Αφηρημένο

Σε προηγούμενη εργασία, δείξαμε ότι ο παράγοντας μεταγραφής Trim28 (Τριμερής μοτίβο που περιέχουν 28) παίζει ογκοκατασταλτικού ρόλο στην πρώιμη σταδιακή αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, λόγω της ικανότητάς του να συγκρατήσει τη μεταγραφή των γονιδίων που ρυθμίζουν τον κύκλο-κυττάρου. Εδώ εξετάζουμε ρόλος Trim28 στην επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), το οποίο είναι έντονα εμπλέκεται στην μετάσταση καρκίνου. Βρήκαμε ότι Trim28 παίζει ένα ρόλο στην ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα κύτταρο. Σίγαση Trim28 με ανασταλτική RNAs μεταβάλλει την έκφραση πολλών δεικτών EMT, όπως Ε-καδερίνης και Ν-καδερίνης, ενώ η υπερέκφραση του Trim28 έχει ένα αντίθετο αποτέλεσμα. έκφραση Trim28 επάγεται μετά από αγωγή ΤΟΡ-β τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA. ανεπάρκεια Trim28 εξασθενεί ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT και μειώνει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Τέλος, αποδεικνύουμε ότι η έκφραση του Trim28 επηρεάζει την ακετυλίωση και μεθυλίωση των ιστονών σε Ε-καδερίνης και προαγωγούς Ν-καδερίνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Trim28 συμβάλλει στην ΕΜΤ και θα μπορούσε να είναι σημαντική για μετάσταση όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα. Σε συνδυασμό με την προηγούμενη εργασία μας αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ένα μοντέλο στο οποίο Trim28 είναι ένα ογκοκατασταλτικό νωρίς στη διαδικασία μετασχηματισμού στον καρκίνο του πνεύμονα, αλλά σε μεταγενέστερα στάδια λειτουργεί ως ογκογονίδιο

Παράθεση:. Chen L, Muñoz- Αντωνία T, Κάρδαμο WD (2014) Trim28 συμβάλλει στην EMT μέσω του κανονισμού της Ε-καδχερίνη και Ν-καδχερίνη στον καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (7): e101040. doi: 10.1371 /journal.pone.0101040

Επιμέλεια: Olivier de Wever, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο

Ελήφθη: 11 Δεκέμβρη 2013? Αποδεκτές: 3 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (CA119997 και CA163068) και του Κέντρου Καρκίνου Moffitt. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) χαρακτηρίζεται από απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και την πολικότητα, ρύθμιση προς τα κάτω των επιθηλιακών δεικτών, και απόκτηση των δεικτών μεσεγχυματικών και φαινότυπο [1]. Συσσωρευμένα στοιχεία από τις έρευνες για την EMT έχουν εμπλακεί πολλά μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων των TGF-β, Notch, Wnt, EGF και FGF [2]. Μεταξύ αυτών, ο ΤΟΡ-β επάγει ΕΜΤ αποτελεσματικά σε μια ποικιλία κυτταρικών γραμμών μοντέλου και

in vivo

[3]. Όπως πολλές άλλες βιολογικές διαδικασίες, ΕΜΤ τελικά ρυθμίζεται μεταγραφικά από έναν αριθμό παραγόντων μεταγραφής όπως Snail1, Snail2, ZEB1 και ZEB2 [4]. Επιπλέον, επιγενετικές τροποποιητές έχουν επίσης δειχθεί να παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της EMT. Για παράδειγμα, ιστόνης δεακετυλάσης SIRT1 προκαλεί EMT μέσω του μεταγραφικού παράγοντα ZEB1 ενώ ιστονών μεθυλοτρανσφεράση SUV39H1 και G9a καταστέλλουν την έκφραση Ε-καδερίνης και επάγουν EMT σε ένα σαλιγκάρι-εξαρτώμενο τρόπο [5], [6], [7].

