Αφηρημένο

SRPX2 (Σούσι επανάληψη που περιέχουν πρωτεΐνη, φυλοσύνδετη 2) έχει πρόσφατα αναδειχθεί ως μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην επιληπτικές διαταραχές, αγγειογένεση και την κυτταρική προσκόλληση. Εδώ, αναλύσαμε την πρωτεΐνη αυτή βιοχημικά. πρωτεΐνη SRPX2 εκκρίθηκε με μια ιδιαίτερα μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Χονδροϊτινάση ABC θεραπεία μείωσε εντελώς τη μοριακή μάζα καθαρισμένης πρωτεΐνης SRPX2 να προβλεπόμενου μεγέθους της, ενώ ηπαριτινάσης, κερατανάση και hyaluroinidase δεν το έκανε. Η εκκρινόμενη πρωτεΐνη SRPX2 ανιχνεύθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα αντι-χονδροϊτίνη αντίσωμα θειική. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι SRPX2 είναι μια νέα πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης (CSPG). Επιπλέον, μια δοκιμασία πρόσδεσης αποκάλυψε ότι αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων δεσμεύεται με δοσοεξαρτώμενο τρόπο με την πρωτεΐνη SRPX2, και μια αλληλεπίδραση συνδετήρα-γλυκοζαμινογλυκανών είχε σκεφτεί να είναι πιθανή σε πρωτεογλυκάνες. Όσον αφορά την μοριακή αρχιτεκτονική του, SRPX2 έχει μονάδες επανάληψης σούσι παρόμοιο με άλλα τέσσερα ΟδΡΟδ /lecticans? Ωστόσο, το μοριακό αρχιτεκτονική του SRPX2 φαίνεται να είναι αρκετά διαφορετική από εκείνη των lecticans. Στο σύνολό τους, βρήκαμε ότι SRPX2 είναι μια νέα CSPG που υπερεκφράζεται σε γαστρεντερικό καρκινικά κύτταρα. Τα ευρήματά μας παρέχουν βασικές glycobiological εικόνα SRPX2 στα καρκινικά κύτταρα και να αποδείξει ότι SRPX2 είναι ένα νέο μέλος του καρκίνου που σχετίζονται με πρωτεογλυκανών οικογένεια

Παράθεση:. Tanaka Κ, Arao Τ, Tamura D, Aomatsu Κ, Furuta K, Matsumoto Κ, et al. (2012) SRPX2 είναι ένα μυθιστόρημα θειική χονδροϊτίνη πρωτεογλυκάνων που υπερεκφράζεται στον καρκίνο του γαστρεντερικού συστήματος. PLoS ONE 7 (1): e27922. doi: 10.1371 /journal.pone.0027922

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 28 Ιούνη του 2011? Αποδεκτές: 27 Οκτωβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιαν 2012

Copyright: © 2012 Tanaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία για την Ολοκληρωμένη 3ο Τρίμηνο του 10-Year στρατηγική για τον έλεγχο του Καρκίνου, ένα Grant-in-Aid για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (19209018), και ένα ταμείο από τις Υγείας και Εργασίας Επιστημονικής Έρευνας επιχορηγήσεις. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σούσι επανάληψη πρωτεΐνη Χ-συνδεδεμένη 2 (SRPX2) αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα γονίδιο πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα λευχαιμίας προ-Β και χαρακτηρίστηκε ως σούσι επανάληψης πρωτεΐνη πάνω ρυθμισμένα σε λευχαιμία (SPRUL, [1] ). Αρκετά χρόνια αργότερα, SRPX2 βρέθηκε να είναι υπεύθυνη για rolandic κρίσεων που σχετίζονται με το στόμα και την ομιλία δυσπραξία και νοητική καθυστέρηση [2]. Η μετάλλαξη που προκαλούν ασθένειες (N327S) και μια δεύτερη μετάλλαξη (Y72S) του SRPX2 ταυτοποιήθηκαν, και αυτές οι μεταλλάξεις είχαν ως αποτέλεσμα τη μορφή κέρδος-of-Ν-γλυκοζυλιωμένη της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης [2]. Αν και οι μοριακές και βιολογικές λειτουργίες του SRPX2 ήταν άγνωστη για μεγάλο χρονικό διάστημα, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε σαφώς ότι SRPX2 δεσμεύεται στον υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (uPAR) σε αλληλεπίδραση συνδέτη /υποδοχέα, και ότι οι μεταλλάξεις SRPX2 οδήγησε σε αύξηση του SRPX2 /uPAR συγγένεια σύνδεσης [3]. Στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, Srpx2 ρυθμίζει μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό του σωλήνα, και την αλληλεπίδραση του SRPX2 και υΡΑΚ εμπλέκεται επίσης στα πρώτα στάδια της ενδοθηλιακής αναδιαμόρφωση κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης [4].

Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι SRPX2 υπερεκφράζεται σε γαστρικό καρκινικό ιστό και η έκφραση συσχετίστηκε με κακή κλινική έκβαση [5]. SRPX2 ενισχύει την κυτταρική μετανάστευση και προσκόλληση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα και, κατά τρόπο ενδιαφέροντα, το ρυθμισμένο θρεπτικό μέσο που λαμβάνεται από κύτταρα SRPX2 παράγουν αύξησε την δραστικότητα κυτταρικής μετανάστευσης και της κυτταρικής προσκόλλησης [5]. Εξετάσαμε περαιτέρω SRPX2, εστιάζοντας σε μια βιοχημική ανάλυση σε αυτή τη μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

ΗΕΚ293 διατηρήθηκε σε μέσο DMEM και SNU-16 και ΜΚΝ7 ήταν διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. HUVEC (ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας) διατηρήθηκε σε Humedia-EG2 (Kurabo, Tokyo, Japan) μέσο με 1% FBS κάτω από την προσθήκη του EGF και FGF-2. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2-υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources Collection (Sennan-shi, Osaka).

κηλίδωση Western ανάλυση

Η κηλίδωση Western ανάλυση έχει περιγραφεί προηγουμένως [6]. Στην πίστη, κυτταρικά ιζήματα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Τρις-HCl: 50 mM, ρΗ 7,4? ΝΡ-40: 1%? Na-δεοξυχολικό: 0,25%? NaCl: 150 mM? ΕϋΤΑ: 1 mM? Φαινυλμεθυλ-σουλφονύλιο: 1 mM? απροτινίνη, λευπεπτίνη, πεπστατίνη: 1 mg /ml κάθε? Na3VO4: 1 mM? NaF: 1 mM). Κυτταρικά εκχυλίσματα ηλεκτροφορήθηκαν σε 7.5% (w /v) γέλες πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκε σε ένα πολυβινυλιδενίου δι-φθοριούχου μεμβράνη (Nihon Millipore, Tokyo, Japan). Η μεμβράνη επωάστηκε σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.5% Tween 20 με 3% BSA και στη συνέχεια αντιδρά με τα πρωτεύοντα αντισώματα και το συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα για 90 λεπτά η κάθε μία. Οπτικοποίηση επιτεύχθηκε με αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας ανίχνευση (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν:. Αντι-ΗΑ υψηλής συγγένειας (Roche Applied Science, Mannheim, Germany), αντι-SRPX2 [5] και αντι-θειική χονδροϊτίνη (CS-56? Seikagaku Kogyo, Tokyo, Japan)

Ανίχνευση της ενδογενούς πρωτεΐνης SRPX2

Το μέσο καλλιέργειας υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου και λυοφιλοποιείται. Το υπόλειμμα διαλύθηκε σε 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4) και φυγοκεντρήθηκε στις 20.000 rpm για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,22 μπι. Το διήθημα υποβλήθηκε σε ταχεία υγρή χρωματογραφία πρωτεΐνης (FPLC? GE Healthcare UK Ltd. Buckinghamshire, Αγγλία) διαχωρισμό σε στήλες HiTrap Q ΗΡ (5 mL? GE Healthcare). Οι στήλες εξισορροπήθηκαν με 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4). Τα δείγματα στη συνέχεια εγχέεται επί των στηλών, οι οποίες πλύθηκαν με το ίδιο ρυθμιστικό και εκλούστηκε σε ένα ρυθμό ροής 4 κ.εκ. /λεπτό χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση που αποτελείται από 0-2 Μ NaCI σε 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4) επί 45 min. Η SRPX2 κλάσματα που περιέχουν πρωτεΐνη ήταν τότε εκτελείται χρησιμοποιώντας χρωματογραφία διήθησης πηκτής (στήλη Superdex200, 16 mm × 60 mm? GE Healthcare).

κατασκευάσματα Έκφραση και καθαρισμός SRPX2-ΗΑ /πρωτεΐνη His

Η μέθοδος για την παραγωγή των κατασκευασμάτων έκφρασης που περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Αδειάστε και SRPX2-ΗΑ /φορείς του έχουν διαμολύνονται μετά σε κύτταρα ΗΕΚ293 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Fugene6 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), και τα κύτταρα στη συνέχεια επιλέγονται με υγρομυκίνη. Οι σταθερές επιμόλυνσης κύτταρα ΗΕΚ293 ορίστηκαν ως ΗΕΚ293-Mock και ΗΕΚ293-SRPX2-HA /Του. Το προσαρμοσμένο μέσο της ΗΕΚ293-Mock και /κύτταρα του ΗΕΚ293-SRPX2-HA υποβλήθηκε σε FPLC φόρτιση σε 3 mL /min σε 5 mL στήλη HisTrap HP (GE Healthcare). Η δεσμευμένη πρωτεΐνη εκπλύθηκε με 15 mL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (WB: 50 mM Na

2HPO

4, 10 mM Tris-HCl, 20 mM ιμιδαζόλης [ρΗ 8.0] και 600 mM NaCl,) και εκλούεται σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (ΕΒ: WB + 230 mM ιμιδαζολίου). Οι SRPX2 ΗΑ-/κλάσματα His που περιέχουν πρωτεΐνη εφαρμόστηκαν σε μία στήλη FPLC Superdex200 (16 χιλ x 60 mm? GE Healthcare) εξισορροπημένη με 0.15 Μ διττανθρακικού αμμωνίου. Η έκλουση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ίδιο ρυθμιστικό σε ρυθμό ροής 1 mL /min. Η SRPX2-ΗΑ /περιέχουν His κλάσματα επαληθεύεται με χρησιμοποίηση western blotting και λυοφιλοποιήθηκε.

Η πέψη του SRPX2 από ειδικά ένζυμα GAG αποικοδόμησης

Τα καθαρισμένα SRPX2-ΗΑ /πρωτεΐνη His υποβλήθηκε σε πέψη με διάφορα ειδικά ένζυμα συμπεριλαμβανομένων χονδροϊτινάση ABC και χονδροϊτινάση AC II (0,1 μονάδες σε 40 mM Tris-HCl, 40 mM οξικό νάτριο [ρΗ 8.0] σε 37 ° C για 2 ώρες), χονδροϊτινάση Β (0,02 μονάδες σε 20 mM Tris-HCl, 0,25 μΜ ασβέστιο οξικό [ρΗ 7,5] στους 37 ° C για 2 ώρες), ηπαρινάση Ι και ηπαρινάση II (0,05 μονάδες σε 5 mM οξικό ασβέστιο, 50 mM οξικό νάτριο [ρΗ 7.0] 37 ° C επί ώρες), κερατανάση (0,1 μονάδες σε 7,5 μΜ Tris-HCI [ρΗ 7.4] στους 37 ° C για 2 ώρες), και hyaluroinidase (0.02 Μ ρυθμιστικό οξικού, 0.15 Μ NaCl [ρΗ 6,0] στους 60 ° C για 2 ώρες). Τα ένζυμα τα προμηθευτήκαμε από την Seikagaku Kogyo. Τα δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western.

Δοκιμασίες Σύνδεσης

Μια IASYS συντονισμού καθρέφτη βιοαισθητήρα (Affinity Sensors, Cambridge, UK) με ένα καρβοξυμεθυλο δεξτράνης-αίσθησης κυψελίδα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των κινητικών σταθερών του αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) δέσμευση σε ακινητοποιημένο SRPX2-HA /του. SRPX2-ΗΑ /His διαλύθηκε σε 10 mM μυρμηκικού νατρίου (ρΗ 4.0) και ακινητοποιημένη στην επιφάνεια καρβοξυμεθυλ δεξτράνης της κυψελίδας, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πειράματα δέσμευσης εκτελέστηκαν σε PBS. Αλλαγές στη συντονισμού γωνία παρακολουθήθηκαν σε διαστήματα 1-s για περίπου 600 s. Τα πειράματα διεξήχθησαν στους 25 ° C με ταχύτητα αναδευτήρα 80 rpm. Οι παράμετροι πρόσδεσης υπολογίστηκαν από τις φάσεις σύνδεσης και διάστασης των δεσμευτικών αντιδράσεων χρησιμοποιώντας το εξάρτημα FastFit μη γραμμική καμπύλη (Affinity Sensors). αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Microarray δεδομένα

Τα κλινικά δείγματα των ζευγαρωμένων ορθοκολικών καρκίνων (CRCs), διαδικασία μικροσυστοιχιών και μέθοδος ανάλυσης έχουν περιγραφεί προηγουμένως [7] . Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στο Κέντρο για τη βάση δεδομένων έκφρασης γονιδίου Πληροφορίες Βιολογίας (CIBEX, https://cibex.nig.ac.jp/index.jsp) ως τον αριθμό πρόσβασης # CBX205. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμβατό και ότι η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (CIBEX), όπως περιγράφεται λεπτομερώς στην ιστοσελίδα MGED Κοινωνία https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html.

ασθενείς και δείγματα

Ο 30 CRC και 10 ζεύγη μη-καρκινικές κολονικό βλεννογόνο δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η μέθοδος εκχύλισης RNA και το πρωτόκολλο ελέγχου ποιότητας έχουν περιγραφεί προηγουμένως [7]. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Εθνικού Νοσοκομείου Cancer Center, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

Real-time PCR αντίστροφης μεταγραφής και ανάλυση Western blot

Η οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται σε αυτή την ενότητα έχουν περιγραφεί προηγουμένως [5].

Αποτελέσματα

η υπερέκφραση του SRPX2 στο CRC ιστούς

Αξιολογήσαμε την έκφραση του mRNA της

SRPX2

σε κλινικά δείγματα του ΚΕΣ εκτός από το ομόλογο του

SRPX

(

SRPX1

) χρησιμοποιώντας δεδομένα μικροσυστοιχιών.

SRPX2

έκφραση ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (20.5 φορές, ρ = 0,00014) σε καρκινικούς ιστούς, σε σύγκριση με ζευγαρωμένα noncancerous δείγματα βλεννογόνου, ενώ το υποθετικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο

SRPX

ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω ( 0,7 φορές, p = 0,029) σε καρκίνο (Εικ. 1). Το αποτέλεσμα δείχνει ότι

SRPX2

υπερεκφράζεται στο CRC κατά τη διάρκεια καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου, σε αντίθεση με

SRPX

. Real-time RT-PCR για την 30 CRC και 10 ζεύγη μη-καρκινικές κολονικό βλεννογόνο δείγματα επιβεβαίωσε ότι

SRPX2

mRNA ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται στα δείγματα CRC αλλά εκφράστηκε μόνο σε πολύ χαμηλό επίπεδο σε μη-καρκινικές κολονική βλεννογόνο (Εικόνα 1Β).

(Α) Η έκφραση του mRNA της

SRPX2

και ομόλογο του

SRPX

σε 15 CRC και σε συνδυασμό κανονική παχέος δείγματα βλεννογόνου. Οι τιμές δείχνουν την κανονικοποιημένη ένταση του σήματος που λαμβάνεται από τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. επίπεδα (Β) έκφραση του mRNA της

SRPX2

προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. CRC: καρκίνο του παχέος εντέρου, Rel mRNA:. Κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης του mRNA (

SRPX2

/

ΘΑΡΡ

× 10

6)

Η

εκκριτική πρωτεΐνη SRPX2 υπάρχει υποψία να τροποποιηθεί μετά τη μετάφραση

Η προβλεπόμενη μοριακή μάζα της πρωτεΐνης SRPX2 ήταν 53 kDa? Ωστόσο, κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι η μοριακή μάζα της πρωτεΐνης που εκκρίνεται SRPX2 ήταν ιδιαίτερα αυξημένη, με αλειμμένο ζώνες στα φαινομενική μοριακή μάζα των 100-150 kDa σε SNU-16 και κυτταρικές σειρές ΜΚΝ7 (Εικ. 2Α). Στη συνέχεια, αξιολόγησε την εξωγενώς εκφρασμένης πρωτεΐνης SRPX2 που προέρχονται από ΗΕΚ293-Mock και ΗΕΚ293-SRPX2-HA /κυττάρων Του. Η μοριακή μάζα της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης SRPX2 ήταν παρόμοιο με το προβλεπόμενο μέγεθος, ενώ η μοριακή μάζα της πρωτεΐνης που εκκρίνεται-SRPX2 ήταν ιδιαίτερα αυξημένη (100-150 kDa). Αλείφεται ζώνες ανιχνεύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας τόσο αντι-ΗΑ και αντι-SRPX2 (Σχ. 2Β). Οι μη-αλείψει ζώνες στα 120 kDa στο κελί λύμα είναι ενδογενείς SRPX2. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εκκριτική πρωτεΐνη SRPX2 μπορούν να υποβληθούν σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις.

(Α) που εκκρίνονται μορφή της ενδογενούς πρωτεΐνης SRPX2 λαμβάνεται από το μέσο καλλιέργειας (CM) σε SNU-16 και ΜΚΝ7 κύτταρα. CM υποβλήθηκε σε χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων και χρησιμοποιήθηκαν για western αποτύπωση ανάλυση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-SRPX2. (Β) κηλίδωση Western για εξωγενή πρωτεΐνη SRPX2 λαμβάνεται από κυτταρικό λύμα και CM χρησιμοποιώντας αντι-SRPX2 και αντίσωμα αντι-ΗΑ. Σταθερό μορφομετατροπέα ΗΕΚ293 κύτταρα, εισάγοντας το θραύσμα πλήρους μήκους cDNA που κωδικοποιεί την ανθρώπινη SRPX2 με ΗΑ και τον φορέα His-tag ή κενό φορέα, χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. Οι μη-αλείψει ζώνες στα 120 kDa στο κελί λύμα είναι ενδογενείς SRPX2. Mock: ΗΕΚ293-παρωδία κύτταρα, SRPX2: ΗΕΚ293-SRPX2-HA /κυττάρων Του. ΙΒ: ανοσοαποτύπωση, Lysate: κυτταρικό λύμα, CM: μέσο καλλιέργειας

Η

SRPX2 είναι ένα μυθιστόρημα θειική χονδροϊτίνη πρωτεογλυκανών

Με βάση την εμφάνιση των αλείψει ζώνες σε μια ιδιαίτερα αυξημένη μοριακή μάζα. , υποθέσαμε ότι SRPX2 είναι μια πρωτεογλυκάνη με γλυκοζαμινογλυκάνης (GAG) αλυσίδες. Κατά συνέπεια, αντιμετωπίζονται καθαρισμένη πρωτεΐνη-SRPX2 λαμβάνεται από το καλλιεργημένο μέσο ΗΕΚ293-Mock (άδειο ελέγχου) ή ΗΕΚ293-SRPX2-HA /κυττάρων του με χονδροϊτινάση ABC, ηπαριτινάσης 1, ηπαριτινάσης 2, κερατανάση, χονδροϊτινάση AciI, χονδροϊτινάση Β, και hyaluroinidase . Κηλίδωση Western αποκάλυψε ότι η μοριακή μάζα της πρωτεΐνης που εκκρίνεται SRPX2 σαφώς μειώθηκε κατά χονδροϊτινάση ABC πέψη, αλλά όχι από ηπαριτινάσης ή κερατανάση ή hyaluroinidase (Σχ. 3Α, 3Β). Περαιτέρω chondroitinase θεραπείας έδειξε ότι χονδροϊτινάση ABC και χονδροϊτινάση AciI χωνεύεται πλήρως GAGs σε SRPX2, αλλά ότι χονδροϊτινάση Β χωνεύεται μερικώς αυτές τις αλυσίδες (Σχ. 3Β). Ένα μικρό χωνευμένη πρωτεΐνη SRPX2 ανιχνεύθηκε επίσης χρησιμοποιώντας αντι-SRPX2 αντίσωμα (Σχ. 3C, 3D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι SRPX2 περιέχει αλυσίδες GAG θειική χονδροϊτίνη και είναι μία νέα πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης (CSPG). Επιπλέον, η μερική πέψη με χονδροϊτινάση Β δείχνει ότι ένα συστατικό θειικό δερματάνη μπορούν να συμπεριληφθούν στις αλυσίδες GAG θειική χονδροϊτίνη. Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της ενζυματικής πέψης έναντι ενδογενών SRPX2 από HUVEC χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-SRPX2 και ένα παρόμοιο αποτέλεσμα λήφθηκε (Σχ. 4Α). Αντι-χονδροϊτίνη αντισώματος θειικό (CS-56) ανιχνεύονται επίσης την GAG θειική χονδροϊτίνη για SRPX2 (Εικ. 4Β). Τα μη-αλείψει ζώνες στα 120 kDa στο προϊόν λύσης κυττάρου είναι ενδογενείς SRPX2.

(Α, Β) πρωτεΐνη Καθαρισμένη SRPX2 λαμβάνεται από καλλιεργημένο μέσο από ΗΕΚ293-Mock ή ΗΕΚ293-SRPX2-ΗΑ /κυττάρων His υποβλήθηκαν σε πέψη με χονδροϊτινάση ABC, ηπαριτινάσης 1, ηπαριτινάσης 2, κερατανάση, χονδροϊτινάση AciI, χονδροϊτινάση Β και hyaluroinidase. Η επίδραση της πέψης των αλυσίδων γλυκοζαμινογλυκάνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-ΗΑ (Α, Β) και αντι-SRPX2 (C, D) αντίσωμα. ΙΒ: ανοσοαποτύπωση, CM: μέσο καλλιέργειας. Mock: ΗΕΚ293-παρωδία κύτταρα, SRPX2:. ΗΕΚ293-SRPX2-HA /κύτταρα του

Η

(Α) πέψης Χονδροϊτινάση ABC για την ενδογενή πρωτεΐνη SRPX2 προέρχεται από HUVEC (ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφαλικής φλέβας). Η πρωτεΐνη SRPX2 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-SRPX2. (Β) κηλίδωση Western για την πρωτεΐνη SRPX2 χρησιμοποιώντας αντι-χονδροϊτίνη αντίσωμα θειική (CS-56). Οι μη-αλείψει ζώνες στα 120 kDa στο κελί λύμα είναι ενδογενείς SRPX2. ΙΒ: ανοσοαποτύπωση, Lysate: λύμα κυττάρων, CM: μέσο καλλιέργειας. Mock: ΗΕΚ293-παρωδία κύτταρα, SRPX2:. ΗΕΚ293-SRPX2-HA /κύτταρα του

Η

HGF δεσμεύεται να SRPX2

Είναι γνωστό ότι αρκετοί συνδέτες συμπεριλαμβανομένων HGF, δέσμευσης ηπαρίνης EGF-αυξητικού παράγοντα, αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα είναι ικανά να συνδέονται με την αλυσίδα GAG και ότι τέτοιες αλληλεπιδράσεις θεωρείται ότι είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της GAGs και πρωτεογλυκάνες [8]. Σύμφωνα με μια έκθεση σχετικά με CSPG endocan και HGF σύνδεση [9], εξετάσαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ των HGF και GAG χρησιμοποιώντας ένα IASYS συντονισμού καθρέφτη βιοαισθητήρα. δοσοεξαρτώμενο HGF δεσμεύεται στα GAGs του SRPX2, ενώ ο έλεγχος BSA δεν το έκανε (Σχ. 5Α). Η

K

δ

αξία αυτής της αλληλεπίδρασης, η οποία υπολογίζεται από την αναλογία του

K

diss /K

κώλο

, ήταν 5,6 nM? Αυτά τα δεδομένα ήταν παρόμοιες με αυτές που έχουν αναφερθεί προηγουμένως για τα δεδομένα σχετικά με HGF και endocan [9]. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη βιολογική λειτουργία του SRPX2 επί HGF. HGF αύξησε τον πολλαπλασιασμό των HUVEC, και η προσθήκη καθαρισμένης πρωτεΐνης SRPX2 εντός του μέσου αυξήθηκαν σημαντικά τον επαγόμενο από HGF πολλαπλασιασμό (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αλληλεπίδραση του HGF με SRPX2 έχει θετική επίδραση επί της αγγειογένεσης.

(Α) IASYS συντονισμού βιοαισθητήρα καθρέφτη χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (Β) Cell πολλαπλασιασμό HUVECs αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Το HUVECs διεγέρθηκαν με ή χωρίς 10 ng /mL του HGF και 5 μg /mL καθαρισμένης πρωτεΐνης SRPX2 για 72 ώρες. *, SRPX2 (-) έναντι (+), p & lt? 0,05

Η

SRPX2 έχει μοναδική μοριακή αρχιτεκτονικές σε σύγκριση με άλλες σούσι επανάληψη που περιέχουν μονάδα-CSPG

Τα δεδομένα από δημόσια διαθέσιμες βάσεις δεδομένων. (https://smart.embl-heidelberg.de/) και μια προηγούμενη έκθεση [10] έδειξε ότι SRPX2 έχει τρεις ενότητες σούσι επανάληψης (γνωστή επίσης και ως μονάδες πρωτεΐνη ελέγχου συμπληρώματος ή βραχείες σύμφωνες επαναλήψεις) και έναν τομέα υαλώδη (Εικ. 6 ). Είναι ενδιαφέρον, τέσσερις CSPG (agrrecan, βερσικάνη, neurocan και brevican? Επίσης γνωστή ως lecticans) βρίσκονται μεταξύ της οικογένειας που περιέχουν μονάδα-σούσι επανάληψη, και την κοινή μοριακή αρχιτεκτονικές τους αποτελούνται από μία παρόμοια με ανοσοσφαιρίνη περιοχή, 2~4 τομείς LINK, ένας EGF -όπως τομέα, ένας λεκτίνης τύπου C, και μία μονάδα σούσι επανάληψης (Εικ. 6). Η παρουσία μιας μονάδας σούσι επανάληψης και ταξινόμηση ως CSPG είναι τα ίδια για SRPX2 και lecticans, αλλά οι άλλες μοριακές αρχιτεκτονικές SRPX2 είναι αρκετά διαφορετική

Τα στοιχεία ελήφθησαν από την δημόσια βάση δεδομένων SMART (http: /. /smart.embl-heidelberg.de/). SRPX2 έχει τρεις ενότητες επανάληψης σούσι και έναν τομέα υαλοειδούς. Τέσσερις σούσι επανάληψη μονάδα που περιέχει CSPG (agrrecan, βερσικάνη, neurocan και brevican? Επίσης γνωστή ως lecticans) δείχνονται επίσης. SP: πεπτίδια-σηματοδότες, ΑΑ: αμινοξέα. Σούσι: σούσι επανάληψη ενότητες /CCP /σύντομη συναίνεση επαναλαμβάνει, υαλώδη: υαλώδη τομέα, IG: ανοσοσφαιρίνης-όπως, LINK: υαλουρονάνη δεσμευτική, EGF-l: EGF-όπως (Ca

2 + που δεσμεύουν), Ct-L :. λεκτίνη τύπου C

η

στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι SRPX2 είναι ένα μυθιστόρημα CSPG που υπερεκφράζεται στο γαστρεντερικό καρκινικά κύτταρα

Συζήτηση

η εκτεταμένη. χρήση και δομική ποικιλομορφία των ενοτήτων επανάληψης σούσι αντικατοπτρίζει πιθανώς την ευελιξία ενός δομικού ικρίωμα που έχει προσαρμοστεί από την εξέλιξη ώστε να ταιριάζει πολλούς σκοπούς, τόσο αρχιτεκτονικά και λειτουργικά, όπως η μεσολάβηση της ειδικής πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και πρωτεΐνης-υδατάνθρακα αλληλεπιδράσεις [10] – [12]. Εν τω μεταξύ, SRPX2 έχει ένα domain υαλώδη, η οποία φαίνεται να εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση. Οι περιοχές Hyaline έχουν εντοπιστεί σε διάφορα ευκαρυωτικών πρωτεϊνών και συχνά συνδέονται με ενότητες επανάληψης σούσι ή διατάσσονται σε πολλαπλά αντίτυπα [13]. Αυτά τα χαρακτηριστικά των μοριακών αρχιτεκτονικές SRPX2, με βάση τη γνώση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, μπορεί να συνεισφέρουν σε αλληλεπιδράσεις συνδέτη /υποδοχέα μεταξύ SRPX2 και uPAR, με επιπτώσεις για διαταραχές της γλώσσας φλοιού, γνωστική λειτουργία, και την αγγειογένεση [3], [4] .

Έχουμε αποδείξει ότι SRPX2 είναι ένας νέος CSPG, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να έχουν SRPX2 επιπλέον ακόμα άγνωστες βιολογικές λειτουργίες ως πρωτεογλυκάνη, όπου συμπεριλαμβάνονται οι αλληλεπιδράσεις με διάφορα εξωκυτταρικά μόρια σηματοδότησης όπως οι αυξητικοί παράγοντες, μορφογόνα, ένζυμα και χημειοκινών και ή /και μπορεί να δρουν στη διαχωριστική επιφάνεια κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας για να διαμορφώνει σηματοδότηση κυττάρων. Το ρυθμισμένο θρεπτικό μέσο των κυττάρων SRPX2 παράγουν σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική προσκόλληση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [5]? Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να εξηγηθεί από την βιολογική λειτουργία του SRPX2 ως πρωτεογλυκάνη. Επιπλέον, αν και έχουμε αποδείξει μόνο ότι ο HGF μπορεί να συνδεθεί με SRPX2, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι άλλα γνωστά προσδέματα GAG-αλληλεπιδρούν μπορεί να είναι ικανό να συνδέεται με την αλυσίδα GAG του SRPX2. Ως εκ τούτου, η λειτουργία του συνδέτη SRPX2 πρόσδεσης μπορεί να επηρεάσει σε μεγάλο βαθμό τις δραστηριότητες των μονοπατιού κρίσιμη για τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρικό πολλαπλασιασμό, απόπτωση, μετανάστευση και επιβίωση [14] σηματοδότησης. Επιπλέον, SRPX2 βρέθηκε να εκκρίνεται και μπορεί να δρα ως πρωτεΐνη εξωκυττάριας ουσίας που είναι παρόμοια με άλλες πρωτεογλυκάνες? πράγματι επικάλυψη του δίσκος καλλιέργειας με πρωτεΐνη SRPX2 αξιοσημείωτα ενισχυμένη κυτταρική προσκόλληση [5], υποστηρίζοντας την ιδέα αυτή.

Τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC αισθητά ρητή SRPX2 στον ίδιο βαθμό όπως καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν υψηλής [5]. Μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι Srpx2 είναι μια νέα μεσολαβητής της αγγειογένεσης και ένα βασικό μόριο που εμπλέκονται στην επεμβατική μετανάστευση του αγγειογόνου ενδοθηλίου μέσω του ρόλου της ως συνδέτης για αγγειακά uPAR [4]. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν επίσης τη συμμετοχή των SRPX2 στην αγγειογένεση από μια άλλη πτυχή των πρωτεογλυκανών. Από endocan είναι γνωστό ως ένα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα ειδικά CSPG [8], SRPX2 μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα αγγειακό σχετίζονται CSPG παρόμοια με endocan.

Εν κατακλείδι, διαπιστώσαμε ότι SRPX2 είναι μια νέα θειική χονδροϊτίνη πρωτεογλυκάνη που υπερεκφράζεται στον καρκίνο του γαστρεντερικού. Τα ευρήματά μας παρέχουν βασικές glycobiological γνώση αυτής της πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε την κα Eiko Honda (Κέντρο Επιστημών Ζωής, Κίνκι Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου) για την τεχνική βοήθεια και ο κ της Kiyotaka Okada (Τμήμα Φυσιολογίας, Κίνκι Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου) για την παροχή τεχνικών συμβουλών.