Αφηρημένο

Το αντικείμενο της μελέτης είναι να προσδιορίσει Ν-γλυκάνης αλλαγές χαρακτηριστικών που συνδέονται με καρκίνο του στομάχου και να εξερευνήσετε τον αντίκτυπο των βασικών-φουκοσυλίωσης για τη βιολογική συμπεριφορά των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Ένα σύνολο 244 ατόμων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του στομάχου, γαστρικό έλκος και υγιή έλεγχο προσλήφθηκαν. Ν-γλυκάνης προφίλ από πρωτεΐνες ορού και ολικής στο γαστρικό ιστούς αναλύθηκε με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση φθοροφόρο υποβοηθούμενη sequencer υποβοηθούμενη DNA. Η αφθονία του συνολικού πυρήνα φουκοζυλιωμένη κατάλοιπα και η έκφραση των ενζύμων που εμπλέκονται στην πυρήνα φουκοσυλίωσης αναλύθηκαν με λεκτίνη κηλίδα, ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, στύπωμα Western, χρώση ανοσοϊστοχημική χρώση και λεκτίνη-ιστοχημική. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια του μεταφορέα ΟϋΡ-φουκόζη και α-1,6-φουκοζυλτρανσφεράση (Fut8) κατασκευάστηκαν και επιμολύνονται σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου BGC-823 και SGC-7901. CCK-8 και δοκιμασία επούλωσης τραυμάτων χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η λειτουργική επίδραση της διαφοροποίησης πυρήνα φουκοσυλίωσης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Ν-γλυκάνης προφίλ Χαρακτηριστικές ορού βρέθηκαν σε γαστρικό καρκίνο. Σε σύγκριση με τον υγιή έλεγχο, ένα trianntenary δομή αφθονία, η κορυφή 9 (NA3Fb), αυξήθηκε σημαντικά σε γαστρικό καρκίνο, ενώ η συνολική πληθώρα πυρήνα-φουκοζυλιωμένη υπολείμματα (sumfuc) μειώθηκε. Πυρήνας-φουκοσυλιωμένες δομές, peak6 (NA2F) και peak7 (NA2FB) είχαν αποβιώσει στο γαστρικό ιστούς όγκων σε σύγκριση με το ότι σε γειτονικούς ιστούς μη-όγκου. Σταθερά, φακός culinaris αγλουτινίνη (LCA) -σύνδεση πρωτεΐνες μειώθηκαν σημαντικά σε ορούς του γαστρικού καρκίνου, και το επίπεδο πρωτεΐνης Fut8 μειώθηκε σημαντικά σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με εκείνη σε παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς. Προς τα πάνω ρύθμιση του ΑΕΠ-Tr και Fut8 θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό, αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στη μετανάστευση των BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα. Πυρήνας-φουκοσυλίωσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του στομάχου. Προς τα πάνω ρύθμιση του πυρήνα φουκοσυλίωσης θα μπορούσε να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Zhao Υ-Ρ, Xu Χ-Υ, Fang Μ, Wang Η, Μπορείτε Q, Yi C-H, et al. (2014) Μειωμένη Πυρήνας-φουκοσυλίωσης Συμβάλλει σε κακοήθεια σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 του Αύγ 2013? Αποδεκτές: 17 Μάρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81201697, 81101639 και Νο 81271925)? Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (Αρ 10ZR1439100 και Νο 11JC1416400) .Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το γαστρικό καρκίνο (GC) είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. – [3], ιδιαίτερα διαδεδομένη σε πολλές χώρες της Ασίας, ιδίως στην Κίνα [4]. Πρωτεΐνη γλυκοζυλίωση είναι μια από τις πιο κοινές μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις που γίνονται με τις πρωτεΐνες του [5]. Γλυκανών μπορεί να συνδεθεί με τις πρωτεΐνες, είτε μέσω μιας ομάδας αμίδης (Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση) ή μία ομάδα υδροξυλίου (Ο-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση), οι οποίες εμφανίζονται μέσω διαφόρων βιοσυνθετικών οδών και ενδεχομένως να έχουν ανεξάρτητες λειτουργίες [6]. Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες όπως προσκόλληση κυττάρου, κυτταρική μετανάστευση, και μεταγωγή σήματος [7]. Ανώμαλη έκφραση του Ν-συνδεδεμένων γλυκοπρωτεϊνών έχει παρατηρηθεί σε διάφορες ασθένειες [8] – [10]. Κατά εις βάθος χαρακτηρισμός των Ν-συνδεδεμένων γλυκοπρωτεϊνών και μεταβολές γλυκοζυλίωσης σχετίζεται με τη νόσο, διάφορες μεθοδολογίες έχουν αναπτυχθεί. Σε προηγούμενη μελέτη μας, έχουμε εντοπίσει κάποιες Ν-γλυκάνης δεικτών σε heptatocellular καρκίνωμα (HCC) και καρκίνο του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας ένα τριχοειδή ηλεκτροφόρηση βάση που ονομάζεται DNA sequencer με τη βοήθεια φθοροφόρου υποβοηθούμενη τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (DSA-FACE) [11]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η α-1, 6-φουκοζυλτρανσφεράση (Fut8) δραστηριότητα και η έκφραση είναι αυξημένη σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους, προτείνοντας ένα ρόλο για το ένζυμο αυτό στην ανάπτυξη του όγκου και της εξέλιξης, όπως HCC [12], καρκίνο του παχέος εντέρου [ ,,,0],13], μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [14] και ορώδες αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών [15]. Altered πυρήνα φουκοσυλίωση είναι ένα από τα πιο σημαντικά ανώμαλη γλυκοζυλιωμένη τροποποίηση προσδιορίζονται σε κακοήθειες. Fut8 καταλύει τη μεταφορά φουκόζης από γουανοσίνη διφωσφορική (ΑΕΠ) -fucose προς τον εσώτατο ΟΙοΝΑο των υβριδικών και συμπλόκου Ν-συνδεδεμένοι ολιγοσακχαρίτες μέσω ενός α-1,6-δεσμός, με αποτέλεσμα πυρήνας-φουκοζυλιωμένη γλυκοπρωτεΐνες [16] – [17] και μεταβάλλοντας βιολογική λειτουργία του με αποτέλεσμα γλυκοπρωτεΐνες [18]. Αν και πολλές μελέτες έχουν αναφέρει τη σχέση μεταξύ αλλαγμένη πυρήνα φουκοσυλίωσης και άλλους επιθετικούς όγκους, με τις γνώσεις μας, η επιρροή του πυρήνα φουκοσυλίωσης για καρκίνο του στομάχου παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε Ν-γλυκάνης προφίλ με DSA-FACE στα δύο δείγματα ορού από καρκίνο του στομάχου, γαστρικό έλκος, υγιείς μάρτυρες και οι πρωτεΐνες του ιστού από όγκους και τα παρακείμενα μη όγκων. Στη συνέχεια, να παρατείνει την λειτουργική έρευνα πάνω στα προσδιορίζονται συγκεκριμένες γλυκοσυλιώσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας κινεζική Ανθρώπινου Δυναμικού κατά τη Δευτέρα Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση.