Trim28 είναι μέλος μιας εξελικτικά συντηρημένη οικογένεια της μεταγραφής συν-παράγοντες που έχουν διαφορετικές λειτουργίες [8]? συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, την επιδιόρθωση του DNA, τη διαφοροποίηση και πλειοδυναμία [9], [10], [11], [12]. Trim28 έχει ειδικά ενοχοποιηθεί στην ενεργοποίηση του ΕΜΤ σε ινοβλάστες [13] και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα [14]. Εξαρτάται από το πλαίσιο, Trim28 μπορούν είτε να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν τη μεταγραφή μέσω διαφορετικών μηχανισμών [15], [16], [17], [18]. Trim28 μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση έχει αποδειχθεί ότι περιλαμβάνει μια ένωση με ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση SETDB1, αποακετυλάσης της ιστόνης συγκρότημα NuRD και της στρατολόγησης περιοχές προαγωγού μέσω μεταγραφικών παραγόντων ειδικής αλληλουχίας [19], [20]. Αυτό το συγκρότημα καταστέλλει τη μεταγραφή του γονιδίου-στόχου αλλάζοντας τις τροποποιήσεις των ιστονών σε υποστηρικτές [8]. Όταν φωσφορυλιωμένο στο S824, Trim28 έχει αποδειχθεί για να συνδέσει με τον παράγοντα μεταγραφής Oct3 /4 και να ενεργοποιήσετε Oct3 /4 γονίδια-στόχους μεταγραφής [12]. Ένας άλλος μηχανισμός του Trim28 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της μεταγραφής πραγματοποιείται μέσω πρόσληψης σε συγκεκριμένα στοιχεία απόκρισης, όπως γλυκοκορτικοειδή στοιχείο απόκρισης (GRE) και στοιχείου απόκρισης Nur (Nure), με NGFI-Β και C /ΕΒΡβ αντίστοιχα [17], [18]. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι Trim28 θα μπορούσαν να παίξουν κάποιο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση [13], [14]. Συγκεκριμένα, η έκφραση Trim28 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς [9], [21], [22], [23]. Σε μια αναζήτηση για τις πρωτεΐνες μετάστασης που σχετίζονται με τον καρκίνο του μαστού, Trim28 αναγνωρίστηκε ως ένας από τους 197 πρωτεϊνών με αυξημένη έκφραση σε μεταστατικούς ιστούς [24].

Σε προηγούμενη εργασία μας [9], ανακαλύψαμε ότι η υψηλή Trim28 (Τριμερής μοτίβο που περιέχουν 28) πρωτεΐνες επίπεδα συσχετίζονται με μεγαλύτερη συνολική επιβίωση σε ασθενείς νωρίς σταδίων αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, αλλά όχι σε ασθενείς με όψιμη σταδιακή. Αυτή η παρατήρηση πρότεινε σε μας ότι Trim28 θα μπορούσαν να παίξουν διπλό ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα. Έχουμε σκεφτεί ότι ο ρόλος σε μεταγενέστερα στάδια μπορεί να σχετίζονται με EMT [14]. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, εξετάσαμε την επίδραση της shRNAi μεσολάβηση εξάντληση Trim28 για EMT σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Α549 και Η358). Βρήκαμε ότι Trim28 συμβάλλει στην ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT, και ότι η υψηλή Trim28 ευνοεί ΕΜΤ υποδηλώνοντας ότι Trim28 μπορούσε να είναι ένας ρυθμιστής της μετάστασης του όγκου, ιδιαίτερα στο μεταγενέστερο στάδιο της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές, πλασμίδια, και τα αντιδραστήρια

Αρχικό κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ελήφθησαν από την ATCC. Α549 και Η358 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου. κύτταρα Trim28 ανεπάρκεια Α549 (Trim28 shRNA), Trim28-καλά Α549 και παρομοίως κύτταρα προερχόμενα γραμμές ελέγχου έχουν περιγραφεί προηγουμένως [9]. κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Η358 Trim28 shRNA επελέγησαν σε 1 μg /ml πουρομυκίνη. Η358 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Trim28 επιλέχθηκαν σε 500 μg /ml G418. Ενιαία κλώνοι υποβλήθηκαν σε διαλογή για έκφραση Trim28. Ομοίως-προερχόμενες κυτταρικές γραμμές ελέγχου δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας κενούς φορείς. PcDNA-FLAG-HA-TIF1β και ρΡΙ_-ΤΚ έχουν περιγραφεί προηγουμένως [9]. pCS2-Myc-Trim28 [25] και pGL3-Ε-cadherin [26] ήταν οι γενναιόδωρες δωρεές από Ryan Potts (UT Southwestern) και Jia Fang (Moffitt Cancer Center), αντίστοιχα. ΤΟΡ-β αγοράστηκε από την R &? D Systems (240-Β-002)

Ανάλυση Πρωτεΐνης

Westerns διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27].. αντισώματα Ε-καδερίνη (# 3195S), Ν-cadherin (# 4061), και β-τουμπουλίνης (# 2128S) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology. Trim28 αντίσωμα (A300-275A) ήταν από Bethyl Laboratories. Flag (F3165), β-ακτίνη (A5441), και γ-τουμπουλίνης (T6557) αντισώματα ήταν από τη Sigma. Λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και ενεργότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα πειράματα διεξήχθησαν σε βιολογικά τριπλούν και όλες επαναλήφθηκαν τρεις φορές. διάνυσμα λουσιφεράσης Renilla ρΡΙ_-ΤΚ χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Q-RT-ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Συνολικά κυτταρικό RNA συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen) μετά το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Real-time PCR χρησιμοποιώντας Perfecta SYBR Green Supermix σε ένα σύστημα ανίχνευσης PCR CFX96 πραγματικό χρόνο. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για χρώση ήταν από τη Cell Signaling Technology (αντι-Ε-καδερίνης # 3195S και αντι-β-τουμπουλίνης # 2128S). AlexaFluor 488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Τα κύτταρα απεικονίζεται από το Μικροσκοπίας πυρήνα σε Moffitt Κέντρο Καρκίνου χρησιμοποιώντας μια Leica SP5 AOBS παράλληλα σάρωσης ανεστραμμένο μικροσκόπιο συνεστιακό.

δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης

δοκιμασίες ChIP εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαθίζηση περιλαμβάνει συνήθεις IgG κουνελιού (12-370, Millipore), αντι-ακετυλο-ιστόνης H3K9 (07-352, Millipore), αντι-ιστόνης Η3 τριμεθυλ K9 (ab8898, Abcam) και αντι-ιστόνης Η3 διμεθυλο K9 (ab1220 , Abcam). Το καταβυθισθέν DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας Kit καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen). Real-time PCR χρησιμοποιώντας Perfecta SYBR Green SuperMix σε ένα σύστημα ανίχνευσης PCR πραγματικού χρόνου Bio-Rad CFX96. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα 1.

δοκιμασίες επούλωση πληγών

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν έως ότου & gt? 90% συρροή. Τρία ευθεία πληγές γδαρμένο σε κάθε φρεάτιο χρησιμοποιώντας στείρο ρύγχος πιπέτας 200 μΐ. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν απαλά με PBS και 2 ml μέσου (χωρίς FBS ή που περιέχει 10% FBS) προστέθηκε. Εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 40x αμέσως μετά το ξύσιμο και πάλι μετά από 24 ώρες και 48 ώρες. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

δοκιμασίες Invasion

δοκιμασίες Εισβολή διεξήχθησαν σε BD Biocoat Matrigel εισβολής θαλάμου (354,480, BD Bioscences) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα Α549 εναιωρούνται εκ νέου σε 5 × 10

4 κύτταρα /ml και φορτώνονται σε ένθετα θαλάμου (ένθετα ελέγχου ή Matrigel επικαλυμμένα ενθέματα). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 22 ώρες και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν σε τρία μικροσκοπικά πεδία. Η επί τοις εκατό εισβολή υπολογίστηκε διαιρώντας τον μέσο αριθμό των κυττάρων που εισβάλλουν μέσω Matrigel ένθετο από τον μέσο αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν μέσω ενός ένθετου ελέγχου. Ο δείκτης εισβολή προσδιορίσθηκε με σύγκριση της επί τοις εκατό εισβολή των κυττάρων knockdown Trim28 με την επί τοις εκατό εισβολή των κυττάρων ελέγχου.

Τρισδιάστατο καλλιέργειες πολυκύτταρους σφαιροειδές

Τρισδιάστατο πολυκύτταρους καλλιέργειες σφαιροειδείς δημιουργήθηκαν ομοίως όπως περιγράφεται [28]. Εν συντομία, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης σε συγκέντρωση 5 × 10

6 κύτταρα /ml, 30 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος χρησιμοποιήθηκαν για να κάνουν ένα σταγονίδιο και 12 σταγονίδια φορτώθηκαν στο καπάκι ενός στείρου 10 cm ιστού πλάκα καλλιέργειας. Το καπάκι προσεκτικά γυρίσει και 20 μΐ μέσου ανάπτυξης προστέθηκαν σε κάθε σταγονίδιο προτού τοποθετηθούν σε μία πλάκα καλλιέργειας ιστού 10-cm που περιέχει 6 ml μέσου αύξησης και επωάζονται όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, 20 μΙ του μέσου απομακρύνθηκε από κάθε σταγονίδιο και 20 μΙ φρέσκου μέσου χωρίς ΤΟΡ-β ή περιέχουν ΤΟΡ-β (τελική συγκέντρωση? 5 ng /ml) προστέθηκε. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες και συλλέχθηκαν για εξαγωγή RNA.

Στατιστική ανάλυση

Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και παρουσιάζονται ως η μέση τιμή +/- SD. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με

t-test για

σημασία δύο ουρών Student.

P

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές και εκπροσωπείται από αστερίσκους στα σχήματα.

