Αφηρημένο

Ιστορικό

Αυξημένα αλλοιώσεις μικροδορυφορικού σε επιλεγμένες επαναλήψεις τετρανουκλεοτιδικές (EMAST ) είναι μια γενετική υπογραφή παρατηρήθηκε στο 60% των σποραδικών καρκίνων του παχέος (CRCs). Σε αντίθεση με μικροδορυφορικού ασταθή CRCs όπου υπερμεθυλίωση της επιδιόρθωσης του DNA (MMR) γονίδιο

υποστηρικτής hMLH1 είναι αιτιώδης, η ακριβής αιτία της EMAST δεν είναι σαφώς καθορισμένη, αλλά πόντους για

hMSH3

ανεπάρκεια.

Στόχος

για να εξεταστεί εάν

hMSH3

ανεπάρκεια προκαλεί EMAST, και να διερευνήσει τους μηχανισμούς για την ανεπάρκεια του.

Μέθοδοι

Εμείς μετριέται -4 bp framshifts σε

D8S321

και

D20S82

τόπους στο εσωτερικό κατασκευάσματα EGFP που περιέχουν για τον προσδιορισμό του σχηματισμού EMAST στο MMR-καλά,

hMLH1

– /-

,

hMSH6

– /-

, και

hMSH3

– /-

CRC κύτταρα. Παρατηρήσαμε την υποκυτταρική θέση της hMSH3 με το οξειδωτικό στρες.

D8S321

μεταλλάξεις συνέβησαν 31-και 40-φορές υψηλότερες και

D20S82

μεταλλάξεις συνέβησαν

Αποτελέσματα

82-και 49-φορές υψηλότερες σε

hMLH1

– /-

και

hMSH3

– /-

κύτταρα, αντίστοιχα, σε σχέση με το

hMSH6

– /-

ή MMR-καλά κύτταρα.

hMSH3

νοκ ντάουν στον MMR-καλά κυττάρων που προκαλείται υψηλότερο

D8S321

ποσοστά μετάλλαξης (18,14 και 11,14 × 10

-4 μεταλλάξεις /κύτταρο /γενιά σε δύο ανεξάρτητους κλώνους) από ό, τι ομελέτα ελέγχους (0 και 0,26 × 10

-4 μεταλλάξεις /κύτταρο /γενιά?

σ

& lt? 0,01). της αλληλουχίας του DNA επιβεβαίωσε τις αναμενόμενες μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου με αποδεικτικά στοιχεία για τη συνεχιζόμενη μεταλλάξεις των κατασκευών. Επειδή οι EMAST-θετικούς όγκους που σχετίζονται με τη φλεγμονή, που υποβάλλεται MMR-καλά κυττάρων σε οξειδωτικό στρες μέσω H

2O

2 για να εξετάσει τις επιπτώσεις της στο

hMSH3

. Μια αναστρέψιμη πυρηνικά-to-κυτταρόπλασμα μετατόπιση της hMSH3 παρατηρήθηκε κατά την H

2O

2 θεραπεία.

Συμπέρασμα

EMAST εξαρτάται από το MMR φόντο, με το

hMSH3

– /-

πιο επιρρεπή σε μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου από το

hMSH6

– /-

, απέναντι από μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου παρατηρήθηκαν για επαναλήψεις μονονουκλεοτίδιο.

hMSH3

– /-

μιμείται πλήρη MMR αποτυχία (

hMLH1

– /-

) στην επαγωγή EMAST. Με δεδομένη η παρατηρούμενη ετερογενή έκφραση hMSH3 σε CRCs με EMAST,

hMSH3

-deficiency φαίνεται να είναι η περίπτωση που αρχίζει EMAST. Το οξειδωτικό στρες, που προκαλεί μια μετατόπιση της υποκυτταρικής θέσης hMSH3 του, μπορεί να συμβάλει σε ένα φαινότυπο hMSH3 απώλεια-του-λειτουργία με διαχωριστικούς να το κυτταρόπλασμα

Παράθεση:. Τσενγκ-Rogenski SS, Chung Η, Wilk MB, Ζανγκ S, M Iwaizumi, Carethers JM (2012) Οξειδωτικό στρες Προκαλεί Πυρηνική-to-κυτοσόλιο Shift της hMSH3, ένα πιθανός μηχανισμός για EMAST σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (11): e50616. doi: 10.1371 /journal.pone.0050616

Επιμέλεια: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Δημοκρατίας της Κορέας

Ελήφθη: 12 του Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 25η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Τσενγκ-Rogenski et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις Ηνωμένες Πολιτείες Υπηρεσία Δημόσιας Υγείας (DK067287 και CA162147) και το SDSU /UCSD Comprehensive Cancer Center Εταιρικής Σχέσης (CA132379 και CA132384). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιδιόρθωσης του DNA (MMR) δυσλειτουργία οδηγεί την διαδικασία της αστάθειας του μικροδορυφορικού DNA (MSI), που παρατηρείται σχεδόν σε όλες του παχέος εντέρου σύνδρομο Lynch (CRCs) και σε 15-20% των σποραδικών CRCs [1]. MSI παρατηρείται όταν τα δύο αλληλόμορφα του μείζονος γονιδίου DNA MMR αδρανοποιείται με μετάλλαξη σε όγκους Lynch ή με υπερμεθυλίωση σε σποραδικά καρκινώματα, προκαλώντας MMR παραγωγή ή την λειτουργία της πρωτεΐνης να αποτύχει, και επιτρέποντας πλαισιοτροποποιήσεις να συμβεί σε αλληλουχίες μικροδορυφορικού DNA σε όλο το γονιδίωμα [1] – [3]. Classic MSI καθορίζεται από την εμφάνιση του πλαισίου στο δεικτών μονο /δινουκλεοτίδιο, και έχει ένα καθορισμένο πίνακα για το οποίο να συγκρίνει μελέτες [4]. Αυτή η ομάδα, ή παραλλαγές αυτών των δεικτών μονο /δινουκλεοτίδιο, ανιχνεύει εύκολα

hMLH1

– και

hMSH2

-deficiency (όπως η δυσλειτουργία των δύο αυτών πρωτεϊνών αδρανοποιεί πλήρως DNA MMR), και περιστασιακά

hMSH6

-deficiency [1], [4]. Ο πίνακας MSI δεν είναι τόσο ειδικό για την ανίχνευση

hMSH3

-deficiency λόγω της φύσης της επισκευής ότι αυτή η πρωτεΐνη συμβάλλει στην MMR, με βάση τις μελέτες μαγιά [5], [6]. DNA MMR είναι ένα ενζυμικό σύστημα του οποίου η κύρια κυτταρική λειτουργία είναι να επισκευάσει mispairs νουκλεοτιδίων και την εισαγωγή /βρόχους διαγραφή (IDLS) κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA. Η ιδιαιτερότητα της αναντιστοιχίας αναγνώριση κατευθύνεται από hMutSα και hMutSβ? hMutSα (hMSH2-hMSH6 ετεροδιμερές) συνδέεται με ενιαίο mispairs και μικρές IDLS (≤2 νουκλεοτίδια), ενώ hMutSβ (ετεροδιμερές hMSH2-hMSH3) δεσμεύει μεγαλύτερη IDLS [1], [5] – [7]. Εμείς και άλλοι έχουν παρατηρηθεί ειδικότητες πρόσδεσης βλάβη του DNA με καθαρισμένο hMutSα και hMutSβ καθώς έκανε συγκεκριμένες παρατηρήσεις επί της σύνδεσης χρησιμοποιώντας ανθρώπινα κύτταρα CRC διαφορετικών DNA MMR-ανεπαρκή υπόβαθρα που φιλοξενούν κατασκευάσματα που περιέχουν IDLS καθορίζονται μήκους ή mispairs νουκλεοτιδίου [8] – [12] .

Πρόσφατα, μια νέα μορφή MSI έχει περιγραφεί σε έως και 60% των σποραδικών κόλον [13] – [15] και πάνω από το 30% των καρκίνων του ορθού [16]. Σε αντίθεση με το κλασικό MSI, αυξημένα μεταβολές μικροδορυφορικών σε επιλεγμένες επαναλήψεις τετρανουκλεοτιδική (EMAST) καθορίζεται από ένα πάνελ tetranuleotide δεικτών [13] – [17]. EMAST φαίνεται να είναι πιο συχνή από ό, τι κλασικό MSI και φαίνεται να είναι μια αποκτήσει το χαρακτηριστικό που σχετίζονται με τη φλεγμονή στην CRCs [14], [16]. ασθενείς CRC που έχουν EMAST-θετικούς όγκους έχουν χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με μη-EMAST ή MSI όγκων [16], [18]. EMAST έχει παρατηρηθεί σε διάφορους όγκους, συμπεριλαμβανομένων του πνεύμονα μη μικρών [17], της ουροδόχου κύστης [19], των ωοθηκών [20], του προστάτη [21], το δέρμα [22], και του παχέος [13] – [16], αλλά αυτά μελέτες δεν παρέχουν πλήρη απόδειξη ως προς την αιτία της EMAST. Στις αρχικές εκθέσεις EMAST σε ορθοκολικό καρκίνου, οι συγγραφείς που παρατηρούνται πυρηνικό ετερογένεια του hMSH3 εντός EMAST-θετικούς όγκους [13], [14]. Τα δεδομένα μας, σε συνδυασμό με μαγιά [5], [6], καθώς και άλλες μελέτες σε ανθρώπους [13] – [16], υποδηλώνει ότι

hMSH3

-deficiency θα μπορούσε να είναι ο οδηγός του EMAST σε CRCs

για να ελέγξετε εάν

hMSH3

-deficiency είναι μια κύρια αιτία της EMAST, δημιουργήσαμε τετρανουκλεοτιδικές επαναλαμβάνω-περιέχουν κατασκευάσματα που συγχωνεύθηκαν out-of-πλαίσιο με EGFP, έτσι ώστε όταν frameshifted από -4 bp ( δηλαδή διαγραφή ενός μονάδα τετρανουκλεοτιδική), EGFP θα εκφραστεί. Αυτό επέτρεψε την παρατήρηση της δημιουργίας EMAST σε πραγματικό χρόνο, και μας έδωσε τη δυνατότητα να υπολογίζουν συχνότητες μετάλλαξης και τα ποσοστά μετάλλαξης σε πολλαπλές MMR ανεπάρκεια υπόβαθρα. Στην έκθεση αυτή, τα δεδομένα μας δείχνει σαφώς ότι

hMSH3

-deficiency είναι μια αιτία της EMAST σε ανθρώπινα κύτταρα CRC και επιπλέον παρέχει ένα πιθανό μηχανισμό που μπορεί να συμβάλει στη απέκτησε

hMSH3

-deficiency στην ανθρώπινο CRCs.

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός συστήματος μέτρησης για EMAST πλαισιοτροποποιήσεις Τετρανουκλεοτιδικός

Επειδή μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι EMAST συνδέεται με ετερογενή έκφραση hMSH3 σε όγκους παχέος εντέρου [13 ] – [16], η προσέγγισή μας ήταν να δημιουργήσει ένα σύστημα για τη μέτρηση EMAST με ποσοτικό τρόπο ως μέσο για να εξετάσει άμεσα αν

hMSH3

-deficiency είναι η αιτία της EMAST. Ανθρώπινα τετρανουκλεοτιδικές

D8S321

και

D20S82

τόπους ακολουθίες (που περιέχει 12 ή /και 16 επαναλήψεις AAAG, αντίστοιχα) έδειξαν την υψηλότερη συχνότητα για μια -4 bp πλαισίου σε όγκους παχέος εντέρου [14], [16]. Ως εκ τούτου, αυτές οι δύο θέσεις επιλέχθηκαν για τη μελέτη χρησιμοποιώντας κύτταρα CRC με διαφορετικά MMR γενετικό υπόβαθρο να διαπιστωθεί μετέπειτα μετάλλαξη. Έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν παρόμοια πειραματικό σύστημα όπου κατάργηση 1 bp του (Α)

ν θα οδηγήσει στην έκφραση του γονιδίου ανταποκριτή EGFP όταν ένα κατασκεύασμα τοποθετήθηκε 1 bp εκτός-πλαισίου [10] – [12 ].

