Αφηρημένο

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η ποσότητα και η δυναμική των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΜΑ) στο περιφερικό αίμα των ασθενών που πάσχουν από στερεά καρκινώματα έχουν μεγάλη σημασία για θεραπευτική αποτελεσματικότητα και την πρόγνωση. Οι διαφορετικές μέθοδοι που βασίζονται σε διάφορες στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για να απομονώσει και να εντοπίσει ΚΜΑ, αλλά πρέπει να βελτιωθεί λόγω της σπανιότητας και της πολυπλοκότητας των CTCs την αποτελεσματικότητά τους. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να εξετάσει τη δυνατότητα της χρήσης ενός απταμερούς SELEX (BC-15) ως ανιχνευτής για τον εντοπισμό σπάνιων ΚΜΑ από φόντου εμπύρηνων κυττάρων. Το απταμερές BC-15 που επιλέγεται από μία τυχαία βιβλιοθήκη ολιγονουκλεοτίδιο διαλογή έναντι ανθρώπινου ιστού καρκίνου του μαστού. Χρώση φθορισμού έδειξε ότι BC-15 είχαν μια υψηλή συγγένεια για τους πυρήνες των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών διαφόρων προελεύσεων, καθώς και ΚΜΑ που απομονώθηκαν από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, ενώ ικανότητα δέσμευσης της για επιθηλιακά κύτταρα του μαστού μη καρκινικών και λευκοκύτταρα ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη. BC-15

+ /CD45

– κυττάρων σε καρκίνο του αίματος του ασθενούς βρέθηκαν επίσης να είναι κυτοκερατίνες 18-θετικών και ανευπλοειδικών με χρώση ανοσοφθορισμού και φθορίζοντα in situ υβριδισμού, αντίστοιχα. Τέλος, η μέθοδος απταμερές συγκρίθηκε με την καθιερωμένη αντι-κυτοκερατίνης μέθοδο χρησιμοποιώντας 15 παγκρεατικό καρκίνο ασθενή δείγματα αίματος, και την απαρίθμηση έδειξε καμία διαφορά μεταξύ αυτών των δύο μεθόδων. Η μελέτη μας καθιερώνει ένα νέο τρόπο για τον εντοπισμό ΚΜΑ χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό ανιχνευτή απταμερούς. Αυτή η νέα προσέγγιση είναι συγκρίσιμη με τη μέθοδο αναγνώρισης CTC αντι-κυτοκερατίνης-based

Παράθεση:. Zhang J, Li S, Liu F, Zhou L, Shao Ν, Zhao X (2015) SELEX Απταμερές χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής για την ανίχνευση κυκλοφορούντων Tumor κυττάρων στο περιφερικό αίμα του παγκρέατος Καρκινοπαθών. PLoS ONE 10 (3): e0121920. doi: 10.1371 /journal.pone.0121920

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 7 Νοεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 5 Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις της υψηλής τεχνολογίας Ε & amp? Δ Πρόγραμμα (Αρ 2012AA020206 και 2012AA02A503), μέλος Βασικά Έργα Βασικής Έρευνας (2011CB910703) και NSFC (30700992, 81372591, 81321091) της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (ΚΜΑ) έχουν βρεθεί στο περιφερικό αίμα των ασθενών που έχουν προσβληθεί με όλες τις μεγάλες στερεό καρκινώματα [1] και την ποσότητα και διακύμανση τους στον καρκίνο του αίματος του ασθενούς συσχετίζεται με ανάπτυξη όγκων, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα, υποτροπή του όγκου, και μακροπρόθεσμη πρόγνωση [2-4]. Επιπλέον, η ανίχνευση CTC παρέχει επίσης ένα πιθανό τρόπο για την παρακολούθηση της απόκρισης του ασθενούς σε ορισμένες αντικαρκινικές θεραπείες [5, 6]. Πολλές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί για τον εντοπισμό CTCs σε ασθενείς με διαφορετικούς τύπους καρκίνου [7]. Η κυρίαρχη στρατηγική εκμεταλλεύεται την επιθηλιακής προέλευσης της ΚΜΑ για να συλλάβει και να εντοπίσει τους χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν επιθηλιακών δεικτών όπως επιθηλιακά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM) και κυτοκερατίνη (CK) [2]. Ωστόσο, ορισμένα ΚΜΑ μπορεί να χάσουν τα επιθηλιακά τους χαρακτηριστικά, λόγω της επιθηλίων-μεσεγχυματικών μετάβασης (ΕΜΤ) και έτσι δεν μπορεί να ανιχνευθεί από αυτά τα αντισώματα [8]. Επιπλέον, αυτές οι μέθοδοι έχουν δυσκολία διάκρισης κακοήθη κύτταρα από καλοήθη κύτταρα που εκφράζουν επιθηλιακά δείκτες. Η ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματικές προσεγγίσεις για την ανίχνευση CTCs χρειάζεται επειγόντως.

