Αφηρημένο

γκαλεκτίνη-3 (Gal-3), ένα μέλος 31 kDa της οικογένειας των βήτα-galactoside- πρωτεΐνες δέσμευσης, έχει εμπλακεί στην πρόοδο των διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, οι προτεινόμενες ρόλοι διαφέρουν πολύ, που κυμαίνονται από όγκο προώθηση κυτταρικές λειτουργίες και αρνητικό αντίκτυπο στην πρόγνωση των ασθενών με ιδιότητες όγκου-κατασταλτικό και θετική προγνωστική αντίκτυπο. Εμείς και άλλοι έχουν προσδιορίσει προηγουμένως Gal-3 ως υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση με χρόνια παγκρεατίτιδα και φυσιολογικό παγκρεατικό ιστό. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν έτσι η ολοκληρωμένη ανάλυση των υποθετικών κυτταρικών λειτουργιών του Gal-3 με παροδική, καθώς και σταθερές σιγαστήρα ή υπερέκφραση του Gal-3 σε ένα πάνελ 6 καθιερωμένων παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι γαλεκτίνης-3 ρυθμίζεται αυξητικά στο επίπεδο mRNA σε καρκίνο του παγκρέατος και έντονα εκφράζεται στην πλειοψηφία των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Σε μεμονωμένες κυτταρικές σειρές, παροδική knockdown του Gal-3 έκφραση οδήγησε σε μέτρια ανασταλτικά αποτελέσματα στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή το αγκυροβόλιο-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά αυτά τα αποτελέσματα δεν ήταν σταθερό σε όλο το φάσμα των κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν. Επιπλέον, λειτουργικές επιδράσεις της διαμόρφωσης της Gal-3 έκφραση δεν παρατηρήθηκαν σε σταθερά νοκ ντάουν ή υπερέκφραση προσεγγίσεις

in vitro

και δεν μετέβαλε τα χαρακτηριστικά της ανάπτυξης των γυμνών όγκων ξενομοσχεύματος ποντικού

in vivo

. Τα δεδομένα μας, επομένως δεν υποστηρίζουν άμεσο λειτουργικό ρόλο της Gal-3 στην κακοήθη εξαλλαγή των παγκρεατικών επιθηλιακών κυττάρων, αν και δεν αποκλείονται παρακρινή ή συστηματικές επιδράσεις της Gal-3 έκφραση

Παράθεση:. Hann Α, Gruner Α , Chen Υ, Gress TM, Buchholz Μ (2011) περιεκτική ανάλυση της Κυτταρικής γκαλεκτίνη-3 αποκαλύπτει καμία συνεπής Ογκογόνες Λειτουργία σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (6): e20859. doi: 10.1371 /journal.pone.0020859

Επιμέλεια: Ίρις Schrijver, Stanford University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15η Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 10η του Μάη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 16, Ιουν, 2011

Copyright: © 2011 Hann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το γερμανικό ομοσπονδιακό Υπουργείο παιδείας και έρευνας (BMBF) στο πλαίσιο του προγράμματος NGFN της ιατρικής έρευνας του γονιδιώματος (PaCa-Net? ID έργο PKB-01GS08), καθώς και το 6ο ΠΠ της ΕΕ επιχορήγησης LSHB-CT-2006- 018771 (Integrated Project «MolDiag-Paca»). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα, την πιο κοινή μορφή του καρκίνου του παγκρέατος, έχει συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών & lt? 5%. Πάνω από το 80% των ασθενών παρουσιάζει σε προχωρημένο στάδιο της νόσου, χωρίς τη δυνατότητα για τους δυνητικούς θεραπευτική εκτομή του όγκου [1], [2]. Αν και η χημειοθεραπεία σε συνδυασμό με έναν αναστολέα μικρού μορίου στόχευσης σηματοδότηση υποδοχέα EGF έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι οδηγεί σε μια μικρή, αλλά σημαντική αύξηση στην επιβίωση σε τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικών όγκων, η πρόγνωση παραμένει μελαγχολική, με μέση επιβίωση δεν υπερβαίνει τους 6,2 μήνες [3] . Έτσι, οι νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις που βελτιώνουν την έκβαση απαιτούνται επειγόντως.

Η οικογένεια των πρωτεϊνών β-γαλακτοζίτη δέσμευσης (γαλεκτίνες) αποτελείται από 14 μέλη στα θηλαστικά. Ένα κοινό χαρακτηριστικό που διακρίνει γαλεκτίνες από άλλες λεκτίνες είναι τομέας υδατάνθρακες αναγνώρισή τους. Γαλεκτίνη-3 (Gal-3), το μέλος 31 kDa της οικογένειας αυτής, έχει συνδεθεί με μια ποικιλία όγκων, αν και με πολύ διαφορετικές ρόλους [4]. Gal-3 η υπερέκφραση σε καρκινικό ιστό έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [5], [6], σαφής κύτταρο νεφρικό καρκίνωμα [7], [8] και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [9]. Αντιστρόφως, μείωση Gal-3 έκφραση σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό αναφέρθηκε στον καρκίνο των ωοθηκών [10], αδενοκαρκίνωμα μήτρας [11], του καρκίνου του μαστού [12], [13] και του τραχήλου της μήτρας νεοπλασία [14]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, εκθέσεις υπήρξαν αντιφατικές. Μερικοί συγγραφείς περιγράφουν μια θετική συσχέτιση των υψηλών επιπέδων του Gal-3 έκφραση σε προχωρημένα στάδια του όγκου και κακή πρόγνωση [15] – [17], ενώ άλλοι συσχετίζουν μειωμένη έκφραση του Gal-3 με τη φτωχή πρόγνωση [18] – [20]. Στον καρκίνο του στομάχου, του Okada et al ανέφεραν ότι μειωμένη έκφραση Gal-3 συσχετίζονται με μετάσταση λεμφαδένα και το στάδιο προηγμένη όγκου [21], ενώ άλλες δύο ομάδες που προσδιορίζονται αυξημένη έκφραση του Gal-3 σε καρκίνο του στομάχου, αλλά δεν κατάφερε να βρει τον συσχετισμό με ιστοπαθολογική διαφοροποίηση ή την εξέλιξη του όγκου [22], [23].

