Αφηρημένο

Η επιθετικότητα του πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDA) χαρακτηρίζεται από υψηλό μεταστατικό δυναμικό της και η έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών, που είναι το αποτέλεσμα της έλλειψης κατανόησης των μηχανισμών που εμπλέκονται στην προώθηση μεταστάσεις PDA. Ταυτοποιήσαμε αννεξίνη Α2 (ANXA2), ένα μέλος της οικογένειας αννεξίνης πρωτεϊνών δέσμευσης φωσφολιπιδίων εξαρτάται από ασβέστιο, σαν ένα νέο μόριο που προάγει PDA εισβολή και μεταστάσεις. Βρήκαμε ANXA2 να είναι ένα PDA που σχετίζεται αντιγόνο που αναγνωρίζεται από μετα-κατεργασία ορούς ασθενών που απέδειξαν παρατεταμένη επιβίωση μετά από αγωγή με ένα PDA-ειδικό εμβόλιο. κυτταρικής επιφάνειας ANXA2 αυξάνει με ανάπτυξη και εξέλιξη PDA. Knockdown έκφρασης ANXA2 με παρεμβολή RNA ή αποκλεισμό με αντισώματα αντι-ANXA2 αναστέλλει

in vitro

εισβολή των κυττάρων του PDA. Επιπλέον, μετά τον εμβολιασμό αναστέλλει ορούς ασθενών

in vitro

εισβολή των κυττάρων του PDA, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι θεραπευτικά αντισώματα αντι-ANXA2 που προκαλείται από το εμβόλιο. Επιπλέον, κυτταρικής επιφάνειας εντοπισμός του ANXA2 είναι τυροσίνη 23 εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση? και η τυροσίνη 23 φωσφορυλίωση απαιτείται για PDA εισβολή. Δείξαμε ότι η τυροσίνη 23 φωσφορυλίωση με αποτέλεσμα επιφανειακή έκφραση του ANXA2 απαιτείται για τον ΤΟΡβ-επαγόμενη, Rho μεσολάβηση επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), που συνδέει την κυτταρική λειτουργία του ANXA2 η οποία είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι συνδέεται με τις μικρές ΟΤΡάσης ρυθμιζόμενες αναδιατάξεις κυτταροσκελετικές , με τη διαδικασία EMT σε PDA. Τέλος, χρησιμοποιώντας μοντέλα PDA ποντίκι, δείξαμε ότι shRNA knock-down του

ANXA2

, μια μετάλλαξη σε τυροσίνη 23, ή αντισώματα αντι-ANXA2, αναστέλλουν μεταστάσεις PDA και παρατείνει την επιβίωση του ποντικιού. Έτσι, ANXA2 είναι μέρος ενός νέου μοριακού μονοπατιού υποκείμενη μεταστάσεις PDA και ένα νέο στόχο για την ανάπτυξη των PDA θεραπευτικών

Παράθεση:. Zheng L, Foley K, L Huang, Leubner Α, Μο G, Olino K, et al. (2011) Τυροσίνη 23 εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση κυτταρικής επιφάνειας Εντοπισμός αννεξίνη Α2 απαιτείται για την εισβολή και μεταστάσεις του καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (4): e19390. doi: 10.1371 /journal.pone.0019390

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 του Μάρτη 2011? Αποδεκτές: 28 Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Zheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το SPORE NCI στην γαστρεντερικού καρκίνοι Ρ50 CA062924-14 (EMJ), Lustgarten Ίδρυμα (EMJ), Γενικοί Ίδρυμα (EMJ), NCI R01 CA88058 (EMJ), Virágh Ιδρύματος, ΝΙΗ 1K23 CA93566-01A1 (DL), ASCO Νέοι ερευνητής Βραβείο (LZ), ΝΙΗ 5T32 CA0090701-28 Κατάρτισης Grant (LZ), το Sol Goldman παγκρέατος Κέντρο Καρκίνου (LZ). Ο Δρ Jaffee είναι ο πρώτος αποδέκτης της Dana and Albert «Cubby» Μπρόκολο Προικισμένο καθηγητικές. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχω διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Στο πλαίσιο συμφωνίας παραχώρησης άδειας εκμετάλλευσης μεταξύ BioSante και το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, το Πανεπιστήμιο έχει το δικαίωμα να ορόσημο των πληρωμών και των δικαιωμάτων επί των πωλήσεων του προϊόντος εμβολίου που περιγράφεται σε αυτό το χειρόγραφο. Δεν έχουμε οποιεσδήποτε άλλες σχετικές συγκρούσεις συμφερόντων που πρέπει να γνωστοποιούνται. Π Illei έχει δώσει μια διάλεξη που χρηματοδοτείται από τη Leica Microsystems. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDA) παραμένει ένα θανατηφόρο καρκίνο με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών & lt? 5% [1]. Αδυναμία να διαγνώσει νωρίς, υψηλού μεταστατικού δυναμικού, και ο λογαριασμός της αντίστασης στα φάρμακα για το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης του. Αν και είναι καλά εδραιωμένη ότι η παθογένεση της PDAs ακολουθεί βαθμηδόν στάδια που εμφανίζουν αύξηση κυτταρική ατυπία και συσσωρεύονται κλωνική μεταλλάξεις ή παρεκκλίνουσα έκφραση ογκογονιδίων ή γονιδίων καταστολής όγκου όπως

K-Ras

,

ρ16

,

p53

,

και DPC4 /Smad4

[2], φάρμακα που στοχεύουν αυτές τις μοριακές ανωμαλίες δεν έχουν ακόμη μεταφραστεί σε βελτιωμένη κλινική απαντήσεις [3]. Η επιθετική φύση του PDA χαρακτηρίζεται από την υψηλή συχνότητα εμφάνισης της μεταστάσεων κατά το χρόνο της αρχικής διάγνωσης και υψηλή συχνότητα εμφάνισης της πρόωρης μεταστάσεων μετά από χειρουργική εκτομή. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την εισβολή και την μεταστατική διεργασίες. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών αυτών είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη καινοτόμων και βελτιωμένων θεραπειών για PDA.

θεραπευτικές προσεγγίσεις του καρκίνου ανοσοθεραπεία είναι υπό ανάπτυξη για το PDA. Έχουμε αναπτύξει μια αλλογενή, παράγοντα διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF) που εκκρίνουν εμβόλιο PDA για ασθενείς με PDA [4], [5], [6]. Φάση Ι και ΙΙ δοκιμές αξιολόγηση αυτού του εμβολίου σε ασθενείς με εκτομή PDA αποδεικνύεται τόσο κλινικές και ανοσολογικές αποκρίσεις [4], [5]. Αυτή η προσέγγιση ανοσοθεραπεία παρέχεται ανοσοποιηθεί αντιδραστήρια λεμφοκυττάρων για την ταυτοποίηση νέων αντιγόνων PDA που δοκιμάζονται σήμερα ως στόχους για θεραπεία PDA [7], [8]. Οι πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι ταυτοποιηθεί μέχρι τώρα έχουν επίσης σημαντικές ενδείξεις για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών που υπόκεινται στην ανάπτυξη PDA και μεταστάσεων. Εδώ αναφέρουμε τη χρησιμοποίηση ενός λειτουργικού πρωτεομικής προσέγγιση που εντοπίστηκαν με αννεξίνη Α2 (ANXA2) ως ένα νέο στόχο υποψήφιο PDA της ανοσολογικής απόκρισης. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η τυροσίνη 23 εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση κυτταρικής επιφάνειας εντοπισμός αννεξίνης Α2 απαιτείται για επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση, εισβολή, και τις μεταστάσεις σχηματισμό PDAs.

Αποτελέσματα

Ταυτοποίηση ANXA2 ως νέο υποψήφιο PDA όγκο αντιγόνο που συνδέεται και βιοδεικτών

Χρησιμοποιήσαμε ανοσοποιηθεί ορούς από δύο άτομα που αποδεικνύεται τόσο αποδείξεις μετά τον εμβολιασμό κυτταρικές ανοσολογικές αποκρίσεις και παρατεταμένη επιβίωση ελεύθερη νόσου (DFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) σε μια μελέτη φάσης ΙΙ του GM-CSF εκκρίνουν εμβόλιο ολόκληρων κυττάρων PDA [4] στην οθόνη εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων από το εμβόλιο κυτταρικές σειρές PDA που χρησίμευσε ως proteome. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων (2-DE)? και ανάλυση ανοσοκηλίδος διεξήχθη για να συγκρίνει την αναγνώριση του αντιγόνου από πριν και μετά τον εμβολιασμό οροί. sera Πρωτεΐνες που αναγνωρίζονται από μετά τον εμβολιασμό οροί σε σχέση με προ-εμβολιασμού ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας. ANXA2 ήταν μια πρωτεΐνη που εντοπίζεται στις μετά τον εμβολιασμό ανοσοστυπώματα ορούς δύο ασθενών που αξιολογήθηκαν. Για την περαιτέρω αξιολόγηση του επιπολασμού της μετά τον εμβολιασμό χυμικών απαντήσεων σε ANXA2, καθαρισμένη ανασυνδυασμένη ANXA2 χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή προ του εμβολιασμού και οροί μετά τον εμβολιασμό από 16 επιπλέον ασθενείς που έλαβαν θεραπεία σε αυτήν την μελέτη φάσης II τόσο από ELISA και Western Blot (Σχήμα S1). Εμβόλιο προκληθέντα αντισώματα αντι-ANXA2, μετρήθηκε με ένα σάντουιτς ELISA, ανιχνεύθηκαν σε 6 από 7 ασθενείς που είχαν DFS μεγαλύτερη από 36 μήνες [4], και μόνο σε 1 από τις άλλες 9 ασθενείς που δεν επιδεικνύουν μακροχρόνια DFS ( Τραπέζι 1). Αυτά τα δεδομένα παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι ANXA2 είναι ένας στόχος αντίσωμα ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι PDA.

Η

ANXA2 έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων PDA, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς [9]. Ωστόσο, ANXA2 είναι κανονικά ένα κυτταροπλασματική και αυλού κατοικούν πρωτεΐνης σε παγκρεατικό ιστό, και προηγούμενες μελέτες [9] δεν έχουν καθοριστεί εάν η έκφραση κυτταρικής επιφάνειας ANXA2 είναι ένα κυρίαρχο μοτίβο σε ιστούς PDA. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την τοποθεσία του ANXA2 έκφρασης με ανοσοϊστοχημεία (IHC) στις εκτομή όγκων από 52 από τους 60 ασθενείς που έλαβαν θεραπεία στη μελέτη μας Φάσης II για τους οποίους τα δείγματα ήταν διαθέσιμα για χρώση. Βρήκαμε ότι η κανονική παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα δείχνουν αδύναμα κυτταροπλασματική και αυλού χρώση με IHC, ενώ κυτταρικής επιφάνειας εντοπισμένης ANXA2 αυξάνει με την πρόοδο από PanIN βλάβες σε επεμβατικές PDA (Εικόνα S2). Συγκεκριμένα, 39 (75%) του 52 φρέσκων δειγμάτων παγκρεατικού ιστού όγκου δοκιμάζονται έχουν αυξημένη έκφραση κυτταρικής επιφάνειας του ANXA2 (Εικόνα S2). Αυτά τα δεδομένα παρέχουν περαιτέρω υποστήριξη ότι η έκφραση επιφάνειας ANXA2 σχετίζεται με την ανάπτυξη PDA και ως τέτοια μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ανοσολογικό στόχο.

Η αναστολή της ANXA2 καταστέλλει το

in vitro

εισβολή των κυττάρων PDA

επόμενο διερευνηθεί κατά πόσον η κυτταρική επιφάνεια εντοπισμός του ANXA2 παίζει ένα βιολογικό ρόλο στη διευκόλυνση PDA εισβολή. ANXA2 έχει αναφερθεί ότι δεσμεύει τα φωσφολιπίδια της μεμβράνης που συνδέεται και έχουν διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης του πλασμινογόνου, ινωδόλυση, μεταφορά μεμβράνης, κυτταροσκελετού αναδιάταξη, αγγειογένεση, κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση. ANXA2 λειτουργεί επίσης ως υποδοχέας υψηλής συγγένειας για πολλαπλές εξωκυτταρικό συνδέτες που έχουν ενοχοποιηθεί στην ανάπτυξη καρκίνου, εισβολή, και οι μεταστάσεις [10], [11], [12], [13]. Για να ελέγξετε άμεσα εάν ANXA2 εμπλέκεται σε PDA εισβολή, ANXA2 έκφραση χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα PDA με παρεμβολή RNA (Εικόνα 1Α). Νοκ-κάτω της

ANXA2

κατέστειλε την

in vitro

εισβολή των κυττάρων PDA σε μια δοκιμασία θαλάμου Boyden (Εικόνα 1Β και το Σχήμα S3). Η επαγωγή των αντισωμάτων έναντι ANXA2 που παρατηρείται σε εμβολιασμένους ασθενείς με παρατεταμένη DFS (Πίνακας 1) υποδεικνύει ότι τα αντισώματα αντι-ANXA2 μπορεί να έχει άμεση επίδραση κατά του όγκου. Ως εκ τούτου, δοκιμάζονται και πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντι-ANXA2 αντισώματα κουνελιού και βρήκαν ότι μπορούν να αναστείλουν ειδικώς

in vitro

εισβολή των κυττάρων του PDA (Σχήμα 1 C, D). Επιπλέον, οροί από εμβολιασμένα ασθενείς οι οποίοι επέδειξαν μια απάντηση μετά τον εμβολιασμό με ANXA2 παρόμοια ανέστειλε

in vitro

εισβολή των κυττάρων PDA (Σχήμα 1Ε). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται μέχρι τώρα σύνδεσμος αυξανόμενη κυτταρική επιφάνεια έκφραση του ANXA2 με ικανότητα εισβολής PDA και προτείνει ότι αποκρίσεις αντισωμάτων επάγονται από το εμβόλιο μπορεί να αναστέλλει αυτήν την πτυχή της εξέλιξης PDA. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο συμβαίνει ANXA2 μεσολάβηση εισβολή PDA έχει ακόμη να διερευνηθούν. Είναι ενδιαφέρον ότι η επεμβατική ικανότητα των κυττάρων PDA δεν συσχετίζεται με ρυθμό πολλαπλασιασμού τους προτείνοντας έναν ανεξάρτητο μηχανισμό (Σχήμα S3). Να αποκαλύψει άλλες ρυθμιστικοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την ικανότητα εισβολής των κυττάρων PDA, εξετάσαμε περαιτέρω την υπο-κυτταρικό εντοπισμό των ANXA2 σε διάφορες κυτταρικές σειρές PDA με χρώση φθορισμού με αντισώματα αντι-ANXA2 (Σχήμα S4). ANXA2 εντοπίζεται κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη σε όλες τις κυτταρικές σειρές 8 PDA βρέθηκαν να έχουν υψηλή ικανότητα εισβολής, ενώ ANXA2 είναι παρούσα κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυτταρικών γραμμών με χαμηλή ικανότητα εισβολής (Σχήμα S4 και στον Πίνακα S1). Αυτά τα δεδομένα περαιτέρω υποστηρίζουν ένα ρόλο για ANXA2 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στην κυτταρική επιφάνεια /μεμβράνης στην ενίσχυση εισβολή κυττάρων PDA.

A. Western blot ανάλυσης που δείχνουν ότι

ANXA2

siRNA αναστέλλει την έκφραση των ANXA2 σε ένα PDA κυτταρική σειρά. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων από Panc10.05 αγωγή με έλεγχο siRNA και

ANXA2

siRNA, αντίστοιχα, κηλιδώθηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ANXA2 αντίσωμα (άνω τμήμα) και από πολυκλωνικά κουνελιού αντι-GAPDH αντίσωμα (κάτω πίνακας). Β

που δείχνει In vitro

δοκιμασία εισβολής που

ANXA2

siRNA αναστέλλει την ικανότητα εισβολής της κυτταρικής σειράς 10,05 PDA. Εισβολή κύτταρα μετρήθηκαν με προσδιορισμούς ΜΤΤ και ομαλοποιήθηκε ως προς το συνολικό αριθμό των κυττάρων. Γ Πολυκλωνικά αντισώματα αντι-ANXA2 αναστέλλουν την ικανότητα εισβολής των κυττάρων Panc10.05. Δ ποντικού αντι-ANXA2 μονοκλωνικά αντισώματα (mAb) αναστέλλουν την ικανότητα εισβολής των Panc02 ποντικού και ανθρώπινα κύτταρα Panc10.5. Για Γ και Δ, αντίσωμα αντι-ANXA2 κουνέλι, ελέγχου Ig κουνελιού, ποντικού αντι-ANXA2 mAb (κλώνος: ZO14), ή ο έλεγχος ισοτύπου IgG1 ποντικού προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 25 μg /ml σε ολόκληρο το

in vitro δοκιμασίες

εισβολή, αντίστοιχα. Ε Μόνο οροί μετά τον εμβολιασμό από ασθενείς (3.009 και 3.028), οι οποίοι κατέδειξαν αποκρίσεις αντισώματος αντι-ANXA2, αλλά όχι από τους ασθενείς (3.037 και 3.039), οι οποίοι δεν επιδεικνύουν αποκρίσεις αντισώματος αντι-ANXA2, αναστέλλουν την εισβολή των κυττάρων Panc10.05. Προ και μετά την οροί εμβολιασμό προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας σε αναλογία 1:50. πειράματα εις τριπλούν έγιναν για Β-Ε.

Η

Η φωσφορυλίωση της ANXA2 στο Tyr23 προάγει την κυτταρική επιφάνεια εντοπισμό των ANXA2 και την ικανότητα εισβολής των κυττάρων PDA

ANXA2 είναι ένα υπόστρωμα για Src κινάση, η οποία φωσφορυλιώνει ANXA2 στο Tyr23 τόσο

in vivo

και

in vitro

[10], [11], [12], [13], και η φωσφορυλίωση Tyr23 έχει προταθεί ότι είναι σημαντικός για κανονική σκέδαση κυττάρων και διακλάδωσης μορφογένεση [14], [15]. ANXA2 επίσης αναφερθεί ότι είναι τυροσίνη-φωσφορυλιωμένα όταν εντοπίζεται στην επιφάνεια του κυττάρου υπό πίεση [16]. Εφόσον τα κακοήθη κύτταρα συχνά μιμούνται τα φυσιολογικά κύτταρα τα οποία έχουν υποβληθεί σε μια ποικιλία ερεθισμάτων στρες, εμείς υποθέτουν ότι ANXA2 μετατοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια ως τυροσίνης-φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, καθώς και. Για να ελεγχθεί αυτό, εκλούεται στην κυτταρική επιφάνεια κλάσμα ANXA2 από κύτταρα Panc10.05 PDA, τα οποία έχουν επιφάνεια εντόπιση των κυττάρων του ANXA2 (Σχήμα S4 και στον Πίνακα S1), και βρέθηκε η επιφάνεια των κυττάρων κλάσμα της πρωτεΐνης ANXA2 είναι στην πραγματικότητα μια τυροσίνη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη (Σχήμα 2Α). Σε αντίθεση, ANXA2 δεν θα μπορούσε να εκλουστεί από την κυτταρική επιφάνεια των Panc 3,11 κυττάρων, ένα PDA κυτταρική γραμμή που κατέδειξαν κυτταροπλασματική εντόπιση του ANXA2 (Σχήμα S4). Για να ελεγχθεί αν η φωσφορυλίωση του ANXA2 στο Tyr23 είναι σημαντική για τον εντοπισμό του στην επιφάνεια του κυττάρου PDA, δημιουργήσαμε ένα πάνελ πλασμιδίων που εκφράζουν είτε άγριου τύπου ANXA2 (ANXA2

WT), η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ANXA2 (ANXA2

Y23A) στην οποία Tyr23 μεταβλήθηκε σε ένα υπόλειμμα αλανίνης κάνει μία μη-φωσφορυλιώσιμη μεταλλαγμένο, ή το ANXA2 μεταλλαγμένη πρωτεΐνη (ANXA2

Y23E) στον οποίο το Tyr23 μεταβλήθηκε σε ένα υπόλειμμα γλουταμικού οξέος που μιμούνται ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση. Όταν τα κύτταρα Panc10.05 επιμολύνθηκαν με αυτά τα πλασμίδια που εκφράζουν ANXA2 χαρακτηρισμένες με GFP [17], ANXA2

WT-GFP και ANXA2

Y23E-GFP εντοπίζεται κυρίως στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων PDA. Σε αντίθεση, ANXA2

Y23A-GFP εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με τη χρήση ενός λεντοϊού να εκφράζουν ιδιοσυστατικά ANXA2

WT, ANXA2

Y23A, ή ANXA2

Y23E στα κύτταρα PDA (Σχήμα S4). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση στο Tyr23 αποτελέσματα στον εντοπισμό του ANXA2 στην επιφάνεια του κυττάρου.

A. Panc10.05 και Panc3.11 κύτταρα είτε επωάστηκαν με EGTA ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει ή EGTA χωρίς ρυθμιστικό. Δύο διαφορετικές εκλούσεις από δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές PDA, όπως υποδεικνύεται, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα αντι-ANXA2 (διαδρομές 1-4) ή αντι-φωσφοτυροσίνης (αντι-ρΤγΓ) αντισωμάτων (διαδρομές 9-12). Μετά την έκλουση, οι δύο κυτταρικές σειρές PDA λύθηκαν και τα προϊόντα λύσης immunoprecipated με αντι-ρΤγΓ αντισώματα (λωρίδες 5-8). Β GFP-tagged ANXA2 στα κύτταρα Panc10.05. Άνω πάνελ: GFP σήματα? κάτω πάνελ: επικαλύπτεται εικόνες των σημάτων GFP και DAPI χρώση των πυρήνων. Γ FLAG-tagged έκφραση ANXA2 σε κύτταρα Panc10.05 επιμολυσμένα με τον φορέα πλασμιδίου pcDNA-based μόνο (λωρίδες 1,5,9,13), το πλασμίδιο που φέρει ANXA2

WT-FLAG (διαδρομές 2,6,10, 14), το πλασμίδιο που φέρει ANXA2

Y23A-FLAG (διαδρομές 3,7,11,15), ή το πλασμίδιο που φέρει ANXA2

Y23E-FLAG (διαδρομές 4,8,12,16). εκχυλίσματα ολόκληρου κυττάρου (ΔΚΕ) (διαδρομές 1-4), κλάσματα κυτταρικής μεμβράνης (διαδρομές 5-8, 13-16), ή κυτταροπλασματικά κλάσματα (λωρίδες 9-12) απομονώθηκαν με βιοχημικές κλασμάτωση από τα κύτταρα Panc10.05 PDA, αντίστοιχα , και ανοσοκατακρημνίσθηκαν χρησιμοποιώντας είτε αντι-FLAG Μ2 αντισώματα (λωρίδες 1-12) ή αντι-φωσφοτυροσίνης αντισώματα (αντι-ρΤγΓ) (διαδρομές 13-16). Τα ανοσοϊζήματα κηλιδώθηκαν χρησιμοποιώντας Μ2 αντισώματα αντι-FLAG. Δ

In vitro

εισβολή των κυττάρων Panc10.05. Ε

In vitro

εισβολή των κυττάρων Panc3.11. Και για τα δύο D και Ε, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον κενό pcDNA-based φορέα πλασμιδίου (διαδρομές 1,2), το πλασμίδιο που φέρει ANXA2

WT-FLAG (λωρίδα 3), το πλασμίδιο που φέρει ANXA2

Y23A-FLAG ( διαδρομή 4), ή το πλασμίδιο που φέρει ANXA2

Y23E-FLAG (λωρίδα 5). Διαδρομή 1 επίσης συνεπιμολύνθηκαν με τον έλεγχο αγωνίζομαι siRNA. Λωρίδες 2-5 επίσης συνεπιμολύνθηκαν με

ANXA2

siRNA διπλής όψης. Τα αποτελέσματα των διπλών πειραμάτων παρουσιάζονται.

Η

Για να καθοριστεί αν η αλλαγή στην ANXA2 εντοπισμό που εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης Tyr23 επηρεάζει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων PDA, ένα σύνολο πλασμιδίων που εκφράζουν εξωγενή FLAG-tagged ANXA2 συμπεριλαμβανομένων ANXA2

WT-FLAG, ANXA2

Y23A-FLAG, και ANXA2

Y23E-FLAG αναπτύχθηκαν. Οι φορείς αυτοί είναι παρεμβολή RNA ανθεκτικά λόγω της σιωπηλές μεταλλάξεις εντός της θέσεως στόχου siRNA. κύτταρα Panc10.05 PDA επιμολυσμένα με αυτά τα πλασμίδια κλασματώθηκαν σε κυτταροπλασματικά και την κυτταρική μεμβράνη κλάσματα (Σχήμα S4). Επιβεβαιώσαμε καταρχάς ότι μόνο ANXA2

WT-FLAG και ANXA2

Y23E-FLAG, αλλά δεν ANXA2

Y23A-FLAG, εντοπίζεται στο κλάσμα κυτταρικής μεμβράνης (Σχήμα 2C). Όπως ήταν αναμενόμενο, ANXA2

WT-FLAG πρωτεΐνη είναι φωσφορυλιωμένη τυροσίνη στο κλάσμα κυτταρικής μεμβράνης. Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι η συν-επιμόλυνση του πλασμιδίου pcDNA εκφράζει ANXA2

WT-FLAG ή ANXA2

Y23E-FLAG, αλλά δεν ANXA2

Y23A-FLAG, με το siRNA (για την αναστολή της ενδογενούς ANXA2), αντέστρεψε siRNA μεσολάβηση αναστολή της εισβολής των κυττάρων Panc10.05 (Σχήμα 2D). Ωστόσο, σε κύτταρα με χαμηλή ικανότητα εισβολής και μόνο κυτταροπλασματική εντόπιση της ANXA2, όπως Panc3.11 (Πίνακας S1), συν-επιμόλυνση με ANXA2

Y23E-FLAG παρακάμπτει τη φωσφορυλίωση ρυθμιστικού μηχανισμού που μιμούνται συστατική φωσφορυλίωση και προωθεί την εισβολή του Panc3.11 κύτταρα (Σχήμα 2Ε). Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι φωσφορυλιωμένη Tyr23 ANXA2 προσδίδει ικανότητα PDA εισβολή.

ANXA2 συμβάλλει στην μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος κυττάρων PDA

Η φωσφορυλιωμένη ANXA2 παίζει ρόλο στην σκέδαση κυττάρων σε κανονικές διαδικασίες μορφογένεση [14] , [15]. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν μέχρι σήμερα ένα ρόλο για φωσφορυλιωμένη ANXA2 στο PDA εισβολή. Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) ρυθμίζει τη φυσιολογική διαδικασία κατά τη διάρκεια μορφογενετική αναδιάρθρωσης εμβρυϊκή ανάπτυξη και ιστών, και τα αρχικά στάδια της εισβολής και μεταστάσεων πρότεινε να μιμούνται ΕΜΤ [18]. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν ANXA2 απαιτείται για την ΕΜΤ σε κύτταρα PDA. EMT χαρακτηρίζεται από την καταστολή της μεταγραφής των επιθηλιακών δεικτών όπως Ε-καδερίνης και επαγωγή δεικτών μεσεγχυματικών όπως γυμνοσάλιαγκα και βιμεντίνη. ANXA2 έχει αναφερθεί ότι μεσολαβεί ΤGFβ-ενεργοποιημένα ΕΜΤ κατά τη διαδικασία της ανάπτυξης καρδιακής βαλβίδας [19]. Επιπλέον, TGFβ έχει αναφερθεί ότι επάγουν ΕΜΤ σε καλλιεργημένα κύτταρα PDA [20], [21]. Να εξετάσει κατά πόσον ANXA2 έχει άμεσο ρόλο στη διαδικασία EMT της εισβολής κυττάρων PDA, ένα φορέα λεντοϊού που περιέχει

ANXA2

shRNA χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί μακροπρόθεσμη καταστολή της ANXA2 στα κύτταρα PDA (Σχήμα S3). Real-time PCR ανάλυση έδειξε ότι η E-cadherin κατεστάλη, ενώ γυμνοσάλιαγκα και βιμεντίνης προκλήθηκαν κατά τη διάρκεια της ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT στα κύτταρα Panc10.05 με έλεγχο shRNA, αλλά όχι σε εκείνους που έχουν μολυνθεί με

ANXA2

shRNA (Εικόνα 3Α ). Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης καταστάλθηκε το ΤGFβ-κατεργασμένα κύτταρα με έλεγχο shRNA, αλλά παρέμεινε αμετάβλητη ΤGFβ-επεξεργασμένα κύτταρα που εκφράζουν επίσης

ANXA2

shRNA (Σχήμα 3Β, C). Όπως είχε προβλεφθεί, τα κύτταρα PDA χωρίς

ANXA2

shRNA χάσουν τον φαινότυπο τους μεταξύ κυττάρων προσκόλλησης και διασποράς γύρω από το κουπόνι καλλιέργεια μετά τη θεραπεία ΤΟΡβ, θυμίζει ένα μοτίβο EMT (Σχήμα 3Β). Αν και ANXA2 δεν έχει ακόμη αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε Smad4 μεσολάβηση EMT, έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε Rho (μικρό ΟΤΡάσες) μεσολάβηση κυττάρων αποκόλληση, ένα γνώρισμα του ΕΜΤ [15]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε επίσης αν Rho μεσολαβεί ANXA2 σχετιζόμενη EMT σε PDA και διαπίστωσε ότι η ενεργοποίηση Rho δεν ανιχνεύεται σε κύτταρα PDA με shRNA αναστολή της ANXA2 μετά από αγωγή ΤΟΡβ (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η απώλεια της έκφρασης ANXA2 οδηγεί σε απώλεια της ΤΟΡβ-Rho μεσολάβηση σε κύτταρα ΕΜΤ PDA.

A. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR του Ε-καδερίνης, γυμνοσάλιαγκα, και έκφραση βιμεντίνη mRNA σε κύτταρα Panc10.05 PDA με και χωρίς knockdown του ANXA2 με shRNA. Οι σχετικές αναλογίες της έκφρασης mRNA με θεραπεία TGFβ1 έναντι χωρίς θεραπεία TGFβ1 απεικονίζεται. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση β-ακτίνης. B. Το ίδιο ζεύγος κυψελών PDA που χρησιμοποιούνται στον πίνακα α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGFβ1 για 0, 36, ή 72 ώρες, αντίστοιχα, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ανοσοχρώση με αντισώματα αντι-Ε-καδερίνης και ΡΕ-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. C. Το ίδιο ζεύγος κυψελών PDA που χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο Α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGFβ1 για 0, 36, ή 72 ώρες, αντίστοιχα, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Ένα κλάσμα του κυτταρικού εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται για ανάλυση Western blot και βάφτηκε με αντι-Ε-καντερίνης, αντι-RhoA, Β, C, ή αντι-β-ακτίνης αντισώματα ως εσωτερικού ελέγχου, αντίστοιχα. Το υπόλοιπο κυτταρικό εκχύλισμα υποβλήθηκε σε μια δοκιμασία πτυσσόμενο μέσω μιας στήλης συγγένειας που δεσμεύεται ειδικά ενεργοποιημένα, GTP-δεσμευμένη μορφές Rho. Αυτό ακολουθήθηκε από ανάλυση στυπώματος Western με αντι-Rho αντισώματα. Σημειώστε ότι τα αντι-Rho αντισώματα αναγνωρίζουν Rho Α, Β και C, των οποίων τα μοριακά βάρη είναι ελαφρώς διαφορετικές, καταλήγοντας σε δύο ζώνες στη γέλη. Ελέγχου προσδιορίζει τα κύτταρα με έλεγχο shRNA?

ANXA2

shRNA ορίζει τα κύτταρα με

ANXA2

shRNA. Δ Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου ανάλυση της Ε-καδερίνης, γυμνοσάλιαγκα, και η έκφραση του mRNA βιμεντίνη σε ένα ζεύγος κυτταρικών σειρών Panc10.05 PDA μολυνθεί με φακοϊό εκφράζουν άγριου τύπου ANXA2 (ANXA2-WT) ή Y23A μεταλλαγμένη ANXA2 (ANXA2-Y23A ), αντίστοιχα. Οι σχετικές αναλογίες της έκφρασης mRNA με θεραπεία TGFβ1 (υποδεικνύεται με +) έναντι χωρίς θεραπεία TGFβ1 (υποδεικνύεται με -) δείχνονται. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση β-ακτίνης.

Η

επόμενο εξετάστηκε αν η φωσφορυλίωση Tyr23 είναι σημαντική για ANXA2 μεσολάβηση ΕΜΤ σε κύτταρα PDA. Παρατηρήσαμε ότι το ενδογενές ANXA2 πλέον εντοπίζεται στην επιφάνεια του κυττάρου στα κύτταρα που εκφράζουν το Y23A παραλλαγή απώλειας θέση τυροσίνης ANXA2

(Εικόνα S4). Επιπλέον, η επιμόλυνση με ANXA2

Y23A-FLAG αναστέλλει την εισβολή των κυττάρων Panc10.05 (Σχήμα S4), γεγονός που υποδηλώνει ότι ANXA2

Y23A έχει κυρίαρχο αρνητικό αποτέλεσμα. Σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα δεδομένα [22], βρήκαμε ότι ANXA2

Y23A μπορεί ακόμα προσδένονται σε εταίρο S100A10 /p11 του [23] στο κυτταρόπλασμα, αλλά όχι στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα S5). Ως εκ τούτου, υπερεκφράζεται, κυτταροπλασματική-εντοπισμένη ANXA2

Y23A μπορεί να απομονώσει το σύνολο των S100A10 /p11 στο κυτταρόπλασμα, παρέχοντας έτσι ένα κυρίαρχο αρνητικό αποτέλεσμα. Ως εκ τούτου, εκμεταλλευόμενοι την κυρίαρχη αρνητική επίδραση της ANXA2

Y23A, και χρησιμοποιώντας αυτήν την ANXA2

Y23A μεταλλαγμένο, αποδείξαμε επίσης ότι EMT προκαλείται από TGFβ σε κύτταρα που εκφράζουν ANXA2

WT, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν ANXA2

Y23A (Σχήμα 3D). Έτσι, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν περαιτέρω ότι η Tyr23 φωσφορυλίωση ANXA2 προάγει την ΕΜΤ των κυττάρων PDA και είναι μία νοητή μηχανισμός με τον οποίο ANXA2 εντοπίζεται στην μεμβράνη των κυττάρων PDA και παρέχει τη δυνατότητα για τα κύτταρα PDA για να εισβάλουν.

Έκφραση και φωσφορυλίωση τυροσίνης του ANXA2 απαιτούνται για PDA μεταστάσεις σχηματισμό

in vivo

η

Τοπικές εισβολή από κύτταρα όγκου είναι ένα γνωστό βήμα στη διαδικασία της μετάστασης. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ANXA2 διευκολύνει την εισβολή των κυττάρων PDA

in vitro

. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ένα μεταμοσχεύσιμο παγκρεατικό καρκίνο μοντέλο μεταστάσεων (σχ S6) ποντικού για να αξιολογηθεί ο ρόλος της έκφρασης ANXA2, φωσφορυλίωση, και εντοπισμό επιφανείας κυττάρου στη διαδικασία μετάστασης PDA

in vivo

. Σε αυτό το μοντέλο, το 100% των ποντικών πεθαίνουν με ηπατικές μεταστάσεις σε περίπου 4-6 εβδομάδες (Σχήμα 4Α) μετά σπληνική ένεση 2 × 10

6 Panc02 κύτταρα ποντικού PDA. κύτταρα Panc02 μολυνθεί με ένα GFP που εκφράζει lentivirus μεταφέρουν shRNA ειδικά για

ANXA2

νοκ ντάουν ή τον έλεγχο shRNA έχουν ταξινομηθεί για GFP-θετικά κύτταρα με FACS.