Για να δημιουργήσετε τις πειραματικές κατασκευές, εισαγάγαμε την τόποι

D8S321

(D8) και

D20S82

(Δ20) ως 60-μερή που περιέχουν τις επαναλήψεις τετρανουκλεοτιδικές και γύρω νουκλεοτίδια αμέσως μετά το κωδικόνιο έναρξης EGFP [Πίνακας S1]. Πειραματική δομές [D8-ΤΟΥ (D8-out-of-πλαισίου) και D20-OF] έγιναν +1 bp out-of-πλαισίου, έτσι ώστε διαγραφή ενός AAAG επανάληψη θα μετατοπίσει το πλαίσιο ανάγνωσης EGFP (1 bp έως -3 bp) μέσα στο σωστό πλαίσιο για να προκαλέσει EGFP έκφραση. Mutation ανθεκτικά (MR) πλασμίδια (MR-D8 και MR-D20), που χρησιμεύει ως αρνητικοί έλεγχοι, κατασκευάστηκαν με την αντικατάσταση των μεσαία νουκλεοτίδια ΑΑ εντός της AAAG επαναλαμβάνει με C /νουκλεοτίδια G σε κάθε τρίτη AAAG, διακόπτοντας την σειρά τετρανουκλεοτιδική επαναλαμβάνει προς αποτρέψει μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου. Τα πλασμίδια MR-D8 και MR-D20 φέρθηκαν εκτός πλαισίου (από? D8 /D20-MR-OF) και /ή εντός πλαισίου (IF? D8 /D20-MR-IF) για να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικά και θετικά ελέγχων για έκφραση EGFP (επίσης βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Αυτά τα κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC με διαφορετικά γενετικά υπόβαθρα MMR και σταθερές κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν μέσω επιλογής υγρομυκίνη Β. κλώνοι απλού κυττάρου στη συνέχεια ιδρύθηκε. της αλληλουχίας του DNA χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει σωστά τα επιμολυσμένα κατασκευάσματα EMAST (Πίνακας S1). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα που φέρουν MR-IF (θετικός έλεγχος) ήταν EGFP θετικά, ενώ τα κύτταρα που περιέχουν MR-ΤΟΥ (αρνητικός μάρτυρας) ήταν EGFP αρνητικά.

Για να ελέγξετε εάν

hMSH3

-deficiency θα μπορούσαν να προκαλέσουν EMAST, μη φθοριζόντων κυττάρων που φέρουν τα διάφορα σταθερά επιμολυσμένα κατασκευάσματα EMAST ταξινομήθηκαν με κυτομετρία ροής και εκθετικά καλλιεργούνται για τέσσερις έως έξι εβδομάδες. Κάθε εβδομάδα, τα κύτταρα αναλύθηκαν εις διπλούν με κυτταρομετρία ροής για έκφραση EGFP, πιθανώς προκύπτουν από τη διαγραφή ενός AAAG επανάληψη από τα επιμολυσμένα

D8S321

και /ή

D20S82

τόπους. EGFP θετικών κυττάρων άρχισε αναδυόμενες ταχύτερο μία εβδομάδα μετά αρνητικά κύτταρα EGFP ταξινομήθηκαν και επιστρώθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εξασφαλιστεί ότι το πειραματικό σύστημα μας μας επέτρεψε να εκτιμήσει σωστά την εμφάνιση της EMAST, οι EGFP αρνητικά και θετικά κύτταρα από

hMLH1

– /-

και /ή

hMSH3

– /- κύτταρα που φιλοξενούν τις πειραματικές κατασκευές (D8-D20 τΩΝ και-OF) ταξινομήθηκαν για την απομόνωση γενωμικού DNA για αλληλούχιση. Όπως αναμενόταν, ουσιαστικά όλοι οι κλώνοι (μεγαλύτερη από 96%) από αρνητικά κύτταρα EGFP διατηρούνται αλληλουχίες άγριου τύπου (WT) για κάθε μία από

D8S321

και

D20S82

loci τόσο

hMLH1

– /-

και

hMSH3

– /-

κυτταρικές σειρές, ενώ οι κλώνοι από EGFP θετικών κυττάρων που αποκτήθηκαν διαγραφή ενός AAAG επανάληψης (Εικόνα 1Α και Εικόνα S1 Α και S1B). Παρατηρήσαμε επίσης μεταλλάξεις πλαισίου επέκτασης σε κάθε τόπο με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA (που περιλαμβάνονται στο «άλλοι» στο Σχήμα 1Α). Η πιο συχνή ένα (που κυμαίνεται από 12,5% έως τόσο υψηλό όπως 30% της συνολικής EGFP-θετικών κυττάρων) ήταν εισαγωγή δύο AAAG επαναλαμβάνει [(AAAG)

12 έως (AAAG)

14] σε

D8S321

που άλλαξε το πλαίσιο ανάγνωσης από 1 bp έως 9 bp (που αναφέρονται ως «άλλοι» στο Σχήμα 1Α και το σχήμα S1 Α). Επιπλέον, περισσότερες από μία AAAG επανάληψη διαγραφή (π.χ. 4 ή 10 AAAG επανάληψη διαγραφή) σπάνια παρατηρήθηκε (& lt? 8% του συνόλου, που περιλαμβάνονται στο «άλλοι» στο Σχήμα 1Α). Είναι σημαντικό ότι, οι μεταλλάξεις διαγραφής /παρεμβολής πάντοτε ανιχνεύθηκαν εντός των μικροδορυφορικών ακολουθιών ενώ καμία μετάλλαξη εμφανίστηκε στα πλευρικές αλληλουχίες που περιβάλλουν επανάληψης AAAG (Σχήμα S1). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι έχουμε δημιουργήσει ένα αξιόπιστο πειραματικό σύστημα για την παρακολούθηση της εμφάνισης EMAST σε κύτταρα CRC.

(Α) Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από EGFP και αρνητικών κατά Gramm κύτταρα που φέρουν πειραματικούς κατασκευάσματα (D8-και /ή D20-OF) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση θραυσμάτων DNA που περιέχει EMAST loci να εξετάσει εάν είχε πραγματοποιηθεί οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου. (Β) συχνότητες μετάλλαξης υπολογίστηκαν με διαίρεση του ποσοστού του EGFP θετικών πληθυσμού στην πειραματική ομάδα (OF) κατά το ποσοστό της EGFP θετικών σε αρνητικό μάρτυρα (MR-OF) για να υπολογίσει την αύξηση του EGFP θετικών πληθυσμού πτυχώσεις. Υπήρχαν σημαντικά πιο EGFP-θετικά κύτταρα στο

hMLH1

– και

hMSH3

ελλιπή ως κύτταρα σε σύγκριση με το MMR-καλά ή /και

hMSH6

ελλιπή ως κύτταρα. *: Ρ. & Lt? 0,05

Η

μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε Τετρανουκλεοτιδικός Επαναλαμβάνει του

D8S321

και

D20S82

Loci εξαρτώνται από το MMR Ιστορικό

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα MMR υπόβαθρο για μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στο τετρανουκλεοτιδική

D8S321

και

D20S82

loci, υπολογίσαμε συχνότητες μετάλλαξης των δεικτών, συγκρίνοντας κάθε πειραματική ομάδα (OF) με τον αρνητικό μάρτυρα του (MR -Από) χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: «(θετικά κύτταρα EGFP /σύνολο ζώντων κυττάρων από OF) /(EGFP θετικά κύτταρα /σύνολο ζωντανά κύτταρα από MR-OF)».

hMLH1

– /-

κύτταρα (εντελώς άνευ δραστηριότητας DNA MMR) και

hMSH3

– /- κύτταρα παρουσίασαν 7-12 φορές υψηλότερες συχνότητες μετάλλαξης σε σύγκριση με τους ελέγχους για την τόσο loci (Εικόνα 1Β). Ειδικότερα, οι συχνότητες μετάλλαξη παρατηρήθηκε σε

hMSH3

– /- ήταν συγκρίσιμη με εκείνη σε

hMLH1

– /- και για τις δύο θέσεις (Εικόνα 1Β). Οι -4 bp ποσοστά μετάλλαξης για αμφότερους τους τόπους σε κάθε υπόβαθρο MMR υπολογίστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Με πλήρη MMR-ανεπάρκειας (

hMLH1

– /-

), τα ποσοστά μετάλλαξης και για τις δύο θέσεις ήταν 27 και 56 × 10

-4 μετάλλαξη /κύτταρο /γενιά. Ομοίως,

hMSH3

– /-

κύτταρα που παράγονται 33 και 34 × 10

-4 μεταλλάξεις /κύτταρο /γενιά. Έτσι, οι ρυθμοί μετάλλαξης με το

hMSH3

-deficiency είναι πολύ συγκρίσιμες με εκείνες που παρατηρήθηκαν για την πλήρη MMR-ανεπάρκεια. Αυτό έρχεται σε έντονη αντίθεση με

hMSH6

-deficiency (& lt? 1 × 10

-4 μετάλλαξη /κύτταρο /γενιά), κατ ‘ουσίαν ταυτόσημη με MMR-καλά κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν έντονα το

hMSH3

-deficiency είναι ο οδηγός για το σχηματισμό EMAST.

Η

Άμεση εξόντωση hMSH3 έκφραση σε MMR-καλά κύτταρα Προκαλεί EMAST

Για να επιβεβαιώσετε ένας ρόλος των hMSH3 στο EMAST, έχουμε γκρέμισε

hMSH3

έκφραση στο MMR-καλά κύτταρα που φέρουν το

D8S321

-EGFP κατασκευάσει με επιμόλυνση των πλασμιδίων που φέρουν

hMSH3

-ειδικό shRNA και /ή ομελέτα ελέγχου, στη συνέχεια μετράται

D8S321

τετρανουκλεοτιδικές πλαισίου μεταλλάξεις όπως παραπάνω. Πριν από την shRNA επιμόλυνση, τα επίπεδα έκφρασης hMSH3 στην επιλεγμένη MMR-ικανοί κλώνοι ήταν συγκρίσιμα μεταξύ τους (Σχήμα S2). Μετά δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών shRNA (κλώνοι απλού κυττάρου), έκφραση hMSH3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε

hMSH3

shRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2? Κυμαίνονται μεταξύ 26-34% των επιπέδων πρωτεΐνης των ελέγχων σκαρφάλωμα).

hMSH3

shRNA επιμόλυνση με επιτυχία και συγκεκριμένα μείωσε τα επίπεδα έκφρασης hMSH3 στους κλώνους κυττάρων CRC. Σημειώστε ότι τα επίπεδα έκφρασης άλλων γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA παραμένουν αμετάβλητες.

Η

Χρησιμοποιώντας τις shRNA σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα που περιέχουν το

D8S321

τόπο, εξετάσαμε τις κυτταρικές σειρές για την εμφάνιση της EMAST με κυτταρομετρία ροής. Μια EGFP-θετικό πληθυσμό εμφανίστηκε σε κύτταρα όπου

hMSH3

έκφραση χτυπήθηκε κάτω.

hMSH3

KD κύτταρα έδειξαν 5-φορές (κλώνος 1) και 6-φορές (κλώνος 2) αύξηση στις συχνότητες μετάλλαξης (Σχήμα 3Α) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου κωδικοποιημένα shRNA. Μείωση στην έκφραση hMSH3 αυξηθεί σημαντικά ποσοστά μετάλλαξης του

D8S321

κατασκευάσει σε 12,7 και 18,4 × 10

-4 μετάλλαξη /κύτταρο /γενιά, σε σύγκριση με 1 × 10

-4 μετάλλαξη /κυττάρων /γενεά σε αγωνίζομαι ελέγχου (Πίνακας 2). EGFP και αρνητικών κατά Gramm κύτταρα διαχωρίστηκαν για προσδιορισμό αλληλουχίας DNA για να εξετάσει μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου. Σε αμφότερους τους κλώνους, μεγαλύτερη από το 90% των αρνητικών κυττάρων EGFP διατηρούνται WT αλληλουχία [(AAAG)

12], ενώ περίπου το 90% των EGFP-θετικά κύτταρα απεκάλυψε μία διαγραφή ενός επανάληψης AAAG (Σχήμα 3Β). Επέκταση των μικροδορυφορικών επαναλήψεων ανιχνεύθηκε επίσης (περιλαμβάνονται ως «άλλα» στην Εικόνα 3Β). Συνολικά, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι η άμεση KD του

hMSH3

προκαλώντας

hMSH3

-deficiency μόνο είναι σε θέση να παράγουν EMAST σε προηγούμενες MMR-καλά κύτταρα CRC.

Η

( Α) κύτταρα SW480 (MMR καλά) που φέρει το κατασκεύασμα EMAST (D8-OF ή D8-MR-OF) επιμολύνονται με

hMSH3

shRNA κατασκευή (

hMSH3

KD) ή τον έλεγχο αγωνίζομαι (αγωνίζομαι ) ξεχωριστά. Δύο ανεξάρτητες

hMSH3

και κλώνοι σκαρφάλωμα KD καθώς και τα γονικά κύτταρα συμπεριλήφθηκαν για αυτή τη μελέτη. συχνότητες μετάλλαξης EMAST υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1Β για τη γονική, αγωνίζομαι, και /ή

hMSH3

KD κύτταρα. Υπήρχαν σημαντικά πιο EGFP-θετικά κύτταρα στο

hMSH3

KD κύτταρα σε σύγκριση με το γονέα ή /και κύτταρα ελέγχου αγωνίζομαι. *: P & lt? 0.001? **: P & lt? 0,05. (Β) EGFP-αρνητικά και -θετικό κύτταρα από

hMSH3

KD κύτταρα που φέρουν D8-ΤΟΥ έχουν ταξινομηθεί για γονιδιωματική απομόνωση DNA για να εξετάσει πλαισίου μεταλλάξεις με αλληλούχιση.

Η

Οξειδωτικό στρες προκαλεί υποκυτταρικά διαμερισματική Μετατόπιση του hMSH3 από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα

EMAST έχει παρατηρηθεί ότι σχετίζεται στενά με ετερογενή απώλεια της έκφρασης hMSH3 καθώς και στην πυρηνική ετερογενή έκφραση (Haugen

et al

, 2008.? Lee

et al

., 210, Devaraj

et al

., 2010). Οι μελέτες μας παρέχουν παραπάνω περαιτέρω ενδείξεις ότι η μείωση της έκφρασης hMSH3 μόνη της μπορεί να προκαλέσει EMAST σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Αρχίσαμε να διερευνήσουν πώς hMSH3 θα μπορούσε να γίνει έλλειψη σε EMAST-θετικούς όγκους με την παρατηρούμενη μείωση από πλήρη σε ετερογενή έκφραση. Στο CRC, EMAST συνδέεται με φλεγμονώδη κύτταρα [13], [14], [16] που μπορούν να διευκολύνουν το οξειδωτικό στρες, η οποία έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει την λειτουργία MMR [23]. Χρησιμοποιώντας H

2O

2 ως υποκατάστατο, διερευνήθηκε η επίδραση (ες) του οξειδωτικού στρες στην έκφραση hMSH3. MMR-καλά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις H

2O

2 (50 μΜ -500 μΜ) για μέχρι 24 ώρες. Εμείς δεν εντόπισε καμία μείωση στα επίπεδα της ολικής πρωτεΐνης hMSH3 σε οποιεσδήποτε συνθήκες προσπαθήσαμε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, κατά την κατεργασία των κυττάρων με 50 μΜ H

2O

2 για 4 ώρες, hMSH3 βρέθηκε ομοιογενώς τόσο στον πυρήνα και στο κυτοσόλιο σε ένα σημαντικό ποσοστό των κυττάρων (40-60%? Δεύτερη στήλη του πίνακα στην εικόνα 4Α). Εντυπωσιακά, hMSH3 παρατηρήθηκε να εκκενώσει εντελώς πυρήνες σε μερικά κύτταρα [10-20% των συνολικών κυττάρων (στήλη τρίτο φύλλο στην Εικόνα 4Α], σε έντονη αντίθεση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα όπου hMSH3 κυρίως παρέμεινε εντοπισμένη στον πυρήνα (αριστερά πάνελ στο σχήμα 4Α ). η μετατόπιση του hMSH3 εντοπισμού θα μπορούσε να ανιχνευθεί μόλις 2 ώρες μετά την έναρξη της θεραπείας, και το αποτέλεσμα κορυφώθηκε μεταξύ 4 και 8 ώρες μετά την H

2O

2 θεραπεία ξεκίνησε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). σε αντίθεση με hMSH3, hMLH1, hMSH2, και hMSH6 δεν μετέβαλε κυτταρικό εντοπισμό τους και παρέμειναν σε πυρήνες (Σχήμα 4Β και σχ S3A, S3b, και S3C). ΟβΙΙ κλασμάτωση για τον διαχωρισμό των πυρηνικών και κυτοσολικά κλάσματα συμφωνημένα παρατηρήσεις ανοσοκυτταροχημεία μας (διαδρομές 1-3 και 5-7 στην Εικόνα 4Β).

