Αφηρημένο

Υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η κακή ρύθμιση ορισμένων microRNAs (miRNAs) μπορούν να συμβάλλουν στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση και έχουν προταθεί για να είναι το κλειδί ρυθμιστές των διαφόρων βιολογικών διεργασιών, όπως η μεταγραφική ρύθμιση, την ανάπτυξη των κυττάρων και ογκογένεση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miR-137 είναι απορρυθμισμένη σε ορισμένες κακοήθειες, αλλά ο ρόλος του στην καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι ακόμα άγνωστη. Στη μελέτη μας, διαπιστώνουμε ότι miR-137 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, το υψηλότερο επίπεδο miR-137 συνδέθηκε με ρΜ ή pTNM στάδιο σε ασθενείς κλινικά καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Επιβάλλεται η έκφραση του miR-137 στα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης ενισχυθεί σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή τους. ανάλυση βιοπληροφορικής εντοπίσει το γονίδιο καταστολής όγκων PAQR3 ως πιθανό γονίδιο στόχο miR-137. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι miR-137 κατέστειλε την έκφραση των PAQR3 με σύνδεση προς 3′-αμετάφραστη περιοχή του. Αποσιώπηση των PAQR3 από μικρά παρεμβαλλόμενα RNA phenocopied τα αποτελέσματα των miR-137 υπερέκφραση, ενώ η αποκατάσταση των PAQR3 σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης που υπερεκφράζουν το miR-137, αντιστρέφονται εν μέρει τις κατασταλτικές επιδράσεις του miR-137. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι το miR-137 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός ογκογονίδιο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Xiu Υ, Liu Ζ, Xia S, Jin C, Γιν H, Zhao W, et al. (2014) microRNA-137 πάνω ρύθμιση Αυξάνει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή από Στόχευση PAQR3. PLoS ONE 9 (10): e109734. doi: 10.1371 /journal.pone.0109734

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 15 του Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: 8 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Xiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81170534) (https://www.nsfc.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στο γενικό πληθυσμό και η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου σε ασθενείς με κακοήθειες του ουροποιογεννητικού συστήματος [1], [2]. Περισσότερο από το 90% του όγκους της ουροδόχου κύστης αποτελούνται από μεταβατικού κυτταρικού καρκινώματος (TCC) που προκύπτει από μεταβατικό επιθήλιο [3]. όγκους της ουροδόχου κύστης μπορεί να ταξινομηθεί σε δύο διαφορετικές κατηγορίες: μη μυών και των μυών επεμβατική καρκίνου της ουροδόχου κύστης [4], [5]. Οι περισσότεροι όγκοι της ουροδόχου κύστης (75-80%) διαγνώστηκαν ως μη-διηθητικό όγκων των οποίων τα ποσοστά υποτροπής είναι υψηλά (50-70%) [6]. Τα υπόλοιπα είναι υψηλής ποιότητας μυ επιθετικοί όγκοι (15%) που μπορούν γρήγορα να εξελιχθεί σε μετάσταση και να οδηγήσει σε θάνατο [7]. Παρά το γεγονός ότι έχουν σημαντικές πρόοδοι στην θεραπεία έχουν γίνει, συμπεριλαμβανομένης της βελτιωμένης χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης συνεχίζει να είναι μια κοινή ασθένεια με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας [8], [9].

Πρόσφατα, αυξάνοντας ενδείξεις υποδηλώνουν ότι μια νέα κατηγορία RNAs, που είναι γνωστή ως microRNAs (miRNAs), θα μπορούσε να ρυθμίσει διάφορα γονίδια-στόχους, συμπεριλαμβανομένων των ογκογόνων και ογκοκατασταλτικών [10]. miRNAs είναι ενδογενείς 19~22 νουκλεοτιδίων (nt) μη-κωδικοποίησης RNAs που μπορούν να ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση πρωτεΐνης με την πρόκληση αποδόμησης των mRNA στόχου, αλλοιώνοντας μετάφραση ή και τα δύο τους με ειδική πρόσδεση στο 3 ‘μη μεταφρασμένης περιοχές (3’UTR) των mRNA στόχου [ ,,,0],11], [12]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι miRNAs συμβάλλουν στην περισσότερα, αν όχι όλα, βασικές βιολογικές διεργασίες, όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, την απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [13] – [16]. Μεταλλάξεις των γονιδίων miRNA ή έκφραση απορύθμιση της miRNAs έχουν περιγραφεί καλά σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων γαστρικό καρκίνο, λέμφωμα, του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και καρκίνων του ήπατος [17] – [22]. Ωστόσο, ο ρόλος των miRNAs στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος.

MiR-137 έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή, επειδή είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα κάτω και λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε πολλούς καρκίνους όπως καρκίνο των ωοθηκών, καρκίνο του στομάχου, γλοιοβλάστωμα, καρκίνο πνεύμονα, καρκίνο του παχέος εντέρου και νευροβλάστωμα [23] – [28]. Μια προηγούμενη μελέτη από Shimuzu et al. Επίσης, έδειξε ότι το miR-137 ήταν συχνά μετουσιωμένο σε πρωτογενείς όγκους της ουροδόχου κύστης και έκτοπη έκφραση του miR-137 κατέστειλε κύστης καρκίνου πολλαπλασιασμό των κυττάρων [29]. Ωστόσο, στην παρούσα αναφέρουν την αντιφατική έκφραση και η λειτουργία των miR-137 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, οι οποίες σε αντίθεση με αυτό που αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύσαμε συχνή ρύθμιση προς τα πάνω του miR-137 σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση του miR-137 προωθείται κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων κύστης. Επιπλέον, βρήκαμε ότι PAQR3, ένα νέο γονίδιο καταστολέα όγκου, ήταν ο άμεσο στόχο miR-137 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν σημαντικό ρόλο για miR-137 στην παθογένεση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και να αναφέρει την πιθανή εφαρμογή του στη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα αυτά ασθενών συμφώνησαν να συμμετάσχουν στη μελέτη και έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Τόσο η μελέτη αυτή και συγκατάθεση εγκρίθηκαν από την ηθική του διοικητικού συμβουλίου του ινστιτούτου του πρώτου Συνδεδεμένες Νοσοκομείο Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο και συμμορφώθηκε με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Ανθρώπινοι ιστοί

Οι βιοψίες από καρκίνο της ουροδόχου κύστης και το παρακείμενο φυσιολογικό ουροθήλιο ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική κυστεκτομή για καρκίνο της ουροδόχου κύστης κατά το πρώτο Affiliated Νοσοκομείο Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα. Οι χειρουργικές επεμβάσεις προέκυψαν από Απρίλιος 2010-Απρίλιος 2013, και όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση υπέγραψε ενημερωμένη συγκατάθεση. Οι βιοψίες αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά την εκτομή του μέχρι την εκχύλιση του RNA. Οι δημογραφικές και κλινικές παθολογικές δεδομένα που αναφέρονται στον πίνακα S1.

Οι κυτταρικές σειρές, κυτταρική καλλιέργεια και miRNA επιμόλυνση

Τέσσερις ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικών σειρών Τ24, J82, 5637 και UMUC3 και ένα φυσιολογικό κύτταρο της ουροδόχου κύστης γραμμή, SV-HUC-1, αγοράστηκαν από την Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας στο κινεζική Ακαδημία Επιστημών [30]. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο βόειο υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 37 ° C. Την ημέρα πριν την επιμόλυνση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά σε πυκνότητα 30-40%. Η επιμόλυνση HSA-miR-137 μιμητικό, αναστολέα, και σκαρφάλωμα, χημικώς συντίθενται με GenePharma (Σαγκάη, Κίνα) διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και διαμολύνθηκαν στα κύτταρα με τελικό συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίων των 20 nmol /L.

απομόνωση RNA και qRT-PCR

Το συνολικό RNA από δείγματα ιστών και καλλιεργημένα κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Takara, Dalian, Κίνα). Πριν από την εκτέλεση δοκιμασιών Ποσοτική RT-PCR (qPCR), το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε miRNA cDNA και συνολικό cDNA χρησιμοποιώντας ένα βήμα PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Κίνα) και PrimeScript RT κιτ αντιδραστηρίου (Takara, Dalian, Κίνα), αντίστοιχα. Σε πραγματικό χρόνο αλληλουχίες εκκινητών PCR και οι συνθήκες που αναφέρονται στον πίνακα S2 και στον Πίνακα S3, αντίστοιχα, σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή MIQE. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και miRNA ανιχνεύθηκαν με qPCR με Applied Biosystems 7500 Fast σύστημα πραγματικού χρόνου PCR πραγματικού χρόνου PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) με SYBR πρόμιγμα Εχ Taq (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ομαλοποιήθηκαν έναντι GAPDH mRNA και μικρού πυρηνικού RNA U6, αντίστοιχα. Η τιμή Ct του miR-137 και PAQR3 προσδιορίστηκε ποσοτικά με την 2

-ΔΔCt μέθοδο.

Μετανάστευση και αναλύσεις εισβολή

κυττάρων εισβολής και της μετανάστευσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο φρεατίων (Millipore, ΗΠΑ) με και χωρίς Matrigel (BD, Franklin Lakes, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Για τη δοκιμασία εισβολής, ένα θάλαμο transwell τοποθετήθηκε σε ένα πλακίδιο των 24 φρεάτων και επικαλύφθηκε με 30 μΙ Matrigel και επωάστηκε για σαράντα λεπτά στους 37 ° C. Σε αμφότερα δοκιμασία Transwell, κύτταρα, 48 ώρες μετά την επιμολυσμένα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη και σπέρνονται σε θαλάμους στην πυκνότητα 8 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε μέσο με ΚΡΜΙ 1640 με 2% ορό, ενώ 600 μΙ 10 % FBS-1640 προστέθηκαν στο κατώτερο θάλαμο. Twentyfour ώρες αργότερα, μετανάστευσαν κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη για 30 λεπτά. Μη-κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν αφαιρέθηκαν από μπατονέτες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma) για 20 λεπτά. εικόνες κυττάρων ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus, Tokyo, Japan).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός κυττάρου Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Κουμαμότο, Ιαπωνία ). καρκινικά κύτταρα ουροδόχου κύστης απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων στα 2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 10% CCK-8 (Dojindo? Kumamoto, Japan) που είχε αραιωθεί σε κανονικό μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C έως ότου λάβει χώρα η οπτική μετατροπή χρώμα. ρυθμούς πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκαν σε 0, 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

κηλίδες Western

Ισοδύναμες ποσότητες (30-50 μg) πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS πηκτώματα 10% πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν να πολυβινυλιδένιο φθορίδιο (PVDF) μεμβράνες. Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% σκόνη άπαχου γάλακτος και επωάστηκαν για μία νύχτα με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα σε αραιώσεις καθορίζεται από τον κατασκευαστή. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές σε TBST και επωάστηκε με το αντίστοιχο υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα σε αραίωση 1:5,0000 για 1 ώρα. Το συνδεδεμένο δευτερεύον αντίσωμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Pierce Biotechnology Inc, USA). Πρωτογενή αντισώματα ανοσοκηλιδώσεως ήταν τα εξής:. Αντι-GAPDH, αντι-PAQR3 (Santa Cruz Biotechnology, USA)

δοκιμασία Λουσιφεράσης

κύτταρα Τ24 σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και επωάστηκαν για 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Για τον προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με 0,5 μg του pGL3-PAQR3-3’UTR ή pGL3- PAQR3-3’UTR Mut πλασμίδιο, 0,05 ng του φορέα ελέγχου phRL-SV40 (Promega, USA), και 100 ηΜ miR-137 ή RNA ελέγχου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). Οι δραστηριότητες της πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράσης μετρήθηκαν διαδοχικά μέσω ενός διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega, USA) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Στατιστική ανάλυση

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 15.0. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν είτε με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) ή έλεγχος τ, και το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο α = 0,05 (δύο-πλευρά).

Αποτελέσματα

Έκφραση του miR-137 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως

Η έκφραση του miR-137 αξιολογήθηκε πρώτα με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR) σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και ένα φυσιολογικό κύτταρο κύστη γραμμή SV-HUC-1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, miR-137 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με SV-HUC-1. Εμείς ποσοτικοποιηθεί περαιτέρω το επίπεδο έκφρασης του miR-137 σε 6 ζεύγη ανθρώπινων ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των παρακείμενων κανονικής βλεννογόνου ιστούς με qRT-PCR (Εικ. 1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-137 ήταν γενικά υψηλότερη σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς. Έτσι, υπέθεσαν ότι miR-137 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός ογκογονίδιο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

(Α). Προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miR-137 σε κυτταρικές σειρές και ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου. Σχετική έκφραση του miR-137 σε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και ένα φυσιολογικό κύτταρο κύστη γραμμή SV-HUC-1 προσδιορίστηκε με qRT-PCR. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) σχετική έκφραση του miR-137 σε 6 χειρουργικά δείγματα ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς προσδιορίστηκε με qRTPCR. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Η έκφραση του miR-137 σε ασθενείς με κλινικές του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και της ανάλυσης συσχέτισης τους με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά

Για να μελετήσουμε τη σχέση του miR-137 με την ουροδόχο κύστη εμφάνιση του καρκίνου, η έκφραση του miR-137 ανιχνεύτηκε σε 50 κλινικές ασθενείς που χρησιμοποιούν PCR πραγματικού χρόνου. Από 50 δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης, miR-137 ήταν ρυθμισμένη σε 45 περιπτώσεις (45/50, 90%) σε σύγκριση με γειτονικούς ιστούς (Εικ. 2Β). Εν τω μεταξύ, miR-137 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε 5 περιπτώσεις (5/50, 10%). Σε γενικές γραμμές, η έκφραση του miR-137 στην κύστη καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό, τι γειτονικούς ιστούς (Σχήμα 2Α, ρ & lt?. 0.001). Το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης του miR-137 συνδέθηκε με το στάδιο pTNM (Σχήμα 2C.) Και υψηλότερο επίπεδο miR-137 συνδέθηκε με το στάδιο ρΜ (p = & lt? 0,05, μετάσταση vs. χωρίς metastssis) σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης (Σχ . 2D). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι αλλοιώσεις του miR-137 θα μπορούσε να συμμετέχει στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

(Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-137 στην κύστη καρκινικούς ιστούς και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών προσδιορίστηκαν με qRT-PCR. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) miR-137 ανιχνεύθηκε σε 50 ζεύγη ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των παρακείμενων φυσιολογικούς ελέγχους του με ποσοτική RT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως log2 των φορές μεταβολής των ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σχέση με παρακείμενο φυσιολογικό περιοχές? (Γ) και (Δ) Η στατιστική ανάλυση της σχέσης μεταξύ επιπέδου miRNA και το στάδιο pTNM (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και IV) και το στάδιο μ.μ. (αριθ μετάσταση και μετάσταση)? * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

Η υπερέκφραση του miR-137 προωθείται κύστης πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή

διερευνηθούν ο πιθανός αντίκτυπος του miR-137 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, τη μετανάστευση και την εισβολή. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με περιπλεγμένο ολίγο ελέγχου ή miR-137 μιμείται και αναστολέα, η οποία έδειξε υψηλή αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής (Εικ. 3Α). CCK-8 δοκιμασία πολλαπλασιασμού έδειξαν ότι πολλαπλασιασμού των κυττάρων προήχθη σε miR-137 μιμείται-επιμολυσμένα καρκινικών κυττάρων κύστης σε σύγκριση με τα ανακατωμένα ολιγο-επιμολυσμένα κύτταρα ή μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 3Β). Αντιστρόφως, αναστολέας miR-137 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Τ24 (Σχ. 3C). Περιέργως, η μετανάστευση και δοκιμασία εισβολής έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-137 προωθείται σημαντικά την μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων T24 σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ miR-137 αναστολέα ανέστειλε τόσο την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή (Σχ. 3D και Ε).

επίπεδα (Α) Εκφραση του miR-137 εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου μετά την επιμόλυνση του miR-137 μιμείται ή sramble ή καμία διαμόλυνση. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων Τ24 αποδείχθηκε μετά από επιμόλυνση με miR-137 μιμείται ή sramble ή καμία διαμόλυνση. Ο δείκτης ανάπτυξης όπως αξιολογήθηκε στις 0, 24, 48 και 72 ώρες. (Γ) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-137 εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου μετά την επιμόλυνση του miR-137 αναστολέα ή τον έλεγχο ή χωρίς την επιμόλυνση. (Δ) Ανάπτυξη των κυττάρων Τ24 αποδείχθηκε μετά από επιμόλυνση με miR-137 αναστολέα ή τον έλεγχο ή καμία επιμόλυνση. Ο δείκτης ανάπτυξης όπως αξιολογήθηκε στις 0, 24, 48 και 72 ώρες. ανάλυση (Ε) Transwell των κυττάρων Τ24 μετά τη θεραπεία με miR-137 μιμείται, αναστολείς ή αγωνίζομαι ή τον έλεγχο? Η σχετική αναλογία του μετανάστευσαν κυττάρων ανά πεδίο φαίνεται παρακάτω. (D) Transwell ανάλυση των κυττάρων Τ24 μετά τη θεραπεία με miR-137 μιμείται, αναστολείς ή αγωνίζομαι ή τον έλεγχο? η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο παρουσιάζεται πιο κάτω, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

MiR-137 στόχους PAQR3 σε καρκινικά κύτταρα κύστης

Όπως προβλέπεται από PicTar, υπήρξε συμπληρωματικότητα μεταξύ έχει-miR-137 και η PAQR3 3’ΙΙΤΡ (Σχ. 4Α). Η υπερέκφραση του miR-137 μείωσε την πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του PAQR3 σε καρκινικά κύτταρα κύστης (Σχ. 4C και D). Η επίδραση του miR-137 κατά τη μετατροπή των PAQR3 mRNA σε πρωτεΐνη στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης (Σχ. 4Β). Επιβάλλεται η έκφραση του miR-137 μείωσε σημαντικά τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του γονιδίου αναφοράς με το κατασκεύασμα άγριου τύπου, αλλά όχι με το μεταλλαγμένο PAQR3 3’ΙΙΤΡ κατασκευή, γεγονός που δείχνει ότι το miR-137 στοχεύει άμεσα την PAQR3 3’ΙΙΤΡ.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του PAQR3 3 ‘UTRs δείχνει πιθανή θέση-στόχο miRNA. (Β) Η ανάλυση των σχετικών λουσιφεράσης δραστηριότητες PAQR3-WT, PAQR3-MUT στα κύτταρα Τ24. Οι ράβδοι σφάλματος που προέρχονται από εις τριπλούν expriments. (C) Ανάλυση qRT-PCR της έκφρασης PAQR3 mRNA σε κύτταρα Τ24 μετά τη θεραπεία με miR-137 μιμείται ή αγωνίζομαι ή χωρίς επιμόλυνση. Η έκφραση της PAQR3 ομαλοποιήθηκε σε GAPDH. (Δ) ανάλυση Western blot της έκφρασης PAQR3 στα κύτταρα Τ24 επιμολυσμένα με miR-137 μιμείται ή αγωνίζομαι ή χωρίς επιμόλυνση. GAPDH ανιχνεύθηκε επίσης ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Αναπαλαιωμένη έκφραση PAQR3 μερικώς διασωθεί miR-137-ενισχυμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής

Αναλύσαμε πρώτα τη λειτουργία της PAQR3 στα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης . Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, επιμόλυνση μικρά παρεμβαλλόμενα RNA κατά PAQR3 σε κύτταρα Τ24 οδήγησε σε μειωμένη δραματικά την έκφραση της πρωτεΐνης PAQR3. Αποσιώπηση του PAQR3 ενίσχυσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων κύστης (Σχ. 5Β), το οποίο phenocopied τις επιδράσεις της miR-137 επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων κύστης. Η συν-επιμόλυνση ενός κατασκευάσματος που εκφράζει PAQR3 και miR-137 σε κύτταρα T24 οδήγησε στην αποκατάσταση της έκφρασης PAQR3, όπως επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western (Εικ. 5C). Αυτή η αποκατάσταση του PAQR3 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και επεμβατικές δυνατότητες των καρκινικών κυττάρων κύστης. Το πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι η αποκατάσταση της PAQR3 μπόρεσε να ανατρέψει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή που προωθείται από το miR-137 (Σχ. 5D και 5Ε). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της έκφρασης PAQR3 με miR-137 είναι υπεύθυνη, τουλάχιστον εν μέρει, για τα αποτελέσματα προαγωγής του miR-137 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή στον ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι η επιμόλυνση μικρό παρεμβαλλόμενο RNA κατά PAQR3 σε κύτταρα Τ24 οδήγησε σε μειωμένη δραματικά την έκφραση της πρωτεΐνης PAQR3. GAPDH ανιχνεύθηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Η σίγαση του PAQR3 ενίσχυσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων κύστης. Ο δείκτης ανάπτυξης όπως αξιολογήθηκε στις 0, 24, 48 και 72 ώρες. (C) Ανάλυση Western blot των PAQR3 σε κύτταρα Τ24 συν-επιμολυσμένα είτε με miR-137 μιμούνται ή σκαρφάλωμα και 2,0 μg pCDNA- PAQR3 ή pCDNA κενό φορέα. GAPDH ανιχνεύθηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης. καμπύλες (D) Η ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα Τ24 επιμολυσμένα με διαφορετικούς συνδυασμούς στις 0, 24, 48 και 72 ώρες. ανάλυση (Ε) Transwell των κυττάρων Τ24 σε επεξεργασία με διαφορετικούς συνδυασμούς. Η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο εμφανίζεται δεξιά. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, miRNAs έχουν αναδειχθεί σε μείζονες ρυθμιστικές αρχές που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες όπως μεταγραφική ρύθμιση, κυτταρική διαφοροποίηση και ογκογένεση [31]. Σε παγκόσμιο επίπεδο παρεκκλίνουσα προφίλ έκφρασης των miRNAs των όγκων έχουν παράσχει πολύτιμες πληροφορίες για τις μοριακές οδούς της ογκογένεσης [32]. Ως ένα από τα πιο γνωστά miRNAs που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, miR-137 έχει παρουσιαστεί με ένα αμφιλεγόμενο ρόλο κατά την εξέλιξη του όγκου [33]. MiR-137 βρέθηκε να είναι μειωμένη σε πολυάριθμες ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου καρκίνου του στομάχου, το γλοιοβλάστωμα και το καρκίνο του μαστού [24], [25], [34]. Ο ακριβής ρόλος του miR-137 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης ήταν ακόμα ασαφές αν και λειτουργία καταστολής όγκου του έχει ενοχοποιηθεί [29]. Έτσι, η τρέχουσα μελέτη μας αποσκοπεί στην αποσαφήνιση της έκφρασης και η βιολογική λειτουργία των miR-137 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Σε αντίθεση με τα ευρήματα της Shimuzu et al. [29], η μελέτη μας έδειξε ότι miR-137 ήταν συχνά πάνω ρυθμισμένα σε κυτταρικές σειρές και ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με φυσιολογικό κύτταρο της ουροδόχου κύστης γραμμή και τους ιστούς. Με βάση αυτά τα ευρήματα, υποθέσαμε ότι miR-137 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός ογκογονίδιο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Όπως ήταν αναμενόμενο, επιβάλλεται η έκφραση του miR-137 ενισχύεται πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων Τ24. Οι λόγοι των αποκλίσεων μεταξύ των ευρημάτων της παρούσας μελέτης και της Shimuzu et al. παραμένει ασαφές, αλλά η εθνοτική καταγωγή των κλινικών δειγμάτων μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο. Επιπλέον, το ογκογόνο λειτουργία του miR-137 μπορεί να είναι ειδικές για ιστό ουροδόχου κύστης από τη λειτουργία καταστολή του όγκου του έχει αναφερθεί ευρέως σε άλλους τύπους ιστών. παρούσας ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το miR-137, διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επεμβατική και μεταστατικό δυναμικό του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και μπορεί να αποτελούν πιθανές διαγνωστικές και προγνωστική βιολογικών δεικτών.

Στη συνέχεια, ασχολήθηκε με το μοριακό μηχανισμό του miR-137 στην προώθηση της διάδοσης , τη μετανάστευση και εισβολή σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Σε αυτή τη μελέτη, η PCR πραγματικού χρόνου, κηλίδες Western και δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι PAQR3 είναι ένας στόχος του miR-137. Είναι σημαντικό, ειδικά PAQR3 knockdown με siRNA phenocopied τα μεταναστευτικής και η εισβολή-προώθηση αποτελέσματα των miR-137 υπερ-έκφραση. Δείξαμε επίσης ότι, όταν miR-137 κύτταρα που εκφράζουν την επανάληψη της έκφρασης PAQR3, ελλείψεις εισβολή τους εν μέρει αντιστράφηκε. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι miR-137 παίζει ένα ρόλο στην προώθηση της μετάστασης σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης, τουλάχιστον εν μέρει, από ρύθμιση προς τα κάτω της πρωτεΐνης έκφρασης του PAQR3. PAQR3 ανήκει στην προγεστερόνης και των υποδοχέων ADIPOQ οικογένεια (PAQR) και είναι επτά-διαμεμβράνης πρωτεΐνη ειδικώς βρίσκεται στην συσκευή Golgi στα κύτταρα των θηλαστικών [35]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι PAQR3, επίσης γνωστή ως RKTG (Raf κινάσης παγίδευσης να Golgi), θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα χωρικό ρυθμιστής της Raf κινάσης μέσω απομόνωσης Raf στη συσκευή Golgi [36]. PAQR3 λειτουργεί ως καταστολέας όγκου λόγω της ανασταλτικής δράσης της στην Raf /MEK /ERK σηματοδότηση [37]. Όταν υπερεκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος Α375, ένα ανθρώπινο κακόηθες κυτταρική γραμμή μελανώματος με μετάλλαξη Β-Raf, PAQR3 /RKTG αναστέλλει την ενεργοποίηση ERK, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μεταμόρφωση των κυττάρων [37]. Επιπλέον, η διαγραφή του PAQR3 σε ποντίκια οδήγησε σε αυξημένη συχνότητα εμφάνισης της ογκογένεσης του δέρματος. PAQR3 /RKTG επίσης θα μπορούσε να αναστείλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, τη βλάστηση και την αγγειογένεση των ενδοθηλιακών κυττάρων, και το επίπεδο έκφρασης του PAQR3 σημαντικά προς τα κάτω σε δείγματα νεφρικού καρκινώματος κλινική σαφής-κυττάρου, με ένα αντίστροφο συσχετισμό με το επίπεδο έκφρασης του VEGF [38]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι PAQR3 έχει μια λειτουργική αλληλεπίδραση με την ρ53 στο σχηματισμό του καρκίνου και των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση [39]. Το επίπεδο έκφρασης του PAQR3 μειώθηκε σημαντικά σε ορθοκολικό καρκίνο δείγματα σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς και το επίπεδο έκφρασης της PAQR3 συσχετίστηκε αντίστροφα με βαθμό όγκου στα παχέος δείγματα καρκίνου του [40]. Οι μελέτες μας επίσης έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του PAQR3 μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή. Προς τα πάνω ρύθμιση αυτών των miRNAs στον καρκίνο μπορεί να διευκολύνει την έκφραση του PAQR3, οδηγώντας σε αυξημένη μετάσταση του καρκίνου.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι miR-137 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύστη καρκινικά κύτταρα και ιστούς. Επιβάλλεται η έκφραση του miR-137 προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, τη μετανάστευση και την εισβολή μέσω της άμεσης στόχευσης PAQR3. Αυτό το μυθιστόρημα άξονα miR-137 /PAQR3 μπορεί να παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς που διέπουν τη μετάσταση του όγκου, και την καταστολή των miR-137 έκφρασης μπορεί να είναι μια δυνητική θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης στο μέλλον.

Υποστήριξη Πληροφοριών

Πίνακας S1.

κλινικοπαθολογικοί ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0109734.s001

(DOCX)

Πίνακας S2. .

Primer ακολουθίες

doi: 10.1371 /journal.pone.0109734.s002

(DOC)

Πίνακα S3.

Λίστα ελέγχου της κατευθυντήριας γραμμής MIQE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0109734.s003

(DOC)