Παρά τα αντικρουόμενα αποτελέσματα σχετικά με μια πιθανή προγνωστική ρόλο της Gal-3 έκφρασης, μερικές αναφορές έχουν περιγράψει τις λειτουργίες όγκο προώθηση της Gal-3 σε κυτταρικές σειρές όγκων

in vitro

. Knockdown του Gal-3 οδήγησε σε μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [24], η ενισχυμένη επαγωγή απόπτωσης σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα [25], και ανέστειλαν

in vitro

σχηματισμό αποικίας όπως επίσης και γυμνού ποντικού ξενομοσχεύματος επαγωγή σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [26]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει προηγουμένως ότι Gal-3 υπερεκφράζεται σταθερά στον καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση τόσο με τη χρόνια παγκρεατίτιδα και φυσιολογικό πάγκρεας [27] – [30]. Ωστόσο, οι έρευνες σε μια πιθανή λειτουργικός ρόλος του Gal-3 έκφραση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα δεν έχουν αναφερθεί. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν έτσι να αξιολογήσει πειραματικά τα αποτελέσματα των υπερέκφραση ή εξουδετέρωση της Gal-3 σε ένα ολοκληρωμένο σύνολο των παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές (Patù 8988s, Patù 8988t, S2-007, S2-028, IMIM-Υ-1 και ΜΙΑ PaCa-2). Λειτουργικές αναλύσεις περιλαμβάνονται δοκιμασίες για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, την απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξης καθώς και την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Εκτός από απομονωμένα αποτελέσματα σε μονές γραμμές κυττάρων, της διαφοροποίησης των Gal-3 έκφραση δεν είχε καμία επίδραση επί συνεπής όγκων σχετικά χαρακτηριστικά των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα γραμμή IMIM-PC-1 [31] παρασχέθηκε ευγενώς από τον FX Real (Ινστιτούτο Municipale de Investigacion Medica, Βαρκελώνη, Ισπανία). S2-028 και S2-007 [32] ήταν από Τ Iwamura (Miyazaki Medical College, Μιγιαζάκι, Ιαπωνία). ΜΙΑ PaCa-2 ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, RMD, USA). Patu 8988t και Patù 8988s ήταν ευγενική παραχώρηση από Η.Ρ. Elsässer (Institut für Klinische Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps Universität, Marburg, Γερμανία). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο βασικό μέσο Dulbecco (GIBCO, Invitrogen Corp., ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% FCS (GIBCO, Invitrogen Corp., ΝΥ, USA) και Γενταμυκίνη 0,045 mg /ml (GIBCO, Invitrogen Corp. , NY, USA).

Ηθική Δήλωση

χειρουργικά αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος και της χρόνιας παγκρεατίτιδας ιστούς δόθηκαν από τις υπηρεσίες της χειρουργικής επέμβασης στα πανεπιστήμια του Ulm και Homburg /Saar. Κανονική δείγματα παγκρέατος λήφθηκαν από υγιείς περιοχές στα σύνορα της χρόνιας παγκρεατίτιδας resectates. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη χρήση δειγμάτων ιστών. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Ulm, Γερμανία (Ethikkommission der Universitaet Ulm), καθώς και την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Homburg /Saar, Γερμανία (Ethikkommission der Universitaet Homburg).

Η επιμόλυνση κυτταρικών σειρών

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) μετασκευάστηκε σε Patù 8988s, S2-007 και S2-028 κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο siLentFect λιπιδίων (Bio-Rad, Μόναχο, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. διαμόλυνση siRNA σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Transmessenger (Qiagen, Hilden, Germany) και IMIM-PC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο X-tremeGENE siRNA Επιμόλυνσης (Roche, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών, αντίστοιχα. Οι Gal-3-ειδικό siRNAs ήταν: Sigal-3-1, Hs_LGALS3_1 FlexiTube siRNA SI00470036 και Sigal-3-2, Hs_LGALS3_2 FlexiTube siRNA SI00470043 (Qiagen). Silencer αρνητικού ελέγχου από Ambion χρησιμοποιήθηκε ως μη φίμωση ελέγχου.

Ο φορέας έκφρασης Gal-3 κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση του ΡΟΚ-ενισχυμένου Gal-3 ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης εντός του φορέα /V5 dest pcDNA V3.2 χρησιμοποιώντας η τεχνολογία της κλωνοποίησης ανασυνδυασμού πύλη (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων 8988t Patù χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 Μορφομετατροπή Αντιδραστήριο (Invitrogen), την επιλογή των σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών κλώνων πραγματοποιήθηκε με προσθήκη 800 μg /ml G418 στο μέσο καλλιέργειας.