πληθυσμός Μελέτη

Συνολικά, 105 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (n = 80) και το γαστρικό έλκος (n = 25) είχαν εγγραφεί Δεκέμβριο του 2007 έως και τον Οκτώβριο 2010 Changzheng Νοσοκομείο του Β Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι περιπτώσεις με καρκίνο του στομάχου είναι εγγεγραμμένοι επιβεβαιώθηκαν ιστοπαθολογικά από 2 παθολόγους και περιπτώσεις με γαστρικό έλκος προσληφθεί επιβεβαιώθηκαν από γαστροσκόπιο. Οι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που έλαβαν προεγχειρητική χημειοθεραπεία, και οι οποίοι είχαν άλλες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων μολύνσεων αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Ελήφθησαν δείγματα ορού πριν τη χειρουργική εκτομές. Για μια ομάδα ελέγχου, 139 αντίστοιχης ηλικίας, υγιείς εθελοντές εγγράφηκαν από μια ομάδα του καρκίνου χωρίς ατόμων που επισκέφθηκαν το ίδιο νοσοκομείο για μια τακτική σωματική εξέταση και οι οποίοι προσφέρθηκαν να συμμετάσχουν στην έρευνα κατά τη διάρκεια της ίδιας περιόδου. Ορίσαμε ένα υγιές άτομο, όπως κάποιος που κρίθηκε δωρεάν ασθενειών (συμπεριλαμβανομένων χωρίς ιστορικό καρκίνου) σε τσεκ-απ υγείας. Τα ακόλουθα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών λήφθηκαν κατά τον χρόνο της συλλογής πλήρους αίματος. Μια σύνοψη των δεδομένων από τα θέματα αυτά παρέχονται στον Πίνακα 1. Η εξέλιξη του συνόλου των ασθενών με καρκίνο του στομάχου ταξινομήθηκε σύμφωνα με την Ένωση για τη Διεθνή Έλεγχο του Καρκίνου (UICC) κριτήρια TNM στάσης για καρκίνο του στομάχου, 13 ασθενείς (16,25%) είχαν σταδίου Ι, 24 ασθενείς (30,00%) είχαν σταδίου ΙΙ, 30 ασθενείς (37,5%) είχαν σταδίου ΙΙΙ και 13 ασθενείς (16,25%) είχαν σταδίου IV. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 54,35 ± 6,69 περιλαμβανομένων 60 άνδρες και 20 γυναίκες. Ορός συνελέγη χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο από πλήρες αίμα, κατεργάζεται με φυγοκέντρηση στα 10.000 g για 20 λεπτά και φυλάχθηκαν στους -80 ° C.

Η

N-γλυκάνης προφίλ από πρωτεΐνες ορού

πρωτεΐνη ορού Ν-γλυκάνης αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Εν συντομία, τα Ν-γλυκάνες που υπάρχουν επί των πρωτεϊνών σε 2 μl ορού απελευθερώθηκαν με πεπτίδιο Ν-γλυκοσιδάση F-(ΡΝΘάσηΡ) (New England Biolabs, Boston, Mass) και στη συνέχεια επισημαίνονται με 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- τρισουλφονικό οξύ (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, Calif) .Sialic οξύ απομακρύνθηκε με Arthrobacter ureafaciens σιαλιδάση (Roche Bioscience, Palo Alto, Calif), και τα επεξεργασμένα δείγματα αναλύθηκαν με τεχνολογία DSA-FACE χρησιμοποιώντας τριχοειδή ηλεκτροφόρηση που βασίζεται ABI3500 Γενετική αναλυτή (Applied Biosystems, Foster City, Καλιφόρνια). Τα 9 πιο έντονες κορυφές που ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα (μαζί, αυτές οι κορυφές αντιστοιχούσαν & gt? 90% των συνολικών Ν-γλυκανών ορού) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GeneMapper (Applied Biosystems). Κάθε δομή Ν-γλυκάνης περιγράφεται αριθμητικά με κανονικοποίηση ύψος της προς το άθροισμα των υψών όλων των κορυφών.

δείγματα ιστών

Όλοι οι ιστοί χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τους Κανονισμούς Institutional Review Board του η Δεύτερη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Δείγματα ιστών λήφθηκαν from10 του 80 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Δείγματα ιστού περιλαμβάνονται 2 φέτες, έναν ιστό όγκου και ένα παρακείμενο μη καρκινικό ιστό. Δείγματα ιστού Ζεύγη (περίπου 0,5 χ 0,5 χ 0,5 cm

3, διπλές για κάθε δείγμα) που επιλέγεται είτε αμέσως καταψύχθηκαν στους -80 ° C για RNA και πρωτεΐνη εκχύλιση ή σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες και στη συνέχεια μεταποιηθεί σε παραφίνη ενσωματωμένα μπλοκ και αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για ιστοχημική χρώση.

N-γλυκάνης προφίλ από πρωτεΐνες του ιστού και δομική ανάλυση χρησιμοποιώντας εξωγλυκοσιδάσης πέψη

οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από περίπου 25 mg κατεψυγμένα δείγματα ιστών . Τα δείγματα ιστών αιωρήθηκαν και τρίβεται σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche Diagnostics, Meylan, France). Που δεν λύθηκαν μέρη απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση (12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C) δύο φορές. Η συγκέντρωση του διαλυτοποιημένου πρωτεϊνών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ BCA (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), και τα δείγματα πρωτεΐνης φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Ένα σύνολο 40 μα πρωτεϊνών του ιστού χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό Ν-γλυκάνης προφίλ χρησιμοποιώντας κανονικές μέθοδο Ν-γλυκάνης προφίλ το ίδιο με εκείνο που εκτελούνται στον ορό που περιγράφεται παραπάνω. Για τον προσδιορισμό του πυρήνα-α-1, 6-φουκοζυλιωμένη Ν-γλυκάνης δομές, κατάλληλο αριθμό APTS-επισημασμένου Ν-γλυκάνες σε πέψη με τα δύο Arthrobacter ureafaciens σιαλιδάση και των νεφρών των βοοειδών α-1, 6-φουκοσιδάση (Prozyme, San Leandro, CA , ΗΠΑ). τεχνολογία DSA-FACE χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα προϊόντα πέψης και το λογισμικό GeneMapper χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του ύψους των κορυφών.

εκχύλιση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικά RNAs εκχυλίσθηκαν από κατεψυγμένα ιστών και κυττάρων, χρησιμοποιώντας ολικό κιτ εκχύλισης RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Axygen Biosciences, Hangzhou, Κίνα). Η καθαρότητα και η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με φασματοφωτόμετρο (Eppendorf, Hamburg, Germany), και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ReverTra Ace-α-RT-PCR (Toyobo Co., Osaka, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Primer Express (Applied Biosystems? Οι αλληλουχίες φαίνονται στον Πίνακα S1). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SYBR® Πράσινο πραγματικού χρόνου PCR Master Mix κιτ (Toyobo Co., Osaka, Japan) και αναλύθηκε σε Applied Biosystems 7300 σύστημα πραγματικού χρόνου PCR (ΑΒΙ, Foster City, CA, USA) . Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν ανεξάρτητα. ποδηλασία PCR συνίστατο από μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και στους 59 ° C ή 55 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και ανίχνευσης για 45 δευτερόλεπτα στους 72 ° C. Η σχετική ποσότητα Fut8 ή γουανοσίνη διφωσφορικής (ΑΕΠ) -fucose μεταφορέα (ΑΕΠ-Tr) μεταγραφές σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε στο γονίδιο βασικών β-ακτίνης και αφυδρογονάση αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) αφαιρώντας τον κύκλο. Τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Delta-Delta Ct. Απόλυτες τιμές έκφρασης μεταγραφή πέρα ​​από 40 κύκλους θεωρήθηκαν κάτω από τα ανιχνεύσιμα επίπεδα. Λιώστε καμπύλες ελέγχθηκαν για κάθε αντίδραση να εγγυηθεί ότι ένα μόνο προϊόν ενισχύθηκε.

κηλίδος Western και λεκτίνη κηλίδα

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από τα κατεψυγμένα ιστούς με τη διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω, και ένα σύνολο 50 μg πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 10% δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Τα πήγματα βάφτηκαν με coomassie blue G250 ή οι πρωτεΐνες εντός του πηκτώματος μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης () για την ανίχνευση του Fut8 ή το ποσοστό του πυρήνα-φουκοζυλιωμένη πρωτεΐνες. Για δείγματα ορού, συνολικά 85 περιπτώσεις από το γαστρικό καρκίνο (n = 80), γαστρικό έλκος (n = 25) και υγιών μαρτύρων (n = 30) χρησιμοποιήθηκαν για SDS-PAGE και λεκτίνη-blot. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C με 5% πρωτεΐνη άπαχο γάλα ή 5% αλβουμίνη βόειου ορού σε ρυθμισμένο με tris αλατούχο [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (TBS)] και στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με 1:100 αραιωμένο αντίσωμα αντι-ανθρώπινης Fut8 (15C6, αντι-ανθρώπινο Fut8, Fujirebio Corp., Japan) ή 5 μg /ml βιοτινυλιωμένου Lens culinaris αγλουτινίνης Α (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Calif) σε TBS που περιέχει 0.05% Tween-20 (ρυθμιστικό διάλυμα TBST), και στη συνέχεια επωάστηκαν με αραίωση 1:10,000 του δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με φθορισμό (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ) ή IRDye 800CW-στρεπταβιδίνη (LI-COR Biosciences) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου . Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με την IR Σύστημα Απεικόνισης Οδύσσεια. Anti-βήτα ακτίνης (1:2000) χρησιμοποιήθηκε για την εσωτερική αντισώματος αναφοράς για το δυτικό-κηλίδα. Καθαρισμένη λευκωματίνη χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος για λεκτίνη κηλίδος και συνολική πρωτεΐνη χρωματίστηκαν με coomassie μπλε χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το ποσοστό των πυρήνα-φουκοζυλιωμένη πρωτεΐνη.

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση και λεκτίνη-ιστοχημική χρώση

Τα σταθερά δείγματα ιστών ενσωματωμένα σε παραφίνη κόπηκαν σε 4-mm-άρρωστα φέτες για ανοσοϊστοχημική χρώση για Fut8 και λεκτίνη-ιστοχημική χρώση για την ΑΚΖ. Μετά την έκθεσή του αποπαραφίνωση, ενυδάτωση, η ενδογενής υπεροξειδάση μπλοκάρισμα, και ανάκτηση αντιγόνου (10 mM Tris /1 mM EDTA, ρΗ 9.0, αυτόκλειστο υπό θεραπεία), τα δείγματα επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης Fut8 (1:100) ή βιοτινυλιωμένο LCA (1 :500) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και στη συνέχεια με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση ή φλουορεσκεΐνη επισημασμένη στρεπταβιδίνη στους 37 ° C για 30 λεπτά. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη ή DRAQ5. Αρνητικός μάρτυρας αποτελείτο από τον ίδιο επεξεργασία ιστολογικών τομών με IgG ποντικιού για να αντικαταστήσει το ποντίκι Fut8.

κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, BGC-823 και SGC-7901, αγοράστηκαν από την Shanghai Institute of Cell Biology, κινεζική Ακαδημία Επιστημών και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2 σε RPMI 1640 και ϋΜΕΜ μέσο (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), αντίστοιχα, με 10% FBS, 1% γλουταμίνη, και 1% διάλυμα αντιβιοτικού.

Κατασκευή του ΑΕΠ-Tr και Fut8 ανασυνδυασμένα πλασμίδια και επιμόλυνση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων

η ρΕΟΡΡ-Ν1-ΑΕΠ-Tr και το pEGFP-Ν1 -Fut8, το πλασμίδιο φορέα που κωδικοποιεί ανθρώπινο GDP-Tr ή Fut8, δημιουργήθηκε με εισαγωγή GDP-Tr ή cDNA Fut8 σε φορέα pEGFP-Ν1 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), που περιέχει έναν υποκινητή CMV και SV40 πρώιμο προαγωγό, καθώς επίσης και το γονίδιο αντίστασης νεομυκίνη /καναμυκίνη του Τη5. Ο φορέας ραχοκοκαλιά περιέχει επίσης ένα SV40 αφετηρία αντιγραφής σε κύτταρα θηλαστικών. Η θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (MCS) βρίσκεται δίπλα στο άμεσο πρώιμο υποκινητή του CMV. Το ανθρώπινο γονίδιο GDP-Tr ή Fut8 κλωνοποιήθηκε από το mRNA εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, USA) από ανθρώπινο ιστό ήπατος με διεξαγωγή RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές (Πίνακας S2) στην οποία η Xho Ι ή ΚρηΙ περιοριστικές θέσεις συμπεριλήφθηκαν, πέψη με Xho Ι ή ΚρηΙ και σύνδεση στο ρΕΟΡΡ-Ν1. Η ρΕΟΡΡ-Ν1-GDP-Tr ή pEGFP-Ν1-Fut8 μετασκευάστηκε σε Escherichia coli ϋΗ5α για αλληλούχιση ενίσχυση και DNA χρησιμοποιείται για να εξασφαλιστεί η πιστότητα. Πλασμιδιακό DNA παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen DNA mini (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πλασμίδια διαμολύνθηκαν στα ανθρώπινα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, BGC-823 και SGC-7901 σε 80% συρροή και 5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια έξι-φρεατίων χρησιμοποιώντας το Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα τα οποία εξέφρασαν γονιδίου στόχου επιβεβαιώθηκαν με ποσοτική RT-PCR.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8, Dojin, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κυτταρική ανάπτυξη παρακολουθήθηκε κάθε 24 ώρες επί 5 ημέρες, και για κάθε χρονικό σημείο διεξήχθη εις διπλούν. Η απορρόφηση μετρήθηκε για κάθε φρέαρ σε ένα μήκος κύματος 450 nm.

πληγών επούλωσης

δοκιμασία

Για την επούλωσης πληγών δοκιμασίας, τα ανθρώπινα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, BGC-823 και SGC-7901 ( 1 × 10

5 κύτταρα /35 × 11 mm πιάτα) σπάρθηκαν και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με ανασυνδυασμένα πλασμίδια. Μετά την επίτευξη συρροής, η κυτταρική στοιβάδα σε κάθε πλάκα ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα πλαστικό ρύγχος πιπέτας. Η μετανάστευση των κυττάρων στο άκρο του μηδέν αναλύθηκε στις 0, 24 και 48 ώρες, οι εικόνες συλλήφθηκαν και αναλύθηκαν με Leica μικροσκόπιο φθορισμού και συμφωνημένα λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Comet Δοκιμασία IV σύστημα ανάλυσης εικόνας, ΡΙ, UK).

Τακτική Tumor τσάι Ανίχνευση

τα κλινικά και βιοχημικά δεδομένα από τους ασθενείς συνοψίζονται στον πίνακα 1. ρουτίνας βιοχημικές εξετάσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους και συμφωνημένα αντιδραστήρια (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan) . επίπεδα καρκινικού δείκτη, συμπεριλαμβανομένου του αντιγόνου υδατάνθρακας 19-9 (CA19-9), καρκινο-εμβρυϊκό αντιγόνο (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 και CA724, προσδιορίστηκαν σε μια σπονδυλωτή Roche Ε170 με συμφωνημένα αντιδραστηρίων.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα ποσοτικές μεταβλητές εκφράσθηκαν ως μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. ποσοτικές μεταβλητές συγκρίθηκαν με Student t τεστ, αναλύσεις διακύμανσης (ANOVA), ή μη παραμετρικές δοκιμές. Pearson συντελεστές συσχέτισης (Spearman συντελεστές συσχέτισης υπολογίστηκαν για τακτικό κατηγορηματικές μεταβλητές) και αντίστοιχες πιθανότητες τους (

σ

) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί συσχετίσεις μεταξύ των παραμέτρων. Όλες οι αναφερόμενες

σ

τιμές ήταν 2-ουρά, και

σ

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 16.0 για Windows στατιστικού λογισμικού (SPSS Inc.).

Αποτελέσματα

Διαφορετικές Ν-γλυκάνης πρότυπα προφίλ του ορού σε καρκίνο του στομάχου, γαστρικό έλκος και υγιείς μάρτυρες

Χρήση DSA-FACE, εξετάσαμε τα Ν-γλυκάνης προφίλ αποσιαλυλιωμένες ορούς από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (n = 80), γαστρικό έλκος (n = 25), και την ηλικία υγιών ατόμων (n = 139). Εμείς ποσοτικά και στατιστικά σύγκριση αυτών των κορυφών μεταξύ 3 διαφορετικές ομάδες. Τουλάχιστον 9 Ν-γλυκάνης δομών (κορυφές) ταυτοποιήθηκαν σε όλα τα δείγματα (Σχήμα 1Α). Η δομική ανάλυση αυτών των Ν-γλυκανών δημοσιεύθηκε προηγουμένως από Callewaert [11]. Η μέση σχετική αφθονία αυτών των Ν-γλυκανών δομές περιγράφηκε στον Πίνακα 2. Η αφθονία των δομών σε κορυφές 2, 3, 5, 6, 7, 8 και 9 έδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των γαστρικό καρκίνο, γαστρικό έλκος, και υγιή έλεγχο ομάδες, υποδεικνύοντας ότι διαφορετικά Ν-γλυκάνης πρότυπα εμφανίστηκε σε διαφορετικές παθοφυσιολογικές συνθήκες. Σε σύγκριση με την υγιή ομάδα ελέγχου, peak5 (bigalacto διπλής κεραίας γλυκάνη, NA2) και peak9 (διακλάδωση α-1,3-φουκοζυλιωμένη γλυκάνη triantennary, NA3Fb) ήταν αυξημένα (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 1Β)? ενώ πυρήνος φουκοζυλιωμένη κορυφές, όπως peak2 (agalacto πυρήνας-α-1,6-φουκοζυλιωμένη γλυκάνη που διχοτομεί διπλής κεραίας, NGA2FB), peak3 (μονό agalacto πυρήνα-α-1,6-φουκοζυλιωμένη γλυκάνη διπλής κεραίας, NG1A2F), peak6 (bigalacto πυρήνας -α-1,6-φουκοζυλιωμένη γλυκάνη διπλής κεραίας, NA2F) και peak7 (bigalacto πυρήνας-α-1,6-φουκοζυλιωμένη γλυκάνη που διχοτομεί διπλής κεραίας, NA2FB) μειώθηκαν στο γαστρικό καρκίνο ομάδα (Ρ & lt? 0.001). Ομοίως, η αφθονία του πυρήνα φουκοζυλιωμένη γλυκάνες δομή ονομάστηκε sumfuc (υποδεικνύει συνολικός πυρήνας-φουκοζυλιωμένη δομών, συμπεριλαμβανομένων κορυφή 1, 2, 3, 4, 6, και 7) μειώθηκε σημαντικά στο γαστρικό καρκίνο (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 1 C ). Η γαστρική ομάδα καρκίνος ταξινομείται περαιτέρω σε 4 υποομάδες ανάλογα με ΤΝΜ σταδιοποίηση της UICC για καρκίνο του στομάχου. Η αφθονία δομή και sumfuc δεν μεταβλήθηκε σημαντικά μεταξύ των 4 διαφορετικές υποομάδες? Ωστόσο, sumfuc μειώθηκε σταδιακά με στάδια εξέλιξης του γαστρικού καρκίνου (Πίνακας 3).

(Α) Οι τρεις πίνακες (από πάνω προς τα κάτω) είναι το Ν-γλυκάνης προφίλ τυπικό ορό από υγιή έλεγχο, γαστρικό έλκος και γαστρικό καρκίνους. Εννέα μεγάλες κορυφές μπορούν να αναγνωριστούν. Οι δομές των Ν-γλυκανών κορυφές που δείχνονται παρακάτω στο διάγραμμα. Επίπεδα σε κορυφές 5 και 9 είναι αυξημένα (επάνω βέλη), και τα επίπεδα σε κορυφές 2, 3, 4, 6, 7 και 8 μειώθηκαν (κάτω βέλος) σε γαστρικό καρκίνο σε σύγκριση με εκείνη των υγιών και ασθένεια ελέγχους. Κορυφές 1, 2, 3, 4, 6 και 7 είναι πυρήνα φουκοσυλιωμένες γλυκάνες. (Β) Η αξία των peak9 (διακλάδωση α-1,3-φουκοσυλιωμένες αντένας Ν-γλυκάνη, NA3FB) είναι αυξημένα διαδοχικά από υγιή ελέγχου, γαστρικό έλκος σε καρκίνο του στομάχου (P & lt? 0.001), ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (95 % CI) για τα μέσα. (Γ) Η αξία των sumfuc μειώνεται στο γαστρικό καρκίνο (P & lt? 0.001). Sumfuc δείχνει το συνολικό αφθονία του πυρήνα φουκοζυλιωμένη δομή γλυκάνες (κορυφές 1, 2, 3, 4, 6 και 7). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το 95% CI για τη βοήθεια.

Η

Η

Η συσχέτιση μεταξύ Ν-γλυκάνες και τη ρουτίνα δείκτες όγκου

Μέχρι σήμερα, CEA εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως για την προβολή και παρακολούθηση του καρκίνου του στομάχου. Αναλύσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ μεμονωμένων Ν-γλυκάνης δείκτη με CA19-9, CEA, CK19, CA125 και CA724. Η ανάλυση συσχέτισης Pearson έδειξε ότι CEA σχετιζόταν θετικά με peak1 (r = 0,19? P & lt? 0.01), και peak9 (r = 0,28? P & lt? 0.01), ενώ αρνητικά με peak6 (r = -0.18? P & lt? 0,01) και peak8 (r = -0,23? P & lt? 0,01) (Πίνακας 4)

η

Σύγκριση των sumfuc μεταξύ γαστρικού καρκίνου και άλλων μορφών καρκίνου του πεπτικού συστήματος

Στο παρελθόν έχουμε μελετήσει το Ν-γλυκάνης προφίλ. ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) [19] και του παχέος εντέρου (CRC) [20]. Η αφθονία των sumfuc αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ του γαστρικού καρκίνου (41.32 ± 6.39), το HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) και υγιών μαρτύρων (47,67 ± 5,08) ομάδες (P & lt? 0.001, Πίνακας 5), υποδεικνύοντας ότι διαφορετικό επίπεδο πυρήνα φουκοσυλίωσης εμφανίστηκε σε καρκίνους με διαφορετική προέλευση ιστού. Μεταξύ των 4 ομάδων, το επίπεδο του πυρήνα φουκοσυλίωσης στο HCC ήταν το υψηλότερο, ενώ το επίπεδο φουκοσυλίωσης σε καρκίνο του στομάχου ήταν η χαμηλότερη, και ήταν ακόμη χαμηλότερη από ότι σε υγιή έλεγχο.

Η

Ν-γλυκάνης προφίλ μοτίβα σε γαστρικό όγκου και μη καρκινικών ιστών

N-γλυκάνης προφίλ εξετάστηκαν σε σιαλυλιωμένη πρωτεΐνης από γαστρικού όγκου και μη καρκινικών ιστών. Τα τρία πιο άφθονα bigalacto διπλής κεραίας γλυκανών έδειξε στον ορό, peak5 (ΝΑ2), peak6 (NA2F) και preak7 (NA2FB) ταυτοποιήθηκαν επίσης σε πρωτεΐνες ιστού (Σχήμα 2Α). Peak6 και Peak7 επιβεβαιώθηκαν να είναι πυρήνας-φουκοζυλιωμένη δομές dervied από peak5 μετά επεξεργάστηκε με πυρήνα-α-1, 6-χώνευση φουκοσιδάση (Σχήμα 2Α). Τα ύψη των τριών αυτών κορυφών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GeneMapper. Η αναλογία peak6 να peak5 ήταν χαμηλότερη σε καρκινικούς ιστούς από ότι σε παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς (0,83 ± 0,18 έναντι 1,05 ± 0,42, Σχήμα 2Β), καθώς και η αναλογία του peak7 να peak5 (0,13 ± 0,06 έναντι 0,16 ± 0.04, Εικόνα 2C). Ωστόσο, δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & gt? 0,05). Μεταξύ όγκου και μη καρκινικών ιστών