Τα απταμερή αντιπροσωπεύουν μία ομάδα θραυσμάτων μονόκλωνου νουκλεϊκού οξέος που σαρώθηκαν εναντίον συγκεκριμένων στόχων από μια τυχαία βιβλιοθήκη συνθετικού νουκλεϊνικού οξέος με την μέθοδο της συστηματικής εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού (SELEX) [9, 10]. Κάποιος μπορεί να πάρει ακόμη και απταμερή, τα οποία δεσμεύονται ειδικά σε ένα μόριο χωρίς να γνωρίζει τα χαρακτηριστικά της. Τα απταμερή μπορεί να συνδεθεί με τους στόχους με υψηλή συγγένεια μέσω ειδικών δομικές περιοχές που επάγονται από την αλληλουχία-εξαρτώμενη πτυχώσεις [11]. Αυτή η τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί για πολλούς σκοπούς, συμπεριλαμβανομένων του σχεδιασμού αναστολέα πρωτεΐνης, μοριακή ανίχνευση και θεραπευτικό φάρμακο και αντικατάσταση αντισώματος [7]. Σε προηγούμενη μελέτη [12], έχουμε εντοπίσει ένα συγκεκριμένο όγκο απταμερούς π.Χ.-15 χρησιμοποιώντας ένα νέο

in situ

ιστό slide-based στρατηγική SELEX. Το απταμερές BC-15 έχει επίσης αποδειχθεί ότι δεσμεύονται σε πολλαπλές καρκινικά κύτταρα διαφόρων προελεύσεων με υψηλή εξειδίκευση. Μέσω στρεπταβιδίνη μαγνητικών σφαιριδίων δοκιμασίας καθαρισμό μεσολάβηση συγγένειας ακολουθούμενη από μάζα αναγνώρισης φασματομετρία και επιβεβαίωση κηλίδος western, ο στόχος του BC-15 εχαρακτηρίσθη να είναι ετερογενής Α1 πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης (hnRNP Α1). Τα οικογενειακά hnRNP πρωτεΐνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην βιογένεση και τη μεταφορά των αγγελιοφόρων RNA. Up-ρύθμιση του hnRNPs συνήθως προηγείται μορφολογική διαφοροποίηση και θεωρείται ένας καλός βιολογικός δείκτης στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου [13]. Ενισχυμένη ποσότητες hnRNP Α1 έχει αναφερθεί σε πολλούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του μαστού και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, των ωοθηκών, ορθοκολικό καρκίνωμα, και καρκίνου του παγκρέατος με μια θέση που είναι κατά κύριο λόγο πυρηνική [13-16]. Υψηλά επίπεδα έκφρασης hnRNP Α1 επίσης αποδειχθεί σε παγκρεατικά καρκινικές κυτταρικές σειρές, ενώ σε φυσιολογικά πρωτογενή παγκρεατικά κύτταρα hnRNP έκφραση ήταν ανιχνεύσιμη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι hnRNP θα μπορούσε να είναι ένας καλός υποψήφιος για τη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος [13]. Ως εκ τούτου, απταμερές BC-15 θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης διάγνωση για πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, λόγω της υψηλής ειδική συγγένεια της προς hnRNA Α1. Εδώ, αναφέραμε τη δυνατότητα χρησιμοποίησης ενός απταμερούς BC-15 ως ανιχνευτή για την αναγνώριση CTCs στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγμα αίματος συλλογή

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τις επιτροπές επανεξέτασης δεοντολογίας του Αντικαρκινικού Νοσοκομείου της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών, και ενημέρωσε γραπτές συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος και υγιείς δότες. Ένα σύνολο 30 δειγμάτων αίματος συλλέχθηκαν, συμπεριλαμβανομένων 15 δείγματα που λαμβάνονται από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος και 15 δείγματα από υγιείς δότες. Για κάθε ασθενή ή υγιή δότη, περιφερικού αίματος (7,5 ml) συντάχθηκε από το μέσο κυβοειδείς φλέβα σε κιτρικό οξύ δεξτρόζη σωλήνες Vacutainer (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ) μετά την απόρριψη του πρώτου 3 ml αίματος για την αποφυγή επιθηλιακά μόλυνση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της φλεβοκέντησης . Όλα τα δείγματα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και υποβάλλεται σε επεξεργασία εντός 12 ωρών μετά τη συλλογή. Για να αποφευχθεί η προκατάληψη, τα δείγματα τυφλά επεξεργασία από διαφορετικά πρόσωπα.

διαδικασία SELEX

Ένα νέο

in situ

ιστό slide-based στρατηγική SELEX είχε προσληφθεί για να επιλέξετε απταμερή υψηλής συγγένειας . Φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένα σε παραφίνη μαστού διηθητικά πορογενή καρκινώματα και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή χρησιμοποιήθηκαν ως στόχος SELEX και ελέγχου αντίστοιχα. Μετά από 12 γύρους διαλογής, επελέγη BC-15 με υψηλή συγγένεια για ιστό όγκου ειδικά, η οποία επαληθεύτηκε επίσης χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές. Η όλη διαδικασία διαλογής SELEX έχει περιγραφεί σε προηγούμενη μελέτη μας [12]. Ο ανιχνευτής απταμερές BC-15 (5′-GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3 ‘) συνετέθη και επισημαίνονται με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) στο 5’ άκρο (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ, USA), και ένα μίγμα τυχαίων αλληλουχιών σήμανση ο ίδιο τρόπο ενήργησε ως ανιχνευτής ελέγχου.

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο καρκίνο PL-45 (ATCC CRL-2558, παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα), MCF-7 (ATCC ΗΤΒ22, αδενοκαρκίνωμα του μαστού), Α549 ( ATCC CCL185, καρκίνωμα του πνεύμονα), MDA-MB-231 (ATCC ΗΤΒ-26, μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα μαστού), κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 (ATCC ΗΤΒ-38, ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα) και ΜΟΡ10Α (ATCC CRL10317, του μαστού ινοκυστική νόσος) αγοράστηκαν από American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Όλα τα κύτταρα εκτός ΜΟΡ10Α καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA). ΜΟΡ10Α καλλιεργήθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου, 20 ng /ml ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF), 10 μg /ml ινσουλίνη, και 0.5μg /ml υδροκορτιζόνη. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C. Για τη χρώση φθορισμού, όλη τη νύκτα καλλιεργημένα κύτταρα στερεώθηκαν σε μεθανόλη στους -20 ° C για 2 ώρες και πλύθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS, ρΗ 7.4), και στη συνέχεια τα κύτταρα βάφτηκαν με απταμερές, όπως περιγράφεται στην επόμενη ενότητα.

εμπλουτισμός και την ταυτοποίηση των CTCs

Η μέθοδος ΚΜΑ εμπλουτισμού ήταν παρόμοια με τα προηγούμενα δημοσιευμένες μεθόδους [17]. Εν συντομία, 7,5 ml περιφερικού αίματος που συλλέγονται σε ένα σωλήνα vacutainer πλύθηκε με PBS μια φορά, και στη συνέχεια, τα ερυθρά αιμοσφαίρια υπέστησαν λύση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM ΝΗ

4Cl, 10mM NaHCO

3, και 0,1 mM EDTA). Το μίγμα της αντίδρασης περιστράφηκε κάτω στα 300 ×

g

για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το προκύπτον κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 0.1 ml αντι-CD45-αντίσωμα επικαλυμμένων μαγνητικών σφαιριδίων (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από διαχωρισμό χρησιμοποιώντας μία μαγνητική βάση (Promega, Madison , WI, USA). Τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης που ακολουθείται από περιδίνηση στα 500 ×

g

για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Κάθε κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε PBS και έπεσαν εξίσου σε δύο πλάκες (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA), ξηραίνεται εις τον αέρα, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε χρώση.

ΚΜΑ ήταν ταυτοποίηση με BC-15 απταμερές ή αντι -CK χρώση. Για BC-15, τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 30 λεπτά στους -20 ° C που ακολουθείται από τη διείσδυση με 0,1% (w /v) Tween 20 σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Μετά από αποκλεισμό με ρυθμιστικό διάλυμα (0,1 mg /ml tRNA, 0,1 mg /ml DNA σπέρματος σολομού, 1% BSA και 0,02% (β /ο) Tween-20 σε PBS) στους 37 ° C για 20 λεπτά, τα πλακίδια επωάστηκαν με 10 μg /ml FITC-επισημασμένο BC-15 σε ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος στους 37 ° C για 1 ώρα. ταυτοποίηση αντι-CK CTC διεξήχθη όπως περιγράφεται σε πολλές μελέτες [2, 7, 18]. Εν συντομία, πλάκες μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεϋδη για 40 λεπτά που ακολουθείται από 0,1% (w /v) Triton Χ-100 διείσδυση και 2% μπλοκάρισμα BSA, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντι-CK (Miltenyi Biotec? 1: 1000 αραίωση σε PBS ), το οποίο αναγνωρίζει των Ck 8, 18, και 19, σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Alexa 594 σημασμένο αντι-CD45 (Miltenyi Biotec? 1: 1000 αραίωση σε PBS) χρησιμοποιήθηκε για την συν-χρώση πειράματα με BC-15 ή αντι-CK σαν ένα αρνητικό σήμα επιλογής. Μετά την επώαση, τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια τοποθετείται με 4′-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) που περιέχει μέσο στερέωσης (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Στη συνέχεια πλάκες υποβλήθηκαν σε ανάλυση με μια Nikon Eclipse μικροσκόπιο φθορισμού 80i. Κύτταρα που πληρούνται τα ακόλουθα κριτήρια θεωρήθηκαν ως ΚΜΑ: το μέγεθος των κυττάρων & gt? 4 μm σε διάμετρο, άθικτο με στρογγυλό σε οβάλ μορφολογία με DAPI-χρωματισμένο πυρήνα, και θετικά για CK ή χρώση BC-15 και αρνητικά για CD45 [18] .

ανευπλοειδικών χρωμοσωμική ανάλυση με τη χρήση φθορισμού

σε situ υβριδισμού

(FISH)

χρωμόσωμα απαρίθμηση ανιχνευτές (CEP) 8 (Vysis, Des Plaines, IL, USA) μετουσιώθηκε σε ρυθμιστικό υβριδισμού (0.15 Μ χλωριούχο νάτριο, 0.015 Μ κιτρικό νάτριο, 70% φορμαμίδιο) στους 73 ° C για 5 λεπτά. Ο καθετήρας στη συνέχεια επωάστηκε με μια διαφάνεια σε υγροποιημένο θάλαμο στους 42 ° C όλη τη νύκτα και ακολουθεί πλύση με 0.3% (w /v) ΝΡ-40 σε 0,4Χ κιτρικό αλατούχο-νάτριο (SSC? 1χ SSC που περιέχει 150 mM NaCl και 15 mM na

3Citrate) στους 73 ° C για 2 λεπτά και με 2χ SSC /0.1% ΝΡ-40 σε θερμοκρασία δωματίου για 30 s. Μετά την ξήρανση εν συντομία, διαφάνειες αναλύθηκαν μετά την τοποθέτηση με μέσο στερέωσης DAPI (Vector Labs) κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού.

Η στατιστική ανάλυση

Η διαφορά μεταξύ των δύο αυτών μεθόδων αναγνώρισης αξιολογήθηκε με SPSS 19 (ΙΒΜ, Armonk , NY, USA) το λογισμικό με το Wilcoxon Signed Ranks test και τη συσχέτιση μεταξύ BC-15 και αντι-κυτοκερατίνης αποτελέσματα εκτιμήθηκε με βάση την αξία rho μη παραμετρικά Spearman του. Ένα

P

-τιμή του & lt?. 0,05 θεωρούν ως στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

BC-15 συνδέεται με τον πυρήνα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων ειδικά

προηγούμενη μελέτη μας δείχνει ότι BC-15 μπορεί να συνδεθεί με τον καρκίνο του μαστού κύτταρα και ιστούς με υψηλή συγγένεια, ενώ ικανότητα δέσμευσης της για μη ογκογόνα κύτταρα και φυσιολογικών ιστών του μαστού είναι πολύ χαμηλότερο? εκτός από τη χρώση φθορισμού, κυτταρομετρία ροής επιβεβαίωσε ότι BC-15 έχει μια υψηλή συγγένεια για κύτταρα όγκου [12]. Για την επικύρωση της πρόσδεσης του BC-15 σε καρκινικά κύτταρα εκτός από τα κύτταρα του καρκίνου του μαστού, ένα σύνολο ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων χρωματίστηκε με BC-15 (Σχ. 1). BC-15 σήματα συσσωρευτεί κυρίως σε πυρήνες των καρκινικών κυττάρων, αλλά ήταν πολύ χαμηλότερες σε αθανατοποιημένα κύτταρα ΜΟΡ10Α επιθηλιακών μαστού. Δεν θετικά σήματα παρατηρήθηκαν σε οποιαδήποτε κύτταρα όταν χρώση με καθετήρα απταμερές τυχαίο έλεγχο. Αυτό πρότεινε ότι οι παρατηρήσεις BC-15 προσδένεται αποκλειστικά σε πυρήνες των καρκινικών κυττάρων.

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο BC-15 απταμερές (Άνω σειρά) ή FITC-επισημασμένο τυχαία απταμερές ελέγχου (Μέση σειρά, πράσινο). Όλα τα κύτταρα μετρητής βάφτηκαν με 0.25% Evans blue για 10 λεπτά για να αποκαλύψει μορφολογία ολικού κυττάρου (κόκκινο). Κάτω σειρά επίδειξη χρώση ανοσοφθορισμού CK διαφορετικών τύπων καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα καλλιεργημένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, έπεσε επί των επικαλυμμένων γυάλινων slides, που ακολουθείται από χρώση με Alexa 594 σημασμένο αντι-CK18 αντίσωμα, και σε αντίθεση χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. PL45, παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα? MCF-7, του καρκίνου του μαστού κύτταρο? Α549, κύτταρο καρκινώματος πνεύμονα? MDA-MB-231, καρκινικό κύτταρο μαστού? ΗΤ-29, αδενοκαρκίνωμα κόλου κύτταρο? ΜΟΡ10Α, μη-ογκογόνο αθανατοποιημένη επιθηλιακά κύτταρα του μαστού. μπαρ κλίμακα, 20μm.

Η

BC-15

+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ασθενών είναι επίσης CK-θετική

Δεδομένου ότι η BC-15 έχει υψηλή και ειδική συγγένεια με CK -θετικό καρκινικά κύτταρα διαφόρων προελεύσεων (Εικ. 1 και το Σχ. 2Α), μπορούμε χρωματίστηκαν δείγματα ασθενών με BC-15. Η μορφολογία του BC-15 + κυττάρων

φαίνεται στο Σχ. 2Β. BC-15 σήματα παρατηρήθηκαν αποκλειστικά σε πυρήνες κυττάρων, η οποία είναι παρόμοια με περιγράφηκε προηγουμένως μοτίβα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και ιστούς. Επιπλέον, η συντριπτική πλειοψηφία των BC-15 + κυττάρων

ήταν CD45

-, και BC-15 πρόσδεση σε λευκοκύτταρα (CD45

+) δεν ανιχνεύθηκε (Σχήμα 2Β και 2Γ.). Ο καρκίνος του παγκρέατος PL-45 κύτταρα και μερικά παγκρεατικά δείγματα ασθενών καρκίνου, η οποία χρωματίστηκαν θετικά με αντι-CK, στη συνέχεια εκ νέου χρώση με BC-15. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, BC-15 και CK σήματα συνέπεσαν καλά και στα δύο κύτταρα PL-45 (πάνω σειρά) και ΚΜΑ από δείγματα του παγκρέατος ασθενή με καρκίνο (κάτω σειρά). Στη συνέχεια, τα πειράματα FISH χρησιμοποιώντας CEP8 εκτελέστηκαν για την επαλήθευση της ανευπλοειδικών χαρακτήρα του BC-15

+ κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D, BC-15

+ /CD45

– κύτταρα ανώμαλα στο χρωμόσωμα 8 καταμέτρηση, ενώ τα λευκά κύτταρα του αίματος (CD45

+) στο παρασκήνιο ήταν διπλοειδή για χρωμόσωμα 8. Εκτός ενιαία και διπλή ΚΜΑ, όγκου κυττάρου-λεμφοκυττάρων μικτά συμπλέγματα ανιχνεύθηκαν επίσης με BC-15 (Σχήμα 2C).? τέτοιες συστάδες έχουν αποδειχθεί ότι είναι μια πιο ακριβής προγνωστικός παράγοντας για τη μετάσταση σε σύγκριση με την παρουσία του ενιαίου κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων [17].

(Α) BC-15

+ (πράσινο) και CK18

+ (κόκκινο) σήματα συνέπεσαν δύο κύτταρα PL-45 (Άνω σειρά) και ΚΜΑ από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (κάτω σειρά). (Β) Μορφολογία των διασπείρονται CTCs από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος που προσδιορίζονται από χρώση ανοσοφθορισμού. ΚΜΑ αποδείχθηκε ως CD45

-κύτταρα με BC-15

+ πυρήνες (πράσινο) και τα βέλη στις εικόνες κάτω μέρος του πίνακα Α υπόδειξη των λευκών αιμοσφαιρίων (CD45

+, κόκκινο). (C) Συμπλέγματος ΚΜΑ αναγνωρίζεται από BC-15 σε δείγματα αίματος από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Λευκά βέλη δείχνουν λευκοκύτταρα (CD45

+). (D) ανοσοφθορισμού ενός BC-15 + κυττάρων

(σημειώνεται με κίτρινο βέλος) κατεστάλη και η ίδια διαφάνεια υποβλήθηκε σε FISH χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή CEP8. BC-15

+ κυττάρων είχε ένα χρωμόσωμα 8 εκτροπή (7 αντίγραφα), ενώ η λευκοκυττάρων φόντο ήταν διπλοειδή για το χρωμόσωμα 8 (λευκό βέλος). Το κύτταρο που υποδεικνύεται από το πράσινο βέλος δεν είχε χαρακτηριστεί ως CTC λόγω της θετικότητας του τόσο για BC-15 και CD45. Κλίμακα μπαρ, 10μm.

Η

BC-15 έχει παρόμοια αποτελεσματικότητα ως αντι-Ck8 /18/19 για την αναγνώριση ΚΜΑ

Anti-CK-based ανοσοχρώση είναι μια καθιερωμένη μέθοδος για την ανίχνευση CTCs σε πολλά συστήματα και δείχνει τη σχετική ικανοποιητική συνοχή και την επαναληψιμότητα σε διάφορα είδη των τύπων καρκίνων [19]. Τα κακοήθη χαρακτηριστικά της CK

+ κύτταρα έχουν επίσης αποδειχθεί με FISH με διάφορους ανιχνευτές CEP. Για να συγκριθεί η ικανότητα αναγνώρισης CTC του BC-15 με εκείνη των μεθόδων αντι-CK, 15 δείγματα περιφερικού αίματος από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (Πίνακας 1) και 15 από υγιείς δότες συλλέχθηκαν. Τα κύτταρα εμπλουτισμένα από αυτά τα δείγματα διαιρέθηκαν εξίσου και χρωματίστηκαν πλάι-πλάι χρησιμοποιώντας αυτές τις δύο μεθόδους. Ούτε μέθοδος ανιχνεύθηκαν θετικά κύτταρα στα δείγματα από υγιείς δότες. Από τα δείγματα 15 ασθενών, 12 (80,0%) είχαν θετικά κύτταρα σύμφωνα με την μέθοδο αντι-CK, ενώ ο θετικός ρυθμός ήταν 73,3% (11/15) με χρήση χρώσης BC-15. Ο μέσος αριθμός των θετικών κυττάρων ανιχνεύθηκαν με αντι-CK ή της χρώσης BC-15 ήταν 25,7 και 19,1 αντίστοιχα ανά δείγμα. Δεν στατιστική διαφορά βρέθηκε μεταξύ των CTC αποτελέσματα απαρίθμηση των δύο μεθόδων με Wilcoxon Signed Ranks test (

P

= 0,699) και υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο αυτών διαφορετικών μεθόδων ανίχνευσης CTC από τεστ συσχέτισης Spearman rank του (rho του Spearman = 0.810,

P

& lt? 0,01)

Η

Συζήτηση

Ως υποκατάστατο των πρωτογενών ή μεταστατικών όγκων, ΚΜΑ παρουσιάζουν ολοένα και μεγαλύτερη σημασία τόσο στην. έρευνα για τον καρκίνο και της κλινικής πρακτικής, και την ανίχνευση CTC απέκτησε ενταθεί το ενδιαφέρον στο πλαίσιο της έρευνας για τον καρκίνο κοινότητα. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δημιουργήσει με επιτυχία ένα σύστημα ανίχνευσης CTC συνδυάζει μια στρατηγική εμπλουτισμού εξάντληση των λευκοκυττάρων και BC-15 ταυτοποίησης απταμερούς. Αυτός ο ισχυρισμός υποστηρίζεται από τις ακόλουθες παρατηρήσεις: (1) BC-15 αναγνωρίζεται διάφορα είδη κυττάρων όγκου ειδικά, και μη ογκογόνα επιθηλιακά κύτταρα και λευκοκύτταρα ήταν αρνητικά για χρώση BC-15? (2) BC-15 είχαν το ίδιο πρότυπο χρώσης σε BC-15

+ /CD45

– κύτταρα εμπλουτίζονται από καρκίνο του παγκρέατος αίμα ασθενούς όπως σε καρκινικά κύτταρα και ιστούς όγκου? (3) BC-15

+ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο του αίματος ήταν CK

+ [20]? (4) BC-15

+ /CD45

– κυττάρων στο αίμα από ασθενείς με καρκίνο έδειξε ανευπλοειδία, ένα κυτταρογενετική ανωμαλία χαρακτηριστικό των κακοήθων κυττάρων? και (5) την αποτελεσματικότητα ταυτοποίηση CTC του BC-15 ήταν ισοδύναμη με εκείνη των μεθόδων αντι-CK.

Λόγω των ετερογενή χαρακτηριστικά τους και το μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση σε κυκλοφορία, ΚΜΑ δεν μπορεί να απαριθμηθούν πλήρως από αντισώματα ότι στόχευση επιθηλιακών δεικτών (π.χ. αντι-CK) [21]. Ωστόσο, θα μπορούσαν να αναπτυχθούν απταμερών να αναγνωρίζουν λεπτές χαρακτηριστικά ή /και χαμηλού ανοσογόνα μόρια των κακοηθών κυττάρων. προκαταρκτικά αποτελέσματα μας παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι είναι εφικτό να χρησιμοποιήσετε ένα απταμερές ως ανιχνευτής ανίχνευσης CTC και επίσης να παρέχουν προοπτικές που θα κάνουν την ανίχνευση CTC πιο προσαρμοσμένη και εξατομικευμένη. Αν και πιλοτικά τα αποτελέσματά μας δεν δείχνουν καμία βελτίωση στην αποτελεσματικότητα της ταυτοποίησης CTC σύγκριση με μεθόδους που βασίζονται σε αντίσωμα, ο ανιχνευτής απταμερές υπόσχεται πολλά για την ανίχνευση ΚΜΑ (τόσο απομόνωση και ταυτοποίηση) λόγω της ικανότητας του να συνδέεται σε διάφορα είδη μοριακών στόχων, υψηλής συγγένειας, καλά καθορισμένη σύνθεση τροποποιημένης διαδικασίας /, τη σταθερότητα και την ομοιομορφία. Επιπλέον, με βάση την καλά αναπτυγμένη /τεχνική ιστο-SELEX κύτταρο, είναι δυνατό να δημιουργήσει ιδιαίτερα απταμερή με υψηλή σταθερότητα με τη χρήση κυττάρων όγκου ή ιστούς όγκων από ένα δεδομένο ασθενή ως επιλογή στόχων [22]. Αυτά τα εξατομικευμένα απταμερή μπορούν να ξεπεράσουν μερικά την αδυναμία έθεσε ομοιόμορφη αντισωμάτων [23] και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως την καθοδήγηση μοριακό στόχευσης θεραπεία ή χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση θεραπευτικής απόκρισης και την πρόβλεψη μακροπρόθεσμη πρόγνωση [22].

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς επιθυμούν να ευχαριστήσω Nathan Ungerleider που βοήθησαν στη γλώσσα επεξεργασίας αγγλική αυτού του χειρογράφου.