Α Gal-3-ειδικό κατασκεύασμα έκφρασης shRNA στο φορέα pGIPZ αγοράστηκε από την Open Biosystems, Huntsville, AL, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής (cat. # RHS4430-99137619). Μη φίμωση shRNAmir (cat. # RHS4348, Ανοιχτό Biosystems) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Σταθερή διαμόλυνση των κυττάρων S2-007 διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Σταθερά επιμολυσμένα κλώνοι επιλέχθηκαν προσθέτοντας υγρομυκίνη (400 μg /ml) στο μέσο καλλιέργειας.

RNA Εκχύλιση και qRT-PCR

RNA από κυτταρικές γραμμές εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας peqGold Ολικό RNA Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. δείγματα χύμα όγκου ιστού ομογενοποιήθηκαν επί ξηρού πάγου /υγρού αζώτου χρησιμοποιώντας ένα γουδί και γουδοχέρι. RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας το Omniscript RT Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green βασικού μείγματος (Applied Biosystems, Wellesley, ΜΑ, USA) και των ειδικών ζευγών εκκινητών σχεδιάστηκε με το πρόγραμμα PrimerExpresss (Applied Biosystems). Τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για qRT-PCR: ριβοσωμικής πρωτεΐνης, μεγάλο, P0 (RPLP0) FWD: 5′-TGGGCAAGAACACCATGATG-3 ‘? στροφή μηχανής. 5’-AGTTTCTCCAGAGCTGGGTTGT-3 ‘? Γαλεκτίνη-3 FWD: 5’-AGAGGGAATGATGTTGCCTTCC-3 ‘? rev:. ACAATGACTCTCCTGTTGTTCTCATT-3 ‘

Υποκυτταρική κλασματοποίηση και ανοσοκηλίδωση

Υποκυτταρική κλασμάτωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1.600 σ.α.λ. στους 4 ° C. Τα προϊόντα λύσης μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM Hepes ρΗ 7,9? 10 mM KCl? 0,1 mM EDTA? 0,1 mM EGTA? 1 mM DTT? Αναστολείς πρωτεϊνάσης) για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά σε 3.600 σ.α.λ. Τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε νέα κύπελλα και φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 σ.α.λ. για επιπλέον 4 λεπτά. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 30-100 ml ρυθμιστικού διαλύματος C (20 mM Hepes ρΗ 7,9? 0,4 Μ NaCl? 1 mM EDTA? 1 mM EGTA? 1 mM DTT? Αναστολείς πρωτεϊνάσης) και επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Ένα τελικό στάδιο φυγοκέντρισης στις 14.000 σ.α.λ. για 10 λεπτά διεξήχθη για να διαχωρίσει πυρηνικές πρωτεΐνες από κυτταρικά θραύσματα. Για στύπωμα Western, τα προκύπτοντα εκχυλίσματα πυρηνικής πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν μέσα από ένα 7.5% πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε PVDF μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [34]. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν είτε με αντι-Gal-3 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, cat. # A3A12, Abcam, Cambridge, UK), αντι-Orc2 (κουνελιού πολυκλωνικό, cat. # 559266, BD Biosciences), αντι-PARP (κουνέλι πολυκλωνικό, γάτα . # 9542, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), ή αντι-β-ακτίνης (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, cat. # A1978, Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΙ, USA) αντισώματα, πλύθηκαν σε TBS ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης και επωάστηκαν με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Βελτιωμένο σύστημα αντίδρασης χημειοφωταύγειας (Roche) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση.

ΜΤΤ βιωσιμότητα κυττάρου δοκιμασία

Τα κύτταρα επανακαλλιεργήθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε 3,9 cm

2 πιάτα στο 60.000 έως 100.000 κύτταρα /φρεάτιο . Μετά από επιπλέον 24 ώρες ή 48 ώρες καλλιέργειας, το μέσο αντικαταστάθηκε με ΜΤΤ-περιέχον μέσον (θειαζολύλιο μπλε, ο Carl Roth, Karlsruhe, Germany) και τα πιάτα επωάζονται επί 2 ώρες στους 37 ° C. Το ΜΤΤ μέσο που περιέχει αντικαταστάθηκε με διάλυμα διαλυτοποίησης (10% Triton Χ-100 (Carl Roth), 0,1 molar υδροχλωρικό οξύ (Fisher Scientific, Schwerte, Γερμανία) διαλυμένο σε ισοπροπανόλη (Sigma-Aldrich)) και απόσβεση μετρηθείσα σε 570 nm. 48 τιμές h διαιρέθηκαν με 24 τιμές h για να διορθώσει για πιθανές διακυμάνσεις των αριθμών των σπαρμένων κυττάρων.

πολλαπλασιασμού BrdU κυττάρων δοκιμασία

αντιγραφή του DNA ως άμεσο μέτρο της μιτωτικής δραστηριότητας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Ο πολλαπλασιασμός ELISA, BrdU χημειοφωταύγεια Kit (Sigma) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5.000 έως 10.000 κύτταρα επανασπάρθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε ένα 96 φρεατίων μClear πλάκες (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany). BrdU που περιέχει μέσο προστέθηκε για 4 ή 6 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του BrdU που περιέχει μέσο, ​​τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με το συζευγμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα αντι-BrdU για 1,5 h. Η αντίδραση χημειοφωταύγειας μετρήθηκε σε σχετικές μονάδες φωτός ανά δευτερόλεπτο (RLU /s).

