Αφηρημένο

καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) συνδέεται αιτιολογικά με τον ιό Epstein-Barr (EBV). Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος του EBV στο NPC παθογένεια παραμένει άπιαστο. Η ενεργοποίηση του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) είναι κοινή σε ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου NPC και παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων. Η ιντερλευκίνη-6 (IL-6), ένα σημαντικό φλεγμονώδης κυτοκίνη, είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής του STAT3. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με ΕΒν αθανατοποιούνται ρινοφαρυγγική επιθηλιακά (ΝΡΕ) συχνά αποκτούν μια ενισχυμένη απόκριση σε IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3 για την προώθηση της ανάπτυξής τους και επεμβατική ιδιότητες. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτή η αυξημένη IL-6 ανταπόκριση /STAT3 επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση υπερέκφραση του υποδοχέα IL-6 (IL-6R). Επιπλέον, η IL-6R υπερέκφραση αυξημένη ενεργοποίηση IL-6 που προκαλείται STAT3 σε μη μολυσμένα αθανατοποιημένα κύτταρα ΝΡΕ

in vitro

, και προώθησε την ανάπτυξη και την ογκογονικότητα των EBV-θετικών NPC κυτταρική σειρά (C666-1)

in vivo

. Επιπλέον, εμφανίζεται για πρώτη φορά ότι η IL-6R υπερεκφράστηκε σε κλινικά δείγματα του NPC. IL-6 έκφραση θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί έντονα στα στρωματικά κύτταρα του NPC και ένα υψηλότερο επίπεδο κυκλοφορίας της IL-6 βρέθηκε στους ορούς των ασθενών προτέρων σταδίων NPC σε σύγκριση με τα άτομα ελέγχου. Ως εκ τούτου, η IL-6R υπερέκφραση, σε συνδυασμό με αυξημένη σηματοδότηση IL-6 /STAT3 μπορεί να διευκολύνει την κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων προκακοήθων ΝΡΕ EBV-μολύνονται σε καρκινικά κύτταρα, και να ενισχύσει κακοήθη ιδιότητες των κυττάρων NPC

Παράθεση:. Zhang G , Tsang CM, Ντενγκ W, Yip YL, Lui VW-Y, Wong SCC, et al. (2013) Ενισχυμένη IL-6 /IL-6R Σηματοδοσίας προωθεί την ανάπτυξη και κακοήθεις Ακίνητα στην EBV-μολυσμένα Προκακοήθεις και καρκινικών ρινοφαρυγγικής επιθηλιακά κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e62284. doi: 10.1371 /journal.pone.0062284

Επιμέλεια: Qian Τάο, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 12 Δεκ 2012? Αποδεκτές: 19 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: May 1, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτείται από GRF επιδοτήσεις που χορηγούνται από το Ερευνητικό Συμβούλιο του Χονγκ Κονγκ Grant (αριθμός Grant: 776608M? 779810M? 780911M να SWT) και η RGC χορηγία Περιοχή αριστείας Θέμα (αριθμός Grant: AoE /M-8.6 σε MLL). VWL υποστηρίζεται από την Patricia L. Knebel Ταμείο του Ιδρύματος Πίτσμπουργκ, ΗΠΑ, το Career 512 Πρόγραμμα Ανάπτυξης του Προγράμματος Specialized της ερευνητικής αριστείας (SPORE) σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου (5P50CA097190-05), τον καρκίνο κεφαλής και τραχήλου SPORE Αναπτυξιακή Βραβείο Έρευνας (5P50CA097007). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (NPC) είναι ένα ξεχωριστό είδος της κεφαλής του καρκίνου του τραχήλου με υψηλό επιπολασμό στη Νοτιοανατολική Ασία [1]. Αυτή η κακοήθεια χαρακτηρίζεται από τον ιό Epstein-Barr (EBV), καθώς και εξαιρετικά φλεγμονώδεις στρώμα του και μεταστατική φύση [2]. EBV είναι παρούσα σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις μη διαφοροποιημένων NPC σε ενδημικές περιοχές και έχει από καιρό θεωρηθεί ότι είναι ένα κρίσιμο αιτιολογικός παράγοντας για NPC παθογένεια. Όμως μέχρι σήμερα, ο ακριβής ρόλος του ΕΒν σε NPC παθογένεση παραμένει ασαφής [3] – [5]. Ο ρόλος των φλεγμονωδών κυτοκινών σε παθογένεση του καρκίνου είναι καθιερωμένη, αλλά τα αποτελέσματά τους επί EBV-μολυσμένα με προκαρκινικές και καρκινικές ρινοφαρυγγικής επιθήλια είναι ακαθόριστα.

Αθροιστική στοιχεία δείχνουν ότι πολλαπλοί παράγοντες που εμπλέκονται στην παθογένεση NPC επιπροσθέτως ή σε συνδυασμό με λοίμωξη EBV [4], [6]. ενεργοποίηση STAT3 είναι κοινή σε ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένων τόσο αιματολογικών και συμπαγών όγκων [7]. Συστατική ενεργοποίηση STAT3, που υποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση της φωσφο-STAT3 (ρ-STAT3), έχει αναφερθεί σε & gt? Το 70% των δειγμάτων NPC [8] – [10]. Υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες, η ενεργοποίηση STAT3 είναι συνήθως παροδική και ρυθμίζεται στενά. Σε κύτταρα όγκου, συστατική ενεργοποίηση του STAT3 μπορεί να προκληθεί από μη φυσιολογική και διατηρούμενες αυτοκρινείς ή /και παρακρινή σηματοδότηση συμπεριλαμβανομένης της ιντερλευκίνης-6 (IL-6) σηματοδότησης [11] – [13]. IL-6 ενεργοποιεί STAT3 με δεσμεύονται ειδικά με τον συγγενή υποδοχέα της στην κυτταρική μεμβράνη, δηλαδή IL-6R. Κατά IL-6 δέσμευσης, ο υποδοχέας IL-6 ενεργοποιεί τον υποδοχέα που σχετίζεται με κινάσες (JAK1, JAK2 και Tyk2), το οποίο στη συνέχεια επάγει φωσφορυλίωση και διμερισμό του STAT3 (ενεργοποίηση του STAT3). Η ενεργοποιημένη STAT3 κατόπιν μετατοπίζεται στον πυρήνα για την επαγωγή γονιδίου στόχου μεταγραφής [14], [15]. Συστατική ενεργοποίηση STAT3 προάγει την ανάπτυξη του όγκου και επιβίωση, όπως επίσης και την εισβολή, επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση και την αγγειογένεση [16] – [18]. Μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι η IL-6-μεσολαβητική ενεργοποίηση STAT3 μπορεί να μεσολαβήσει επαγωγή iNOS σε NPC, με αποτέλεσμα το σχηματισμό μεταλλαξιγόνων βλάβες του DNA που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην παθογένεση του [19].

Παρά την αναδυόμενη βιολογική σημασία της STAT3 ενεργοποίηση σε NPC, ο ακριβής μηχανισμός της ενεργοποίησης του παραμένει σαφώς καθορισμένο, ιδίως στο πλαίσιο της μολύνσεως EBV [20]. Ο υποκινητής L1-TR ενός ΕΒν που κωδικοποιείται ογκογονίδιο, LMP1, περιέχει STAT3-αποκριτικού στοιχείου [21]. ενεργοποίηση STAT3 θα μπορούσε να προκαλέσει μεταγραφή του LMP1 σε EBV-μολυσμένα κύτταρα NPC. Επιπλέον, η έκφραση LMP1 ρυθμίζει αυξητικά παραγωγή IL-6 [22], [23], το οποίο ενεργοποιεί STAT3 σηματοδότηση να καταρτισθεί θετικός βρόχος ανάδρασης του STAT3 /LMP1 /IL-6 /STAT3 activatioin για την ενίσχυση σηματοδότηση STAT3 σε EBV-μολυσμένα κύτταρα NPC [22 ].

ενεργοποίηση STAT3 IL-6-driven είναι ιδιαίτερα σημαντική στο NPC παθογένεια.

In vivo

, η φλεγμονώδης στρώμα μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα ισχυρό πηγή της IL-6 για την οδήγηση ενεργοποίηση STAT3 σε κύτταρα μολυσμένα με ΕΒν ρινοφαρυγγική επιθηλιακά (ΝΡΕ) για την προώθηση της ογκογένεσης και εξέλιξης της νόσου. Παρά το γεγονός ότι η IL-6 είναι μία κυτοκίνη κλειδί μεσολαβώντας STAT3 σηματοδότησης, ο ρόλος της IL-6 σηματοδότηση /STAT3 σε προ-κακοήθη κύτταρα ΝΡΕ μολυσμένων με EBV δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί. Έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν σταθερές λοίμωξη EBV σε αθάνατα κύτταρα NPE [24], [25]. Αυτά τα μολυσμένα με ΕΒν κυτταρικές σειρές ΝΡΕ χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη για να εξετάσει την περίπλοκη σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης STAT3 και μόλυνση EBV. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε για πρώτη φορά ότι η σταθερή μόλυνση ΕΒν σε αθανατοποιημένα κύτταρα ΝΡΕ συχνά ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της απαντήσεις τους σε IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3. Επιπλέον, η ενεργοποίηση STAT3 σε αυτές τις EBV-μολυσμένα κύτταρα NPE ενισχύεται αγκυροβόλιο της ανεξαρτησίας τους και της εισβολής ιδιότητες

in vitro

. Οι μηχανισμοί που διέπουν την ενισχυμένη IL-6 που προκαλείται από σηματοδότηση ενεργοποίηση STAT3 στο ρινοφαρυγγικής κύτταρα EBV-μολυσμένα εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη και την κλινική σημασία της στην NPC έχουν διερευνηθεί.

Υλικά και Μέθοδοι

δηλώσεις Ηθική

Οι μελέτες σε ανθρώπους έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ /Νοσοκομείο Αρχής του Χονγκ Κονγκ West Cluster, και όλα τα θέματα που προβλέπονται γραπτή συγκατάθεση πριν από τη μελέτη της συμμετοχής. Οι έρευνες σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή για την χρήση ζωντανών ζώων στη Διδασκαλία & amp? Έρευνα του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ. χρησιμοποιήθηκε δυνατή προσπάθεια για την αποφυγή της ταλαιπωρίας και την ελαχιστοποίηση του αριθμού των ποντικών που απαιτούνται για κάθε πείραμα.

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Η δημιουργία και ο χαρακτηρισμός των αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά NPE NP460hTert έχει περιγραφεί στο παρελθόν [26 ]. Ίδρυση άλλες κυτταρικές σειρές NPE συμπεριλαμβανομένων NP550-cyclinD1-hTERT, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1-hTERT θα πρέπει να αναφέρονται χωριστά. Σταθερή μόλυνση EBV επιτεύχθηκε σε αυτά τα αθάνατα κύτταρα NPE και οι συνθήκες του πολιτισμού τους έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [24], [25]. μόλυνση EBV και κυτταρικής καλλιέργειας των κυττάρων NPE εκτελέστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24]. Ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές NPC CNE2, C666-1, HONE1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) που περιέχει 10% FBS σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

τα πλασμίδια

το πλασμίδιο για την έκφραση ενός ουσιαστικά δραστική μεταλλαγμένη STAT3 (pBabe-STAT3-C), η IL-6 προαγωγό κατασκεύασμα αναφοράς λουσιφεράσης (pGL3-IL-6-Luc), και το πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης M67 χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της ενεργοποίησης STAT3 (Luc-M67) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. JF Bromberg, Τμήμα Ιατρικής, Memorial Sloan-Kettering, ΗΠΑ [27]. Το pUC-IL-6R που χρησιμοποιείται για την έκφραση της IL-6R παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. R. Stefan (Ινστιτούτο Βιοχημείας, Christian-Albrechts-University, Γερμανία) [28]. Ο ρετροϊικός φορέας έκφρασης (pBabe-IL-6R), που χρησιμοποιείται για την υπερέκφραση της IL-6R παράχθηκε εισάγοντας το θραύσμα IL-6R από το pUC-IL-6R στον φορέα pBabe στη θέση SalI. Το πλασμίδιο έκφρασης LMP1 (ροϋΝΑ 2117), το οποίο χρησιμοποιήθηκε σε μια προηγούμενη μελέτη [29] ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Β.Π. Huang, Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ.

Western Blotting Ανάλυση

αναλύσεις στυπώματος Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [26]. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από καλλιέργεια κυττάρων με τη χρήση της ΝΕ-PER πυρηνικής και κυτταροπλασματικής εκχύλισης Αντιδραστήρια (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση IL-6R, η κυκλίνη D1 και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Τα αντισώματα έναντι STAT3, ρ-STAT3 (Tyr705) και Bcl-2 αγοράστηκαν από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ, USA). Τα αντισώματα έναντι του c-myc, αντι-Flag αγοράστηκαν από την Sigma. Το αντίσωμα έναντι LMP-1 αγοράστηκε από την Dako (Glostrup, Δανία). Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υπεροξειδάσης αρμορακίας-συνδεδεμένων αντισωμάτων αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ανίχνευση του αντιγόνου στη Δυτική κηλίδωση ήταν από τα αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας ECL Plus (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

EMSA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες manufactor χρησιμοποιώντας ένα εμπορικώς διαθέσιμο κιτ για ενεργοποίηση STAT3 (Thermo Scientific). Εν συντομία, τα εκχυλίσματα ολικού κυττάρου (4 μg πρωτεΐνης) παρασκευάστηκε από την IL-6-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν με ορό υψηλής συγγένειας επισημασμένο με βιοτίνη επαγώγιμο στοιχείο (hSIE) διπλού ολιγονουκλεοτιδίου (GATCCATTTCCCGTAAATC). Μετά την ηλεκτροφόρηση πηκτώματος, η δεσμευμένη STAT3: ολιγονουκλεοτίδιο ηλεκτροστυπώθηκε στα 350 mA για Biodyne Β membrances (νάιλον) και στερεώνεται χρησιμοποιώντας ένα μέσο διασύνδεσης UV. Οι μεμβράνες με το δεσμευμένο ολιγονουκλεοτίδιο μεταφέρεται αποκλείστηκαν, επισημάνθηκαν με προϊόν σύζευξης στρεπταβιδίνης-HPR στο 1:1000 συγκέντρωση, και εκτίθεται σε αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας ECL Plus (GE Healthcare) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Supershifting της STAT3: ολιγονουκλεοτιδίων συγκροτήματα εντοπίστηκαν μετά από 30 λεπτά προ-επώαση με αντι-STAT3 αντίσωμα (Santa Cruz)

Transwell εισβολή δοκιμασία

Ο προσδιορισμός εισβολή θάλαμο Boyden διεξήχθη χρησιμοποιώντας Transwell θάλαμο από το. Milipore Company (6,4 mm σε διάμετρο με μέγεθος πόρων 8,0 μm) σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο [30]. Η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με μέσο όρο του αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν σε δέκα τυχαίως επιλεγέντα μικροσκοπικά πεδία σε μεγέθυνση × 400. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από φρεάτια εις τριπλούν.

Παροδική επιμόλυνση πλασμιδίου και λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Lipofectamine

™ 2000 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση παροδική πλασμιδικό DNA σύμφωνα με τον κατασκευαστή του εντολή. Για τη μέτρηση της δραστικότητας STAT3 μετενεργοποιητική σε HONE1 και κύτταρα HONE1-EBV, 0.8 μg του Μ67 αναφοράς λουσιφεράσης (luc-M67) πλασμιδίου ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε. Η ανίχνευση της ενεργοποίησης STAT3 διεξήχθη με συν-επιμόλυνση των RcCMV STAT3-C ή φορέα ελέγχου με το πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης. Για τη μέτρηση δραστικότητας IL-6 γονίδιο υποκινητή σε κύτταρα HONE1, 0.8 μg του pGL3-IL-6-Luc ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε. Η αναλογία πυγολαμπίδας κατασκευάσματος ανταποκριτή λουσιφεράσης και Renilla που χρησιμοποιήθηκε ήταν 200: 1. Τριάντα έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν, και η λουσιφεράση δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Dual-Luciferase Reporter Kit (Promega, Madison, WI, USA). Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε έναντι της τιμής του σήματος λουσιφεράση της Renilla.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

RNA απομονώθηκε από δείγματα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση SuperScriptII (Invitrogen) σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένα πρωτόκολλα [26]. Οι ανιχνευτές και εναύσματα σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα γενικής χρήσης Probe Library (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μίγμα της αντίδρασης αποτελούνταν από 0,4 μΙ προς τα εμπρός εναρκτήρα (10 μΜ), 0.4 μΙ εκκινητή προς τα πίσω (10 μΜ), 10 μΐ LightCycler κύριου μείγματος, 4 μΙ αυτόκλειστο νερό Milli-Q, ανιχνευτή 0,2 μΙ και 5 μΙ cDNA. Real time PCR πραγματοποιήθηκε σε IQTM2 μου Real Time PCR Σύστημα Ανίχνευσης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι Gene ειδικοί εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφών mRNA των γονιδίων που εξετάστηκαν κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα μεταγραφής του εσωτερικού ελέγχου GAPDH.

Η

Anchorage ανάπτυξη ανεξάρτητη

δοκιμασία αποικίας Soft-άγαρ χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη των μολυσμένων με EBV και μη μολυσμένα κύτταρα. Το άγαρ πυθμένα (0,6%) παρασκευάστηκε με ανάμιξη 6% βακτο-άγαρ και μέσο σε 1:09 αναλογία. Δύο ml του άνω άγαρ (0.3%) αναμιγνύονται με 1 × 10

5 κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν πάνω από το άγαρ πυθμένα. Τα μεγέθη των αποικιών βαθμολογήθηκαν μετά από 3 εβδομάδες επώασης. Μόνο οι αποικίες & gt? Μετρήθηκαν 0,2 mm σε διάμετρο. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από φρεάτια εις τριπλούν.

Ογκογονικότητα δοκιμασία σε γυμνούς ποντικούς

C666-1 κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα) που εκφράζουν εκτοπικά IL-6R συλλέχθηκαν και αιωρήθηκε σε 50 μΙ PBS, και στη συνέχεια αναμιγνύεται με ίσο όγκο του Matrigel

™ Υπόγειο Membrane Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Ο συνολικός όγκος των 100 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος εγχύθηκε στο πλευρό του ηλικίας 6-8 εβδομάδων αρσενικούς γυμνούς ποντικούς. Μόλις καθιερώθηκε ανάπτυξης του όγκου, τα μεγέθη όγκων μετρήθηκαν κάθε δεύτερη μέρα. Ο όγκος του όγκου (μέσος όρος ± SD) υπολογίστηκε ως μήκος Χ πλάτος

2/2 [31].

ΜΤΤ δοκιμασία

Εν συντομία, 1 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο ήταν σπάρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκαν με μέσο RPMI που περιείχε 1% FBS με ή χωρίς ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-6 και επωάστηκαν περαιτέρω για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Στη συνέχεια, 20 μΐ αντιδραστηρίου σήμανσης ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS? Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C και ακολούθησε προσθήκη 200 μΐ DMSO για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πολλαπλών δίσκων (Merck Eurolab, Dietikon, Ελβετία). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± SD από τρία πηγάδια ανά ομάδα θεραπείας.

Η ανοσοϊστοχημεία

Ιστός μικροσυστοιχίες (ΤΜΑ) που περιέχουν τα δείγματα ιστού NPC ελέγχου και ελήφθησαν από NPC τράπεζα ιστών ιδρύθηκε από το Κέντρο καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα Ερευνών (RGC χρηματοδοτείται Area of ​​Excellence Θέμα). Τμήματα για ανοσοϊστοχημεία αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση πλακίδια με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά. Για ανάκτηση αντιγόνου, όλοι οι πλάκες επωάστηκαν με 10 mmol /L ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού (ρΗ 6,0), για 93 ° C για 10 λεπτά, και στη συνέχεια ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από αυτό, οι τομές ξεπλύθηκαν με PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό φραγμού (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) για 30 λεπτά. Αντι-ανθρώπινο IL-6 αντισώματος και αντισωμάτων αντι-ανθρώπινο IL-6R (Santa Cruz) αραιώθηκε σε PBS (1:100) εφαρμόστηκαν στις τομές και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την έκπλυση, όλα τα τμήματα επωάστηκαν περαιτέρω για 1 ώρα με συζευγμένο με βιοτίνη δευτερεύον αντίσωμα και υπεροξειδάση ραφανίδας συζευγμένη με στρεπταβιδίνη που ακολουθείται από ένα χρωμογόνο, διαμινοβενζιδίνη (Dako). Αντιχρωματισμός διεξήχθη με αιματοξυλίνη πριν από την αφυδάτωση και την τοποθέτηση. Οι αρνητικοί έλεγχοι διεξήχθησαν με προσθήκη μπλοκάροντας πεπτίδιο να αντικαταστήσει πρόσδεσης των πρωτογενών αντισωμάτων προς τα αντιγόνα.

ELISA για την IL-6

Οι κυκλοφορούσες συγκεντρώσεις της IL-6 στους ορούς των ελέγχων και ασθενείς NPC και τα υπερκείμενα των κυτταρικών σειρών ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ELISA για την IL-6 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διπλότυπα δείγματα εκτιμήθηκαν και οι μέσες τιμές χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα από κάθε πείραμα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση σε (SD).

t

δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθούν οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Ένα

σ

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική σε όλη αυτή τη μελέτη

Αποτελέσματα

EBV-μόλυνση αθανατοποιημένων κυττάρων ΝΡΕ αυξημένες αποκρίσεις τους σε ενεργοποίηση STAT3 προκαλείται από την IL. -6

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν την καθιέρωση σταθερών μόλυνσης EBV σε τελομεράση κυτταρική γενιά NPE (NP460hTert) [24]. Όταν εξετάστηκαν για αποκρίσεις προς IL-6, παρατηρήσαμε ότι ο EBV-μολυσμένα NP460 (NP460hTert-EBV) κύτταρα που εμφανίζονται με συνέπεια ένα πολύ υψηλότερο επίπεδο από ρ-STAT3 (Tyr 705) σε σύγκριση με μη μολυσμένα NP460hTert κύτταρα κατά IL-6 έκθεση (Σχήμα 1Α ). Είχαμε επίσης σε θέση να δείχνουν παρατεταμένη διέγερση ρ-STAT3 κατά την παρατεταμένη χρονικά σημεία μετά IL-6 θεραπεία (Σχήμα 1Β). Το π-STAT3 θα μπορούσε να ανιχνευθεί έως 12 ώρες σε κύτταρα μολυσμένα με ΕΒν (Σχήμα 1Β). Σε μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου, το επίπεδο της ρ-STAT3 ήδη επιστρέψει στο βασικό επίπεδο σε 0,5 ώρα (Σχήμα 1Α και Β). Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζει περαιτέρω ότι η IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3 είναι πολύ περισσότερο ενισχύεται σε κύτταρα μολυσμένα με ΕΒν σε σύγκριση με μη μολυσμένα αυτά. Είχαμε τη δυνατότητα να επιβεβαιώσει την αυξημένη ενεργοποίηση του STAT3 με την IL-6 θεραπεία σε NP460hTert-EBV κύτταρα με πυρηνική μετατόπιση του ρ-STAT3 (σχήμα 1C), δείχνοντας υπερενεργοποίηση των STAT3 από την IL-6 σε κύτταρα ΝΡΕ EBV-μολυσμένα, αλλά όχι το EBV-αρνητικών ομόλογό του. Αυτή η αυξημένη ενεργοποίηση της STAT3 από την IL-6 θεραπεία σε κύτταρα NP460hTert-EBV επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τον EMSA (Σχήμα 1D). Η ειδικότητα του EMSA για ενεργοποίηση STAT3 επιβεβαιώθηκε με supershifting του συμπλόκου STAT3 /DNA μετά από δέσμευση σε ειδικό αντίσωμα για STAT3 (σχήμα 1 Ε). Η αύξηση της παραγωγής IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3 παρατηρήθηκε επίσης σε ένα άλλο αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά ΝΡΕ, NP550-cyclinD1-hTERT (αθανατοποιημένα πρόσφατα από συνδυασμένη δράση hTERT και η κυκλίνη D1? Χειρόγραφο υπό προετοιμασία) (Σχήμα 1 F). Μια ενισχυμένη ενεργοποίηση STAT3 παρατηρήθηκε επίσης σε ένα NPC κυτταρική γραμμή EBV-μολυσμένα, CNE2, παρά σε μικρότερο βαθμό (Σχήμα 1 G) σε σύγκριση με εκείνη των αθανατοποιημένων κυτταρικών γραμμών ΝΡΕ. Το υψηλότερο επίπεδο της p-STAT3 σε καρκινικά κύτταρα μετά την επεξεργασία της IL-6 θα μπορούσε να αντιπροσωπεύουν ένα ασθενέστερο απόκριση προς αυξημένη ενεργοποίηση STAT3 μετά τη μόλυνση EBV. Αυτό ασθενέστερη απόκριση σε μολυσμένα με ΕΒν CNE2 καταδείχθηκε με επανειλημμένα πειράματα. Συλλογικά, υπό την παρουσία μόλυνσης από ΕΒν (τόσο μολυσμένα με ΕΒν ΝΡΕ και EBV-μολυσμένα κύτταρα NPC), IL-6 επάγει υπερενεργοποίηση του STAT3.

EBV και μη προσβεβλημένων NP460hTert κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IL-6 σε 50 ng /ml για το (Α) 10, 20 ή 30 λεπτά και για το (Β) 0,5, 1, 2, 4, 8 ή 12 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και έκφραση του ρ-STAT3 (Tyr 705) αναλύθηκε με στύπωμα Western. Σύνολο STAT3 ανιχνεύθηκε ως ο έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. (Γ) Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από EBV και μη προσβεβλημένων NP460hTert κύτταρα με ή χωρίς IL-6 θεραπεία (50 ng /ml για 30 λεπτά) και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western για ρ-STAT3 έκφρασης. Η ιστόνη 1 ανιχνεύθηκε ως ο έλεγχος για τη φόρτωση πυρηνικό εκχύλισμα. (D) Ολόκληρο προϊόντα λύσης κυτταρικής πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν μετά την κατεργασία με IL-6 για τον υποδεικνυόμενο χρόνο και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση EMSA χρησιμοποιώντας επισημασμένο με βιοτίνη hSIE ανιχνευτή (που περιέχουν στοιχεία δέσμευσης STAT DNA). Για την «εν ψυχρώ» του ανταγωνισμού, τα εκχυλίσματα προεπωάστηκαν με μη σημασμένο ανιχνευτή hSIE σε 200-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια για 20 λεπτά πριν από την ανάλυση. (Ε) Η δοκιμασία υπερμετατόπισης διεξήχθη με επώαση του εκχυλίσματος με αντι-STAT3 αντίσωμα για 30 λεπτά πριν από την ανάλυση EMSA. Η ειδική υπερμετατοπισθεί συγκρότημα STAT3 παρατηρήθηκε οποία επιβεβαίωσε την ειδικότητα του EMSA για ενισχυμένη ενεργοποίηση STAT3 σε μολυσμένα με ΕΒν NP460hTert σε IL-6 διέγερση. (F) NP550-cyclinD1-hTERT και EBV-μολυσμένα με NP550hTert-cyclinD1 είτε επεξεργασμένο ή με IL-6 σε μια τελική συγκέντρωση 50 ng /ml για 30 λεπτά. Η έκφραση του ρ-STAT3 (Tyr 705) αναλύθηκε με κηλίδωση Western. έκφραση STAT3 ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης των πρωτεϊνών. (G) CNE2 και EBV-μολυσμένα κύτταρα CNE2 είτε επεξεργασμένο ή με IL-6 σε μια τελική συγκέντρωση 50 ng /ml για 30 λεπτά. Η έκφραση του ρ-STAT3 (Tyr 705) αναλύθηκε με κηλίδωση Western. έκφραση STAT3 ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης των πρωτεϊνών από διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων.

Η

IL-6R υπερέκφραση εμπλέκεται στην ενίσχυση της IL-6-μεσολαβητική ενεργοποίηση STAT3 σε EBV-μολυσμένα με αθάνατα κύτταρα ΝΡΕ

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τον υποκείμενο μηχανισμό για μια τέτοια ενισχυμένη απόκριση των κυττάρων ΝΡΕ EBV-μολυσμένα στο IL-6. Όπως η IL-6, διαβιβάζει σηματοδότηση μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης κυτταρικής επιφάνειας με το IL-6R, εξετάσαμε την έκφραση του IL-6R σε κύτταρα ΝΡΕ ΕΒν μολυνθεί και τα μη μολυσμένα αντίστοιχά. Απροσδόκητα, υπερέκφραση της πρωτεΐνης IL-6R, καθώς και αυξημένα επίπεδα μεταγραφημάτων IL-6R mRNA ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western και σε πραγματικό χρόνο PCR, αντίστοιχα, σε κύτταρα NP460hTert-EBV (Σχήμα 2Α & amp? 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της πρωτεΐνης του IL-6R δεν ήταν άμεσα αναλογικά με το επίπεδο μεταγραφής του. Ωστόσο, το επίπεδο της πρωτεΐνης ενός συγκεκριμένου γονιδίου μπορεί να μην είναι πλήρως εξαρτημένη από μεταγραφικό επίπεδο. Το επίπεδο έκφρασης μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστική διάσπαση. Επιπλέον, η υπερέκφραση της IL-6R με ρετροϊική γονιδιακή μεταφορά σε κύτταρα NP460hTert ανατίθενται επίσης τον ενισχυμένο ανταπόκριση σε IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3 (Σχήμα 2C). Επιπλέον, η αυξημένη ενεργοποίηση STAT3 από την IL-6 σε κύτταρα NP460-EBV μπορεί να εξουδετερωθεί διά κατεργασίας αντι-IL-6R αντισωμάτων (Σχήμα 2D). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση της IL-6R σε κύτταρα NP460hTert-EBV διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη μεσολάβηση της ενισχυμένης ανταπόκρισης σε ενεργοποίηση STAT3 με την IL-6 θεραπεία.

(Α) Η έκφραση του IL-6R στην EBV μολυνθέντα και μη μολυσμένα κύτταρα NP460hTert αναλύθηκε με στύπωμα Western. Ανοσοκηλίδωση για β-ακτίνη παρέχεται ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (Β) Το συνολικό RNA εκχυλίζεται και τα επίπεδα έκφρασης της IL-6R mRNA σε NP460hTert και κύτταρα NP460hTert-EBV αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα επίπεδα mRNA της IL-6Rα κανονικοποιήθηκαν σε κυτταρικό mRNA GAPDH. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από ξεχωριστά πειράματα εις τριπλούν. *

σ

& lt?

0.05

. κύτταρα (C) NP460hTert μολύνθηκαν με φορείς ρετροϊικής έκφρασης, pBabe-IL-6Rα ή pBabe κενούς φορείς. Σταθερά μεταδιηγερμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-6 σε 50 ng /ml για 30 λεπτά. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και εξετάστηκαν για έκφραση της IL-6Rα και ρ-STAT3 (Tyr 705) με κηλίδα Western. Οι Immunoblottings για STAT3 και β-ακτίνη εμφανίζονται ως μάρτυρες για φορτίο πρωτεΐνης. (D) NP460hTert και NP460hTert-EBV κύτταρα προ-θεραπεία με αντι-IL-6R αντισώματος σε 5 μg /ml για 30 λεπτά πριν από την IL-6 θεραπεία. Η έκφραση του ρ-STAT3 αναλύθηκε με στύπωμα Western. Ανοσοκηλίδωση για συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης STAT3 παρουσιάζεται ως έλεγχοι για την πρωτεΐνη φόρτωσης. (Ε) Μετά την μόλυνση EBV, τα ΕΒν-μολυσμένα κύτταρα NP460hTert και μη μολυσμένα κύτταρα του γονικού συνεχώς υποκαλλιεργήθηκαν. Κύτταρα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα που είχαν περάστηκαν για 56, 99 και 133 φορές (ορίζεται ως νωρίς, μέση και τέλος πέρασμα). Η έκφραση του IL-6R αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Ανοσοκηλίδωση για β-ακτίνη περιλήφθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης. (F) Τα επίπεδα έκφρασης IL-6R σε κύτταρα ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western σε πολλά ζεύγη μη μολυσμένα και μολυσμένα με ΕΒν κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων EBV μολυσμένα και μη μολυσμένα ζεύγη NP460hTert, NP550-CDK4-hTERT, NP361-cyclinD1- hTERT, NP550-cyclinD1-hTERT. β-ακτίνης εκφράσεις εμφανίζονται ως έλεγχος πρωτεΐνη φόρτωσης.

Η

Στη συνέχεια προσπάθησε να εξετάσει κατά πόσον IL-6R υπερέκφραση ήταν άμεση συνέπεια της μόλυνσης EBV ή το αποτέλεσμα της προοδευτικής επιλογή των EBV-μολυσμένα κύτταρα που υπερεκφράζουν NP460hTert IL-6R μετά από παρατεταμένες περάσματα. συγκρίθηκαν Τα επίπεδα έκφρασης του IL-6R σε διαφορετικά περάσματα των μολυσμένων με EBV και μη μολυσμένα κύτταρα NP460hTert. Παρατηρήσαμε μια πολύ μέτρια αύξηση στην έκφραση IL-6R στο πρώιμο πέρασμα του EBV-μολυσμένα κύτταρα NP460hTert, και υπήρξε μια προοδευτική αύξηση στην έκφραση IL-6R σε NP460hTert-EBV κυττάρων κατά παρατεταμένη καλλιέργεια (Σχήμα 2Ε). Σημειώστε ότι μια τέτοια αλλαγή των επιπέδων IL-6R δεν παρατηρήθηκε στα μη μολυσμένα κύτταρα NP460hTert επί παρατεταμένη καλλιέργειες (Σχήμα 2Ε). Αυτό έδειξε σαφώς ότι η υπερέκφραση της IL-6R έχει επιλεκτικό πλεονέκτημα ανάπτυξης για EBV-μολυσμένα κύτταρα NP460hTert και ενεργά που επιλέγονται σε καλλιέργεια. Η υπερέκφραση της IL-6R ανιχνεύθηκε επίσης σε τρεις άλλες σταθερώς μολυσμένα με ΕΒν αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές ΝΡΕ ιδρύθηκε πρόσφατα στο εργαστήριο μας με συνδυασμένες δράσεις του τελομεράσης με CDK4 ή κυκλίνη D1 (NP550-CDK4-hTERT-EBV? NP361-cyclinD1-hTERT-EBV ? NP550-cyclinD1-hTERT-EBV) [25], αλλά όχι σε μη μολυσμένα αντίστοιχά (NP550-CDK4-hTERT? NP361-cyclinD1-hTERT? NP550-cyclinD1-hTERT) (Σχήμα 2F). Λεπτομερή χαρακτηριστικά αυτών των νέων αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές NPE θα δημοσιευθεί χωριστά. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι η υπερέκφραση της IL-6R έχει επιλεκτικό πλεονέκτημα ανάπτυξης σε κύτταρα ΝΡΕ μολυσμένων με EBV και είναι ενεργά επιλέγεται για παρατεταμένες περάσματα.

Συστατική ενεργοποίηση STAT3 ενισχύει την ανάπτυξη και την κακοήθη ιδιότητες των κυττάρων μολυσμένων με EBV

Προσπαθήσαμε να διερευνήσει μερικά από βιολογική σημασία αυτής της δραστικής επιλογή της έκφρασης IL-6R στην EBV-μολυσμένα κύτταρα NPE. Μια υπόθεση είναι ότι η μόλυνση ΕΒν μπορεί να προκαλέσει άγχος να αθανατοποιημένα κύτταρα ΝΡΕ [5] και ενεργοποίηση STAT3 μπορεί να υπερνικήσουν το άγχος που προκαλείται από διακοπή της ανάπτυξης σε κύτταρα ΝΡΕ μετά τη μόλυνση EBV και να προωθήσει την επιβίωσή τους. Η ενεργοποίηση της STAT3 είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί μια σειρά από καθοδικά συμβάντα στόχου να ενισχύουν την ανάπτυξη και κακοήθεις ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων [16]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε εάν η ενεργοποίηση STAT3 μπορεί να ενισχύσει την ανάπτυξη και κακοηθών ιδιοτήτων του EBV-μολυσμένα κύτταρα ΝΡΕ. Ένα κυρίαρχο δραστική μεταλλαγμένη μορφή της STAT3 (STAT3C) επιμολύνθηκε σε μολυσμένα με ΕΒν και μη μολυσμένα κύτταρα NP460hTert έτσι ώστε να επιτευχθεί συστατική ενεργοποίηση του STAT3 (σχήμα 3Α). Μπορέσαμε να παρατηρήσουμε μια μέτρια αύξηση στην έκφραση του c-myc και Bcl-2, κάτω από την συστατική ενεργοποίηση της STAT3 σε EBV-μολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 3Α). IL-6 θεραπεία υπέστη επίσης μια μεγαλύτερη και ισχυρότερη έκφραση της κυκλίνης D1 σε κύτταρα μολυσμένα με ΕΒν (Σχήμα 3Β). Πυκνομετρία χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των επιπέδων της κυκλίνης D1 σε 0,5, 1, 2, 4 ώρα (ες) σε κύτταρα μολυσμένα με ΕΒν και μη μολυσμένα κύτταρα μετά από IL-6 θεραπεία. Το επίπεδο της κυκλίνης D1 ρυθμίζεται αυξητικά σε IL-6-αγωγή EBV-μολυσμένα κύτταρα με 2 πτυχώσεις σε 4 ώρες χρονικό σημείο (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, τα επίπεδα κυκλίνης D1 σε IL-6 που έλαβαν μη μολυσμένα κύτταρα μόνο οριακά ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά 0,5 ώρα και έπαυσε να αυξηθεί σε άλλα χρονικά σημεία (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η IL-6 θα μπορούσε διαφορικά ανυψώσει την έκφραση της κυκλίνης D1 σε κύτταρα ΕΒν-μολυσμένα, αλλά όχι σε μη μολυσμένα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, συστατική ενεργοποίηση της STAT3 με την έκφραση STAT3C ενίσχυσε επίσης τις επεμβατικές ιδιότητες των NP460hTert-EBV σε σύγκριση με τον έλεγχο μη μολυσμένα κύτταρα NP460hTert όπως προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία εισβολής Matrigel (Σχήμα 3C). Επιπλέον, η IL-6 θεραπεία ενισχυμένη επίσης τις επεμβατικές ιδιότητες των κυττάρων NP460hTert-EBV (Σχήμα 3D). Συστατική ενεργοποίηση της STAT3 με έκφραση σε κύτταρα STAT3C NP460hTert-EBV επάγεται επίσης ισχυρή αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ, υποδηλώνοντας ένα ρόλο ενεργοποίησης STAT3 για την προώθηση ογκογόνο μετασχηματισμό των μολυσμένων με EBV αθανατοποιημένα κύτταρα ΝΡΕ (Σχήμα 3Ε). Οι αριθμοί καθώς και τα μεγέθη των αγκύρωσης ανεξάρτητες αποικίες σε κύτταρα NP460hTert-EBV STAT3C εκφράζουν ήταν αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έχουν μολυνθεί με τον κενό φορέα pBabe (Σχήμα 3Ε). Όλες αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι η ενεργοποίηση STAT3 ενισχύει ιδιότητες ανάπτυξης σε EBV-μολυσμένα με αθανατοποιημένα κύτταρα ΝΡΕ, το οποίο μπορεί να εξηγήσει την επιλογή του IL-6R φαινότυπο υπερέκφραση σε EBV-μολυσμένα κύτταρα ΝΡΕ καθιστώντας τα περισσότερο αποκρίνεται σε IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3.

(Α) c-Myc και Bcl-2 που διεγείρεται από έκφραση STAT3-C σε NP460hTert και κύτταρα NP460hTert-EBV. Η FLAG-tagged STAT3-C μετήχθη και επιλέγονται κύτταρα NP460hTert και NP460hTert-EBV. Ανάλυση Western blotting αποκάλυψε την έκφραση του FLAG υποδεικνύοντας επιτυχή έκφραση του STAT3C. Η έκφραση του c-myc και Bcl-2 επάγεται και στις δύο κύτταρα NP460hTert και NP460hTert-EBV μετά την έκφραση STAT3-C. (Β) Ενισχυμένη έκφραση της κυκλίνης D1 σε IL-6-κατεργασμένων κυττάρων NP460hTert-EBV παρατηρήθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου NP460hTert. Τα κύτταρα επεξεργασμένα ή μη επεξεργασμένα με IL-6 σε μια τελική συγκέντρωση 50 ng /ml για τον αναφερόμενο χρόνο. Στον αριστερό πίνακα, η έκφραση της κυκλίνης D1 αναλύθηκε με κηλίδα Western για έκφραση πρωτεΐνης. Στο δεξιό πάνελ, πυκνομετρία χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης της κυκλίνης D1 με αναφορά στην ακτίνη. Η παρατεταμένη έκφραση της κυκλίνης D1 παρατηρήθηκε σε IL-6-αγωγή EBV-μολυσμένα κύτταρα αλλά όχι στα IL-6-επεξεργασμένα κύτταρα NP460hTert. (C) STAT3-C που εκφράζουν NP460hTert και τα κύτταρα NP460hTert-EBV έδειξαν αυξημένη ικανότητα εισβολής σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα. Η επεμβατική ικανότητα μετρήθηκε με απαρίθμηση του αριθμού των κυττάρων που διέσχισαν τη Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνης σε 24 ώρες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από φρεάτια εις τριπλούν από πειράματα εις τριπλούν. *,

#

σ

& lt? 0,05. (D) IL-6 θεραπεία ενισχυμένη κυτταρική εισβολή των κυττάρων NP460hTert-EBV

in vitro

. κύτταρα NP460hTert-EBV φορτώθηκαν μέσα στον άνω θάλαμο εισβολή με ή χωρίς αγωγή της IL-6 (50 ng /ml). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που εισχωρεί στον κατώτερο θάλαμο βάφτηκαν και μετρήθηκαν. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από φρεάτια εις τριπλούν από πειράματα εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05. (Ε) pBabe φορέα ελέγχου-και STAT3-C-κύτταρα που εκφράζουν (1 × 10

5) απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ. Τρεις εβδομάδες αργότερα, λήφθηκαν φωτογραφίες των αποικιών. Αποικίες με διάμετρο (≥0.2 mm) μετρήθηκαν. Οι αριθμοί των αποικιών που εμφανίζονται είναι τα μέσα ± SD από τα αποτελέσματα εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05

Η

IL-6 ρυθμίζει προς τα πάνω έκφραση LMP1 σε EBV-μολυσμένα NPE και NPC κύτταρα

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η ενεργοποίηση STAT3 θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα πάνω LMP1