Αποτελέσματα

ανεπάρκεια Trim28 μεταβάλλει την έκφραση της EMT δεικτών

Για να εξεταστεί ο ρόλος των Trim28 σε Α549 και Η358 μη μικροκυτταρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές πνεύμονα, τον έλεγχο και την ανεπάρκεια κυττάρων Trim28 αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας μη φίμωση shRNA ως έλεγχος και shRNA στόχευση Trim28. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε ένα αντίσωμα Ε καδερίνης και συνεστιακή μικροσκοπία για έκφραση Ε-καδερίνης εικόνας σε κύτταρα Α549 έλεγχο και σε Trim28 ανεπάρκεια A549s. Σύκο. 1Α δείχνει ότι τα κύτταρα Α549 έλεγχος εκφράζουν σχετικά χαμηλά επίπεδα Ε καδερίνης, ενώ Trim28 ελλειμματικών κύτταρα εκφράζουν μεγάλη E καντερίνης εντοπίζεται στη μεμβράνη του πλάσματος. Επίπεδα β-τουμπουλίνης δεν επηρεάστηκαν από Trim28 ανεπάρκειας. Real-time PCR χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση της έκφρασης των πρόσθετων δεικτών EMT στον έλεγχο και Trim28 ανεπάρκεια A549s και τα κύτταρα Η358. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, E-cadherin mRNA αυξάνεται ενώ Ν-καντερίνης και Snail2 μειώθηκαν σε knockdown κυττάρων Trim28. Σε κύτταρα Η358 (Εικ. 1Β κάτω) E-cadherin αυξάνεται, ενώ Ινωδονεκτίνης, Snail1, Snail2 και Twist1 μειώνονται σε νοκ ντάουν κύτταρα Trim28. Κηλίδες Western επιβεβαίωσε ότι Trim28 knockdown είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση στην έκφραση Ε-καδερίνης και μείωση στην έκφραση Ν-καδερίνης στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 1 C). Η μείωση της πρωτεΐνης Ν-καδερίνης ήταν επίσης εμφανής με συνεστιακή μικροσκοπία (βλέπε Σχ S1). Οι αντίστοιχες θετικές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης Trim28 και της έκφρασης Ν-cadherin και την αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Trim28 και της έκφρασης Ε-καδερίνης είναι επίσης εμφανής όταν μια σειρά από μη κατεργασμένου δείγματος κυτταρικές σειρές εξετάζονται από κηλίδωση Western (βλέπε σχήμα S2).

A

, τον έλεγχο και Trim28 knockdown Α549 κύτταρα χρωματίστηκαν (όπως περιγράφεται στο «Πειραματικές Διαδικασίες») και εξετάστηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, ως ακολούθως: Ε-καδερίνης (πράσινο, άνω πλαίσιο), β-τουμπουλίνης ( πράσινο, κάτω πάνελ) και DAPI (μπλε). Συγχωνευμένη εικόνες είναι στο κάτω μέρος της κάθε πάνελ.

B

, RNA εκχυλίσματα ελέγχου και Trim28 knockdown Α549 και Η358 κύτταρα υποβλήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου για τον προσδιορισμό της έκφρασης των γονιδίων στόχων όπως υποδεικνύεται.

Οι αστερίσκοι

αντιπροσωπεύουν σημαντική

σ

αξίες, *:

σ

& lt? 0,05.

C

, η έκφραση του EMT Σημάδια Ε-καδερίνης και Ν-καδερίνης μετρήθηκαν σε έλεγχο και Trim28 knockdown Α549 και Η358 κυττάρων με κηλίδωση Western.

Η

Trim28 υπερέκφραση μεταβάλλει την έκφραση του EMT δείκτες

από προηγούμενη εργασία έχει αναφέρει ότι Trim28 μπορεί να δράσει ως συν-παράγοντα μεταγραφής [16], [17], αναρωτηθήκαμε εάν Trim28 μπορεί να ρυθμίσει τη δραστηριότητα του υποκινητή Ε-καδερίνης, χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης οδηγείται από τον υποκινητή Ε-καδερίνης. Άδειο φορέα pcDNA ή pCS2-Μγο-Trim28 πλασμίδια διαμολύνθηκαν σε Α549 και Η358 κύτταρα μαζί με ένα κατευθυνόμενο από υποκινητή αναφοράς λουσιφεράσης της Ε-καδερίνης και ρεπόρτερ έλεγχος επιμόλυνσης (PRL-ΤΚ Renilla λουσιφεράση). Σύκο. 2Α δείχνει ότι ο υποκινητής Ε-καδερίνης καταστέλλεται σημαντικά με Trim28 υπερέκφραση στις δύο κυτταρικές σειρές. Για την αντιμετώπιση μεγαλύτερο αριθμό δεικτών Α549 και Η358 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Trim28 προήλθαν μαζί με γραμμές ελέγχου παρομοίως προερχόμενο χρησιμοποιώντας κενό φορέα. Όπως ήταν αναμενόμενο, Trim28 υπερέκφραση οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης, ενώ τα επίπεδα Ν-cadherin αυξήθηκαν (Εικ. 2Β). Παρόμοια αποτελέσματα (Σχ. 2C) ελήφθησαν σε επίπεδο mRNA χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι μπορεί να προωθήσει Trim28 EMT σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα.

A

, Α549 και Η358 επιμολύνθηκαν εις τριπλούν με Ε-καδερίνης ανταποκριτή λουσιφεράσης προαγωγό, ρΡΙ_-ΤΚ ρεπόρτερ, και πλασμίδια έκφρασης που αναφέρονται στο σχήμα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για τον προσδιορισμό των επιπέδων λουσιφεράσης.

Β

, ελέγχου (pcDNA3) και σημαία-Trim28 εκφράζεται σταθερά Α549 και Η358 κύτταρα αναλύθηκαν για E-cadherin και N-cadherin επίπεδα με western αποτύπωση.

C

, RNA εκχυλίσματα ελέγχου και Trim28 σταθερώς εκφράζονται Α549 και Η358 κύτταρα υποβλήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου. Η έκφραση των γονιδίων στόχων προσδιορίστηκε.

Οι αστερίσκοι

αντιπροσωπεύουν σημαντική

σ

αξίες, *:

σ

& lt? 0,05

Η

έκφραση Trim28 προκαλείται από τον TGF-β

είναι γνωστό ότι η έκφραση Trim28 και σηματοδότηση ΤΟΡ-β αυξάνονται και τα δύο σε μια ποικιλία καρκίνων συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα [9], [23], [29]. Για να καθοριστεί εάν αυτές οι παρατηρήσεις που συνδέεται στον καρκίνο του πνεύμονα, χρησιμοποιήσαμε δύο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμές κυττάρων που υποβάλλονται σε ΕΜΤ κατά την κατεργασία του ΤΟΡ-β ως μοντέλα [30], [31]. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 3Α, τα επίπεδα πρωτεΐνης Trim28 αυξήθηκε κατά την κατεργασία του ΤΟΡ-β στις δύο κυτταρικές σειρές. Παρόλο που το βασικό επίπεδο Trim28 ήταν πολύ χαμηλή σε Trim28 knockdown κυττάρων, η έκφραση της ήταν παρ ‘όλα αυτά που προκαλείται μετά από επώαση ΤΟΡ-β. Real-time PCR έδειξε το ανάλογο αποτέλεσμα στα επίπεδα mRNA (Σχήμα 3Β).

Μια

και

Β

, Α549 και Η358 που εκφράζουν σταθερά μη φίμωση shRNA και Trim28 shRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-β (2 ng /ml) για 3 έως 10 ημέρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων και εκχυλίσματα RNA υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (Α) και πραγματικού χρόνου PCR (Β).

Οι αστερίσκοι

αντιπροσωπεύουν σημαντική

σ

αξίες, *:

σ

& lt? 0,05

Η

Trim28 συμμετέχει σε TGF-β επαγόμενη EMT

κύτταρα επεξεργασμένα TGF-β θα υποστεί EMT που μπορεί να χαρακτηρίζεται από μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων από βότσαλα που μοιάζουν με άξονα-όπως μορφή [32]. Για να καθοριστεί εάν Trim28 απαιτείται για ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT, υποβάλλαμε σε αγωγή έλεγχο και Trim28 knockdown κυττάρων με ΤΟΡ-β (2 ng /ml) και παρατηρήθηκε η μορφολογική μεταβολή με το χρόνο. Σύκο. 4Α δείχνει ότι η απόκτηση των μεσεγχυματικών μορφολογία στον έλεγχο Η358 επάγεται από ΤΟΡ-β δεν παρατηρήθηκε σε Trim28 knockdown κυττάρων υπό τις ίδιες συνθήκες, υποδηλώνοντας έντονα ότι Trim28 εμπλέκεται σε ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT. Χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, εξετάσαμε το επίπεδο mRNA του Ε-καδερίνης και άλλα γνωστά δείκτες μεσεγχυματικά στον έλεγχο Α549 και κύτταρα Trim KD μετά την επεξεργασία του ΤΟΡ-β. Αν και σε νοκ ντάουν κύτταρα Trim28 ορισμένα γονίδια μεσεγχυματικά παρουσιάζουν ελαφρά προς τα πάνω ρύθμιση, την ισχυρή επαγωγή δείκτες μεσεγχυματικών Ν-cadherin, φιμπρονεκτίνη, βιμεντίνη και Twist1 που προκαλείται από τον TGF-β θεραπεία ήταν σημαντικά εξασθενημένος (Σχήμα 4Β). αποτελέσματα κηλίδας Western (4Γ) επιβεβαιώνουν ότι ο TGF-β είναι σε θέση να μειώσει E-cadherin και up-ρυθμίζουν την έκφραση Ν-καντερίνης στα κύτταρα ελέγχου, αλλά παραλείπει να το πράξει στο Trim28 νοκ ντάουν κύτταρα.

A

, τον έλεγχο και Trim28 knockdown κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 40 φορές.