Trail απόπτωση που επάγεται από

Για να προκληθεί εξωγενώς απόπτωση σε Patù 8988s κύτταρα, 300.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε 9,6 εκατοστά

2 δίσκους καλλιέργειας και αντιμετωπίζονται με την πρωτεΐνη TRAIL (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ). σε μία δόση των 25 ng /ml για 24 ώρες

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Τροποποιημένο Boyden δοκιμασίες θάλαμος διεξήχθησαν με επανασπορά 20.000 έως 40.000 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού στο παρεμβλημάτων Transwell με μέγεθος πόρων 8 μm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Ένθετα αιωρήθηκαν σε 24well πλάκες γεμίζουν με μέσο συμπληρωμένο με 1% FCS. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς το κάτω όψη της μεμβράνης για 2 ή 4 ώρες στους 37 ° C. Μη κύτταρα που μετανάστευσαν αφαιρεθεί από το εσωτερικό των ένθετων, χρησιμοποιώντας μπατονέτες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν χρωματίστηκαν με εμβάπτιση των μεμβρανών σε 0.2% crystal violet σε 20% μεθανόλη για 10 λεπτά. Κύτταρα που μετανάστευσαν μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 10 ×.

μαλακό άγαρ δοκιμασίες

Προκειμένου να αξιολογηθεί η δυνατότητα για ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, μαλακό άγαρ δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],35]. Εν συντομία, 1 χ 10

4 κύτταρα ανά 9,6 cm

2 τρυβλίο καλλιέργειας κυττάρων σπάρθηκαν σε DMEM /0.33% Bacto-Agar σε ένα κάτω στρώμα από DMEM /0.5% Bacto-Agar. Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη μετρήθηκε μετά από 7 ημέρες επώασης μετρώντας τον αριθμό βιώσιμων αποικιών.

Nude ξενομοσχεύματα ποντίκι

NMRI-

ηυ /ηυ ποντίκια

αναπαράχθηκαν και διατηρήθηκαν σε ένα περιβάλλον χωρίς παθογόνα. Θηλυκό 6-8 εβδομάδων ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Για να παραχθούν τα ξενομοσχεύματα, 10

6 καρκινικά κύτταρα σε 0.1 ml ϋΜΕΜ χωρίς ορό εγχύθηκαν subcuntaneously στα πλευρά των ποντικών. Τρεις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, οι ποντικοί θανατώθηκαν, οι όγκοι αφαιρέθηκαν και τα μεγέθη των όγκων προσδιορίσθηκαν. Το ένα ήμισυ κάθε όγκου αποθηκεύτηκε σε 2% φορμαλδεΰδη και εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη για ιστολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση. Το άλλο μισό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για RNA και την απομόνωση της πρωτεΐνης.

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του Gal-3 σε καρκίνο του παγκρέατος

Σε αναλύσεις προηγούμενη μικροσυστοιχίες υψηλής περιεκτικότητας, έχουμε εντοπίσει Gal-3 ως ένα από τα γονίδια που υπερεκφράζεται σε μικροδιατομή παγκρεατικό καρκινικούς ιστούς [28]. Προκειμένου να επικυρώσει τα αποτελέσματα αυτά, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό πραγματικό χρόνο PCR (qRT-PCR) σε ένα σύνολο των δειγμάτων ιστού, συμπεριλαμβανομένων 10 τον καρκίνο του παγκρέατος, 5 χρόνια παγκρεατίτιδα και 5 δείγματα φυσιολογικού παγκρεατικού ιστού. Gal-3 mRNA επίπεδα ήταν ελαφρώς αυξημένα στις χρόνιες δείγματα pancreatits, και έντονα αυξητικά στην πλειονότητα των δειγμάτων καρκίνου (Εικ. 1Α), επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. Η μετέπειτα ανάλυση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παγκρέατος κατέδειξε ισχυρή έκφραση, τόσο στο mRNA καθώς και στο επίπεδο πρωτεΐνης, σε 5 από τις 6 εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές (Εικ. 1Β).

επίπεδα Gal-3 mRNA προσδιορίστηκαν με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) (Α, Β). Ριβοσωμικής πρωτεΐνης, μεγάλο, P0 (RPLP0) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. PC: καρκίνο του παγκρέατος? CP: χρόνια παγκρεατίτιδα? NP: φυσιολογικό πάγκρεας. Η έκφραση της πρωτεΐνης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος προσδιορίστηκε με κηλίδα Western (C) αναλύσεις. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

επίπεδο έκφρασης της Gal-3 δεν έχει καμία επίδραση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

Η

Για να εκτιμηθεί το λειτουργικό ρόλο της παρεκκλίνοντα εκφράζεται Gal-3 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, Gal-3 παροδικά ή σταθερά υπερεκφράζονται ή σιγήσει σε διαφορετικές παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και τα αποτελέσματα αναλύονται σε διάφορες

in vitro

λειτουργικές δοκιμασίες. Για παροδική σίγηση, χρησιμοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητες αλληλουχίες siRNA καθώς και ένα siRNA ελέγχου μη-αποσιώπησης. Για κάθε μία από τις πέντε κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν (Patù 8988s, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 και ΜΙΑ PaCa-2), αντιδραστήρια και -οι όροι διαμόλυνση βελτιστοποιήθηκαν για να επιτευχθεί βελτίωση της αποτελεσματικότητας knockdown & gt? 80% (Σχ. 2Α).

(Α) παροδική knockdown του Gal-3 πραγματοποιήθηκε με παροδική επιμόλυνση των πολλαπλών κυτταρικών γραμμών χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά 3 Gal-ειδικές αλληλουχίες siRNA (Sigal-3 1 και 2) ή ένα μη φίμωση έλεγχο siRNA (NC). (Β) Σταθερό knockdown στο S2-007 διεξήχθη χρησιμοποιώντας κατασκευάσματα έκφρασης shRNA. Τρία Gal-3 ειδικό shRNA επιμολυσμένων κλώνων (shGal-3 1, 2 και 3) και τρεις nonsilencing ελέγχου shRNA επιμολυσμένων κλώνων (SHC 1, 2 και 3) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. (Γ) Σταθερή υπερέκφραση του Gal-3 επιτεύχθηκε με επιμόλυνση των κυττάρων 8988t Patù με ένα φορέα Gal-3 έκφρασης (pGAL-3 1, 2 και 3) ή φορέα ελέγχου (PC 1 και 2). U δηλώνει μη επιμολυσμένα κύτταρα. Σύνολο κυτταρολύματα αναλύθηκαν με qRT-PCR (άνω πάνελ) και κηλίδας Western (κάτω πάνελ) για τα επίπεδα Gal-3 έκφραση. Gal-3 mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν σε σχέση με RPLP0. Sigal-3 1 και 2 κανονικοποιήθηκαν σε NC. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης των κηλίδων Western.

Η

Σταθεροί κλώνοι knockdown παρήχθησαν χρησιμοποιώντας S2-007 κύτταρα επιμολυσμένα με shRNA αλληλουχίες κλωνοποιήθηκε στο φορέα pGIPZ. Τρεις σταθερά επιμολυσμένων κλώνων, καθώς και τρεις φορέα ελέγχου επιμολυσμένοι κλώνοι επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (Σχ. 2Β).

Δεδομένου ότι τα κύτταρα 8988t Patù έδειξαν πολύ χαμηλή ενδογενή Gal-3 επίπεδα, αυτή η κυτταρική σειρά επελέγη για την κατασκευή σταθερών Gal-3 που υπερεκφράζουν κλώνους. ιδρύθηκαν τρεις ανεξάρτητους κλώνους. Δύο από αυτά έδειξαν μέτρια υπερέκφραση της ανασυνδυασμένης Gal-3 στο επίπεδο mRNA, η οποία ήταν πολύ πιο έντονη στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχ. 2C, λωρίδες 4, 6). Το υπόλοιπο κλώνος δεν παρουσίασε αξιόλογη έκφραση του ανασυνδυασμένου Gal-3 (Σχ. 2C, λωρίδα 5), αλλά συμπεριελήφθη στα περαιτέρω πειράματα ως πρόσθετη κλώνο ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι κλώνοι ελέγχου επιμολυσμένα με άδειο φορέα παρουσίασαν επίσης κάπως αυξημένες Gal-3 επίπεδα (Σχ. 2C, λωρίδες 2, 3).

Σε μία πρώτη λειτουργική δοκιμασία, η επίδραση της Gal-3 έκφραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν αναλύθηκαν με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Ούτε παροδική knockdown σε οποιαδήποτε από τις 5 δοκιμάστηκαν κυτταρικές γραμμές, ούτε σταθερή knockdown σε S2-007 κύτταρα ή σταθερή υπερέκφραση σε κύτταρα 8988t Patù είχε οποιαδήποτε σημαντική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας σε σύγκριση με τα κατάλληλα στοιχεία ελέγχου (Σχ. 3 Α- C).

Παροδικά Gal-3 σιγήσει κυτταρικές γραμμές (Α), σταθερά Gal-3 σιγήσει S2-007 κυτταρικοί κλώνοι (Β) ή σταθερώς Gal-3 που υπερεκφράζουν Patù κλώνους 8988t κυττάρου (C) καλλιεργήθηκαν για 24 και 48 ώρες που ακολουθείται από επώαση με αντιδραστήριο ΜΤΤ. 48 ώρες τιμές διαιρέθηκαν με 24 τιμές h (για να διορθώσει για πιθανές διακυμάνσεις των αριθμών των σπαρμένων κυττάρων) και ομαλοποιήθηκε ως προς τον έλεγχο των siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (NC). Οι τιμές των σταθερών κλώνων Gal-3 knockdown κυττάρων (shGal-3 1, 2 και 3) και σταθερών κυτταρικών κλώνων Gal-3 που υπερεκφράζουν (pGAL-3 1, 2 και 3) κανονικοποιήθηκαν προς τη μέση του φορέα ελέγχου επιμολυσμένα σταθερούς κλώνους κυττάρων ( SHC 1, 2, 3 και pC 1, 2), αντίστοιχα. Δεδομένων περιλαμβάνει ένα ελάχιστο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς BrdU έδειξε μια μέτρια, αλλά σημαντική αναστολή της πολλαπλασιαστικής δραστικότητας σε S2-028 κύτταρα μετά από knockdown του Gal-3 (Εικ. 4Α , πάνελ 3). Ωστόσο, η τάση να μειώνεται ο πολλαπλασιασμός δεν έφθασε σε σημαντικότητα Patù 8988s και S2-007 κύτταρα, ήταν απούσα σε IMIM-PC-1 και ακόμη και αναστραφεί σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 (Σχ. 4Α). Ούτε σταθερά νοκ ντάουν στο S2-007 κύτταρα, ούτε σταθερή υπερέκφραση του Gal-3 σε κύτταρα 8988t Patù είχε καμία σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκύπτουν κλώνους.

Παροδικά Gal-3 σιγήσει κυτταρικές σειρές (Α), σταθερά Gal-3 σιγήσει S2-007 κυτταρικοί κλώνοι (Β) ή σταθερώς Gal-3 που υπερεκφράζουν Patù 8988t κυτταρικών κλώνων (C) καλλιεργήθηκαν με τον παράγοντα BrdU για 2 ή 4 ώρες. ενσωμάτωσης BrdU από πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα μετρήθηκε με ELISA. Οι τιμές των κυττάρων παροδικά επιμολυσμένων με διαφορετικά Gal-3 ειδικό siRNAs (Sigal-3 1 και 2) ομαλοποιήθηκαν για τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (NC). Οι τιμές των σταθερών κλώνων Gal-3 knockdown κυττάρων (shGal-3 1, 2 και 3) και σταθερών κυτταρικών κλώνων Gal-3 που υπερεκφράζουν (pGAL-3 1, 2 και 3) κανονικοποιήθηκαν προς τη μέση του φορέα ελέγχου επιμολυσμένα σταθερούς κλώνους κυττάρων ( SHC 1, 2, 3 και pC 1, 2), αντίστοιχα. Δεδομένων περιλαμβάνει ένα ελάχιστο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Δηλώνει

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα (διπλής όψης αταίριαστο

t-test

)

Η

Επίσης, παροδική Gal-3. knockdown είχε καμία επίδραση στην αποπτωτική δραστικότητα (όπως μετράται με διάσπαση PARP) του Patù 8988s κυττάρων απουσία (Εικ. 5, λωρίδες 1-4) ή παρουσία (Εικ. 5, λωρίδες 5-8) της εξωγενούς επαγωγέα απόπτωσης Trail. διάσπαση PARP προκλήθηκε από την διαδικασία επιμόλυνσης και ήταν πιο έντονη σε παρουσία Trail (Σχ. 5, λωρίδες 2 και 6), αλλά δεν ενισχύεται περαιτέρω με knockdown του Gal-3 (Σχ. 5, λωρίδες 3-4 και 7 -8).

Cells παροδικά επιμολυσμένα με Gal-3 ειδικό siRNAs (Sigal-3 1 και 2), nonsilencing ελέγχου siRNA (NC) ή μη επιμολυσμένα κύτταρα (U) αναλύθηκαν με κηλίδα Western για πολυ ADP-ριβόζη πολυμεράσης (PARP) διάσπαση. Αυξημένη διάσπαση, που υποδεικνύεται από το ενισχυμένο σήμα του κάτω ζώνη, παρατηρήθηκε σε όλες επιμολυσμένα κύτταρα. διάσπαση PARP ενισχύθηκε με κατεργασία με το Trail εξωγενή απόπτωση επαγωγέα, αλλά δεν επηρεάστηκε από Gal-3 knockdown. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων.

Η

Η αναπαραγωγή του αυτό το σύνολο πειραμάτων υπό συνθήκες χωρίς ορό που παράγεται παρόμοια αποτελέσματα, αποτυγχάνοντας να αποδείξει οποιαδήποτε συνεπή επίδραση της διαφοροποίησης του Gal-3 έκφραση στην κυτταρική ανάπτυξη ή απόπτωσης στα δοκιμάστηκαν κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ασυνεπής επίδραση του Gal-3 στην κυτταρική μετανάστευση

ext αναλύσαμε την επίδραση της Gal-3 έκφραση στην κυτταρική μετανάστευση σε ένα Boyden δοκιμασία θαλάμου. Τα κύτταρα ήταν σε θέση να μεταναστεύσουν μέσω φίλτρου κατά μήκος ενός εμβρύου κλίση ορό. Αριθμούς παροδικά Gal 3-σιγήσει μεταναστεύσει κύτταρα κανονικοποιημένη να μη φίμωση siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. Παροδική knockdown του Gal-3 είχε ως αποτέλεσμα μια τάση προς μειωμένη μετανάστευση των κυττάρων σε τρεις από τις πέντε κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν, αν και αυτή η επίδραση δεν έφθασε σημασία στις περισσότερες περιπτώσεις (Σχ. 6Α). Επιπλέον, το αποτέλεσμα αυτό δεν περιελήφθη στην κυτταρικούς κλώνους S2-007 με σταθερό Gal-3 knockdown (Εικ. 6, Β). Στην αντίστροφη αναλογία με τα αποτελέσματα των πειράματα παροδικής knockdown, σταθερή υπερέκφραση του Gal-3 σε κύτταρα 8988t Patù επάγεται μια τάση προς αυξημένη κυτταρική μετανάστευση (Εικ. 6, C), αν και η τάση αυτή και πάλι δεν έφθασε σημασία και ήταν επίσης εμφανής σε κλώνος pGAL-3 2, η οποία έδειξε χαμηλή ή απούσα έκφραση του ανασυνδυασμένου Gal-3 (βλέπε Σχ. 2C). Στο σύνολό τους, η διαμόρφωση των Gal-3 έκφρασης είχε μια ήπια και μάλλον αντιφατική επίδραση στις δοκιμασίες θάλαμο Boyden, υποστηρίζοντας έτσι κατά ένα σημαντικό ρόλο των κυτταρικών Gal-3 στην κατευθυνόμενη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Παροδικά Gal- 3 σιγήσει κυτταρικές γραμμές (Α), σταθερά Gal-3 σιγήσει S2-007 κυτταρικοί κλώνοι (Β) ή σταθερώς Gal-3 που υπερεκφράζουν Patù 8988t κυτταρικών κλώνων (C) καλλιεργήθηκαν σε ένθετα Boyden θαλάμων για 2 ή 4 ώρες. Τα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσω των πόρων των ένθετων κατά μήκος ενός εμβρύου κλίση ορό σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν μπλε του μεθυλενίου και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο. Οι αριθμοί των κυττάρων που μετανάστευσαν παροδικά επιμολυσμένων με διαφορετικά Gal-3 ειδικό siRNA (Sigal-3 1 και 2) ομαλοποιήθηκαν για τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (NC). Μεταναστεύσει σταθερό Gal-3 κύτταρα knockdown (shGal-3 1, 2 και 3) και σταθερή κύτταρα Gal-3 που υπερεκφράζουν (pGAL-3 1, 2 και 3) κανονικοποιήθηκαν προς τη μέση του φορέα ελέγχου επιμολυσμένων κλώνων σταθερές κυτταρικές (Shc 1, 2, 3 και pC 1, 2), αντίστοιχα. Δεδομένων περιλαμβάνει ένα ελάχιστο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Δηλώνει

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα (διπλής όψης αταίριαστο

t-test

)

Η

Αναστολή της Gal-3 έκφρασης. εξασθενίζει αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη σε ένα υποσύνολο του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος

in vivo

Η

Το δυναμικό για αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων αξιολογήθηκε με αξιολόγηση οι αριθμοί των αποικιών που σχηματίστηκαν σε μαλακό άγαρ προσδιορισμούς. Παροδική νοκ ντάουν της Gal-3 οδήγησε σε μια σαφή μείωση της ικανότητας σχηματισμού αποικιών για τις κυτταρικές σειρές Patù 8988s, S2-007 και IMIM-Υ-1, με την ισχυρότερη δράση και υψηλότερη στατιστική σημαντικότητα παρατηρήθηκε για S2-007 κύτταρα (Εικ. 7Α ). Αντίθετα, τα κύτταρα S2-028 και ΜΙΑ PaCa-2 δεν επηρεάστηκαν από την Gal-3 νοκ ντάουν. Από προηγούμενες εκθέσεις είχε δηλώσει ότι οι λειτουργίες προαγωγής του καρκίνου της Gal-3 σε άλλα συστήματα κυττάρων μπορεί να εξαρτάται από την υποκυτταρικό εντοπισμό της πρωτεΐνης [26], [36], [37], αναλύσαμε εάν η διαφορική επίδραση της Gal-3 νοκ ντάουν ικανότητα σχηματισμού αποικιών συσχετίζονται με διαφορετικές υποκυτταρική εντόπιση του Gal-3 στις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Gal-3 πρωτεΐνη ομοιόμορφα κατανεμημένη μεταξύ πυρήνα και κυτταρόπλασμα σε 2 PaCa και S2-007 κύτταρα ΜΙΑ και ήταν ελαφρώς υπερεκπροσωπούνται στα κυτοσολικά κλάσματα σε Patù 8988s, S2-028 και κυττάρων (Εικ. 7Β) 1 IMIM-PC-έτσι που δεν δείχνει συσχέτιση με την ευαισθησία προς Gal-3 knockdown.

(Α) Gal-3 παροδικά σιγήσει σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με χρήση δύο ανεξάρτητων αλληλουχιών siRNA (Sigal-3 1 και 2). Knockdown και έλεγχος κύτταρα σπάρθηκαν σε άγαρ και αποικία σχηματισμό μαλακών αξιολογείται μετά από 7 ημέρες. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (NC). Δεδομένων περιλαμβάνει ένα ελάχιστο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Δηλώνει p & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (διπλής όψης αταίριαστο

t

-τεστ). (Β) ανάλυση κηλίδας Western των πυρηνικών (n) και κυτταροπλασματική κλάσματα (γ) πρωτεΐνες που προέρχονται από καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές. Gal-3 δείχνεται στο άνω λωρίδα. χρώση β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η χρώση για την Orc2 πυρηνικό παράγοντα χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η καθαρότητα των υποκυτταρικών κλασμάτων. (Γ) ξενομοσχεύματος όγκοι επάγονται σε γυμνούς ποντικούς με υποδόρια ένεση δύο σταθερών Gal-3 knockdown S2-007 κλώνους κυττάρων (shGal-3 2 και 3) και δύο nonsilencing ελέγχου shRNA επιμολυσμένα S2-007 κλώνους (SHC 2 και 3). Έξι ποντικοί ανά πειραματική ομάδα αναλύθηκαν. οικόπεδα Box-and-μουστακιού απεικονίζουν όγκους όγκου την ημέρα 22 μετά την ένεση. Μουστάκια δηλώνουν 1.5 × διατεταρτημοριακό εύρος (IQR). Οι τιμές εκτός αυτού του εύρους εμφανίζονται ως μαύρα τρίγωνα. (D) Τα επίπεδα Gal-3 mRNA σε χύμα ιστό των όγκων ξενομοσχεύματος όπου προσδιορίζεται από qRT-PCR. RPLP0 χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς.