(Α) MMR-ικανοί κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε παντελή στέρηση ορού για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μΜ του H

2O

2 για 4 ώρες. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-αντίσωμα hMSH3 και, στη συνέχεια, Alexa 488 συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού να παρατηρήσουμε την υποκυτταρική τοποθεσία του hMSH3. Για να ελεγχθεί αν η επίδραση ήταν αναστρέψιμη, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 24 ώρες μετά την απομάκρυνση του H

2O

2. (Β) κύτταρα SW480 ήταν άνευ ορού για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με H

2O

2 για 4 ώρες (-FBS + Η

2O

2). Γονικά κύτταρα (Γονικό) και τα κύτταρα που είχαν σε παντελή στέρηση ορού χωρίς την επακόλουθη H

2O

2 θεραπεία (-FBS) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Οι κυτταρικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πυρηνικά και κυτοσολικά κλάσματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ πυρηνική κλασματοποίηση. Ίσο όγκο πρωτεϊνών από κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για SDS-PAGE και επακόλουθη Western Blotting να ελέγξει τα επίπεδα του hMSH3. Αντι-ιστόνης Η3 χρησιμοποιήθηκε για την ισότητα φόρτωση πυρηνικό κλάσμα και τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε για κυτοσολικό ισότητα κλάσμα φόρτωσης.

Η

Για να εξεταστεί εάν η επίδραση της H

2O

2 για hMSH3 ήταν αναστρέψιμη , αντικαταστήσαμε H

2O

2 που περιέχει μέσο με φρέσκο ​​μέσο μετά από 4 ώρες επεξεργασίας. hMSH3 βρέθηκε να είναι πυρηνικός από 24 ώρες μετά την απομάκρυνση του H

2O

2 (δεξιά πάνελ στο σχήμα 4Α και λωρίδες 4 και 8 στο Σχήμα 4Β). Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι η επίδραση του H

2O

2 για hMSH3 ήταν αναστρέψιμη, όπου hMSH3 επιτρέπεται να εισέλθει εκ νέου στον πυρήνα μία φορά το οξειδωτικό στρες κοπάσει. Εναλλακτικά, η hMSH3 που ήταν στο κυτταρόπλασμα μπορεί να έχουν καταστραφεί και υποβαθμισμένη και, συνεπώς, δεν ήταν σε θέση να εισέλθουν εκ νέου σε πυρήνες, και μπορεί να δείχνουν ότι η παρατηρούμενη πυρηνική hMSH3 έγινε πρόσφατα συντεθεί. Για να καθοριστεί ποιο σενάριο θα μπορούσε να είναι σωστή, κατεργασμένα κύτταρα με 20 μg /ml του κυκλοεξαμίδιο κατά την απομάκρυνση του H

2O

2 για να σταματήσει τη σύνθεση πρωτεΐνης για 24 ώρες. hMSH3 βρέθηκε να είναι στον πυρήνα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αποδεικνύοντας ότι η hMSH3 που μετατοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα ήταν πράγματι σε θέση να εισέλθει εκ νέου στον πυρήνα.

Συζήτηση

DNA MMR μελέτες από βακτηρίδια και ζυμομύκητες δείχνουν ότι hMutSβ, ετεροδιμερές hMSH2 και hMSH3, δεσμεύει και κατευθύνει την επισκευή των διεισδύσεως διαγραφή βρόχους ± 2 νουκλεοτίδια [1], [5], [6]. Έτσι,

hMSH3

-deficiency θα αναμενόταν να επιτρέψει μεγάλο διεισδύσεως διαγραφή μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου βρόγχου, η οποία έχει έντονα προταθεί σε προηγούμενες μελέτες [13] – [16]. Προσδιορισμός ως συνέπεια της

hMSH3

-deficiency δεν ήταν προηγουμένως πρωταρχικής σημασίας, καθώς δεν έχει υπάρξει ποτέ περιγραφεί μια βλαστική μετάλλαξη για

Σύνδρομο hMSH3

να προκαλέσει Lynch, και δεν υπήρχε καμία συσχέτιση με σποραδικές CRC μέχρι την περιγραφή της EMAST σε CRCs [13] – [16]. Η σύνδεση των EMAST με ετερογενή απώλεια της έκφρασης hMSH3 σε σποραδικές CRCs πρότεινε ότι αυτή η πρωτεΐνη DNA MMR θα μπορούσε να οδηγήσει EMAST. Στη μελέτη μας, έθεσε ως στόχο να δοκιμάσει αυτό με τη δημιουργία ενός μοντέλου ανθρώπινου κυττάρου για να μετρήσει το σχηματισμό EMAST με ποσοτικό τρόπο. Η μελέτη μας δείχνει ότι (α) το σχηματισμό EMAST εξαρτάται από το MMR φόντο, με το

hMSH3

-deficiency ταιριάζουν πλήρη MMR-ανεπάρκεια στην πρόκληση EMAST, (β)

hMSH3

-deficiency ποσοστά μετάλλαξης για σχηματισμό EMAST είναι σημαντικά υψηλότερο σε σύγκριση με εκείνο του

hMSH6

-deficiency (ουσιαστικά μηδενική για το σχηματισμό EMAST), (γ) νοκ ντάουν του

hMSH3

μόνη έναυσμα για τον σχηματισμό του EMAST, και (δ) το οξειδωτικό στρες μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που προκαλούν ανεπάρκεια της hMSH3, καθώς αυτό MMR πρωτεΐνη μετατοπίζει υποκυτταρική της θέση με H

2O

2. Συνολικά, η μελέτη μας προσφέρει ισχυρή υποστήριξη στην ιδέα ότι

hMSH3

-deficiency οδηγεί σχηματισμό EMAST και παρέχει ένα πιθανό μηχανισμό που μπορεί να συμβάλει στην hMSH3 ανεπάρκειας σε ανθρώπινο CRCs.

