Αφηρημένο

Ιστορικό

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία των γυναικολογικών θανάτων από καρκίνο. Οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται αρχικά με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία μετά τη χειρουργική debulking, ωστόσο υποτροπή είναι πολύ συχνή και τελικά αντίστασης πλατίνας αναδύεται. Η κατανόηση του μηχανισμού ανάπτυξης του όγκου, μετάσταση και ανθεκτικών στα φάρμακα υποτροπής θα επηρεάσει βαθύτατα τη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου των ωοθηκών.

Μέθοδοι /Κύρια Ευρήματα

Η χρήση των μικροσυστοιχιών ασθενή ιστό (TMA),

στο vitro

και

in vivo

μελέτες που αναφέρουν ένα ρόλο της κυσταθειονίνης-β-συνθάσης (CBS), ένα ένζυμο του μεταβολισμού του θείου στο καρκίνωμα των ωοθηκών. Αναφέρουμε εδώ ότι η έκφραση του κυσταθειονίνης-β-συνθάση (CBS), ένα ένζυμο του μεταβολισμού του θείου, είναι κοινή σε πρωτογενείς ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών. Η

in vitro

επιπτώσεις της CBS σίγηση μπορεί να αναστραφεί με εξωγενή συμπλήρωση με την GSH και H

2S παραγωγή χημικών Na

2S. Σίγαση CBS σε σισπλατίνη ανθεκτική ορθοτοπικό μοντέλο

in vivo από

παράδοση nanoliposomal του CBS siRNA αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου, μειώνει το σχηματισμό οζιδίων και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε σισπλατίνη. Τα αποτελέσματα περαιτέρω επιβεβαιώθηκαν με ανοσοϊστοχημεία που επιδεικνύει μία μείωση του Η &? Ε, Ki-67 και θετικών κυττάρων CD31 σε si-RNA αντιμετωπίζονται σε σύγκριση με ζώα υπό θεραπεία κωδικοποιημένα-RNA. Επιπλέον, CBS ρυθμίζει επίσης βιοενεργητική των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με τη ρύθμιση μιτοχονδριακή παραγωγή ROS, η κατανάλωση οξυγόνου και ΑΤΡ γενιάς. Αυτή η μελέτη αναφέρει ένα σημαντικό ρόλο του CBS στην προώθηση της ανάπτυξης των όγκων των ωοθηκών και τη διατήρηση ανθεκτικοί στα φάρμακα φαινότυπο με τον έλεγχο της συμπεριφοράς των κυττάρων οξειδοαναγωγής και για τη ρύθμιση των μιτοχονδρίων Βιοενέργεια.

Συμπέρασμα

Η παρούσα έρευνα αναδεικνύει CBS ως πιθανή θεραπευτική στόχου σε υποτροπιάζον και ανθεκτικό πλατίνα καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Bhattacharyya S, Saha S, Giri Κ, Lanza IR, Nair KS, Jennings NB, et al. (2013) ΚυσταθειονίνΓΚ βήτα-συνθάση (CBS) Συμβάλλει στην προχωρημένους καρκίνο των ωοθηκών Εξέλιξη και αντοχή στα φάρμακα. PLoS ONE 8 (11): e79167. doi: 10.1371 /journal.pone.0079167

Επιμέλεια: Soumitro Pal, Νοσοκομείο Παίδων της Βοστόνης & amp? Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Αύγ, 2013? Αποδεκτές: 18η Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Bhattacharyya et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) CA135011 και CA136494 (PM), CA 157 481 (RB), CA148747 (WC) και το Πρόγραμμα Καρκίνου Mayo Clinic Γυναικών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα τελευταία χρόνια η gasotransmitter H

2S έχει αποκτήσει τεράστια σημασία που κυμαίνονται από προκαρυωτικό σε σπονδυλωτά βιολογία και την επέκταση [1] – [6]. Σε ένα δημιουργικό άρθρο, Roth et al. κατέδειξε ότι η προ-θεραπεία με H

2S εμποδίζεται υποξική κάκωση σε ποντίκια με δραστική μείωση της θερμοκρασίας του σώματος του ζώου και τον μεταβολισμό, παρόμοια με αυτό που παρατηρείται σε νάρκη θηλαστικά [7]. Ακόμη ένα άλλο αντικείμενο έδειξαν ότι η απώλεια H

2S σύνθεση ενζύμων ευαισθητοποιηθεί μια πληθώρα νοσογόνων βακτηρίων στα αντιβιοτικά κυρίως με την αύξηση του οξειδωτικού στρες [8]. Ωστόσο, ένας ρόλος για μεταβολικά ένζυμα που συνθέτουν H

2S δεν έχει περιγραφεί στη βιολογία του καρκίνου του παραμένει υπό έρευνα.

Στους ανθρώπους, δύο κύρια μεταβολικά ένζυμα συνθέσει H

2S, κυσταθειονίνης βήτα συνθάσης (CBS ) εντοπίζεται κυρίως στον εγκέφαλο και τους ιστούς του ήπατος και κυσταθειονίνης γάμμα λυάση (CSE /CTH) που απαντάται κυρίως σε μυϊκούς ιστούς [9]. CBS είναι το πρώτο περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην οδό transsulfuration και με τη χρήση της ομοκυστεΐνης (Hcy) παράγει H

2S και του προδρόμου κυστεΐνη κυσταθειονίνης [10]. Εκτός από την κυτταρική πρόσληψη του κυστίνη, κυστεΐνη σύνθεση είναι το στάδιο περιορισμού του ρυθμού για γλουταθειόνη (GSH) παραγωγή, την πανταχού παρούσα αντιοξειδωτικό. Μελέτες χρησιμοποιώντας CBS ποντίκια νοκ ντάουν έχουν υπογράμμισε τη σημασία αυτού του ενζύμου στην καρδιαγγειακή και νευροαγγειακές διαταραχές, προκαλώντας κυρίως ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, πιστεύεται ότι οφείλεται σε αυξημένα επίπεδα Hcy πλάσμα [11] – [13]. Ωστόσο, η συμπλήρωση με βιταμίνη Β

12 και το φολικό οξύ (τα οποία διευκολύνουν επαναμεθυλίωση του Hcy σε μεθειονίνη) μείωσε ακόμη κυκλοφορούντα επίπεδα Hcy απέτυχε να μειώσει τα συμπτώματα της καρδιαγγειακής νόσου. Από την άλλη πλευρά, η βιταμίνη Β

6, ένας συμπαράγοντας για CBS, απέτυχε να μειώσει τα κυκλοφορούντα επίπεδα Hcy σε πρόσφατες κλινικές δοκιμές [14], [15]. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν εμπλοκή άλλων συστατικών, εκτός από Hcy, ως βασικών παραγόντων στις διαταραχές που αναφέρθηκαν παραπάνω.

Λαμβάνοντας υπόψη την αξιοσημείωτη κυτταροπροστατευτική δράση των φυσιολογικών H

2S και γλουταθειόνης που έθεσε ευθέως ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εκμεταλλευτεί αυτή τη μοναδική χαρακτηριστικό του CBS για την παραγωγή H

2S, όταν κάτω από το οξειδωτικό στρες ή μετά από κυτταροτοξική προσβολή. Σε αυτό το πλαίσιο, εστιάσαμε στην επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, η οποία είναι η κύρια αιτία θανάτου των γυναικολογικών καρκίνο στις γυναίκες. Οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται αρχικά με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία μετά τη χειρουργική debulking, ωστόσο υποτροπή είναι πολύ συχνή και τελικά αντίστασης πλατίνας αναδύεται. Ο μηχανισμός αυτής της επανάληψης και της εξέλιξης του φαινοτύπου της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, ωστόσο παραμένει λίγο κατανοητή [16], [17]. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που περιγράφει ένα ρόλο για CBS στη διατήρηση της κυτταρικής υγείας των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από tuning κυτταρική συμπεριφορά οξειδοαναγωγής και μιτοχονδριακή παραγωγή ενέργειας. Φίμωση CBS αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων, σχηματισμό μεταστατικό οζίδιο και να τους ευαισθητοποιεί σε σισπλατίνη, τόσο

in vitro

και σε προ-κλινικές ορθοτοπική μοντέλα ποντικών

in vivo

. Μηχανιστικά, φίμωση CBS μειώνει σημαντικά κυτταρικά επίπεδα GSH, εξασθενίζει H

παραγωγή 2S, ενεργοποιεί καταστολείς όγκου όπως ρ53 και αναστέλλει την ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. CBS συνεντοπίζεται με μιτοχονδριακή δείκτες σε καρκινικά κύτταρα, και φίμωσης CBS μειώνει μιτοχονδριακό κατανάλωση οξυγόνου με ταυτόχρονη αύξηση σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή. Αυτά τα αποτελέσματα μαζί δείχνουν ότι η CBS παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ισορροπίας οξειδοαναγωγής και το μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών προώθηση της ανάπτυξης των όγκων και των μεταστάσεων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Τα δείγματα ασθενών.

Όλα τα 210 συμμετέχοντες που εγγράφονται μέχρι το 2009, από τον οποίο ελήφθη ιστού για TMA, παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για μια IRB-εγκεκριμένο πρωτόκολλο (09-008365) και τα κλινικά δεδομένα που αντλείται για όλες τις περιπτώσεις. Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review Mayo Clinic (Πρωτόκολλο # 09-008365).

Τα πειράματα σε ζώα.

Γυναίκα αθυμικά γυμνά ποντίκια (NCr-ηυ) αγοράστηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου -Frederick Κέντρο Ανάπτυξης (Frederick, MD) Cancer Research και. Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (Acuf # 01-12-01531) και σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα πρότυπα του Υπουργείου Γεωργίας, ΗΠΑ ΗΠΑ Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων υπηρεσιών, και ΝΙΗ. Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης.

Αντιδραστήρια

Οι λεπτομέρειες όλων των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται παρέχονται στο

S1 αρχείου.

OV167 και OV202 (που λαμβάνεται από V. Sridhar, Mayo Clinic) κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ και DMEM αντίστοιχα συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό (πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη). OVCAR-5 ήταν από την ATCC και αναπτύχθηκαν σε DMEM με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδούς και 1% αντιβιοτικό (πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη). Α2780 κύτταρα (Sigma-Aldrich) αναπτύχθηκαν σε RPMI με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό (πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη) σύμφωνα με τις συστάσεις του παρόχου. OVCAR-5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης με 10% FBS, L-γλουταμίνη και ΝΕΑΑ. κύτταρα ΟΣΕ (TST) αναπτύχθηκαν σε MCDB105 μέσο με 15% FBS και 1% υγρομυκίνη. Οι /CP-70 κυτταρικές γραμμές Α2780 αναπτύχθηκαν σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένες διαδικασίες μας [18]. κυτταρική σειρά SKOV3 από την ATCC και SKOV3-ip από το εργαστήριο V. Sridhar του (Mayo Clinic) αναπτύχθηκαν σε μέσα McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό.

Οι συμμετέχοντες Μελέτη και Κατασκευή ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs)

TMAs δημιουργήθηκαν από φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη όγκους των 210 περιπτώσεων Mayo Clinic που εγγράφονται μέσω του Δεκεμβρίου 2009. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση για μια IRB-εγκεκριμένο πρωτόκολλο (09-008365) και τα κλινικά δεδομένα που αντλείται για όλες τις περιπτώσεις. Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο της Mayo Clinic Institutional Review (Πρωτόκολλο # 09-008365).

Χρησιμοποιήσαμε ένα αυτοματοποιημένο Beecher Instruments ATA-27 arrayer επόμενο έλεγχο παθολόγος που δείχνει την τοποθεσία του όγκου. Τρεις πυρήνες 0,6-mm απομακρύνθηκαν από κάθε μπλοκ περίπτωση παραφίνη και τοποθετούνται σε ένα μπλοκ δέκτη παραφίνης σύμφωνα με μια τυχαιοποιημένη ηλεκτρονικό χάρτη ΤΜΑ. μπλοκ παραλήπτη κόπηκαν σε 5-μm τμήματα και τοποθετημένα σε φορτισμένη διαφάνειες.

αντισωμάτων, ανοσοϊστοχημεία, και Scoring

χρώση

ΤΜΑ πραγματοποιήθηκε στο auto χρώσης Leica BOND, χρησιμοποιώντας πολυμερές ομολόγων κιτ ανίχνευσης βελτιώσετε (κατάλογος # DS9800, Leica Microsystems). Διαφάνειες εκτέθηκαν σε πρωτογενές αντίσωμα που αναγνωρίζει CBS (1:1000, πολύκλωνα A01, Abnova), μετά τη βελτιστοποίηση των όρων χρώση σε θετικές ιστούς ελέγχου (κοκκιοκυτταρικών όγκων). Οι αρνητικοί έλεγχοι περιελάμβαναν μη ειδικό αγώνα ισοτόπου και αρνητικοί οροί ποντικού (1:500)? Διαφάνειες βαθμολογήθηκαν ανεξάρτητα από 2 συγγραφείς (RB και ΕΒ), και οι διαφορές επιλύθηκαν από ένα γυναικολογικό παθολόγο (

S1 αρχείου

).

Η επιμόλυνση και Knockdown

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με ομελέτα ελέγχου siRNA ή CBS siRNA (Hs_CBS_5 FlexiTube siRNA (SI02777159, QIAGEN) /SASI_Hs01_00214623 (Sigma)) από HiPerFect® παράγοντα επιμόλυνσης σε αναστολή με μια μικρή τροποποίηση του πρωτοκόλλου του κατασκευαστή (

Αρχείο S1

).

λύση κυττάρων και κηλίδωση Western

η λύση των κυττάρων και κηλίδωση Western διεξήχθη όπως ανά ήδη δημοσιευμένη διαδικασία [19]. Τα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε μία συγκέντρωση ως εξής: CBS (1:1000 αραίωση), αντίσωμα CSE (1:1000), α-τουμπουλίνης (1:2000), β-ακτίνης (1:1000 αραίωση), ΝΡ-κΒ ρ65 (1:1000 αραίωση) και το αντίσωμα p53 (1:200 αραίωση).

Realtime PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy Plus Mini kit (QIAGEN). Το RNA πρώτα αναδρομικά μεταγραφομένων χρησιμοποιώντας κιτ iScript cDNA Synthesis (Bio-Rad) και έπειτα πραγματικό χρόνο, η PCR διεξήχθη με τη χρήση TaqMan® SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Οι εκκινητές για την ανθρώπινη CBS (PPH13484B-200) και βήτα ακτίνης (PPH00073G-200 ACTB) ήταν από QIAGEN. Για ΧΑΚ, ειδικά σχεδιασμένα εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν (Forward: CAGCCTTCAATGTCAATCACC: CAGCAATTACACCAGAAACCAAG και Αντίστροφη). Η συγκριτική C

t μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της σχετικής αφθονίας του mRNA και συγκρίθηκε με εκείνη της έκφρασης βήτα ακτίνης [20]. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές εις τριπλούν.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Τα επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μετρήθηκαν εμβολιάστηκαν σε 24 wellplates (4 × 10

4 ανά φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και δοκιμασία θυμιδίνης (3Η) διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [21] (

File S1

).

η ομοκυστεΐνη (Hcy)

Μέτρηση

επίπεδα Hcy στην κυτταρολύματα των Sc-siRNA και CBS siRNA αγωγή Α2780 κύτταρα προσδιορίστηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με υγρή χρωματογραφία διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC /MS /MS) (

S1 File

).

ομοκυστεΐνη υπερδοσολογία πειραματιστείτε

Περίπου 10

4 Α2780, ΟΣΕ ή SKOV3-ip κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων με τις αντίστοιχες μέσα καλλιέργειας ανάπτυξης. Μετά από 24 ώρες, διάφορες συγκεντρώσεις Hcy διαλύονται σε μέσα καλλιέργειας ανάπτυξης προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για 24 ώρες σε CO

2 θερμοκοιτίδα. 24 ώρες μετά τη θεραπεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

H

2S Μέτρηση

H

2S συγκεντρώσεις των μη επεξεργασμένων ή ΑΟΑΑ κατεργασία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα μετρήθηκαν μετά από τη βιβλιογραφία αναφέρονται πρωτόκολλο με μικρές τροποποιήσεις [22]. Η H

συγκέντρωση 2S κάθε δείγματος υπολογίστηκε έναντι μιας καμπύλης βαθμονόμησης του Na

2S.

H

2S διάσωσης Πείραμα

κύτταρα Α2780 επιμολύνονται με ομελέτα siRNA ελέγχου ή τον έλεγχο CBS siRNA όπως αναφέρθηκε παραπάνω. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και 10

4 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 12 ώρες, διάφορες συγκεντρώσεις Na

2S διαλυμένο σε RPMI-10% FBS προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για 24 ώρες σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Μετά από 24 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

GSH Δοκιμασία

Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Cayman Chemicals). Εν συντομία, τα κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών επιμολύνθηκαν με το ανακατωμένο έλεγχο ή CBS siRNA σε πλάκες καλλιέργειας 60 mm όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα αποξέστηκαν και συλλέγεται σε 50 mM MES ρΗ 6,0 και λύθηκαν με υπερήχους σε 4 ° C. Το προϊόν λύσης στη συνέχεια στροβιλίστηκε στα 14000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C και το διαυγές υπερκείμενο (δηλ προϊόν λύσης κυττάρου) συλλέχθηκε. Το λύμα απο-πρωτεϊνώθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου ομάδας και η συνολική κυτταρική GSH προσδιορίζεται με μια πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται ταυτόχρονα με μέτρηση της απορρόφησης στα 405 nm για 25 λεπτά μετά την προσθήκη του κοκτέιλ δοκιμασίας. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και η σημασία προσδιορίζεται με τη χρήση t-test δύο όψεων του Student, p ≤ 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

GSH Πείραμα διάσωσης

κύτταρα Α2780 επιμολύνονται με ομελέτα ελέγχου siRNA ή ελέγχου CBS siRNA όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Δημοσίευση 48 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και 10

4 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 12 ώρες, διάφορες συγκεντρώσεις ανηγμένου γλουταθείου διαλυμένο σε RPMI-10% FBS προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για 24 ώρες σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Δημοσίευση 24 ώρες θεραπείας, το βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS με Κυττάρων Titer 96® (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό αναλογία της απορρόφησης των κατεργασμένων κυττάρων στα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής.

ROS Δοκιμασία

Η δοκιμασία ROS διεξήχθη σε κύτταρα Α2780 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με ομελέτα έλεγχο ή CBS siRNA μετά από μια τροποποίηση μιας προηγουμένως δημοσιευθεί διαδικασία χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής [23] (

Αρχείο S1

).

λουσιφεράσης Reporter

Περίπου 2 × 10

4 αριθμός κυττάρων Α2780 επιστρώθηκαν ανά φρεάτιο πλάκας 96 φρεατίων, την ημέρα πριν την επιμόλυνση. Την επόμενη ημέρα τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μίγμα ΝΡ-κΒ οδηγείται λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλασμίδιο (100 ng), το πλασμίδιο λουσιφεράση της Renilla (50 ng) και siRNA (200 ηΜ) ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη και Plus αντιδραστηρίου (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή . Δημοσίευση 48 ώρες την επιμόλυνση, τα μέσα καλλιέργειας απορρίφθηκαν και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας και δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla χρησιμοποιούν Glo σύστημα προσδιορισμού διπλής λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με τη μέθοδο του κατασκευαστή. Η αναλογία της δραστικότητας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας να λουσιφεράση της Renilla δραστηριότητα μετρήθηκε με φωταύγεια υπολογίστηκε στη συνέχεια και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t τεστ δύο όψεων του Student, p ≤ 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Ομοεστιακή Μικροσκοπία

Ο εντοπισμός του CBS προσδιορίστηκε με ανοσοχρώση ακολουθούμενη από ομοεστιακό μικροσκόπιο. Περίπου 1,5 × 10

3 κύτταρα απλώθηκαν ανά θάλαμο ενός 4-σε θάλαμο διαφάνειες. Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 ηΜ Mitotracker Green (Invitrogen) για 30 λεπτά στους 37 ° C σε πλήρες μέσο σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA, διαπερατά με 0.1% TritonX-100 σε PBS, αποκλείστηκαν με 4% BSA σε PBS, χρωματίστηκαν με πρωτεύον αντίσωμα CBS (αραίωση 1:100) σε 1% BSA-PBS, αποκλείστηκαν με 5% ορό κατσίκας σε 1% BSA-PBS και χρωματίστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού Cy3-επισημασμένο κατσίκα. Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 χ 3 λεπτά με PBS μετά από κάθε στάδιο κατά τη διάρκεια της ανοσοχρώση. Οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας Zeiss μικροσκόπιο LSM 510 και επεξεργασία χρησιμοποιώντας ImageJ (ΝΙΗ).

Πειράματα οξυγόνου Κατανάλωση

Υψηλής ανάλυσης αναπνευσιομετρίας (Oxygraph, Oroboros Όργανα, Innsbruk, AT) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του οξυγόνου ποσοστά κατανάλωσης σε ακέραια κύτταρα [24]. DatLab λογισμικού (Oroboros Instruments, Innsbruk AT) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό O

2 ροή υπό οξεία θεραπεία ΑΟΑΑ και siRNA επεξεργασμένα κύτταρα Α2780. ταχύτητες ροής οξυγόνου εκφράστηκαν ανά εκατομμύριο κυττάρων

(S1 File).

Η

μιτοχονδριακού ROS Παραγωγή

επίπεδα μιτοχονδριακού ROS προσδιορίστηκαν σε κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA και CBS siRNA επεξεργασμένα κύτταρα 48 h μετά την επιμόλυνση με MitoSOX χρώσης (Invitrogen) διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο της βιβλιογραφίας [25]

(που αναλύεται στο S1 File)

.

κιτρικής συνθάσης (CS) Δραστηριότητα

δραστικότητα CS μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου του Α2780 κυττάρων μετά τη θεραπεία με διαφορετικές δόσεις ΑΟΑΑ για 3 ώρες μετά από τη βιβλιογραφία αναφέρονται μέθοδο [26].

NAD /NADH

Μέτρηση Λόγος

αναλογία /NADH NAD μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Abcam NAD /NADH Assay Kit (ab65348) σε λύματα ολόκληρων κυττάρων σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών (λεπτομέρειες παρέχονται στο

S1 αρχείου

).

Σύνολο ΑΤΡ και ADP /ATP αναλογία

επίπεδα Σύνολο ΑΤΡ σε CBS σιγήσει κύτταρα Α2780 και ΑΟΑΑ επεξεργασμένα κύτταρα Α2780 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Sigma 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ) δοκιμασία βιοφωτεινότητας Kit (FLAA) και ADP /αναλογία ΑΤΡ μετρήθηκε με τη χρήση ADP Abcam του /ΑΤΡ κιτ προσδιορισμού λόγος, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών. Λεπτομερές πρωτόκολλο στο

S1 αρχείου.

Η

Λιποσωμικά siRNA Προετοιμασία

Για

in vivo

παράδοση, siRNA ενσωματώθηκε DOPC όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για λεπτομέρειες βλέπε

S1 αρχείου.

Η

πρότυπο ορθοτοπικής του καρκίνου των ωοθηκών

Πριν όγκου έγχυση κυττάρων στα ποντίκια (ηλικίας 8-12 εβδομάδων), τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, αποκολλήθηκαν με 0,1% ψυχρό EDTA, φυγοκεντρήθηκε για 7 λεπτά, και να ανασυσταθεί σε HBSS (Invitrogen). Η βιωσιμότητα των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με αποκλεισμό trypan blue. Όγκοι συστάθηκε με ε.π. ένεση 1,0 × 10

6A2780 κύτταρα /CP20. Μόλις καθοριστεί, αυτό το πρότυπο όγκου αντανακλά την πρότυπο ανάπτυξης των προχωρημένου καρκίνου των ωοθηκών [27]. Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις της θεραπείας με siRNA για την ανάπτυξη του όγκου, η θεραπεία ξεκίνησε 1 εβδομάδα μετά την ε.π. ένεση των κυττάρων του όγκου. Τα άτομα που έκαναν τις νεκροψίες, συλλογές όγκου και επεξεργασία των ιστών τυφλώθηκαν στις αναθέσεις ομάδα θεραπείας (File S1).

Η ανοσοϊστοχημεία των δείγματα όγκων

Οκτώβριος κατεψυγμένα δείγματα όγκου κόπηκαν και χρωματίστηκαν για η &? Ε, Ki-67 (Mib-1, Dako, M7240) ή CD31 (PECAM-1, SantaCruz, sc-1506-R) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. (S1 File).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως μέση τιμή +/- Τ.Α. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t test δύο ουρών του Student, και μια τιμή του p ≤ 0,05 (*) θεωρήθηκε σημαντική και P≤0.01 ως άκρως σημαντική (**). Για σύγκριση μεταξύ πολλών ομάδων, One-way ANOVA χρησιμοποιήθηκε (File S1).

Αποτελέσματα

CBS υπερεκφράζεται στην Πρωτοβάθμια Τα επιθηλιακά Καρκίνος των ωοθηκών και του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων Γραμμές

Ιστός μελέτες κατανομής σε ανθρώπους έχουν δείξει ότι το ήπαρ και το πάγκρεας έχουν την υψηλότερη έκφραση του mRNA CBS με κάποια έκφραση στον εγκέφαλο και το νεφρό [29]. Σε μοντέλα ποντικών, CBS έχει προταθεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη των ωαρίων και

CBS

– /- ποντίκια πάσχουν από δυσλειτουργία της μήτρας [11], [30]. Για να κατανοήσουμε τον ρόλο του CBS στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών, αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης του CBS στο πρωτογενές δείγματα καρκίνου των ωοθηκών και η σχέση του με χειρουργική-παθολογικών παραγόντων. Χρησιμοποιώντας μια σειρά από μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) κατασκευασμένη από πρωτογενή επιθηλιακά καρκίνους των ωοθηκών που εντοπίστηκαν 210 περιπτώσεις με αξιολογήσιμη χρώση χρησιμοποιώντας TMAs. Βρήκαμε έκφραση του CBS να είναι κοινά στο κυτοσόλιο των πρωτογενών όγκων των ωοθηκών, ιδιαίτερα στον ορώδες καρκίνωμα, η πιο κοινή ιστολογική παραλλαγή. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα δημογραφικά, κλινικά και ιστολογικά παράγοντες που αξιολογήθηκαν για μια ένωση με μέτρια έως ισχυρή έκφραση CBS (Πίνακας 1). Εν συντομία, μέτρια-έντονη έκφραση συσχετίστηκε με ορώδες ιστολογία (69,8% έναντι 41,0% ορώδες εναντίον nonserous, σ & lt? 0.001) και τα υψηλότερα καρκίνους βαθμό (64,7% έναντι 31,6%, βαθμού 3 ή 4 βαθμού εναντίον 1 ή 2, p = 0,005) (Σχ. 1Α). Ενώ στατιστικά σημαντικά διαφορετική μεταξύ των σταδίων, η έκφραση ήταν ακόμη παρούσα στο 35% των όγκων πρώιμο στάδιο. Κατά την εξέταση μόνο τα 149 ορώδες περιπτώσεις στο μεγαλύτερο ομάδα, η έκφραση ήταν μέτρια έως ισχυρή στις 8/11 πρώιμο στάδιο (FIGO στάδια Ι και II) καρκίνους, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση CBS είναι ένα σχετικά πρώιμο χαρακτηριστικό της ορώδους καρκίνων των ωοθηκών. Έχοντας καταδείξει την έκφραση του CBS σε ανθρώπινους ιστούς όγκων, συγκρίναμε την έκφραση του CBS σε φυσιολογικό ωοθηκικό εναντίον καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Χρησιμοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) και ανοσοκηλίδωση να εκτιμηθεί η έκφραση του CBS στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης αντίστοιχα (Σχ. 1 Β-D). Τόσο σε mRNA και το επίπεδο πρωτεΐνης, ελάχιστη έως καθόλου έκφραση του CBS παρατηρήθηκε στον μη κακοήθη επιφάνεια επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ωοθηκών (ΟΣΕ). Ωστόσο 4 από τις 6 καρκινικές κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν σημαντικά υψηλά CBS τόσο σε πρωτεΐνη και το επίπεδο του mRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του ΧΑΚ παρατηρήθηκε σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν λίγο ή καθόλου CBS συμπεριλαμβανομένων ΟΣΕ, γεγονός που υποδηλώνει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ εκφράσεων των δύο ενζύμων (Εικ. 1Β). Έχοντας επιβεβαιώσει ότι CBS εκφράζεται τόσο σε κυτταρικές σειρές, και σε πρωτογενή ωοθηκική καρκίνους εμείς δίπλα επεδίωξε να εξετάσει την λειτουργική σημασία του CBS.

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση ενός μικροσυστοιχιών ιστού του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών δειγμάτων. Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται από κανένα (i), ασθενές (ii), μέτρια (iii), και (iv) έντονη χρώση. (Β) Έκφραση του CBS και ΧΑΚ σε διάφορες κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, όπως προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιείται ως έλεγχος φόρτωσης. δεδομένων (C) RT-PCR που δείχνει την έκφραση του CBS mRNA σε διάφορες κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. δεδομένων (D) RT-PCR που δείχνει την έκφραση του mRNA του ΧΑΚ σε διάφορες κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. (Ε) Επίδραση CBS knockdown στον πολλαπλασιασμό των OV202, SKOV3, Α2780 και Α2780 /CP-70 κύτταρα και τα δεδομένα (F) Ανοσοκηλίδωση για να προσδιοριστεί η έκταση του siRNA με τη μεσολάβηση knockdown. (G) Επίδραση της αναστολής CBS στον πολλαπλασιασμό των OV202, SKOV3 και τα κύτταρα Α2780 από ΑΟΑΑ (24 ώρες θεραπείας) προσδιορίζεται μέσω της δοκιμασίας MTS.

Η

Ελάττωση του CBS βλάπτει κυτταρικού πολλαπλασιασμού

in vitro

η

για να προσδιορίσετε κάποιο ρόλο για CBS στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, CBS είχε σιγήσει στο Α2780, Α2780 /CP-70, τα κύτταρα OV202 και SKOV3 χρησιμοποιώντας CBS-ειδικά siRNA. Για να αποκλειστεί μη ειδική στόχευση του siRNA, νοκ ντάουν και ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με siRNA από δύο διαφορετικές πηγές. Μια σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές του καρκίνου των ωοθηκών που μελετήθηκαν κατά CBS knockdown από (

3Η) -θυμιδίνης (Εικ. 1 Ε). Αποτελεσματική knockdown του CBS (~ 80%) επιβεβαιώθηκε επίσης με ανοσοκηλίδωση 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, σε σύγκριση με μπερδεμένο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 1 F). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση των επιπτώσεων της CBS σιγαστήρα για τον καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική βιωσιμότητα, χρησιμοποιήσαμε μια συγκεκριμένη χημική αναστολέας της CBS, Aminoxyacetic οξύ (ΑΟΑΑ) [8]. Η βιωσιμότητα των Α2780, OV202 και SKOV3 κυττάρων, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΑΟΑΑ για 24 ώρες αξιολογήθηκαν με την δοκιμασία MTS. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε απότομα στο 50% σε περίπου 7 mM συγκέντρωση ΑΟΑΑ με περαιτέρω δοσοεξαρτώμενες μειώσεις μέχρι το -10 mM συγκέντρωση για την Α2780 και SKOV3 κυττάρων ενώ σε OV202 η επίδραση ήταν λιγότερο έντονη (Εικ. 1G). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η οριακή τιμή για τη δραστηριότητα CBS υπάρχει που απαιτείται για τη διατήρηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Ελάττωση του CBS Alters επίπεδα αντιοξειδωτικών, εναύσματα αποπτωτικά Cascades και ενισχύει τα ναρκωτικά ευαισθησία

Η έξοδος του CBS ανέστειλε αντιδράσεις στο κύτταρο θα μπορούσε να είναι, α) μια συσσώρευση Hcy β) μειώθηκε H

2S και γ) μειώθηκε κυσταθειονίνη, τον πρόδρομο για GSH. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε πρώτα εάν Hcy ήταν ένας αιτιώδης παράγοντας για την μείωση του πολλαπλασιασμού (Σχ. 2Α, Β). Εμείς συμπληρωμένο το μέσο καλλιέργειας με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Hcy και στη συνέχεια προσδιορίζεται η βιωσιμότητα του ΟΣΕ και τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (SKOV3-ip και Α2780) χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS. Η αύξηση των επιπέδων Hcy δεν είχε καμία επίπτωση στην βιωσιμότητα του οποιοδήποτε από τα κύτταρα δοκιμάζονται δείχνοντας έτσι ότι τα μειωμένα επίπεδα H

2S ή κυσταθειονίνης ήταν πιθανώς υπεύθυνο για μειωμένη πολλαπλασιασμό (Εικ. 2Β). Επίσης, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα κυτταρικής Hcy παρατηρήθηκαν, όπως μετράται με φασματομετρία μάζας μετά CBS knockdown στο Α2780 κύτταρα, περαιτέρω αποκλείοντας ένα ρόλο για Hcy στην πρόκληση μειωμένη πολλαπλασιασμό (Εικ. 2Α). Ωστόσο, η έλλειψη σημαντικές διαφορές στα επίπεδα Hcy θα μπορούσε να είναι επειδή Hcy μπορεί να υποβληθεί σε γρήγορη μετατροπή σε μεθειονίνη από συνθάση μεθειονίνης ή μπορούν να χρησιμοποιηθούν από ΧΑΚ για την παραγωγή H

2S, αλλά δεν κυσταθειονίνης [31].

(Α ) Μεταβολή των επιπέδων Hcy στα κυτταρικά προϊόντα λύσης του Sc-siRNA και CBS siRNA κύτταρα επεξεργασμένα Α2780 μετριέται με φασματομετρία μάζας. (Β) Hcy πείραμα υπερδοσολογία για να αποδειχθεί η επίδραση της Hcy (24 ώρες θεραπείας) για τον πολλαπλασιασμό του ΟΣΕ, Α2780 και κύτταρα SKOV3-ip με δοκιμασία MTS. (Γ) Η

επίπεδα 2S σε OV202, SKOV3 και κύτταρα Α2780 μετά από χρόνια αναστολή με διαφορετικές δόσεις ΑΟΑΑ για 3 ώρες. (D) Na

πείραμα διάσωσης 2S μετά από νοκ ντάουν του CBS στο Α2780 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις Na

2S για 24 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS. (Ε) Αλλαγή στο συνολικό επίπεδο της γλουταθειόνης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τα ανακατωμένα ελέγχου και CBS siRNA σε OV202, SKOV3 και τα κύτταρα Α2780. πείραμα διάσωσης (F) GSH μετά από νοκ ντάουν του CBS στο Α2780 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις GSH επί 24 ώρες και το κύτταρο βιωσιμότητα εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε τη συνεισφορά της H

2S στην υποστήριξη του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών . Μία δοσοεξαρτώμενη μείωση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του H

2S παρατηρήθηκε 3h μετά την αναστολή της CBS με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΑΟΑΑ (Σχ. 2C). Η συνολική μείωση της H

επίπεδα 2S της OV202 κυττάρων ήταν λιγότερο έντονη από εκείνη Α2780 και κύτταρα SKOV3 η οποία θα μπορούσε να οφείλεται στην ύπαρξη εναλλακτικών H

2S οδό σύνθεσης σε OV202 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CBS παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην H

σύνθεση 2S σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ωστόσο, ο ρόλος του ΧΑΚ δεν θα μπορούσε να αποκλειστεί σε αυτό το σημείο αν και είναι απίθανο, δεδομένου πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών δοκιμαστεί εδώ αποδειχθεί μια χαμηλή έως αμελητέα έκφραση του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου και στο Messenger και στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ένα ρόλο H

2S συμπληρώσαμε το μέσο καλλιέργειας με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ενός H

2S δότη, θειούχο νάτριο (Na

2S) [(32, 33] σε μπερδεμένο siRNA και CBS siRNA αντιμετωπίζονται Α2780 κύτταρα. σε 5 mM Na

2S συγκέντρωση παρατηρήθηκε μια διάσωση ~ 20% της βιωσιμότητας των κυττάρων (Εικ. 2D). Μερική διάσωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από H

2S σε CBS-σιγήσει κύτταρα υποδηλώνει ότι μονοπάτια διαφορετικό από η

βιοσύνθεση 2S όπως GSH μπορεί επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο. ως εκ τούτου, το επόμενο επικεντρώθηκε στην αποκρυπτογράφηση ρόλο της GSH στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. κατασιγάσει CBS μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της ολικής κυτταρικής γλουταθειόνης (GSH + GSSG) σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών δραματικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 2Ε). Σημαντικά, μια συγκέντρωση GSH εξαρτώμενη διάσωση της κυτταρικής βιωσιμότητας παρατηρήθηκε σε CBS σιγήσει κύτταρα Α2780, με πλήρη διάσωση σε συγκέντρωση 2 mM για 24 ώρες (Εικ. 2F). αυξήσει Ταυτόχρονα στην κυτταρική ROS επίπεδα παρατηρήθηκαν όπως καθορίζεται από το H

2carboxy δοκιμασία φθορισμού DCF σε CBS-σιγήσει κύτταρα Α2780 (Σχ. 3Α), το οποίο επιβεβαιώνει με την πτώση της συνολικής ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης στο CBS-σιγήσει κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η πιο σημαντική επίδραση της αποσιώπησης CBS σε καρκινικά κύτταρα είναι η αναστολή της κυτταρικής αντιοξειδωτικό μηχανημάτων. Σε αυτό το πλαίσιο, δύο άλλα μόρια, ρ53 και NF-κΒ έχει δειχθεί ότι είναι εντυπωσιακά οξειδοαναγωγής ευαίσθητη [34] – [38]. Πράγματι, φίμωση CBS σε κύτταρα Α2780 επαγόμενη έκφραση του ρ53 και μειωμένη έκφραση του

ΚεΙΑ

/p65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ (Σχ. 3Β). Σύμφωνα, η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ ανεστάλη επίσης σχεδόν κατά 50% το CBS σιγήσει κύτταρα Α2780 όπως προσδιορίζεται με μία δοκιμασία λουσιφεράσης προαγωγό που έχει πολλαπλά ΝΡ-κΒ (ρ65 /ρ50) θέσεις δέσμευσης (Σχ. 3C). Ωστόσο, ένας πιο άμεσος ρόλος για CBS εκτός ενισχυμένη ROS στην πρόκληση μειωμένη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ είναι επίσης δυνατή. Από ενδοκυτταρική γλουταθειόνη και ROS επηρεάστηκαν σημαντικά στο CBS σιγήσει κύτταρα, είμαστε δίπλα προσδιορίζεται αν συνδυασμό με σισπλατίνη θα ενισχύσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα [39]. Πράγματι θεραπεία των Α2780 κυττάρων με σισπλατίνη μειώθηκε η IC

50 τιμή από 13,1 μΜ σε έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε 7,9 μΜ σε CBS siRNA επιμολυσμένα κύτταρα όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία MTS, 24 ώρες μετά τη θεραπεία cisplatin (Σχ. 3D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CBS δρώντας μέσω της γλουταθειόνης και H

2S μπορεί να προσφέρει ένα σημαντικό πλεονέκτημα επιβίωσης για τα καρκινικά κύτταρα κατά των κυτταροτοξικών προσβολή.

(Α) Επίδραση της CBS knockdown (48 ώρες μετά την επιμόλυνση) στο συνολικό επίπεδο ROS προσδιορίστηκε με δοκιμασία DCF και ποσοτικοποιείται με κυτταρομετρία ροής. δεδομένων (Β) Ανοσοστύπωμα παραδειγματική την επίδραση του CBS σίγασης στην έκφραση της ρ53 και NF-κΒ ρ65 σε Α2780 κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης που δείχνει την επίδραση του CBS knockdown επί της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα επιμολυσμένα με Α2780 Firefly λουσιφεράσης με θέση δέσμευσης πολλαπλές NF-κΒ και κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA ή CBS siRNA.

κβ

-renilla λουσιφεράσης επιμολυσμένα να ομαλοποιήσει δραστηριότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας. (D) CBS σίγηση ενισχύει τη δραστικότητα της κισπλατίνης σε Α2780 κύτταρα. Η (•) και (О) δείχνει την επίδραση της σισπλατίνης επί κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA και CBS siRNA επεξεργασμένα κύτταρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις σισπλατίνης για 24 ώρες μέσω MTS δοκιμασίας και της βιωσιμότητας των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό αναλογία των κατεργασμένων κυττάρων στα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής. Τα IC

50 τιμές ελήφθησαν από μη-γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης.

Η

Σίγαση CBS Μειώνει μιτοχονδριακή αναπνοή και αναστέλλει τη σύνθεση ΑΤΡ

Σε μια προσπάθεια να διερευνήσει το ρόλο του CBS, εκτός μεταβολισμός αμινοξέων, προσδιορίσαμε πρώτα την κυτταρική εντόπιση του ενζύμου CBS χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού.