φυσιολογικής κυτταρικής λειτουργίας. Ωστόσο, οι ρόλοι των TRs στον ανθρώπινο καρκίνο δεν είναι καλά κατανοητοί. Η μειωμένη έκφραση του TRs εξαιτίας υπερμεθυλίωση ή διαγραφή των γονιδίων TR σε ανθρώπινους καρκίνους υποδηλώνει ότι TRs θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως καταστολείς όγκων [2]. Μια στενή συνεργασία των σωματικών μεταλλάξεων των TR με καρκίνους του θυρεοειδούς στηρίζει περαιτέρω την άποψη ότι η απώλεια των συνήθων καθηκόντων των TR θα μπορούσε να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη ανάπτυξη και την απώλεια της διαφοροποίησης των κυττάρων [3].

Για να κατανοήσουμε τις λειτουργικές συνέπειες του συνδέτη το δεσμευμένο επιπτώσεις ΤΡβ στην κατάντη οδούς σηματοδότησης στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, εστιάσαμε στην RhoB που είναι μέλος της υπεροικογένειας Ras των ισοπρενυλιωμένες μικρά GTPases, οι οποίες ρυθμίζουν ίνες στρες ακτίνη και μεταφορά κυστιδίων [4]. Άλλες RhoGTPases, οι οποίες περιλαμβάνουν RhoA και RhoC, την προώθηση της ογκογένεσης, εισβολή, και μετάσταση [5]. Σε αντίθεση, RhoB έχει αντιπολλαπλασιαστική και προ-απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, και η υπερέκφραση του RhoB μπορούν να αναστείλουν τη μετανάστευση των κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση [6]. συσχέτιση μεμβράνης της RhoB πρωτεΐνης γίνεται μέσω δύο γερανυλγερανυλιωμένες (RhoB-GG) ή φαρνεζυλιωμένων τροποποιήσεις. RhoB ανταποκρίνεται σε φαρνεσυλ τρανσφεράσης αναστολέα (FTI) -Θεραπεία από ένα μηχανισμό κέρδος-of-λειτουργία που χαρακτηρίζεται από ανύψωση της μορφής RhoB-GG που αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό ή την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [7]. Έτσι, αλλοιωμένη έκφραση και τη δραστηριότητα των RhoB μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την εξέλιξη του καρκίνου και τη θεραπευτική ανταπόκριση.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε την λειτουργία του συνδέτη δεσμεύεται ΤΡβ στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Ligand δεσμευμένο επαγόμενη ΤΡβ έκφραση πρωτεΐνης RhoB, οδηγώντας σε αυξημένη έκφραση του p21 που ακολουθείται από μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και κινητικότητα. FTI-θεραπεία ενισχυμένης αυτές αντιπολλαπλασιαστική λειτουργίες του συνδέτη δεσμευμένου ΤΡβ. Τα αποτελέσματά μας εντοπισμό RhoB ρύθμιση προς τα πάνω ως σημαντικό βήμα για τη στόχευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του καρκίνου του θυρεοειδούς και την εξέλιξη του όγκου. Αυτό το μονοπάτι μυθιστόρημα σηματοδότησης ενεργοποιείται από συνδέτη δεσμεύεται ΤΡβ παρέχει πληροφορίες για την πιθανή πολλαπλασιασμό και την εισβολή των μηχανισμών του καρκίνου του θυρεοειδούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

BHP18-21 κύτταρα, που αναφέρθηκαν από Ohta

et al.

[8], δόθηκαν ως δώρο από τον Δρ Jerome Hershman, UCLA. κύτταρα BHP18-21v, που εκφράζουν Pax-8, αλλά δεν εκφράζουν είτε το θυρεοσφαιρίνη ή η μεταγραφή του θυρεοειδούς γονίδιο παράγοντα-1, απομονώθηκαν από κύτταρα BHP18-21v [9]. FRO και τα κύτταρα WRO, τα οποία αναφέρθηκαν στην παραπομπή [10], [11] ευγενικά από τον Dr. Shunichi Yamashita, Πανεπιστήμιο του Ναγκασάκι. Αυτές οι κυτταρικές σειρές δεν είναι

de

novo

κυτταρικές σειρές, αλλά έχουν ήδη αναφερθεί [8], [10], [11] και είχαν την καλοσύνη να παρέχονται ως δώρα από τους συνεργάτες μας. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (FBS) σε υγροποιημένο επωαστή κάτω από 5% CO

2 ατμόσφαιρα. DNA προφίλ των κυτταρικών σειρών καρκίνου αναλύθηκε με Promega Ιαπωνία (Τόκιο, Ιαπωνία) και παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. ορμονών του θυρεοειδούς, τριιωδοθυρονίνη (Τ3) και του αναστολέα φαρνεσυλ τρανσφεράσης (FTI), FTI-277, αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St . Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα επωάστηκαν με ρητίνη απογυμνωμένο (T

3-απεμπλουτισμένου) FBS [12] και στη συνέχεια μολύνθηκαν με 30 ΜΟΙ AdTRβ ή AdLacZ ελέγχου. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο με ή χωρίς 30 ηΜ Τ3 ή 5 μΜ FTI.

Η

Κατασκευή του ανασυνδυασμένου αδενοϊικών φορέων

AdTRβ είναι ένα ΔΕ1-ΔE3 ανασυνδυασμένου αδενοϊού που εκφράζει το ανθρώπινο γονίδιο ΤΡβ [13] υπό τον έλεγχο του άμεσου πρώιμου υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού (CMV). Κατασκευή του ιού AdTRβ έχει περιγραφεί προηγουμένως [13]. AdLacZ, που περιέχει το CMV προαγωγό ελεγχόμενη

lacZ γονίδιο

, αγοράστηκε από την Quantum Biotechnologies (Μόντρεαλ, Καναδάς) και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. AdTRβPV είναι ένας ανασυνδυασμένος αδενοϊικός φορέας που εκφράζει ανθρώπινο TRβPV, η οποία είναι μια κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη του ΤΡβ [14], υπό τον έλεγχο του άμεσο πρώιμο προαγωγέα κυτταρομεγαλοϊού. Το πλασμίδιο FLAG-TRβPV [15] χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για κλωνοποίηση

TRβPV

σε pShuttle2 (Clontech, Mountain View, CA) χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Οι εκκινητές PCR ήταν: FLAG-ApaI-5 ‘(AAGGGCCCGCCGCCATGGACTACAAAGACGATGACGAC), και TRβPV-3’ ΚρηΙ (AATGGTACCTTCAGTCTAATCCTCGAACACTTCC) στα οποία οι υπογραμμίσεις υποδεικνύουν θέσεις περιορισμού. Ένας φορέας αδενοϊού στη συνέχεια κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Εκφράζοντας αδενο X (Clontech) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί καθαρίστηκαν σε πλάκες, συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά τη μόλυνση των κυττάρων 293, και καθαρίστηκε με υπερφυγοκέντρηση διπλό βαθμίδα χλωριούχου καισίου [16]. Viral τίτλοι προσδιορίστηκαν με αναλύσεις πλάκα με κύτταρα καλλιεργημένα 293 [16] και ένα κιτ αδενοϊό τιτλοδότηση (Clontech).

κατασκευή πλασμιδίου και δοκιμασίες λουσιφεράσης

Το πλασμίδιο αναφοράς RhoB -726 /+ 86 RhoB -Luc πλασμίδιο παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Δημήτρης Καρδάσης (Πανεπιστήμιο Κρήτης Ιατρική Σχολή) [17]. Παροδικές συν-μορφομετατροπές διεξήχθησαν εις τριπλούν. Το πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla συν-επιμολύνθηκε για ομαλοποίηση. Το πλασμίδιο επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε AdTRβ ή τον έλεγχο του καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα μολυσμένα με ιό χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (τεχνολογίες ζωής, Grand Island, ΝΥ). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς Τ3 για επιπλέον 24 ώρες. Διπλή προσδιορισμοί λουσιφεράσης διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, Madison, WI).

δοκιμασία ChIP

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μια απλή ChIP ενζυματική κιτ χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα (5 × 10

7) τα οποία υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς Τ3 σταθεροποιήθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη και χωνεύεται χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-ιστόνης 3 (θετικός έλεγχος), IgG κανονικής κουνελιού (αρνητικός έλεγχος), αντι -ακετυλο ιστόνης 3 (Lys 9), αντι-αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) 1 ή αντισωμάτων αντι-HDAC3. Πεντακόσια μλ αραιωμένου χρωματίνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με 5 μg κάθε αντισώματος και η πρωτεΐνη G μαγνητικά σφαιρίδια σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική πραγματικού χρόνου (RT) -PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο πραγματικού χρόνου PCR kit (Life Technologies). Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για RT-PCR ήταν: 5′-προς τα εμπρός GCAGCAGCAGCGCAGACT-3 ‘και αντίστροφος 5′-ACTCGGCCTAGCTCTCTC-3’

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάστροφης μεταγραφάσης

Ολικό RNA. εξάγεται από τα κύτταρα με τη χρήση ενός κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό με φασματοφωτομετρία, 5 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα για τη λήψη του cDNA με τη χρήση 160 μΜ τριφωσφορική δεοξυνουκλεοτιδίου, 50 ng τυχαίου εξαμερούς εκκινητές και 200 ​​μονάδες Superscript II, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Life Technologies). ανιχνευτές TaqMan για ανθρώπινη RhoB, ΤΡβ και 18S rRNA αγοράστηκαν από την Life Technologies. τα επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν από πραγματικού χρόνου RT-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Furuya

et al.

[18].

ανάλυση Western blot

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Yamanashi. Φυσιολογικούς ιστούς του θυρεοειδούς από το αντίθετο λοβό του καρκινώματα ελήφθησαν από τη χειρουργική επέμβαση μετά τις ασθενείς έδωσαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Τα έγγραφα σχετικά με ενημερωμένη συγκατάθεση, οι οποίες εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας, κρατήθηκαν στο υπουργικό συμβούλιο πανεπιστήμιο αποθήκευσης νοσοκομείο. Κανονική ιστού από 4 από τους ασθενείς συγκεντρώθηκε για τη Δυτική πείραμα κηλίδωσης. Οι ιστοί καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά την εκτομή. Πρωτεϊνικά λύματα της κανονικής θυρεοειδούς ιστού και των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παρασκευάστηκαν με χρήση ρυθμιστικού διαλύματος κυτταρικής λύσης (Cell Signaling Technology) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. πρωτεΐνη μεμβράνης καθαρίστηκε από AdTRβ κύτταρα μολυσμένα BHP18-21v χρησιμοποιώντας ένα κιτ καθαρισμού πρωτεϊνών μεμβράνης (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, ΡΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Προσδιορισμός της πρωτεΐνης αφθονίας με ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφεται [19] χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα (1:500 αραίωση): αντι-RhoB και αντι-φωσφορυλιωμένες Rb (Cell Signaling Technology)? αντι- ΡΡΑΚγ, αντι-ρ21, αντι-τουμπουλίνης, και αντι-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas ΤΧ). Αρνητικού ελέγχου siRNA και siRNA εναντίον RhoB αγοράστηκαν από Dharmacon (Thermo Fisher, Leicestershire, Ηνωμένο Βασίλειο). Η ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων siRNA επιμολυσμένα διεξήχθη ως εξής: Καρκινικές κυτταρικές γραμμές (1.0-1.3 × 10

5) μολύνθηκαν με αδενοϊό (ΜΟΙ 30) επωάστηκαν με Τ3 για 12 ώρες και στη συνέχεια 50 nm του siRNA διαμολύνθηκε σε τα κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (Ca

2 + /Mg

2 + -δωρεάν) και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ανοσοκαταβύθιση ανάλυση

Για να αναλυθεί η έκφραση πρωτεΐνης του ΤΡβ σε κύτταρα, 500 μg πρωτεΐνης κυτταρολύματος από θυρεοειδή ιστό, HepG2 ή ιός-επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς ανοσοκαταβυθίστηκε με 5 μg του μονοκλωνικού αντισώματος C3 ποντικού ενάντια στο C άκρο του ΤΡβ (Santa Cruz Biotechnology) ή με 5 μg IgG ποντικού, όπως αναφέρεται στο κείμενο, χρησιμοποιώντας το κιτ G ανοσοκαταβύθιση Dynabeads πρωτεΐνη (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντι-ΤΡβ αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) έναντι ενός Ν-τερματικού πεπτιδίου ΤΡβ ή ένα αντίσωμα αντι-ΤΚα (Santa Cruz Biotechnology) έναντι ενός Ν-τερματικού πεπτιδίου ΤΚα. Τα κυτταρολύματα των AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με Rhotekin RBD tagged σφαιρίδια αγαρόζης και η αφθονία του GTP-δεσμευμένη RhoB αναλύθηκε με δοκιμασία pull-down, χρησιμοποιώντας RhoB κιτ δοκιμασίας ενεργοποίησης (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 20 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Life Technologies) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή BD Biosciences FACS Calibur κυτταρόμετρο (Franklin Lakes, NJ) και Cell Quest έκδοση λογισμικού 3.0. Το ποσοστό των κυττάρων στο G

1, S, ή G

2 /M φάση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ModFitLT έκδοση 3.1.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες

Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση ενός μη ραδιενεργού ποσοτικού προσδιορισμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Cell Μετρώντας Kit-8? Dojindo, Kumamoto, Japan) όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Furuya

κ.ά.

[19]. Cellular εισβολή μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας Cytoselect κυτταρική διείσδυση (Cell Biolabs, Inc.), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κυττάρων μέσο καλλιέργειας με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στο κάτω φρεάτιο του θαλάμου. Μετά επανυδάτωση της βασικής μεμβράνης, κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα του θαλάμου σε μέσο ελεύθερο ορού (1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) με Τ3 ή FTI-θεραπεία. Μετά από επώαση στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες, τα μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια, και τα κύτταρα που είχαν εισβάλει τη μεμβράνη (μέγεθος πόρων 8 μm) για να φθάσει η κάτω επιφάνεια ήταν βάφονται με CyQuant GR φθορίζουσα χρωστική. φθορισμό τους αναλύθηκε στα 480 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός φθορισμού.

ξενομοσχευμάτων κυττάρων BHP18-21v και ένεση φορέα

BHP18-21v κύτταρα (1 χ 10

7) μεταμοσχεύθηκαν σε η κοιλιακή υποδόριο ιστό 8 εβδομάδων γυμνά ποντίκια αρσενικά (BALB /C

ηυ /ηυ

). Τρεις εβδομάδες αργότερα, όταν οι όγκοι είχαν φθάσει περίπου 1 cm σε διάμετρο, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε πειραματικό ή της ομάδας ελέγχου (6 ποντικοί ανά ομάδα). Πέντε × 10

8 μονάδες σχηματισμού πλάκας του AdTRβ ή AdLacZ σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν εντός των όγκων. χορήγηση αδενοϊός επαναλαμβάνεται κάθε 7 ημέρες. Σε κάθε χρονικό σημείο, όλοι οι ποντικοί επίσης ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με 100 mg /kg /σωματικού βάρους του FTI-277. Την ημέρα 30, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή. Οι όγκοι που αφαιρέθηκαν από τους ποντικούς σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Οι τομές κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ορού ελεύθερης Τ3 και τα επίπεδα TSH προσδιορίστηκαν με τη χρήση της ελεύθερης Τ3 κιτ ELISA (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, CA) και ένα κιτ προσδιορισμού TSH (Uscn Life Science Inc, Wuhan, Κίνα), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Η θεσμική επιτροπή βιοασφάλεια του Πανεπιστημίου Yamanashi ενέκρινε τις διαδικασίες των ζώων και τη χρήση του ανασυνδυασμένου DNA.

Στατιστικά

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± Τ.Α. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ανάλυσης της διακύμανσης ή η μη ζευγαρωμένα 2-tailed του Student

t-test

, και οι τιμές πιθανότητας μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

για να διερευνήσουν λειτουργία ΤΡβ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του θυρεοειδούς, εστιάσαμε στην ανάλυση των RhoB, η οποία αποτελεί στόχο του ΤΡβ και εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε 130 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές [20]. Για την παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τις καρκινικές κυτταρικές σειρές 3 του θυρεοειδούς, BHP18-21v, FRO και WRO, τα οποία μολύνθηκαν με 30 ΜΟΙ AdTRβ ή AdLacZ. Αναλύσαμε πρώτα έκφραση πρωτεΐνης ΤΡβ σε αυτά τα κύτταρα. Πεντακόσια μα πλήρους πρωτεΐνης κυτταρολύματος ανοσοκαταβυθίστηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει την περιοχή TR C-τερματικό, που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western με ένα αντίσωμα κατά ενός Ν-τερματικού πεπτιδίου ΤΡβ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, η έκφραση ΤΡβ παρατηρήθηκε σαφώς στους θετικούς μάρτυρες? άθικτου ιστού του θυρεοειδούς (λωρίδα 1) και HepG2 κύτταρα που εκφράζουν λειτουργική TR [21] (λωρίδα 2), και επίσης σε AdTRβ μολυσμένα BHP18-21v, FRO και κυττάρων WRO (διαδρομές 6-8). Αριθ έκφραση πρωτεΐνης ΤΡβ παρατηρήθηκε σε AdLacZ μολυσμένα BHP18-21v, FRO ή κύτταρα WRO (λωρίδες 3-5) ή σε κύτταρα HepG2 που ανοσοκαταβυθίστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού IgG ως αρνητικό μάρτυρα (διαδρομή 9). έκφραση τουμπουλίνης στην πρωτεΐνη λύμα (10 μg) αναλύθηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης (σχ. 1Β). Αναλύσαμε επίσης την έκφραση ΤΚα σε αυτά τα προϊόντα λύσης κυττάρου με ανάλυση κηλίδας Western των ανοσοκαταβυθισμένων πρωτεϊνών με ένα αντίσωμα έναντι ενός Ν-τερματικού πεπτιδίου ΤΚα. έκφραση ΤΚα παρατηρήθηκε στους θετικούς μάρτυρες? θυρεοειδούς ιστού και HepG2 (διαδρομές 1 και 2, αντίστοιχα). Αριθ έκφραση πρωτεΐνης ΤΚα παρατηρήθηκε σε BHP18-21v, FRO ή WRO κύτταρα που μολύνθηκαν με AdLacZ (λωρίδες 3-5) ή AdTRβ (διαδρομές 6-8). Down-ρύθμιση της έκφρασης ΡΡΑΚγ και η δραστικότητα του θεωρείται ότι είναι ένας μηχανισμός των θυρεοειδικών καρκινογένεσης [22]. Ως εκ τούτου, ανέλυσε επίσης την πρωτεΐνη έκφραση του PPARγ σε BHP18-21v, FRO ή κύτταρα WRO (Εικ. 1Γ). έκφραση ΡΡΑΚγ μειώθηκε σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη του άθικτου ιστού του θυρεοειδούς, αλλά μόλυνση με AdTRβ δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του ΡΡΑΚγ σε κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι τρεις AdTRβ ή AdLacZ μολυσμένα κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν αποτελούν ένα καλό μοντέλο για την ανάλυση της λειτουργίας ΤΡβ.

A. Western blot κυτταρολυμάτων (500 μg) που παρασκευάστηκε από φυσιολογικό θυρεοειδή ιστό, από θετικά κύτταρα HepG2 ελέγχου, ή από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς BHP18-21v, FRO και WRO που μολύνθηκαν με AdTRβ ή ελέγχουν AdLacZ ιού. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν (IP) με 5 μg του αντί-ΤΡβ μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (C3) που αναγνωρίζει το ΤΡβ C-άκρο, ή με 5 μg του φυσιολογικού IgG ποντικού (IgG) όπως υποδεικνύεται. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα έναντι ενός Ν-τερματικού ΤΡβ πεπτίδιο (ΤΡβ) ή με ένα αντίσωμα κατά ενός Ν-τερματικού πεπτιδίου ΤΚα (ΤΚα). έκφραση Β τουμπουλίνης σε συνολικά κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. κηλίδωση ανάλυση Γ Western του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης ΡΡΑΚγ (άνω πάνελ) σε εκχυλίσματα κυττάρων (20 μα υλικού λύσεως πρωτεΐνης). Τουμπουλίνης επίσης κηλιδώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ).

Η

επόμενο αναλύσει την επίδραση της θεραπείας Τ3 του AdLacZ μολυσμένων με τον καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρικές γραμμές έκφρασης RhoB (Σχ. 2Α-C AdTRβ- ή ). Τ3-θεραπεία (30 ηΜ) AdTRβ μολυσμένα (διαδρομές 1-4), αλλά όχι του AdLacZ μολυσμένα (διαδρομές 5-7) BHP18-21v, FRO και WRO κύτταρα για 6, 12 ή 24 ώρες ενίσχυσε σημαντικά την έκφραση του RhoB mRNA σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα μη μολυσμένα με ιό κύτταρα. Επιπλέον, ανάλυση Western blotting έδειξε ότι Τ3-θεραπείας για 12 ή 24 ώρες προκαλούμενη έκφραση πρωτεΐνης RhoB σε AdTRβ μολυσμένα BHP18-21v, FRO και τα κύτταρα WRO αλλά όχι σε AdLacZ-μολυσμένα κύτταρα (Σχ. 2D-F, λωρίδες 2-4 και διαδρομές 5-7 αντίστοιχα). Έτσι, η επαγωγή της RhoB mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης είναι Τ3 /AdTRβ εξαρτώμενη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς.

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA RhoB (Α-C) ή πρωτεΐνη (D-F) σε μολυσμένα AdTRβ, έλεγχος AdLacZ μολυσμένα ή μη μολυσμένα θυρεοειδούς καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκτίθενται σε 30 ηΜ Τ3 για 0, 6, 12 ή 24 ώρες όπως υποδεικνύεται. (Α-Γ) Η έκφραση των RhoB και 18S mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR με 100 ng του cDNA. επίπεδα έκφρασης Σχετική mRNA προσδιορίστηκαν με αυθαίρετα ορίζοντας την τιμή για κύτταρα μολυσμένα με ιό ελέγχου επωάζονται σε Τ3 μέσο ελεύθερο προς 1. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. (

n

= 6). *,

σ

& lt? 0,05. (D-F) ανάλυση κηλίδας Western των 20 μα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από τα κύτταρα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι RhoB (άνω πάνελ) ή τουμπουλίνης (κάτω πλαίσιο), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

για να διευκρινιστεί οι μηχανισμοί μέσω των οποίων συνδεδεμένο με πρόσδεμα ΤΡβ ενίσχυσε την έκφραση των RhoB σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v, FRO και WRO, αναλύσαμε την επίδραση της θεραπείας Τ3 από αυτές τις κυτταρικές γραμμές για την μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού RhoB. κύτταρα μολυσμένα με AdLacZ AdTRβ- ή ελέγχου επομένως παροδικά επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα ανταποκριτή RhoB υποκινητή-λουσιφεράση, -726 /+ 86 RhoB-Luc. Η δραστικότητα λουσιφεράσης καθοδηγείται από τον προαγωγό RhoB ήταν σημαντικά αυξημένη σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα, αλλά όχι σε AdLacZ μολυσμένα κύτταρα μετά από Τ3-αγωγή (Σχ. 3Α-Γ).

(Α-Γ) RhoB προαγωγού-λουσιφεράσης αναλύσεις δημοσιογράφος. Αδενοϊό μολυσμένα BHP18-211v (Α), FRO (Β), ή WRO κύτταρα (C) διαμολύνθηκαν με 1 μg ενός πλασμιδίου ανταποκριτή RhoB υποκινητή-λουσιφεράση και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες εν απουσία ή παρουσία 30 ηΜ Τ3. δραστηριότητες Σχετική προαγωγό (δραστικότητα λουσιφεράσης) προσδιορίστηκαν με αυθαίρετα ορίζοντας την τιμή για κύτταρα μολυσμένα με ιό ελέγχου επωάζονται σε Τ3 μέσο ελεύθερο προς 1. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. (

n

= 6). *,

σ

& lt? 0,05. (D-F) δοκιμασία ChIP χρησιμοποιώντας AdTRβ μολυσμένα BHP18-211v (D), FRO (Ε), ή WRO (F) κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς 30 ηΜ Τ3. Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν histone3 (Η3), ακετυλιωμένη Η3, HDAC1, HDAC3 ή κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαθίζηση της χρωματίνης. Είσοδος δείχνει το 10% της χρωματίνης. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε 2% πηκτή αγαρόζης.

Η

Η μεταγραφή του υποκινητή της RhoB παρεμποδίζεται από μεταγραφικοί καταστολείς που προσλαμβάνουν αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) για να απομακρυνθεί η ακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης επί histones3 (Η3) ουρές [23]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το καθεστώς ακετυλίωση των περιοχών ουράς του histones3 (Η3) μεταβολή κατά τη διάρκεια της μεταγραφικής ενεργοποίησης του υποκινητή RhoB [24]. Για να καθοριστεί εάν η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου RhoB με συνδέτη δεσμευμένο ΤΡβ συσχετίζεται με μεταβολές στην κατάσταση ακετυλίωση Η3 στην περιοχή προαγωγού του γονιδίου RhoB, διεξήχθησαν χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες. AdTRβ μολυσμένα BHP18-21v, FRO ή κύτταρα WRO επωάστηκαν με ή χωρίς Τ3 για 24 ώρες και δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντισώματα προς Η3, ακετυλιωμένη Η3, HDAC1 και HDAC3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D-F, Η3 βρέθηκε σε θραύσματα του υποκινητή RhoB (λωρίδα 3) σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα με ή χωρίς Τ3-θεραπεία. Ωστόσο, HDAC1 και HDAC3 συνδέθηκαν με θραύσματα του υποκινητή RhoB μόνο όταν τα κύτταρα επωάστηκαν χωρίς Τ3, και όχι όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με Τ3 (HDAC1 /3? Διαδρομές 5 και 6, αντίστοιχα). Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, δεν ακετυλιωμένο Η3 συνδέθηκε με τον προαγωγέα απουσία θεραπείας Τ3, ενώ με την παρουσία Τ3, ο Η3 που συνδέθηκε με τον προαγωγέα ήταν ιδιαίτερα ακετυλιώθηκε (λωρίδα 4). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδέτης δεσμευμένη ΤΡβ επαγόμενη μεταγραφή RhoB μέσω μεταβολής της κατάστασης ακετυλίωσης ιστόνης του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων.

επόμενο αναλύσει την επίδραση του προσδέματος δεσμευμένου ΤΡβ στο κυτταρικό εντοπισμό και τη λειτουργία των RhoB. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε τον παράγοντα της ΠΕΔ. θεραπεία FTI των κυττάρων επάγει τη σύνδεση μεμβράνη των RhoB με τροποποίηση της RhoB μέσω της προσθήκης λιπιδίων τμημάτων [4]. συνεταιρίζεσθαι μεμβράνη του RhoB είναι σημαντική για τη δράση του. Προσδιορίσαμε πρώτα την επίδραση της 5 μΜ της θεραπείας FTI επί της έκφρασης πρωτεΐνης RhoB σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς Τ3 (30 ηΜ). Κηλίδωση Western των προϊόντων λύσης κυττάρου κατεργασμένου /χωρίς θεραπεία AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v με RhoB αντίσωμα (Σχ. 4Α) έδειξε ότι ολόκληρο FTI-θεραπεία δεν μετέβαλλε την επαγωγή της έκφρασης Τ3 RhoB (λωρίδες 2 και 4) και δεν αύξησε RhoB πρωτεΐνη έκφραση σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v απουσία Τ3-θεραπείας (λωρίδα 3).

AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-211v εκτέθηκαν με 30 ηΜ Τ3 ή /και 5 μΜ του αναστολέα φαρνεσυλ τρανσφεράσης ( FTI) για 24 ώρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν ως εξής. Α Western blotting ανάλυση του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης RhoB (επάνω πίνακας) σε εκχυλίσματα κυττάρων (20 μα υλικού λύσεως πρωτεΐνης). Τουμπουλίνης επίσης κηλιδώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ). B. κυτταρολύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με Rhotekin RBD-tagged σφαιρίδια αγαρόζης. GTP-δεσμευμένη RhoB στα ιζήματα αναλύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον RhoB. κηλίδωση ανάλυση Γ Western των RhoB πρωτεΐνης στο κλάσμα πρωτεΐνης μεμβράνης. GAPDH στυπώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης δείκτη πρωτεΐνη μεμβράνης (κάτω πίνακας).

Η

Στη συνέχεια αναλύσαμε την επίδραση της θεραπείας Τ3 με /χωρίς FTI συν-θεραπεία σε δραστηριότητα RhoB. Όπως και άλλα μικρά GTPases, RhoB ρυθμίζει μοριακά γεγονότα με ποδήλατο ανάμεσα σε μια ανενεργό μορφή ΑΕΠ-δεσμεύεται και μια ενεργή GTP-δεσμευμένη μορφή. Στην ενεργή ΟΤΡ-δεσμευμένη μορφή, RhoB δεσμεύεται ειδικά με την περιοχή δέσμευσης Rho-(RBD) του Rhotekin να ρυθμίζουν προς τα κάτω καταρράκτες σηματοδότησης. Ως εκ τούτου αναλύσαμε την αφθονία του GTP-δεσμευμένη RhoB στα κυτταρολύματα του AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς Τ3 ή /και FTI με ανοσοκαθίζηση των προϊόντων λύσης κυττάρου με Rhotekin RBD-tagged σφαιρίδια αγαρόζης που ακολουθείται από ανοσοκηλίδωση για RhoB ( Σχ. 4Β). Αυτές οι δοκιμασίες pull-down έδειξε ότι όχι μόνο η αφθονία των RhoB αλλά και την αφθονία της δραστικής ΟΤΡ-δεσμευμένη μορφή του RhoB σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v ενισχύθηκε με Τ3-αγωγή (λωρίδα 2) και ενισχύεται έντονα από την FTI και Τ3 συν-θεραπεία (λωρίδα 4). Αριθ GTP-δεσμευμένη RhoB ανιχνεύθηκε σε FTI-επεξεργασμένα κύτταρα χωρίς Τ3-επεξεργασία (διαδρομή 3). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδετήρας-δεσμεύεται AdTRβ πρωτεΐνης που προκαλείται από RhoB σε κύτταρα BHP18-21v ήταν ενεργό κινάσης των οποίων η δραστηριότητα ενισχύθηκε με την ταυτόχρονη αγωγή με FTI.

Για να προσδιορίσετε αν Τ3 και FTI θα μπορούσε να προκαλέσει ένωση μεμβράνη RhoB σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v, στην κυτταρική επιφάνεια πρωτεΐνες βιοτινυλιώθηκαν. Βιοτινυλιωμένο πρωτεϊνών σε προϊόντα λύσης κυττάρου στη συνέχεια έλκεται προς τα κάτω με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντι-RhoB αντίσωμα (Σχ. 4C). T3-θεραπεία προκάλεσε την έκφραση του RhoB στην κυτταρική μεμβράνη (λωρίδα 2), η οποία ενισχύεται σε μεγάλο βαθμό με την ταυτόχρονη αγωγή με FTI (λωρίδα 4). FTI-θεραπεία δεν ενισχύουν την έκφραση της πρωτεΐνης RhoB στην κυτταρική μεμβράνη του AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v απουσία Τ3-θεραπείας (λωρίδα 3). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Τ3 επαγόμενη ένωση μεμβράνη του RhoB που ενισχύθηκε με FTI συν-θεραπεία και ήταν σύμφωνες με την επαγωγή της δραστικότητας Τ3 RhoB σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα BHP18-21v.

εξαρτώμενων από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ ) αναστολέα ρ21, είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της προόδου του κυτταρικού κύκλου και είναι ένα από τα κατάντη στόχοι της RhoB. Για να επιβεβαιωθεί η δραστικότητα της RhoB σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με BHP18-21v Τ3 ή /και FTI, αναλύσαμε την πρωτεΐνη έκφραση του ρ21 με ανάλυση στυπώματος Western (Σχ. 5Α-C). έκφραση p21 αναλύθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με RhoB στοχευμένες ή siRNA ελέγχου για να επιβεβαιώσετε την εξάρτηση RhoB του p21changes. Τρεις θυρεοειδούς καρκινικά κύτταρα προ-καλλιεργήθηκαν σε Τ3 μέσο άνευ με απογυμνωμένο ορό, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». FTI-θεραπεία δεν ενισχύουν την έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 σε siRNA-κύτταρα ελέγχου AdTRβ μολυσμένα χωρίς Τ3-επεξεργασία (διαδρομή 2). Σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα, το επίπεδο έκφρασης της ρ21 αυξήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με Τ3 (λωρίδα 3) και ενισχύθηκε σημαντικά με την ταυτόχρονη αγωγή με FTI (λωρίδα 4) σε σύγκριση με μη-κατεργασμένα κύτταρα (λωρίδα 1). Ωστόσο, ρ21 δεν προκλήθηκε με Τ3 συν θεραπεία FTI του AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με RhoB στόχευσης siRNA (λωρίδα 5). ρ21 αναστέλλει τις δραστηριότητες των CDKs, που οδηγεί σε υπο-φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος (Rb), το οποίο με τη σειρά του προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G0 /G1 [25]. Αναλύσαμε την φωσφορυλίωση Rb (ρ-Rb) σε AdTRβ μολυσμένα κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς σε επεξεργασία με Τ3 ή /και FTI [(Σχ. 5 (Α-Γ)). Rb φωσφορυλιώθηκε σε AdTRβ μολυσμένα BHP18-21v, FRO ή WRO κύτταρα με ή χωρίς Τ3-θεραπεία (λωρίδες 1 και 3). FTI-θεραπεία μόνη της δεν αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του Rb εις AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα (λωρίδα 2). Rb φωσφορυλίωσης μειώθηκε σημαντικά σε AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα με συν-θεραπεία με Τ3 και FTI (λωρίδα 4). Από την άλλη πλευρά, η αναστολή της Rb φωσφορυλίωσης δεν παρατηρήθηκε με Τ3 συν θεραπεία FTI του AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα μετά την επιμόλυνση με RhoB στόχευσης siRNA (λωρίδα 5). Ανάλυση

(Α-Γ) Western στύπωμα της επίπεδο έκφρασης του ρ21 ή του φωσφορυλιωμένου Rb πρωτεΐνης σε AdTRβ μολυσμένα BHP18-21v (Α), FRO (Β), ή κύτταρα WRO (C) που έχουν εκτεθεί σε 30 ηΜ Τ3 και μόνο για 12 ώρες ή για 30 ηΜ Τ3 συν 5 μΜ FTI για 12 ώρες, με ή χωρίς siRNA knockdown του RhoB όπως υποδεικνύεται. Τουμπουλίνης στυπώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ). (D-F) Το ποσοστό των κυττάρων στην G

0 /G

1, S, ή G

2 /M φάση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ModFitLT έκδοση 3.1. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. (

n

= 6). *,

σ

& lt?. 0.05

Η

Μελετήσαμε περαιτέρω τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου από αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 5D-F.). Σε si-ελέγχου AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα, η θεραπεία με Τ3 συν FTI προκάλεσε μια σημαντική αύξηση του πληθυσμού φάση G0 /G1 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή Τ3-επεξεργασμένα κύτταρα, ενώ στην RhoB στοχευμένες siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα, Τ3 + θεραπεία FTI είχε καμία επίδραση επί του κυτταρικού πληθυσμού στην φάση G0 /G1. Επιπλέον, η θεραπεία με Τ3 συν FTI μείωσε τον αριθμό των κυττάρων στην G2 φάση /Μ σε si-μάρτυρα αλλά όχι σε RhoB στοχευμένες siRNA-AdTRβ-μολυσμένα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση RhoB σε AdTRβ μολυσμένα καρκινικά κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Τ3 και FTI, συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση του ρ21 και αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου.

Για να επιβεβαιωθεί ότι οι παρατηρούμενες μεταβολές στην έκφραση ρ21 αντικατοπτρίζονται μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναλύσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της ΤΡβ επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ. Για την ανίχνευση αυτή, BHP18-21v, FRO ή WRO κύτταρα μολύνθηκαν με 30 ΜΟΙ AdTRβ και, μετά από 12 ώρες επώασης σε μέσο που περιέχει αδενοϊό, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς Τ3 (30 ηΜ) και 5 μΜ FTI για 24 ή 72 ώρες. Μετά από 24 και 72 ώρες από τον αριθμό των κυττάρων είχε αυξηθεί από επώαση εν απουσία T3-θεραπείας, αλλά μειώθηκε με την παρουσία Τ3 και μειώθηκε σημαντικά παρουσία της Τ3 συν FTI (Σχ. 6A-C).

(Α-Γ) προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων.

You must be logged into post a comment.