Τετρανουκλεοτιδικός πλαισιοτροποποιήσεις που καθορίζουν EMAST σε CRC όγκους μπορεί να γίνει με εισαγωγή ή διαγραφή των επαναλήψεων τετρανουκλεοτιδική. Στα πειράματά μας, σχεδιάσαμε κατασκευάσματα για την ανίχνευση μιας -4 bp διαγραφή? Ωστόσο, κατά την αλληλούχιση του DNA είχαν επίσης εντοπιστεί κάποιοι παρεμβολές (επέκταση) των μικροδορυφόρων. Πράγματι, η πλειονότητα των μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ανιχνεύεται στα πειράματά μας ήταν λόγω απαλοιφής μιας μονάδας AAAG (Σχήμα 1Α και 3Β). Έχουμε επιλέξει το

D8S321

και

D20S82

τόποι για τα πειράματά μας, επειδή διαγραφή μίας μονάδας AAAG είχε αποδειχθεί ότι είναι η επικρατέστερη μετάλλαξη βρέθηκε ανάμεσα τόπους που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση EMAST [14], [16 ]. Επειδή το σύστημά μας σχεδιάστηκε για να ανιχνεύει μόνο έναν τύπο μετάλλαξης, οι τιμές μας υπολογίζονται είναι πιθανό μια υποεκτίμηση της μεταβλητότητας αυτών των τόπων με

hMSH3

-deficiency. Ατομική πλαίσιο αλληλουχία και πλευρικές αλληλουχίες μπορεί επίσης να συμβάλει στην διαφορετική έκβαση της μετάλλαξης (π.χ. εισαγωγή vs. διαγραφή) [11], [12], [24]. Στο

D20S82

τόπο, μόνο περίπου το ένα τρίτο του EGFP θετικών

hMSH3

– /-

κύτταρα απέδειξαν μία διαγραφή μονάδα AAAG και αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε αυτό το συγκεκριμένο κλώνο που περιέχει πολλαπλά αντίγραφα του κατασκευάσματος. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με περισσότερο από το 70% των θετικών κυττάρων EGFP που φέρουν το ίδιο κατασκεύασμα σε

hMLH1

– /-

δείχνει διαγραφή μιας μονάδας AAAG, υποδεικνύοντας το κατασκεύασμα συμπεριφέρθηκε όπως έχει σχεδιαστεί. Για

hMSH3

– /-

κύτταρα, η μετάλλαξη σε ένα από τα αντίγραφα θα οδηγούσε σε έκφρασης EGFP, ενώ το υπόλοιπο παρέμεινε WT, διαψεύδοντας ανάλυση αλληλουχίας. Αυτό, ωστόσο, δεν θα επηρεάσει τη συχνότητα μετάλλαξης και ο ρυθμός μετάλλαξης, όπως ο υπολογισμός έγινε με βάση τον αριθμό των EGFP-θετικών κυττάρων.

Δεν είναι απολύτως σαφές για EMAST-θετικούς όγκους πώς

hMSH3

ρυθμίζεται προς τα κάτω για να ξεκινήσει EMAST. Υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι EMAST-θετικούς όγκους συνδέονται στενά με φλεγμονώδη κύτταρα, ιδιαίτερα εντός των επιθηλιακών συστατικών του όγκου και στο στρώμα που περιβάλλει τον όγκο (το λεγόμενο «φωλιές όγκου») [16]. Έτσι, Μια υπόθεση είναι ότι η φλεγμονή προκαλεί μια αποκτηθεί μείωση του hMSH3, η οποία στη συνέχεια κινεί EMAST. Είναι ενδιαφέρον, H

2O

2 θεραπεία (προσομοίωση οξειδωτικό στρες) οδηγεί σε μετατόπιση της hMSH3 στο κυτταρόπλασμα μακριά από το λειτουργικό site της στον πυρήνα, χωρίς να μειώνονται τα συνολικά επίπεδα έκφρασης του. Με βραχυπρόθεσμη H

2O

2 θεραπεία, δεν θα μπορούσαμε να αποδείξει ανιχνεύσιμα επίπεδα σχηματισμού EMAST στο μοντέλο μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια μεγαλύτερη και συνεπής παρουσία του οξειδωτικού στρες μπορεί να υποχρεωθεί να αρχίσει EMAST, θεωρώντας EMAST φαίνεται να σχετίζεται με χρόνια φλεγμονή και με την προηγμένη ιστολογία όγκων [14]. Εναλλακτικά, άλλα συστατικά της φλεγμονής ή /και του όγκου μπορεί περιβάλλον συνεργαστεί με το οξειδωτικό στρες για να προκαλέσει EMAST. EMAST φαίνεται να είναι ένας φτωχός προγνωστικός παράγοντας για ασθενείς με CRC [16], [18]. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την κλασική MSI για το οποίο οι ασθενείς με CRC έχουν καλύτερη επιβίωση του κατά τη ίδια σταδιακή όγκου των ασθενών με όγκους MSS [1]. Απομένει να καθοριστεί αν αυτό είναι εγγενείς στο είδος της MMR ελαττώματος (

hMLH1

εναντίον

hMSH3

) ή κάποιοι άλλοι παράγοντες, όπως ο βαθμός ή το είδος της φλεγμονής στον όγκο.

Εν ολίγοις, έχουμε δείξει μέσα από τη δημιουργία ενός νέου μοντέλου κελί που

hMSH3

-deficiency οδηγεί EMAST. Τα δεδομένα μας συμπληρώνει σε μεγάλο βαθμό την παρατήρηση των ετερογενών απώλεια της έκφρασης hMSH3 σε EMAST-θετικούς όγκους, και δείχνει ότι απέκτησε

hMSH3

-deficiency, οδηγείται από το οξειδωτικό στρες, μπορεί να είναι η πιο κοινή βλάβη του DNA MMR μεταξύ των ανθρώπινων CRCs.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, HCT116 (

hMLH1

– /- hMSH3

– /-

), DLD-1 (

hMSH6

– /-

), HCT116 + CH3 (

hMLH1-

αποκατασταθεί, αλλά

hMSH3

– /-

), και SW480 (MMR-καλά) κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. HCT116, DLD-1, και SW480 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas? Virginia). HCT116 + CH3 κύτταρα ευγενώς από το Δρ Minoru Koi, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου Baylor, Ντάλας, Τέξας [10]. Anti-hMLH1, hMSH2, hMSH3 και hMSH6 αντισώματα αγοράστηκαν από BD Pharmigen (San Diego, CA). Αντι-τουμπουλίνης αντίσωμα ήταν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). HRP-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού αγοράσθηκε από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). Alexa 488 συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού ήταν από την Invitrogen (Grand Island, Νέα Υόρκη).