B

, RNA εκχυλίστηκε από τον έλεγχο και την Trim28 κύτταρα knockdown Α549 σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β ως ανωτέρω ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε και η έκφραση των γονιδίων στόχων προσδιορίστηκε.

C

, κύτταρα ελέγχου και Trim28 knockdown Α549 και Η358 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-β (2 ng /ml) έως ότου οι αλλαγές μορφολογία παρατηρήθηκαν ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα όπως υποδεικνύεται.

Η

Η εξάντληση των Trim28 μειώνει τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή

Ο ρόλος των Trim28 στη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή αξιολογήθηκε από τυλίγεται ομαλά σε ρολό επούλωση προσδιορισμού και ο προσδιορισμός transwell εισβολή Matrigel που βασίζεται. Σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε ότι Trim28 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Α549, αλλά όχι σημαντικά σε Η358 κύτταρα (μη δημοσιευμένα δεδομένα και [9]). Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μέσα καλλιέργειας με ή χωρίς FBS για να αποκλειστεί η συμβολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στον προσδιορισμό της μετανάστευσης των κυττάρων Α549. Trim28 knockdown κύτταρα έδειξαν λιγότερο από το κλείσιμο του τραύματος κύτταρα ελέγχου (Σχ.5 Α και 5Β) με ή χωρίς ορό. Επιπλέον, ο προσδιορισμός transwell εισβολή Matrigel που βασίζεται έδειξε ότι Trim28 knockdown ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων των κυττάρων Α549 (Σχήμα 5C).

A

, τον έλεγχο και Trim28 knockdown Η358 κύτταρα υποβλήθηκαν σε τραύματος -healing δοκιμασία. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν αμέσως μετά το μηδέν, και 24 ώρες και 48 ώρες μετά το μηδέν.

B

, τον έλεγχο και Trim28 κύτταρα knockdown Α549 υποβλήθηκαν σε δοκιμασία τραύματος επούλωσης απουσία ή παρουσία ορού. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν αμέσως μετά το μηδέν και 24 ώρες αργότερα.

C

, τον έλεγχο και Trim28 knockdown κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν στην κορυφή φρεάτια επικαλυμμένα με Matrigel ή μη επικαλυμμένα θαλάμους. Μετά από 18 ώρες, τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσα από το στρώμα Matrigel μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν. Το ποσοστό των μεταστατικών κυττάρων φαίνεται στο ραβδόγραμμα.

Οι αστερίσκοι

αντιπροσωπεύουν σημαντική

σ

αξίες, *:

σ

& lt? 0,05.

D

, τον έλεγχο και Trim28 knockdown κυττάρων Α549 καλλιεργήθηκαν σε ένα τρισδιάστατο μοντέλο και υποβάλλεται σε αγωγή με ΤΟΡ-β (5 ng /ml) για 72 ώρες. RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε πραγματικό χρόνο PCR. Η έκφραση των γονιδίων στόχων προσδιορίστηκε.

Η

καλλιέργειες Τρισδιάστατο κυττάρων έχουν δειχθεί να υποβληθούν σε EMT πιο αποτελεσματικά από τα κύτταρα μονοστιβάδας [28]. Για να εξεταστεί εάν Trim28 knockdown καταστέλλει ΕΜΤ σε ένα τρισδιάστατο μοντέλο, έχουμε σπάρθηκε ελέγχου και Trim28 knockdown κυττάρων Α549 στα καλύμματα του πιάτου Ρ100 καλλιέργειας και τους επέτρεψε να σχηματίσουν κρέμονται σταγόνες, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Μετά από 72 ώρες παρουσία του ΤΟΡ-β, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το RNA εκχυλίζεται για PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση δεικτών EMT. Σύκο. 4Β αποκαλύπτει ότι μετά την κατεργασία του ΤΟΡ-β η έκφραση της βιμεντίνης, Snail1, και Snail2 σε κύτταρα Α549 έλεγχο αλλάξει περισσότερο δραματικά (6 έως 10 φορές) στο μοντέλο 3D (Σχ. 5D) από εκείνες σε μονοστιβάδες (1,5 έως 2,5 φορές). Ωστόσο, αυτοί οι δείκτες ΕΜΤ δεν ήταν πάνω ρυθμισμένα σε Trim28 knockdown κυττάρων μετά ΤΟΡ-β θεραπεία. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το εύρημα μας ότι Trim28 είναι ένας ρυθμιστής της EMT.

Trim28 αλλάζει ιστόνης 3 τροποποιήσεις στο E-cadherin και υποστηρικτές Ν-cadherin

Trim28 έχει αποδειχθεί για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω τροποποίηση των ιστονών υποκινητών γονιδίου στόχου [8]. Γνωστά συνεργάτες του Trim28 περιλαμβάνουν SETDB1 [19], ένα ιστόνης 3 λυσίνη 9-ειδική μεθυλτρανσφεράση και ιστόνης αποακετυλασών όπως HDAC1 [8]. Σε προηγούμενη εργασία μας, διαπιστώσαμε ότι Trim28 νοκ ντάουν αυξάνει ιστόνης 3 λυσίνη 9 ακετυλίωση σε ορισμένους προαγωγούς στόχο [9]. Εδώ, ερευνήσαμε αν Trim28 επηρεάζει ιστόνης 3 τροποποίηση των Ε-καδερίνης και Ν-cadherin προαγωγούς. δοκιμασίες ChIP χρησιμοποιήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν IgG, ακετυλο-H3K9, διμεθυλο-H3K9, και τριμεθυλο-H3K9 αντισώματα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, σε ελλειμματικά κύτταρα Trim28, ακετυλίωση αυξάνεται ενώ η μεθυλίωση είναι μειωμένη σε ιστόνης 3 λυσίνης 9 του υποκινητή Ε-καδερίνης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου shRNA. Ένα αντίθετο αποτέλεσμα επί Ν-καδερίνης παρατηρήθηκε στα ίδια κύτταρα.

A

, δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν σε έλεγχο και Trim28 κύτταρα knockdown Α549. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε για την εξέταση της πληρότητας των IgG, ακετυλιωμένης ιστόνης 3 Κ9, απομεθυλιώνεται ιστόνης 3 Κ9, και τριμεθυλιωμένη ιστόνης 3 Κ9 επί Ε-καδερίνης και προαγωγούς Ν-καδερίνης. Β, αναλύσεις ChIP διεξήχθησαν σε έλεγχο και Trim28 εκφράζεται σταθερά κύτταρα Α549. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε για την εξέταση της πληρότητας των IgG, ακετυλιωμένης ιστόνης 3 Κ9, απομεθυλιώνεται ιστόνης 3 Κ9, και τριμεθυλιωμένη ιστόνης 3 Κ9 επί Ε-καδερίνης και Ν-cadherin προαγωγούς.

Η

Επιπλέον, για να αποδείξουν αν Trim28 υπερέκφραση μπορεί να επηρεάσει τα E-cadherin και N-cadherin υποστηρικτές, χρησιμοποιήσαμε τον έλεγχο pcDNA3 και Trim28-καλά κύτταρα Α549 και εκτελείται δοκιμασία chip. Στο Σχ. 6Β, αντίθετα με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε Trim28 knockdown κυττάρων, η ακετυλίωση της ιστόνης H3K9 μειώνεται και μεθυλίωση αυξάνεται σε Trim28-καλά κύτταρα. Στις υποκινητή Ν-cadherin, η ακετυλίωση της ιστόνης 3 H3K9 αυξάνεται και μεθυλίωση μειώνεται. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι Trim28 μεταβάλλει E-cadherin και την έκφραση Ν-cadherin (τουλάχιστον εν μέρει) με τροποποίηση των ιστονών που με τη σειρά τους ρυθμίζουν τη μεταγραφή τους.

Συζήτηση

Έχουμε δείξει ότι μπορούμε Trim28 επηρεάζουν την μετα-μεταφραστική τροποποίηση της ιστόνης 3 για Ε-καδερίνη και προαγωγούς Ν-καδερίνης. Σε αυτό το σημείο δεν έχουμε διαλευκανθεί οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί που εμπλέκονται. Trim28 μπορεί να μεσολαβήσει σε αυτές τις τροποποιήσεις, άμεσα ή έμμεσα. Η άμεση μηχανισμός θα περιλαμβάνει Trim28 και Trim28 που σχετίζονται με τροποποιητές της ιστόνης να προσληφθεί στην καντερίνη υποστηρικτές από EMT-ρύθμιση μεταγραφικών παραγόντων. Trim28 έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύουν και ρυθμίζουν πολλούς παράγοντες μεταγραφής με τον τρόπο αυτό [16], [19], [33]. Ωστόσο, έχουμε σχεδιάσει εκκινητές στοχεύουν το -2 kb έως 0.5 kb του Ε-καδερίνης και Ν-καδερίνης προαγωγούς και απέτυχε να ανιχνεύσει μια περιοχή σύνδεσης Trim28 με δοκιμασία πλινθίου (αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι Trim28 ρυθμίζει την έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με τους παράγοντες μεταγραφής που θα ρυθμίζει περαιτέρω γονίδια EMT. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που μπορούν να διαμένουν άμεσα με υποκινητή E-cadherin περιλαμβάνουν Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, Twist1 και FOXC2 [4]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι η έκφραση πολλών μεταγραφικών παραγόντων αλλάζει με Trim28 υπερέκφραση ή ανεπάρκεια η οποία παρέχει στοιχεία που να υποστηρίζουν αυτή τη δυνατότητα. Περαιτέρω έρευνες θα διερευνήσει αυτό το μηχανισμό.

Το πιο αξιοσημείωτο στοιχείο της δουλειάς μας που περιγράφονται εδώ είναι ότι Trim28 επηρεάζει TGF-β επαγόμενη EMT στον καρκίνο του πνεύμονα μέσω της μεταγραφικής ρύθμισης των πολλαπλών δεικτών επιθηλιακών και μεσεγχυματικών. Ποντίκι μελέτες νοκ-άουτ όρους έχουν δείξει σαφώς ότι Trim28 και συναφή μέλος της οικογένειας μπορούν να συμπεριφέρονται ως καταστολείς των όγκων [34]? Ωστόσο, άλλες μελέτες υποδεικνύουν ότι Trim28 έχει αυξημένα επίπεδα και ογκογόνο επιδράσεις σε μια ποικιλία καρκίνων [21], [35]. Προτείνουμε το μοντέλο που φαίνεται στο Σχ. 7 για να εξηγήσει το διπλό ρόλο της Trim28 στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα και τη μετάσταση. Υποθέτουμε ότι Trim28, μέσω της ρύθμισης των πολλαπλών εναλλακτικών δρόμων μπορεί να έχει την καταστολή τόσο των όγκων και ογκογόνες δραστηριότητες σαν το μονοπάτι σηματοδότησης ΤΟΡ-β είναι γνωστό ότι παίζει έναν σύνθετο ρόλο ογκογένεση. Από τη μια πλευρά, ο ΤΟΡ-β1 ρυθμίζει αρνητικά τον κυτταρικό κύκλο και χρησιμεύει ως καταστολέας όγκων σε φυσιολογικούς και προ-malignment ιστούς. Από την άλλη πλευρά, ΤΟΡ-β, που εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα, προάγει εισβολή όγκου και η μετάσταση [36]. Προτείνουμε ότι Trim28 συμβάλλει σημαντικά στην ικανότητα του ΤΟΡ-β για συγκράτηση κυτταρικής ανάπτυξης και για τον ΤΟΡ-β1 να επάγει EMT. Αυτές οι δυνατότητες δεν αλληλοαναιρούνται και το δίκτυο αυτό μπορεί να είναι ακόμη πιο περίπλοκη όταν λαμβάνονται υπόψη τα στάδια και μορφές καρκίνου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, σε φυσιολογικούς ιστούς και καρκίνων πρώιμο στάδιο, Trim28 είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω της E2F μεταγραφικών παραγόντων και HDACs? Ως εκ τούτου, Trim28 δείχνει μία αντι-πολλαπλασιαστική λειτουργία και δρα ως καταστολέας όγκου. Σε προχωρημένο στάδιο ή μεταστατικούς καρκίνους, υψηλό επίπεδο Trim28 συμβάλλουν στην ΕΜΤ μέσω της ρύθμισης της μεταγραφής των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών γονιδίων, ως εκ τούτου, τα κύτταρα με υψηλό επίπεδο Trim28 τείνουν να έχουν ένα πιο επεμβατικές και μεταστατικό χαρακτήρα. Το μοντέλο αυτό υποστηρίζεται από αναφορές στη βιβλιογραφία [13], [24] και τα ευρήματά μας [9]. Τα αποτελέσματά μας μπορεί να ρίξει φως προς την κατανόηση των διπλούς ρόλους της σηματοδότησης TGF-β σε όγκους.

Αυτό το μοντέλο εξηγεί το έργο αυτό και το προηγούμενο έργο μας αποδεικνύει ένα ρόλο καταστολέα όγκου για Trim28 [9].

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. ανεπάρκεια

Trim28 μειώνει την έκφραση του Ν -cadherin.

C

ontrol και Trim28 κύτταρα knockdown Α549 χρωματίσθηκαν (όπως περιγράφεται στο «Πειραματικές Διαδικασίες») και εξετάστηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, ως εξής: Ν-καδερίνης (πράσινο, άνω πλαίσιο), β-τουμπουλίνης (πράσινο, κάτω πίνακα), και DAPI (μπλε). Συγχωνευθείσας εικόνες βρίσκονται στο κάτω μέρος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101040.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Trim28 δείχνουν έκφραση αρνητική συσχέτιση με την έκφραση καδερίνης Ε και θετική συσχέτιση με την έκφραση Ν-καδερίνης σε μια σειρά από μη μικροκυτταρικό γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Α, ολόκληρο κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Β, εντάσεις μπάντα ήταν ποσοτικά και απεικονίζονται σε λογαριθμική κλίμακα. Οι συσχετισμοί δεν είναι στατιστικά σημαντική

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101040.s002

(ΔΕΘ)