Η

Στη συνέχεια, ελέγχεται εάν η επίδραση στην αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη στην S2-007 κύτταρα μετατρέπονται επίσης υπόψη τις διαφορές στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

.

Για το σκοπό αυτό, ξενομοσχεύματος όγκοι προκλήθηκαν σε γυμνούς ποντικούς με υποδόρια ένεση S2-007 κυττάρων με σταθερή Gal-3 κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα knockdown ή ελέγχου, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στον όγκο του όγκου μεταξύ Gal-3 knockdown και ελέγχου όγκους παρατηρήθηκε (Εικ. 7C). Η ιστολογική εξέταση των όγκων, επίσης δεν αποκάλυψε συστηματικές διαφορές στη διαφοροποίηση, τοπική επιθετικότητα ή πυκνότητα μικροαγγείων μεταξύ των διαφόρων ομάδων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να επιβεβαιωθεί επίμονη μείωση του Gal-3 επίπεδα στο knockdown όγκων, mRNA παρασκευάστηκε από χύμα ιστό όγκου και αναλύθηκαν με qRT PCR. Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα Gal-3 mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερα στους όγκους που προέρχονται από τα S2-007 knockdown κλώνοι σε σχέση με εκείνα που προέρχονται από τους κλώνους φορέα-επιμολυσμένα ελέγχου (Σχ. 7D).

Συζήτηση

Απορρύθμιση της Gal-3 έκφρασης έχει περιγραφεί σε αρκετές ανθρώπινους καρκίνους, αν και η προγνωστική σημασία των παρατηρούμενων αλλαγών παραμένει αντικείμενο διαμάχης [37], [38]. Παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα είναι μεταξύ εκείνων των ανθρώπινων όγκων στην οποία ένα σημαντικό υπερέκφραση του Gal-3 τόσο σε mRNA, καθώς και σχετικά με το επίπεδο της πρωτεΐνης είναι καλά εδραιωμένη [27], [30]. Οι δικές μας τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις των μικροσυστοιχιών μικροδιατομή ιστών παγκρεατικού όγκου έδειξε ότι Gal-3 εκφράζεται από τα ίδια τα κύτταρα του όγκου και όχι από τα στρωματικά κύτταρα, τα οποία συνήθως αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου [28]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε επιβεβαιώσει υπερέκφραση του Gal-3 mRNA σε ιστούς όγκου από qRT-PCR και αποδεικνύουν ότι η ισχυρή έκφραση Gal-3 διατηρείται στην πλειονότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών σειρών

in vitro

.

Όπως συμβαίνει με τα δεδομένα σχετικά με την προγνωστική ρόλο στον καρκίνο, εκθέσεις σχετικά με υποθετικό κυτταρικές λειτουργίες του Gal-3 σε καρκινικά κύτταρα είναι εν μέρει ασαφές ή ακόμη και αντιφατική. Ενώ Honjo et al. απώλεια έκθεση (ορός-ανεξάρτητων) πολλαπλασιαστική ικανότητα και κατάργηση της αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη στον καρκίνο του μαστού κύτταρα μετά αποσιώπηση του Gal-3 έκφραση [26], Matarrese et al. δεν τήρησε καμία διαφορά στην ανάπτυξη των κυττάρων ή του πολλαπλασιασμού κατά την διαμόρφωση της Gal-3 έκφρασης, αλλά περιγράφουν αυξημένη αντίσταση στην απόπτωση μετά από υπερέκφραση του Gal-3 [36]. Ομοίως, η ίδια ομάδα που παρατηρούνται τα αποτελέσματα αναστολής αύξησης του Gal-3 σίγηση σε καρκινικά κύτταρα μαστού περιγράφεται ισχυρές επιδράσεις κατά του όγκου του Gal-3 knockdown σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης μειωμένη κύτταρο, εισβολή, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αποικία ανεξάρτητο από αγκύρωση σχηματισμός, και της ανάπτυξης του όγκου σε ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικού [24]. Σε αντίθεση, Califice et al. δεν παρατήρησαν καμία επίδραση από Gal-3 έκφραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε κάθε αστερισμό, και ανέφεραν ότι Matrigel εισβολή, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και τον σχηματισμό γυμνούς ξενομοσχεύματος ποντικού προωθούνται μόνο από κυτταροπλασματική έκφραση Gal-3, ενώ πυρηνικό εντοπισμό του Gal -3 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα [37].

ένα κοινό θέμα σε πολλές από αυτές τις μελέτες είναι το γεγονός ότι συχνά πολύ λίγα ή μόνο μία κυτταρική γραμμή αναλύθηκε, και ότι μερικά από τα αποτελέσματα ήταν μόνο παρατηρήθηκαν κάτω από πολύ συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες.