Αφηρημένο

Σκοπός

Η ανάλυση των εξωσωμάτων /μικροκυστίδιο (εξωκυττάριο κυστίδια (ΕΕΥ)) και η RNA συσκευασμένα στο εσωτερικό τους (exoRNA) έχει τη δυνατότητα να παρέχει μια μη επεμβατική πλατφόρμα για την ανίχνευση και την παρακολούθηση γονιδιακής έκφρασης που συνδέονται με τη νόσο δυνητικά

αντί

του πιο επεμβατικές διαδικασίες, όπως η βιοψία. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν εξετάσει το διαγνωστικό δυναμικό της ανάλυσης EV σε ανθρώπους

Πειραματικός Σχεδιασμός

Η ικανότητα της ανάλυσης EV ώστε να αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την έκφραση του mRNA του ιστού του προστάτη εξετάστηκε με τη σύγκριση του ουροποιητικού TMPRSS2 EV:. ERG exoRNA από προ-ριζική προστατεκτομή (RP) ασθενείς έναντι αντίστοιχων RP ιστού σε 21 ασθενείς. Να εξετάσει τη διαφορική έκφραση της TMPRSS2: ERG σε όλες τις ομάδες ασθενών ένα τυχαίο δείγμα ούρων ελήφθη χωρίς μασάζ του προστάτη από μια ομάδα των 207 ανδρών, συμπεριλαμβανομένης και βιοψία του προστάτη αρνητικό (Bx Αρν, n = 39), η βιοψία του προστάτη θετικό (Bx Pos, n = 47 ), μετά από ριζική προστατεκτομή (μετα-RP, n = 37), un-βιοψία υγιή ίδιας ηλικίας ανδρών (Όχι Bx, n = 44), και νεαρά αρσενικά ελέγχους (Cont, n = 40). Η χρήση της ΕΕΥ εξετάστηκε επίσης ως πιθανή πλατφόρμα για να μη επεμβατικά διαφοροποιούν Bx Pos έναντι των ασθενών που Bx Αρν μέσω του εντοπισμού των γνωστών γονιδίων καρκίνου του προστάτη TMPRSS2:. ERG, BIRC5, ERG, PCA3 και TMPRSS2

Αποτελέσματα

Σε αυτή την τεχνική πιλοτική μελέτη του ουροποιητικού ΕΕΥ είχε ευαισθησία: 81% (13/16), ειδικότητα: 80% (4/5) και μια συνολική ακρίβεια: 81% (17/21) για την μη επεμβατική ανίχνευση του TMPRSS2: ERG έναντι RP ιστού. Το ποσοστό του TMPRSS2: ERG ανίχνευσης exoRNA βρέθηκε να αυξάνει με την ηλικία και το επίπεδο έκφρασης συσχετίζεται με την κατάσταση Bx Pos. χειριστή του δέκτη χαρακτηριστικό αναλύσεις έδειξαν ότι διάφορα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν Bx Pos από Bx ασθενείς Αρν χρησιμοποιώντας exoRNA απομονωθεί από ουρική ΕΕΥ: BIRC5 (AUC 0.674 (CI: 0,560 – 0,788), ERG (AUC 0.785 (CI: 0,680 – 0,890), PCA3 (AUC 0.681 (CI: 0,567 – 0,795), TMPRSS2: ERG (AUC 0.744 (CI: 0,600 – 0,888), και TMPRSS2 (AUC 0,637 (CI: 0,519 – 0,754)

Συμπέρασμα

Αυτή η πιλοτική μελέτη υποδηλώνει ότι η ακράτεια ΕΕΥ έχουν το δυναμικό να χρησιμοποιηθεί ως πλατφόρμα για να μη επεμβατικά διαφοροποιούν τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη με πολύ καλή ακρίβεια. οι μεγαλύτερες μελέτες για να επιβεβαιώσουν τη δυνατότητα για κλινική χρησιμότητα.

Παράθεση:.. Motamedinia P, Scott AN, Bate KL, Sadeghi Ν, Salazar G, Shapiro E, et al (2016) εξωσώματα ούρων για μη-επεμβατική αξιολόγηση της γονιδιακής έκφρασης και μεταλλάξεις του καρκίνου του προστάτη PLoS ONE 11 (5): e0154507 . doi: 10.1371 /journal.pone.0154507

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 6 Αυγούστου, 2015? Αποδεκτές: 14 Απριλίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 4η Μαΐου, 2016

Copyright: © 2016 Motamedinia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. J Lin έλαβε Doris Duke Φιλανθρωπικό Βραβείο Ιδρύματος. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από εξωσωμάτων Diagnostics, Inc. Το χρηματοδότη παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς ANS, KLB, GS, MJD, WDC, LMR, και είχε ένα επιπλέον ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, και την προετοιμασία του χειρογράφου. . Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα: ANS, KLB, GS, WDC, LMR, και MJD ήταν υπάλληλοι ή σύμβουλοι σε εξωσωμάτων Diagnostics, Inc κατά τη στιγμή της η μελέτη. WDC είναι μέτοχος σε εξωσωμάτων Diagnostics, Inc. LMR έχει δικαιώματα προαίρεσης αγοράς μετοχών σε εξωσωμάτων Diagnostics, Inc. Αυτά τα αντικρουόμενα συμφέροντα δεν επηρεάζουν την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

τα εξωσώματα και μικροκυστίδια είναι κυστίδια λιπιδική διπλοστοιβάδα (συνήθως 30-200 nm σε διάμετρο). Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού, εξωσώματα και μικροκυστίδια (αναφέρονται συλλογικά στο παρόν ως εξωκυτταρικό κυστίδια (EV)) ενθυλακώνουν ένα τμήμα του κυτταροπλάσματος μητρικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών μεμβράνης, κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών [1] και νουκλεϊκών οξέων (κυρίως του RNA που αναφέρεται εδώ ως exoRNA) [2, 3]. Οι ΕΕΥ στη συνέχεια απελευθερώνεται από τα κύτταρα και μπορεί να συγκομισθεί από Biofluids συμπεριλαμβανομένου του αίματος και των ούρων. Μέχρι σήμερα έχουν υπάρξει μερικές σημαντικές μελέτες για να κατανοήσουν τις δυνατότητες διαγνωστική χρήση της ΕΕΥ. Καρκίνου

προστάτη αποτελεί την πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες [4] . Ορός ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης για τον καρκίνο του προστάτη, αν και αυτή η στρατηγική έχει επικριθεί λόγω της χαμηλής ευαισθησίας και της ειδικότητας του [5]. Schröder

et al

[6] διαπίστωσε ότι 1055 οι άνδρες θα πρέπει να ελέγχονται και 37 άνδρες θα πρέπει να αντιμετωπιστούν, προκειμένου να σώσει μια ζωή. Αυτή η υπερ-διάγνωση και υπερθεραπεία οδηγεί σε μειωμένη ποιότητα ζωής και την αύξηση του κόστους της υγειονομικής περίθαλψης, υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για πιο ευαίσθητες και ειδικές διαγνωστικές στρατηγικές [7,8]. Το 2009, αναφέρθηκε ότι τα γονίδια του προστάτη που σχετίζονται μπορούσε να ανιχνευθεί με επιτυχία στο ουροποιητικό ΕΕΥ [9]. Έχουμε πρόσφατα προηγμένες μεθόδους i) να απομονώσουν γρήγορα άθικτο ΕΕΥ αφαίρεση εξάρτηση από υπερφυγοκέντρηση και τη δυνατότητα προσαρμογής στο εργαστήριο ρύθμιση κλινικών και ii) να αποκτήσει υψηλή ακεραιότητα exoRNA σημαντικό για την αξιόπιστη ανάλυση μεταγραφική [10,11].

Το 2005, , Tomlins

et al

. [12] ανέφεραν την ταυτοποίηση του ειδικού προστατικού TMPRSS2: μετάλλαξη σύντηξης ERG μεταξύ ανδρογόνων οδηγείται γονίδιο διαμεμβρανικού σερίνης πρωτεάσης 2 (TMPRSS2) και το ογκογονίδιο Ets Σχετικές Gene (ERG). Η πιο κοινή εκδήλωση της σύντηξης (TMPRSS2 εξώνιο 1 με το εξώνιο 4 ERG) έχει αναφερθεί ως έχον συχνότητα μεταξύ 20% -80% στον καρκίνο του προστάτη [13,14]. κατάσταση Fusion έχει εξεταστεί μέσω διαφόρων τεχνικών, συμπεριλαμβανομένων φθορισμού

in situ

υβριδισμός (FISH) και RT-PCR [15]. Ένα άλλο γονίδιο που εξετάστηκαν συνήθως στον καρκίνο του προστάτη είναι PCA3, αρχικά ονομάστηκε Διαφορική Εμφάνιση κωδικός 3 (DD3), PCA3 είναι ένας μη-κωδικοποίησης γονίδιο υψηλής έκφρασης σε καρκίνο του προστάτη [16]. Άλλα γονίδια που έχουν ενοχοποιηθεί στον καρκίνο του προστάτη περιλαμβάνουν βακουλοϊού επανάληψη ΙΑΡ που περιέχει 5 (BIRC5), επίσης γνωστή ως survivin [17] και ERG [18]. Καλλικρεΐνη 3 (KLK3), επίσης γνωστό ότι κωδικοποιεί PSA [19], είναι ένα γονίδιο που σχετίζονται προστάτη των οποίων τα επίπεδα mRNA έχουν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί για την τυποποίηση της γονιδιακής έκφρασης σε ουρική ιζήματα [20].

Προηγούμενες μελέτες που εξετάζουν γονίδιο δείκτης του προστάτη έκφραση στα ούρα απαιτούσαν μασάζ του προστάτη να αποκτήσουν αρκετά κύτταρα για την ανάλυση του RNA. Οι ιδιαιτερότητες του μασάζ ποικίλουν ευρέως μεταξύ των μελετών, από την εφαρμογή του ήπιου δακτυλική πίεση προς τα πλευρικά λοβούς να σταθερή πίεση καθ ‘όλη τη αδένα [20-26]. Τέτοιοι χειρισμοί μπορεί να οδηγήσει σε δυσφορία του ασθενούς και μεταβλητότητας μεταξύ των πάροχο. Επιπλέον, η απαιτούμενη μασάζ προστάτη πριν από τη συλλογή των ούρων αναθέτει μια άμεση αλληλεπίδραση με ένα γιατρό μέσω μιας επίσκεψης στο ιατρείο πριν από κάθε συλλογή δειγμάτων, με αποτέλεσμα την αύξηση του κόστους. Η τρέχουσα πιλοτική μελέτη εξετάζει την πιθανή διαγνωστική χρησιμότητα της ΕΕΥ σε ένα τυχαίο δείγμα ούρων που λαμβάνονται χωρίς προηγούμενη μασάζ του προστάτη. Χρησιμοποιούμε την ανίχνευση του ειδικού προστατικού συμβάν γονιδιακής σύντηξης (TMPRSS2: ERG) σε ουρική ΕΕΥ πριν από ριζική προστατεκτομή (RP) σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστό από τα χειρουργικά δείγμα για να εξετάσει την ικανότητα της ουροδόχου ΕΕΥ να αντανακλούν την έκφραση ιστού. Έχουμε εξετάσει περαιτέρω τη χρήση των ΕΕΥ ως πλατφόρμα για να μη επεμβατικά διαφοροποιούν τους άνδρες με καρκίνο του προστάτη βιοψία αποδεδειγμένη (Βχ Pos) από εκείνα με αρνητικές βιοψίες προστάτη (Βχ Neg) χρησιμοποιώντας περιγράφηκε προηγουμένως γονιδίων που εμπλέκονται στον καρκίνο του προστάτη.

υλικά και Μέθοδοι

Δείγμα

προμηθειών

Το Institutional Review Board του Πανεπιστημίου Κολούμπια ενέκρινε την εν λόγω μελέτη. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για τα δείγματα που συλλέγονται. Τυχαία δείγματα ούρων συλλέγονται χωρίς μασάζ του προστάτη, ελήφθησαν από 207 άνδρες ομαδοποιούνται σε: βιοψίας αρνητικό (Βχ Neg, n = 39), βιοψία θετική (ΒΧ Pos, n = 47), μετα-ριζική προστατεκτομή χωρίς απόδειξη απομένουν νόσου (μετα -RP, n = 37), αντίστοιχης ηλικίας άνδρες (δεν υπάρχει ιστορικό καρκίνου του προστάτη) (δεν Bx, n = 44) και των υγιών μαρτύρων (άνδρες & lt? 35 ετών) (Cont, n = 40). Δείγματα ούρων αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C μέχρι τη χρήση. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ομάδα Bx Αρν περιελάμβανε ασθενείς με υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία του προστάτη (HGPIN) και /ή άτυπα πολλαπλασιασμό μικρών κυψελωτά (ASAP) για βιοψία. Όλα τα δείγματα ούρων που προβλέπονται για ανάλυση διαδοχικά και με τυφλό τρόπο. Η ριζική προστατεκτομή ιστός ελήφθη από 21 ασθενείς για τους οποίους τα δείγματα ταιριάζουν ούρων συλλέχθηκαν πριν από RP ήταν διαθέσιμα (n = 21). Τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη RP ιστός κόπηκε στα 5 μm και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο Τμήματος Παθολογίας. Ο ιστός στη συνέχεια καταψύχθηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

ούρων επεξεργασία του δείγματος

υποβλήθηκαν σε επεξεργασία

Τα δείγματα ούρων, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10] χρησιμοποιώντας 20 mL δείγματα ούρων. Ένα 0,8 μm φίλτρο (Nalgene, ΝΥ) χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση ολόκληρα κύτταρα και τα κυτταρικά θραύσματα. Μικροκυστίδια /εξωσώματα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας συμπυκνωτή διήθησης 100k MWCO (Millipore, ΜΑ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (10). Μετά την προσθήκη του δείγματος ούρων, ο συμπυκνωτής διήθηση φυγοκεντρήθηκε στα 4.500 χ

g

για 5 λεπτά και το διήθημα απορρίπτεται και το συγκρατούμενο διατηρούνται. Το κατακράτημα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε 10 ml PBS πλένουμε και δύο 15ml PBS πλύσεις που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 4500 χ

g

για 5 λεπτά μετά την προσθήκη του κάθε πλύση PBS. 4 μΐ RNasin (Promega, WI) προστέθηκε στο απομονωμένο ΕΕΥ πριν από την εκχύλιση του RNA για να απομακρυνθεί περαιτέρω οποιαδήποτε δραστηριότητα ριβονουκλεάσης. exoRNA απομονώθηκε από το πλυμένο κλάσμα EV χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy PLUS (Qiagen, MD) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, η οποία χρησιμοποιεί μια στήλη σπιν DNA για την απομάκρυνση του γενωμικού DNA (gDNA) από το δείγμα.

Tissue επεξεργασία

οι ασθενείς με προ-ριζική προστατεκτομή ούρα επιλέχθηκαν τυχαία για να εξετάσει τη συμφωνία μεταξύ TMPRSS2: ERG ανίχνευσης στα ούρα και την ανίχνευση στον ιστό. RP ιστός επιλέχθηκε έτσι ώστε να μπορεί να αναλυθεί σε βάθος ανάλυση των πολλαπλών εστιών όγκου και φυσιολογικό ιστό περιοχές. Φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) ιστό από εστίες όγκου και κανονικές περιοχές του προστάτη ήταν χωρισμένο σε 5 μm και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες. Συνολικά 4-6 διαφάνειες από κάθε εστία του όγκου ή της κανονικής περιοχής συντάχθηκαν και νουκλεϊνικά οξέα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ιστού QIAamp DNA FFPE (Qiagen, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τομές ιστών αποξέστηκαν σε σωλήνα Eppendorf σε ένα περιβάλλον χωρίς RNase. Η αποπαραφίνωση τομές ιστών, 1.5 mL Ιστολογία Grade ξυλόλιο (VWR International, ΡΑ) προστέθηκε σε τμήματα, σωλήνες ήταν συνοπτικά στροβιλίστηκαν και στροβιλίστηκε στις 20,000 χ g για δύο λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε με πιπέτα. Τα δείγματα στροβιλίζονται παρομοίως και περιστράφηκαν μετά την προσθήκη 1,5 mL, τότε 1 mL από 100% αιθανόλη (Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Sciences, ΡΑ). Οι σβώλοι ξηραίνονται πλήρως με επώαση uncapped σωλήνες στους 37 ° C για 20 λεπτά. 180 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος ALT προστέθηκε απευθείας στα σφαιρίδια, τα οποία είχαν πλήρως ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία συσκευή ιστο-ρήξη. 20 μι πρωτεϊνάση Κ προστέθηκαν και αναμίχθηκαν με τα δείγματα, τα οποία στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα στους 56 ° C, κατόπιν 1 ώρα στους 90 ° C. Οι σωλήνες εν συντομία περιστρέφεται και δείγματα μεταφέρθηκαν σε στήλες QIAamp MinElute σε 2 σωληνάρια συλλογής mL. Μετά 1 λεπτού 6000 × g σπιν, η ροή μέσω απορρίφθηκαν και στήλες μεταφέρθηκαν σε φρέσκους σωλήνες. Στήλες περιστράφηκαν δύο φορές στα 6000 × g για 1 λεπτό μετά την προσθήκη 500 μL AW1 Buffer και 500 μL AW2 Buffer. Για να αφαιρέσετε όλα τα αιθανόλη, στήλες περιστράφηκαν σε & gt? 20.000 × g για 3 λεπτά. Τα νουκλεϊκά οξέα εκλούστηκαν από τις στήλες σε 35 μL του Ρυθμιστικού ΑΤΕ, η συγκέντρωση του οποίου μετρήθηκε με Nanodrop Φασματοφωτόμετρο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή όπου ρυθμιστικού ΑΤΕ (Qiagen, CA) χρησιμοποιήθηκε σαν τυφλό.

ανάλυση PCR

RNA από αμφότερα τα δείγματα ιστού και ούρων υποβλήθηκαν σε αντίστροφη αντίδραση τρανσκριπτάσης (RT) χρησιμοποιώντας το κιτ Vilo RT (Invitrogen, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγμα προ-ενίσχυσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας το TaqMan

® προενισχυτή Κύριο Μείγμα Kit (Life Technologies, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Προ-ενισχυμένο cDNA αραιώθηκε 1:20 σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ. PCR πραγματοποιήθηκε με 5 μL αραιωμένου, προ-ενισχυμένο cDNA για την ανίχνευση TMPRSS2: ERG (Life Technologies, ΝΥ) (Hs03063375_ft, 106bp), KLK3 (PSA) (Hs03063374_m1, 64bp), ERG (Hs01554635_m1, 104bp), BIRC5 (Hs00153353_m1, 93 ζβ) και PCA3 (Hs01371938_m1, 80bp), TMPRSS2 (Hs00237175_m1) σε ένα μηχάνημα StepOne Plus (Applied Biosystems, CA). Για την έκφραση του γονιδίου exoRNA, τα γονίδια που ενδιαφέρουν ομαλοποιήθηκαν να exoRNA KLK3 (C

t γονίδιο που μας ενδιαφέρει – C

t KLK3). Για τα γονίδια έκφρασης του γονιδίου ενδιαφέροντος του ιστού κανονικοποιούνται σε GAPDH (C

t γονίδιο που μας ενδιαφέρει – C

t GAPDH).

Δεδομένα

Ανάλυση

Το πρόγραμμα DataAssist Έκδοση 2.0 (Applied Biosystems, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων για να προσδιοριστεί σχετική ποσοτικοποίηση (RQ) της γονιδιακής έκφρασης και η σημασία της έκφρασης (

P

-τιμή). Η σύγκριση των κλινικών και των ασθενών χαρακτηριστικά, καθώς και οικόπεδα κουτί και την ανάλυση ROC πραγματοποιήθηκε με τη χρήση STATA IC 12.1 (StataCorp, College Station, TX).

Η στατιστική ανάλυση

t-test του Student, μονόδρομη αναλύσεις ΑΝΟνΑ και ROC χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή για στατιστική σημαντικότητα.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Για να προσδιοριστεί η ακρίβεια με την οποία exoRNA απομονωθεί από ουρική ΕΕΥ αντανακλά mRNA προστατικό ιστό, αναλύσαμε TMPRSS2:. Έκφραση ERG στην RP ιστού από τους 21 ασθενείς και σε σύγκριση με το που ταιριάζουν δείγματα ούρων που λαμβάνονται πριν από την RP. Η ριζική προστατεκτομή ιστός χρησιμοποιήθηκε (σε αντίθεση με βιοψία ιστού) έτσι ώστε μια ακριβέστερη ανάλυση θα μπορούσε να γίνει από TMPRSS2: ERG έκφραση σε ολόκληρο τον προστάτη. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των περιοχών του προστάτη εκχυλίζονται για την ανάλυση (α ‘χάρτης ιστός ») του ιστού προστατεκτομή, η παθολογική κατάσταση κάθε περιοχής (όγκου ή καλοήθης) και το TMPRSS2: ERG κατάσταση κάθε περιοχής εξάγεται φαίνεται στο σχήμα 1 αποδεικνύει το εκτεταμένη ποσότητα του ιστού που αναλύθηκαν (βλ S1 σχήμα για το «χάρτες ιστό» όλων των 21 ασθενείς). Η απομόνωση του mRNA από FFPE ιστούς επιβεβαιώθηκε μέσω της ανάλυσης qPCR αμπλικονίων με και χωρίς προηγούμενη αντίδραση RT (βλέπε Σχ S2). Σε ορισμένες περιπτώσεις, TMPRSS2: ERG έκφραση ανιχνεύθηκε σε «καλοήθης» περιοχές ιστού. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των πολύ μικρών εστιών όγκου σε επόμενα τμήματα του ιστού εξάγεται για ανάλυση RNA κάτω από ότι αρχικά αναλύονται από τον παθολόγο (Βλέπε S3 Εικ) και μπορεί να εξηγήσει γιατί μερικοί «καλοήθης» περιοχές απροσδόκητα έδειξαν θετικά TMPRSS2: έκφραση ERG . Ένας ασθενής θεωρήθηκε TMPRSS2: ERG θετικό αν TMPRSS2: ERG ανιχνεύθηκε σε οποιοδήποτε από τα τμήματα του ιστού προστατεκτομή με τη χρήση RT-qPCR. Η ανάλυση αυτή σε σύγκριση με TMPRSS2: ERG έκφραση στο ουροποιητικό ΕΕΥ χρησιμοποιώντας την ίδια αντίδραση RT-qPCR και αναφέρονται στον Πίνακα 1. Η ανάλυση της ανίχνευσης του TMPRSS2: ERG στον ιστό σε σχέση με ανίχνευση στα ούρα ΕΕΥ έδειξαν μια πολύ καλή συσχέτιση με την ευαισθησία της 81% (13/16), η ειδικότητα 80% (4/5), 93% PPV, NPV 57% και συνολική ακρίβεια του 81% (17/21) (βλέπε πίνακα 2). Για να προσδιορίσετε το λόγο της έκφρασης στο ουροποιητικό ΕΕΥ δεν αντικατοπτρίζει πάντα την έκφραση ιστού, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης ιστού (σχετική ποσοτικοποίηση (RQ)) του TMPRSS2: ERG για τους ασθενείς με ανιχνεύσιμα ουροποιητικού EV TMPRSS2: έκφραση ERG σε σχέση με τους ασθενείς με μη ανιχνεύσιμο ουροποιητικού EV TMPRSS2 : έκφραση ERG. Αν και περιορισμένη σε μέγεθος δείγματος με μόνο 3 TMPRSS2: ERG θετικά δείγματα ιστού είναι TMPRSS2: ERG αρνητικά στα ούρα exoRNA, έναντι 13 που είχε ακριβή συσχετισμό με θετική έκφραση τόσο των ιστών και των ουροφόρων ΕΕΥ, τα στοιχεία έδειξαν ότι TMPRSS2: έκφραση ERG στον ιστό του όγκου ήταν ~ 98 φορές μεγαλύτερη (

P

= 0,009) σε ασθενείς με ανιχνεύσιμα ουροποιητικού exoRNA TMPRSS2: ERG έκφραση. Σε μια άλλη περίπτωση, TMPRSS2:. ERG εντοπίστηκε στο ουροποιητικό exoRNA αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμη στον περιορισμένο διαθέσιμο για την ανάλυση των ιστών (βλέπε Πίνακα 1, ασθενής 10)

Εκπρόσωπος κινουμένων σχεδίων που δείχνει την επιλογή της καλοήθους (μπλε) και του καρκίνου (ροζ) περιοχές από ριζική προστατεκτομή. Ο όγκος και η καλοήθης περιοχές εξετάστηκαν για TMPRSS2: ERG έκφραση του mRNA (Κόκκινο «+» δείχνει θετικός TMPRSS2: ERG έκφρασης, Blue ‘-‘ υποδηλώνει καμία TMPRSS2: έκφραση ERG). Τ: E-TMPRSS2:. ERG, A-πρόσθιο, P-οπίσθια, L-αριστερά, R-δεξιά

Η

Η

Για να εξετάσει περαιτέρω τη χρήση της ΕΕΥ για την ανίχνευση TMPRSS2: έκφραση ERG, τυχαία δείγματα ούρων συλλέχθηκαν από 207 άνδρες κατηγοριοποιήθηκαν σε 5 ομάδες: διορθικό υπερηχογράφημα (TRUS) βιοψία του προστάτη αρνητικό (Bx Αρν, n = 39), TRUS βιοψία θετική (Bx Pos, n = 47), μετά από ριζική προστατεκτομή ( μετα-RP, n = 37), αντίστοιχης ηλικίας άνδρες που δεν υποβάλλονται σε βιοψία (αριθ Bx, n = 44) και ελέγχων (άνδρες ηλικίας κάτω των 35 ετών? Cont, n = 40). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Δεν υπήρχε διαφορά στη μέση ηλικία, εκτός από τα αρσενικά μάρτυρες (

P

& lt? 0,05). PSA ορού μόνο σημαντικά μειωμένη στην ομάδα μετα-RP (

P

& lt? 0.001) συνάδει με την αφαίρεση του προστάτη

Η

Η συχνότητα του TMPRSS2: ERG έκφρασης (Σχήμα 2α) ήταν. υψηλότερη στην ομάδα Bx Pos με το 66% να εκφράζει TMPRSS2: ERG συνάδει με προηγούμενα ευρήματα [12-14]. Είναι ενδιαφέρον, το 44% των ασθενών Bx Αρν βρέθηκαν να εκφράζουν TMPRSS2: ERG. ασθενείς μετά από RP είχε καμία TMPRSS2: ERG έκφραση συνεπής με την ειδικού προστατικού έκφραση του γονιδίου, η οποία χάνεται κατά την αφαίρεση του προστάτη [12]. Μόνο το 5% των ανδρών ελέγχου (& lt? 35 ετών) εξέφρασε TMPRSS2: ERG σε αντίθεση με το 41% ​​στην «ίδιας ηλικίας» ελέγχων Όχι Bx (άνδρες της ίδιας ηλικίας με τις ομάδες Bx Pos και Bx Αρν, αλλά που δεν έχουν ένα ένδειξη για βιοψία του προστάτη). Εξετάσαμε περαιτέρω το επίπεδο της TMPRSS2: ERG έκφρασης από RQ του TMPRSS2: ERG σε όλες τις ομάδες (Σχήμα 2β). TMPRSS2: ERG έκφραση ήταν υψηλότερη στην ομάδα Bx Pos (

P

= 0,013), σύμφωνα με την επιβεβαιωμένη παρουσία του καρκίνου (βλ S4 σχήμα για τη διανομή Θηκόγραμμα του δέλτα C

t). Ακολουθήσαμε επίσης ουροποιητικού TMPRSS2: ERG ανίχνευση σε ασθενείς προ και μετά-RP, όταν είναι διαθέσιμα. Αν και περιορισμένου μεγέθους του δείγματος, οι 3 ασθενείς που ήταν exoRNA TMPRSS2: ERG θετικός πριν RP βρέθηκαν να έχουν καμία exoRNA TMPRSS2: έκφραση ERG μετα-RP, υποδηλώνοντας ότι η TMPRSS2: ERG ανιχνεύθηκε σε αυτά τα ουροποιητικού ΗΟ ήταν πράγματι ειδικό προστατικό.

α) Ποσοστό του TMPRSS2: ERG ανίχνευσης στα ούρα ΕΕΥ. Επένδυση μπαρ-TMPRSS2: ERG θετική, στερεά μπαρ-όχι ΤΜΡΡδδ2: έκφραση ERG. Ποσοστό αναφέρεται σε TMPRSS2: ERG θετικούς ασθενείς. β) Η σχετική ποσοτικοποίηση (RQ) του TMPRSS2: ERG έκφρασης έναντι των ασθενών που Bx Αρν. TMPRSS2: ERG έκφραση τυποποιήθηκε σε KLK3 συνάδει με άλλες μελέτες βιοδεικτών προστάτη [20]. Βχ Αρν-βιοψία αρνητικό (n = 39), Βχ Pos-θετική βιοψία (n = 47), άνδρες Cont ελέγχου & lt? 35 ετών (n = 40), αριθ BX-όχι βιοψία (ηλικία συμφωνημένα ελέγχου) (n = 44), RP-ριζική προστατεκτομή (n = 37). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως RQ ± SEM.

Η

Για να προσδιορίσετε αν ουροποιητικού ΕΕΥ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει και άλλα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη ερευνήσαμε την διαφορική έκφραση του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG και TMPRSS2 στο Bx Pos έναντι των ασθενών Bx Αρν (Σχήμα 3α). Ανάλυση της RQ έδειξε ότι όλα τα γονίδια εκτός από AR ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς Bx Pos έναντι των ασθενών Bx Αρν (βλ S5 σχήμα για τη διανομή Θηκόγραμμα του δέλτα C

t). Ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ της ERG και TMPRSS2: έκφραση ERG (Σχήμα 3β) αποκάλυψε ότι υπήρχε μια ισχυρή τάση μεταξύ των δύο γονιδίων (R

2 = 0,826) σε συμφωνία με ουρική δεδομένων ιστού γεγονός που υποδηλώνει ότι η πιο κοινή σύντηξης κυττάρων και (TMPRSS2 (εξόνιο 1) με ERG (εξόνιο 4)) μπορούν να οδηγήσουν σε αυξημένη έκφραση ERG [12,18]. Η τάση αυτή δεν ήταν εμφανής όταν TMPRSS2: ERG έκφραση συσχετίστηκε με την έκφραση PCA3 (R

2 = 0,110) (Σχήμα 3γ). ROC αναλύσεις διεξήχθησαν επίσης για να προσδιοριστεί η ικανότητα αυτών των γονιδίων να διακρίνουν βιοψία κατάσταση (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG και TMPRSS2 ήταν σε θέση να διαφοροποιήσει Bx Pos από ασθενείς Bx Αρν (Πίνακας 4)

α) Η σχετική ποσοτικοποίηση (RQ) της γονιδιακής έκφρασης για να διαπιστωθεί αν τυχόν γονίδια. τα σημαντικά υψηλότερο εκφράζονται σε Bx Pos ασθενείς. AR (Bx Αρν n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Αρν n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Αρν n = 33, Bx Pos n = 41), PCA3 (Bx Αρν n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Αρν n = 17, Bx Pos n = 31) και TMPRSS2 (Bx Αρν n = 39, Bx Pos n = 45). Όλα τα γονίδια εκτός AR βρέθηκαν να έχουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε σύγκριση με τους ασθενείς Βχ Αρν. Στερεά μπαρ-Bx Αρν, με επένδυση μπαρ-Bx Pos. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως RQ ± SEM. β) Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του TMPRSS2: ERG και ERG προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δέλτα Ct κατά KLK3 στο Bx Pos (μαύρο) και Bx Αρν (γκρι) ασθενείς. γ) Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του TMPRSS2: ERG και PCA3 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δέλτα C

t κατά KLK3 στο Bx Pos (μαύρο) και Bx Αρν (γκρι) ασθενείς. δέλτα C

t = C

t γονίδιο που μας ενδιαφέρει – C

t KLK3

Η

Ατομική ROC καμπύλες για AR, BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2:. ERG και TMPRSS2. Τ: E-TMPRSS2: ERG. AR (Bx Αρν n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Αρν n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Αρν n = 33, Bx Pos n = 41), PCA3 (Bx Αρν n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Αρν n = 17, Bx Pos n = 31) και TMPRSS2 (Bx Αρν n = 39, Bx Pos n = 45)

Η

Συζήτηση

Ανάλυση του RNA στα ούρα έχει σημαντικές συνέπειες για την ανάπτυξη των μη επεμβατικές δοκιμές που εξετάζουν την έκφραση του γονιδίου διαφορικό και ανίχνευση μετάλλαξης. Παρά τις τεράστιες δυνατότητες ότι μη επεμβατική ανάλυση της υποκείμενης νόσου μπορεί να έχει στην καθοδήγηση έναν ιατρό, ένα βασικό περιορισμός στη χρήση των Biofluids είναι εάν αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε ιστό της μητρικής. Η ανάλυσή μας έχει χρησιμοποιήσει ουροποιητικού EV exoRNA για να διαπιστώσει αν είναι: 1) αντανακλαστικό της γονιδιακής έκφρασης ιστού, και 2) σε θέση να διαφοροποιήσει BxPos από ασθενείς BxNeg μη επεμβατικά. Λόγω του ~ 25% εγγενείς ψευδώς αρνητικό ποσοστό του TRUS καθοδηγούμενη βιοψία του προστάτη στην ανίχνευση του καρκίνου και την περιορισμένη ποσότητα του ιστού που ερωτήθηκαν κατά τη διάρκεια της βιοψίας, επιλέξαμε να αξιοποιήσει ασθενείς που έχουν προγραμματιστεί να υποβληθούν σε RP, προκειμένου να συγκρίνουν τη συμφωνία μεταξύ TMPRSS2: ανίχνευση ERG mRNA στον ιστό έναντι στην ΕΕΥ ούρα. TMPRSS: ανίχνευση ERG ήταν ειδικά επιλεγεί για τον καθορισμό αυτής της συσχέτισης λόγω της γνωστής ειδικότητας της στον ιστό του προστάτη. Ακράτεια ανάλυση exoRNA ήταν σε θέση να μη επεμβατική ανίχνευση της έκφρασης ιστού του TMPRSS2: ERG mRNA με πολύ καλή ακρίβεια και μια συνολική συμφωνία του 80%. Σε ορισμένες περιπτώσεις, TMPRSS2: ERG έκφραση ανιχνεύθηκε σε «καλοήθης» περιοχές ιστού. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των πολύ μικρών εστιών όγκου σε επόμενα τμήματα του ιστού εξάγεται για ανάλυση RNA κάτω από ότι αρχικά αναλύονται από τον παθολόγο (Βλέπε Εικ S3). Αυτό είναι ένα εγγενές πρόβλημα με αυτό το είδος της ανάλυσης RP ιστού, αλλά μπορεί να εξηγήσει γιατί μερικοί «καλοήθης» περιοχές απροσδόκητα έδειξαν θετικά TMPRSS2:. Έκφραση ERG

Τρεις από τους 21 ασθενείς είχαν ανιχνεύσιμη TMPRSS2: ERG έκφρασης σε ιστό αλλά μη ανιχνεύσιμα TMPRSS2: ERG στις ουροποιητικού ΕΕΥ. Κατά την περαιτέρω ανάλυση των δεδομένων μπορεί να υποστηριχθεί ότι η έκφραση χαμηλού επιπέδου στον ιστό δεν μπορεί να ανιχνευθεί σε ΕΕΥ και μπορεί να θεωρηθεί ως πιθανός περιορισμός. Ωστόσο, αυτό θα πρέπει να εξετάζεται με προσοχή καθώς υπήρχαν μόνο τρία τέτοια δείγματα διαθέσιμα για ανάλυση και μια μεγαλύτερη μελέτη θα πρέπει να διεξάγεται για να υποστηρίξει αυτό το συμπέρασμα

Σε μία περίπτωση, TMPRSS2:. ERG εντοπίστηκε στο ουροποιητικό ΗΟ αλλά απουσίαζε στον ιστό διαθέσιμες για ανάλυση. Δεδομένου ότι τα τμήματα ολόκληρο-mount προστάτη δεν ήταν διαθέσιμα για ανάλυση συνολικών αδένα, είναι πιθανό ότι ο ασθενής μπορεί να είχε μια TMPRSS2: ERG θετική εστίαση σε μια περιοχή ιστού διαθέσιμο για ανάλυση. Αυτό τονίζει το δυναμικό πλεονέκτημα της ουρικής ΕΕΥ, καθώς μπορεί να αντανακλούν μια μεγαλύτερη αναλογία του όγκου του προστάτη από ό, τι μπορούν να αποκτηθούν μέσω άλλων μεθόδων δειγματοληψίας, όπως η βιοψία.

Η ικανότητα να χρησιμοποιεί τυχαία δείγματα ούρων (συλλέγονται χωρίς μασάζ του προστάτη) μας επέτρεψε να αναλύσουν ένα ευρύ φάσμα θεμάτων, συμπεριλαμβανομένων των νέων, υγιείς άνδρες (& lt? 35 ετών) η οποία έδειξε, όπως αναμενόταν, ότι πολύ λίγοι είχαν ανιχνεύσιμα TMPRSS2: ERG επίπεδα (5% (2/40)). Αυτό ήταν σε αντίθεση με παλαιότερες άνδρες στην Βχ Pos (66%), Βχ Neg (44%) και αριθ Βχ (41%) ομάδες ασθενών. Αυτό υποδηλώνει ότι η πιθανότητα μιας TMPRSS2: εκδήλωση σύντηξης ERG που συμβαίνουν μπορεί να αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου (δηλαδή με την ηλικία), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές ότι συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του προστάτη επίσης αυξάνει με την ηλικία [27]. ποσοστό ανίχνευσης μας TMPRSS2: ERG μέσω exoRNA σε ασθενείς Bx Pos, ήταν στην κορυφή της σειράς για το ότι έχουν αναφερθεί στο παρελθόν για TMPRSS2: ERG ανίχνευση μέσω ανάλυσης του ουροποιητικού κυττάρων στον καρκίνο του προστάτη θετικούς ασθενείς που κυμαίνονταν 37-69% (22/32 (69%) [28], 10/15 (67%) [26], 8/19 (42%) [21], 56/138 (41%) [22], 29/78 (37%) [25 ], 9/13 (69%) [29]), με ποσοστά ανίχνευσης τόσο χαμηλά όσο 10/42 (24%), όταν δεν μασάζ του προστάτη πραγματοποιήθηκε πριν από τη συλλογή των ούρων [29] και 46/196 (24%), όταν ένα TMPRSS2 : ERG ανίχνευση αποκοπής & gt? εφαρμόστηκε 10 αντίτυπα [30]. Σε ασθενείς χωρίς καρκίνο του προστάτη (καθορίζουν μέσω αρνητική βιοψία), η ανίχνευση του TMPRSS2: ERG μέσω ανάλυσης του ουροποιητικού κυττάρων ήταν χαμηλότερη από ό, τι ποσοστό ανίχνευσης μας μέσω ανάλυσης EV και κυμάνθηκε 7-21% (2/30 (7%) [25], 4/30 (13%) [26], 4/24 (17%) [28], 20/96 (21%) [22] και τόσο χαμηλά όσο 6% χωρίς προηγούμενη μασάζ του προστάτη, 15/247 (6%) [29] Αν και υπήρχε ένας μεγάλος αριθμός Bx Αρν και αριθ Bx ασθενείς με ανιχνεύσιμη TMPRSS2:. συμβάν σύντηξης ERG στην παρούσα μελέτη μας, TMPRSS2: επίπεδο έκφρασης ERG (αναλύονται μέσω RQ) ήταν υψηλότερη στην ομάδα Bx Pos συνάδει με το . επιβεβαιωμένη παρουσία του καρκίνου του χαμηλού επιπέδου έκφραση στις ομάδες Bx Αρν και αριθ Bx μπορεί να αντιπροσωπεύει ψευδή μεταγραφές RNA και όχι μόλυνσης καθώς υπήρχε πλήρης απουσία TMPRSS2: ERG exoRNA (0% (0/40)) στο 40 μετά ασθενείς ριζική προστατεκτομή δοκιμάστηκαν. Η χρήση μιας έκφρασης cut-off, όπως αυτό που χρησιμοποιείται από Leyten κ.ά., [30] θα μπορούσε δυνητικά να επιτρέπει την διαφοροποίηση μεταξύ έκφραση χαμηλού επιπέδου πλαστές γονίδιο (όπως αυτό που φαίνεται στο Βχ Neg και ίδιας ηλικίας Κανένας ασθενής δεν Βχ) και σταθερή έκφραση του γονιδίου που παρατηρείται σε ασθενείς Βχ Pos. Κάποιος μπορεί να σκεφτεί μόνο ως προς το γιατί η ανάλυση EV ανιχνεύει πιο θετική TMPRSS2: ERG εκφράζουν οι ασθενείς από την ανάλυση του ουροποιητικού κυττάρων ιδιαίτερα στις ομάδες Όχι Bx και Bx Αρν. Μια πρόταση μπορεί να είναι επειδή ΕΕΥ αντιπροσωπεύουν μια μεγαλύτερη έρευνα του προστάτη όπως αυτά συστατικά απελευθερώνονται από δυνητικά όλα τα κύτταρα. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την ανάλυση της ουρικής κυττάρων που προέρχονται προστάτη που έχουν αναποδογυριστεί με πολύ βραδύτερο ρυθμό. Έτσι, η ανάλυση της ΕΕΥ σε Bx Αρν (και όχι Βχ) ομάδες μπορεί να δώσει μια μεγαλύτερη ευκαιρία για τον εντοπισμό ψευδή TMPRSS2: ERG διαβάζει σε σύγκριση με την ανάλυση των ούρων των κυττάρων του προστάτη

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ERG εξετάστηκαν επίσης να καθοριστεί εάν. ένας συσχετισμός μεταξύ exoRNA έκφραση της TMPRSS2: ERG και ERG ήταν εμφανής. Ακράτεια αποτελέσματα EV υποστήριξε σθεναρά τις προηγούμενες εκθέσεις ότι η αυξημένη έκφραση ERG μπορεί να σχετίζεται με το TMPRSS2: εκδήλωση σύντηξης ERG [12,18,31]. Ανάλυση της έκφρασης ERG βρέθηκε να έχουν καλύτερες επιδόσεις από την ανάλυση του TMPRSS2: ERG έκφρασης στη διαφοροποίηση Bx Pos από ασθενείς Bx Αρν. Αυτό μπορεί να οφείλεται TMPRSS2: ERG ανιχνεύεται με δοκιμασία μας μπορούν να αντιπροσωπεύουν μόνο ένα κλάσμα του που σχετίζονται με ERG γεγονότα σύντηξης [18]. Έτσι, η ανάλυση μας από μόνη της έκφρασης ERG μπορεί δυνητικά να πάρει πρόσθετα γεγονότα σύντηξης ERG πέρα ​​ανιχνεύεται από TMPRSS2 μας: δοκιμασία ERG κάνει ERG μόνη της μια πιο ευαίσθητος δείκτης στη μελέτη μας

Για να εξεταστεί η χρήση των ΕΕΥ ως πλατφόρμα. να μη διεισδυτικά διαφοροποιούν Βχ Pos και Βχ Αρν ασθενείς χωρίς μασάζ του προστάτη, αναλύσαμε την ικανότητα των άλλων γονιδίων προηγουμένως εμπλακεί στον καρκίνο του προστάτη να διαφοροποιηθούν Βχ Pos και Βχ Αρν ασθενείς που χρησιμοποιούν το ουροποιητικό πλατφόρμα EV. Σχετική ανάλυση ποσοτικοποίηση έδειξε ότι exoRNA για BIRC5, ERG, PCA3 και TMPRSS2: ERG τυποποιηθεί σε KLK3, διαφοροποιημένη Bx Pos από ασθενείς Bx Αρν. έκφραση AR ήταν σε θέση να διαφοροποιήσει αυτές τις ομάδες. Η τάση αυτή αντικατοπτρίζεται στην ανάλυση ROC αυτών των γονιδίων. Είναι δύσκολο να υποθέσουμε γιατί τεκμηριωμένη αλλαγές στην έκφραση AR στον καρκίνο δεν αντικατοπτρίζεται στη μελέτη exoRNA μας εκτός από το ότι ίσως AR έκφραση δεν ρυθμίζεται σε επίπεδο mRNA, αλλά όχι στο επίπεδο της πρωτεΐνης.

Αυτή η πιλοτική μελέτη αποδεικνύει η πιθανή χρησιμότητα exoRNA να εξετάσει την έκφραση του γονιδίου του προστάτη σχετίζονται απομονώνεται από ένα ενιαίο, τυχαίο δείγμα ούρων. Συγκεκριμένα, η ανάλυση EV έχει μια ακρίβεια ~ 80% για την ανίχνευση TMPRSS2: ERG μετάλλαξης, υποθέτοντας ότι δεν υπάρχουν ψευδώς αρνητικά στην ρίζα δείγματα προστατεκτομή, και επηρεάζεται από το επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης σε ιστό. Η ικανότητα να διαχωρίζουν Bx Pos από ασθενείς Bx Αρν χρησιμοποιώντας μια μη επεμβατική δείγμα ούρων χωρίς τη χρήση του ένα μασάζ προστάτη Αποδείχθηκε επίσης, και υποστηρίζει τη μελλοντική ανάπτυξη του ουροποιητικού διαγνωστική εξέταση πιθανών EV βάση για τον καρκίνο του προστάτη. Μεγαλύτερες ομάδες απαιτούνται τώρα για να επιβεβαιώσει αυτές τις μελέτες. Τέλος, λόγω της πανταχού παρούσα απελευθέρωση των ΕΕΥ από τα κύτταρα, είναι πιθανό ότι η ακράτεια ΕΕΥ μπορεί να γίνει μια νέα, μη επεμβατική πλατφόρμα για να εξετάσει άλλα όργανα του ουρογεννητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των νεφρών και της ουροδόχου κύστης.

Υποστήριξη Πληροφοριών

S1 Εικ. Γελοιογραφία του προστάτη τμήματα ιστού που λαμβάνεται για συγκριτική ανάλυση των TMPRSS2:. ERG Gene Expression σε Tissue Versus ουροποιητικού exoRNA

Κινούμενα σχέδια δείχνουν καλοήθεις (μπλε) και του καρκίνου (ροζ) περιοχές από ριζική προστατεκτομή που επιλέχθηκαν για την εξαγωγή RNA και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης . Tumor και καλοήθεις περιοχές θετικά για TMPRSS2: ERG έκφραση υποδεικνύονται με ένα κόκκινο «+». Αρνητική TMPRSS2: ERG έκφραση υποδεικνύεται με ένα μπλε »-«. Μωβ «+» χρησιμοποιείται για να δείξει θετικά TMPRSS2: ERG έκφραση σε ένα ενοποιημένο δείγμα του ιστού. Τ: E-TMPRSS2: ERG, A-πρόσθιο, P-οπίσθια, L-αριστερά, R-δεξιά. «Επίπεδο» δείχνει την περιοχή του προστάτη που συμμετείχαν στην έρευνα για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης (ουρήθρα για να σπερματοδόχες κύστεις)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154507.s001

(TIFF)

S2 Εικ. Η ανίχνευση του mRNA αντιγράφων σε FFPE Tissue. Ανάλυση

Agilent BioAnalyzer τσιπ DNA αμπλικονίων που παράγονται μέσω PCR σε καμία ελέγχου χωρίς πρότυπο (NTC) και τα δείγματα με αντίστροφη αντίδραση τρανσκριπτάσης (RT) και χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση (αριθ RT) αντίδραση. δείγματα του «Όχι RT ‘απέτυχε να δημιουργήσει αμπλικόνια σύμφωνο με τους ειδικούς εκκινητές RNA και ανιχνευτής για κάθε γονίδιο. Τα δείγματα που υποβάλλονται σε αντίδραση RT παράγονται αμπλικόνια παρόμοιου μεγέθους με το ΑΒΙ αναφερθεί μέγεθος αμπλικονίου. NTC απέτυχαν να παράγουν προϊόντα ενίσχυσης υποδηλώνει καμία μόλυνση.