(Α) Οι πέντε πάνελ (από πάνω προς τα κάτω) είναι αποσιαλυλιωμένες Ν-γλυκάνης προφίλ από ορό ως αναφορά, σιαλυλιωμένη Ν-γλυκάνης προφίλ από ιστούς όγκων, αποσιαλυλιωμένες Ν-γλυκάνης προφίλ από ιστούς όγκων σε επεξεργασία με πέψη α-1,6-φουκοσιδάση, αποσιαλυλιωμένες Ν-γλυκάνης προφίλ από γειτονικούς ιστούς μη-όγκου, και από-σιαλυλιωμένη Ν-γλυκάνης προφίλ από παρακείμενα μη ιστοί όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με πέψη α-1,6-φουκοσιδάση. Οι γραμμές υποδεικνύουν τις βέλος αλλαγές του Ν-γλυκάνης κορυφές σε επεξεργασία με πέψη α-1,6-φουκοσιδάση. Peak6 και peak7 αφαιρέστε προς τα εμπρός μετά την πέψη α-1,6-φουκοσιδάση, που reveale ότι peak5, 6 και 7 έχουν τις ίδιες δομές όπως στον ορό, και peak6 και peak7 είναι α-1,6-φουκοζυλιωμένη Ν-γλυκανών. (Β) Η αξία των peak6 /peak5 μειώνεται σε ιστούς όγκων, αλλά η διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το 95% CI για τα μέσα. (Γ) η αξία των peak7 /peak5 είναι επίσης μειωμένη σε ιστούς όγκων, αλλά η διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική.

Η

Μειωμένα επίπεδα του συνολικού πυρήνα φουκοσυλίωσης προσδιορίζονται τόσο ορούς και ιστούς από καρκίνο του στομάχου

από ΑΚΖ μπορεί να αναγνωρίζουν ειδικά τους γλυκοπρωτεΐνες με α-1,6-φουκοζυλιωμένη-συνδεδεμένη Ν-ακετυλο-ϋ-γλυκοζαμίνη-ασπαραγίνη (ΟΙοΝΑο-Asp) στον πυρήνα τριμαννοσυλίου, διερευνήσαμε συνολικά οργανικά φουκοζυλιωμένη πρωτεΐνες από ορούς και ιστών σε γαστρικό καρκίνο με τη χρήση της ΑΚΖ για να επικυρώσει το πόρισμα του DSA-FACE. Στον ορό, το επίπεδο του πυρήνα του κατάλοιπα φουκόζης LCA δέσμευσης ήταν χαμηλότερη σε καρκίνο του στομάχου από ότι στο γαστρικό έλκος και υγιείς μάρτυρες (Σχήμα 3Α). Σύνολο πυρήνα φουκόζη αφθονία trended επίσης να είναι χαμηλότερη σε γαστρικών όγκων σε σύγκριση με εκείνη σε ζεύγη γειτονικούς ιστούς (Σχήμα 3Β). Για να προσδιοριστεί αν η μεταβολή του συνολικού πυρήνα φουκοσυλίωσης σε γαστρικό καρκινικό ιστό είναι σχετική με αλλοίωση της οδού βιοσύνθεσης γλυκοζυλίωσης, ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η αφθονία των Fut8 θηλαστικών και ΑΕΠ Tr σε γαστρικών όγκων και των παρακείμενων ιστών. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές της Fut8 και έκφραση GDP-Tr mRNA μεταξύ των όγκων και των παρακείμενων ιστών (Εικόνα 3C και 3D). Η σχετική αφθονία των Fut8 πρωτεΐνης απεικονίζεται χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (μη επεξεργασμένα δεδομένα δείχθηκε στο Σχήμα S1). Η Fut8 σε γειτονικούς ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε ιστούς όγκων (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 3Ε). Ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε ότι η Fut8 ήταν έντονα θετικά εκφράζεται στα σύνορα του αυλού του γαστρικού μη καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 4Β), όμως ασθενώς θετικά εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4Α). Η έκφραση του πυρήνα φουκοζυλιωμένη γλυκοπρωτεΐνες LCA δέσμευσης ήταν υψηλότερη σε μη-όγκου γαστρικά κύτταρα από ότι στα καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4C, 4D). Έτσι, το επίπεδο των συνολικών πυρήνα φουκοσυλίωσης ταυτοποιήθηκε μειώθηκε τόσο ορούς και ιστών από γαστρικό καρκίνο.

(Α) Λεκτίνη blots των πρωτεϊνών του ορού ανιχνεύθηκαν με LCA. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις πειραματικές ομάδες: υγιείς μάρτυρες (n = 30), γαστρικό έλκος (n = 25), και γαστρικού καρκίνου (GC) (n = 30)? ο κατακόρυφος άξονας υποδεικνύει την αναλογία της φουκοζυλιωμένη πρωτεϊνών στο σύνολο των πρωτεϊνών. Το επίπεδο των φουκοσυλιωμένες πρωτεϊνών σε καρκίνο του στομάχου είναι η χαμηλότερη μεταξύ των 3 ομάδων (P & lt? 0.001). (Β) Λεκτίνη κηλίδες από τις πρωτεΐνες του ιστού ανιχνεύθηκαν με ΑΚΖ. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις πειραματικές ομάδες: ιστούς όγκων (n = 10) και των παρακείμενων ιστών (n = 10). Ο κάθετος άξονας δείχνει την αναλογία των πρωτεϊνών φουκοζυλιωμένη προς το σύνολο των πρωτεϊνών. Το επίπεδο του πυρήνα-φουκοζυλιωμένη ήταν χαμηλότερη σε γαστρικό όγκο, αλλά η διαφορά δεν έδειξαν στατιστική σημασία (Ρ & gt? 0,05). (C) και τα επίπεδα (D) Σχετική αγγελιοφόρο RNA (mRNA) έκφραση του Fut8 ή ΑΕΠ Tr σε ιστούς μετρήθηκαν με ποσοτική RT-PCR. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις πειραματικές ομάδες: ιστούς όγκων (n = 10) και των παρακείμενων ιστών (n = 10). Ο κάθετος άξονας δείχνει τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του Fut8 ή το ΑΕΠ-Tr. Η διαφορά μεταξύ των ομάδων δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ & gt? 0,05). (Ε) Η σχετική αφθονία των Fut8 πρωτεΐνης που απεικονίζεται με τη χρήση western blot. Ο οριζόντιος άξονας αντιπροσωπεύει τις πειραματικές ομάδες: ιστούς όγκων (n = 9) και γειτονικούς ιστούς (n = 9). Ο κάθετος άξονας δείχνει τα σχετικά επίπεδα της Fut8 πρωτεΐνης. Η σχετική αφθονία των Fut8 πρωτεΐνης σε γειτονικούς ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε ιστούς όγκων (Ρ & lt? 0,05).

Η

(Α) Η ανοσοϊστοχημική χρώση με Fut8 σε καρκινικά κύτταρα (200 Χ), η έκφραση του Fut8 είναι ασθενώς θετική. (Β) Η ανοσοϊστοχημική χρώση με Fut8 σε γαστρικό μη καρκινικά κύτταρα (200 Χ), η έκφραση του Fut8 είναι ισχυρά θετικό. (C) Λεκτίνη-ιστοχημική χρώση με LCA σε κύτταρα όγκου, μπαρ 75 μm, η έκφραση της LCA-δέσμευσης πυρήνα φουκοζυλιωμένη πρωτεϊνών είναι ασθενώς θετική. (D) Λεκτίνη-ιστοχημική χρώση με LCA στο γαστρικό μη καρκινικά κύτταρα, bar 75 μm, η έκφραση του πυρήνα φουκοσυλιωμένες πρωτεϊνών είναι έντονα θετικές.

Η

Επίδραση του Fut8 και ΑΕΠ-Tr επί του πολλαπλασιασμού και μετανάστευση στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, BGC-823 και SGC-7901 χρησιμοποιήθηκαν μελέτη in vitro. Από BGC-823 που εκφράζεται χαμηλότερο επίπεδο του ΑΕΠ-Tr, ενώ SGC-7901 εξέφρασε χαμηλότερο επίπεδο Fut8 στην πιλοτική έρευνα μας, ρΕΟΡΡ-Ν1-ΑΕΠ-Tr μετασκευάστηκε σε BGC-823 για υπερεκφράζουν το ΑΕΠ-Tr και ρΕΟΡΡ-Ν1 Fut8 ήταν επιμολύνονται σε SGC-7901 για υπερεκφράζουν Fut8. Ανασυνδυασμένη εκφράσεις επιτυχία επιτυγχάνεται φαίνεται από την έκφραση του γονιδίου αναφοράς GFP (Εικόνα S2). Να εξετάσει την πιθανή εμπλοκή του ΑΕΠ-Tr και Fut8 στον πολλαπλασιασμό του όγκου και της μετανάστευσης, BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα διερευνήθηκαν μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας CCK-8 και επούλωσης πληγών δοκιμασία μετανάστευσης αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυξητική ρύθμιση του ΑΕΠ-Tr μειώθηκε BGC-823 πολλαπλασιασμό σε 2-5 ημέρες μετά την επιμόλυνση και προς τα πάνω ρύθμιση Fut8 μειώθηκε SGC-7901 πολλαπλασιασμό σε 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 5Α και 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλή έκφραση του GDP-Tr και Fut8 θα μπορούσε να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Πληγή δοκιμασία επούλωσης έδειξαν ότι το ΑΕΠ-Tr και Fut8 δεν έχουν σημαντική επίδραση για τη μετανάστευση στην BGC-823 και SGC-7901 στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία (Σχήμα 5C και 5D).

(Α) και (Β) Η πολλαπλασιασμό του BGC-823 κύτταρα και SGC-7901 κυττάρων μετά από επιμόλυνση με pEGFP-Ν1-ΑΕΠ-Tr και ρΕΟΡΡ-Ν1-Fut8 αντίστοιχα αναλύθηκε με τηλέφωνο Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) δοκιμασίες. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Γ) και (Δ) Η επούλωσης πληγών δοκιμασία μετανάστευσης του BGC-823 κυττάρων μετά από επιμόλυνση με pEGFP-Ν1-GDP-Tr καθώς SGC-7901 κυττάρων μετά από επιμόλυνση με pEGFP-Ν1-Fut8. Η απόσταση διακένου (μm) σε δοκιμασία μετανάστευσης μπορεί να αξιολογηθεί ποσοτικά με τη χρήση λογισμικών. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από 3 ανεξάρτητα πειράματα απεικονίζεται. Ρ & gt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

Συζήτηση

Η γλυκοζυλίωση είναι μια από τις πιο κοινές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις εμφανίστηκε σε περίπου 70% όλων των γνωστών πρωτεϊνών. Μεταβολές στην γλυκοζυλίωση παίζουν ένα ρόλο σε ένα διαφορετικό σύνολο των βιολογικών φαινομένων, όπως μετάσταση όγκου των κυττάρων, η ενδοκυτταρική επικοινωνία και τη φλεγμονή [21] – [23]. Όλο και περισσότερες μελέτες δείχνουν ότι οι τροποποιήσεις της γλυκοζυλίωσης και τα επίπεδα των γλυκοζυλοτρανσφερασών δραστηριότητες που προέρχονται από την κακοήθη εξαλλαγή είναι σχετικές με ανθρώπινες κακοήθειες [24] – [25].