Κλωνοποίηση pIREShyg2-

D8S321

-EGFP και pIREShyg2-

D20S82

-EGFP πλασμίδια

Οι δύο ανθρώπινων τόπων,

D8S321

και

D20S82,

έχουν αναφερθεί να έχουν την υψηλότερη συχνότητα μετάλλαξης στο EMAST παχέος όγκους [13] – επιλέχθηκαν [16], και να κατασκευάσει πλασμίδια.

D8S321

και

D20S82

ακολουθίες περιέχουν 12 ή /και 16 επαναλήψεις AAAG, αντίστοιχα. Λογική και αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν

D8S321

ή

D20S82

, γύρω ακολουθίες, καθώς και

Pme

Ι και

Asc

Ι θέσεις κλωνοποίησης (Πίνακας S1) συντέθηκαν (DNA Technologies Integrated, Inc., San Diego, CA) και υποβλήθηκε σε αντιδράσεις κινάσης Τ4-πολυνουκλεοτιδίου να φωσφορυλιώσει το 5 ‘άκρα (Invitrogen). Τα ολιγονουκλεοτίδια με νόημα και αντι-νόημα αφέθηκαν να ανοπτηθούν και κλωνοποιήθηκε σε pIREShyg2-EGFP πλασμίδια μέσω

Pme

I-

Asc

sites I αμέσως μετά το κωδικόνιο έναρξης του γονιδίου EGFP όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],10] – [12], [24]. Πειραματικό πλασμίδια κατασκευάστηκαν 1 bp έξω από το πλαίσιο, έτσι ώστε μια διαγραφή μιας επανάληψης τετρανουκλεοτιδικές στο

D8S321

ή

D20S82

(-4 bp μετάλλαξη πλαισίου) θα μετατοπίσει το πλαίσιο ανάγνωσης στη σωστή πλαίσιο για να επιτρέψει EGFP έκφραση. ανθεκτικών μεταλλάξεων πλασμίδια [MR-out-of-πλαισίου (OF)] δομήθηκαν χρησιμοποιώντας με νόημα και αντι-oligos έννοια με την οποία αλλάχθηκαν δύο νουκλεοτίδια μέσα σε κάθε τρίτη επανάληψη της AAAG για την πρόληψη της μετατόπισης πλαισίου μεταλλάξεις. Η μετάλλαξη ανθεκτική στο πλαίσιο (MR-D8-IF) πλασμίδιο, ένας θετικός έλεγχος για έκφραση EGFP, κατασκευάστηκε με τη διαγραφή 1 bp από

D8S321

αλληλουχίας στο MR-D8-πλασμιδίων χρησιμοποιώντας QuikChange II τοποκατευθυνόμενη κιτ μεταλλαξιγένεσης (Stratagene, La Jolla, CA).

hMSH3

shRNA Κατασκευή

hMSH3

shRNA κατασκευάσει και να συνδυαστεί με κενό φορέα του ήταν ευγενική παραχώρηση από Ο Δρ Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Dallas, TX. Η αλληλουχία GFP αυτού του κατασκευάσματος απομακρύνθηκε με πέψη του κατασκευάσματος με

Apa

Ι και

Pac

Ι, πλήρωση-χρησιμοποιώντας θραύσμα Klenow για να σχηματίσουν αμβλεία άκρα, και στη συνέχεια εκτελεί αμβλύ άκρου. Για να γίνει ένα κωδικοποιημένο ελέγχου, η αλληλουχία GFP από τον κενό φορέα αφαιρέθηκε πρώτα όπως περιγράφεται παραπάνω και η ομελέτα αλληλουχία, απομακρύνονται από ένα εμπορικά διαθέσιμο κατασκεύασμα (GeneCopoeia, Rockville, MD), εισήχθη επάνω στο φορέα μέσω

EcoR

I και

Xho

sites μου. και /ή

hMSH3

shRNA αλληλουχιών στα πλασμίδια επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA.

Η επιμόλυνση και η δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών

Cells Η ύπαρξη και η ακρίβεια των αγωνίζομαι ήταν επιμολυσμένα με το διαφορετικό pIREShyg2-

D8S321

-EGFP και pIREShyg2-

D20S82

-EGFP πλασμίδια (που περιγράφονται στον πίνακα S1) με τη χρήση Nucleofector κιτ (Amaxa, Κολωνία, Γερμανία). Σταθερές κυτταρικές γραμμές καθιερώθηκαν με υγρομυκίνη Β (Invitrogen) επιλογής. Κάθε κυτταρική γραμμή υποβλήθηκε σε μονό κύτταρο διαλογής χρησιμοποιώντας FACS ARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA) για τη δημιουργία ξεχωριστών κλώνων. Όλα τα μονόκλινα κυτταρικοί κλώνοι εξετάστηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA για να διασφαλίσει την ύπαρξη και την ακρίβεια της κατασκευής EMAST που πραγματοποιούνται.

Για

hMSH3

κύτταρα νοκ ντάουν (KD), MMR-καλά κύτταρα (SW480) που μεταφέρουν D8-και /ή D8-MR-κατασκευασμάτων επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που φέρουν σκαρφάλωμα ή

hMSH3

-ειδικές shRNA χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche, Mannheim, Germany), που ακολουθείται από πουρομυκίνη (Invitrogen) επιλογή για τη δημιουργία σταθερών γραμμές. Δύο ανεξάρτητοι κλώνοι από κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για τις μελέτες.

Μετάλλαξη Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

Τέσσερις εκατοντάδες χιλιάδες μη φθορίζουσα σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα ταξινομήθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων με