Αφηρημένο

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση K-ras είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση ανοσολογικών αποκρίσεων και τη φλεγμονή με γνώμονα την ογκογένεση. Οι ιντερλευκίνες IL-17, IL-22 και IL-23 έχουν αναφερθεί σε διάφορους τύπους κακοηθειών, αλλά ο ακριβής ρόλος μηχανιστική των μορίων αυτών παραμένει να διευκρινιστεί. Δεδομένου του ρόλου του K-ras και της συμμετοχής των ιντερλευκινών σε ορθοκολικό ογκογένεση, οι ερευνητικές προσπάθειες που αναφέρθηκαν για πρώτη φορά, δείχνοντας ότι εκφράζονται διαφορικά ιντερλευκίνη είναι IL-17, IL-22 και IL-23 επίπεδα που σχετίζονται με K-ras σε ένα στάδιο-ειδικό τρόπο κατά μήκος του παχέος εξέλιξης του καρκίνου. Συγκεκριμένα, α) η επίδραση του K-ras σηματοδότηση ερευνήθηκε στη συνολική έκφραση του ιντερλευκίνες σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και υγιείς μάρτυρες, και β) μια ένωση ιδρύθηκε μεταξύ μεταλλαγμένο K-ras και κυτοκίνες GM-CSF και ΙΡΝ-γ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι συγκεκριμένες ιντερλευκίνες εκφράζονται διαφορικά σε K-ras θετικών ασθενών και η χρήση της K-ras αναστολέα Manumycin Α μειώνει τόσο τα επίπεδα της ιντερλευκίνης και απόπτωση σε κύτταρα Caco-2 με την αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων. Τέλος, τα επίπεδα της φλεγμονής με γνώμονα GM-CSF και ΙΡΝ-γ διαμορφώνεται μέσω της έκφρασης ιντερλευκίνης σε ασθενείς με όγκο, με την έκφραση της ιντερλευκίνης στον εντερικό αυλό και καρκινικούς ιστούς που προκαλούνται από παρεκκλίνουσα σηματοδότηση K-ras. Συλλογικά, τα ευρήματα α) υποδεικνύει ότι η ιντερλευκίνη έκφραση επηρεάζεται από σηματοδότησης Ras και συγκεκριμένες ιντερλευκίνες παίζουν ογκογόνο ρόλο υποκινητή σε καρκίνο του παχέος εντέρου, τονίζοντας τη μοριακή σχέση μεταξύ φλεγμονής και της ογκογένεσης, και β) να επιτείνει τις αλληλοσυνδεόμενες μοριακό συσχετίσεις ως οδηγεί σε νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις στο μέλλον

Παράθεση:. ΠΕΤΑΝΙΔΗΣ S, D ΑΝΕΣΤΑΚΗΣ, Αργυράκη Μ, Hadzopoulou-Cladaras M, Σαλίφογλου Α (2013) διαφορική έκφραση της IL-17, 22 και 23 στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ασθενείς με K-ras μετάλλαξης: Ras Σήμα Αναστολή και Παρεμβολή με GM-CSF και IFN-γ. PLoS ONE 8 (9): e73616. doi: 10.1371 /journal.pone.0073616

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 21 του Ιούνη 2013? Αποδεκτές: 23, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 ΠΕΤΑΝΙΔΗΣ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο είχε συγχρηματοδοτηθεί από την ΕΕ-ΕΚΤ και Έλληνες εθνικούς πόρους μέσω του προγράμματος ΕΣΠΑ-Ηράκλειτος ΙΙ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη πιο διαδεδομένη μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Επί του παρόντος, στις περισσότερες από τις αναπτυσσόμενες χώρες, δεν υπάρχουν οργανωμένες ελέγχου και των διαγνωστικών προγραμμάτων [1], [2]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι καρκίνου του παχέος εντέρου είναι μία πολυπαραγοντική νόσος, στην οποία η έκφραση πολλών ειδικών γονιδίων, που είναι γνωστή ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων, είναι ασυνήθως αλλαγμένη [3]. Από αυτή την άποψη, το γονίδιο PIK3CA, η οποία εμπλέκεται στο μονοπάτι σηματοδότησης ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ορθοκολικό καρκίνο. Το γονίδιο φωσφατάση ογκοκατασταλτικό και tensin ομόλογο (ΡΤΕΝ) είναι κάτω-ρυθμίζονται οφείλεται σε γενετική μετάλλαξη ή διαγραφή [4]. Ωστόσο, μοριακοί μηχανισμοί του ορθοκολικού καρκινογένεσης μένει να διευκρινιστεί. Προς αυτές τις προσπάθειες, είναι ζωτικής σημασίας για τον εντοπισμό συγκεκριμένων μοριακών δεικτών για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό των μηχανισμών που συμβάλλουν στην παχέος καρκινογένεση. Ένας τέτοιος εκπρόσωπος βιοδείκτη είναι K-ras, ένα ογκογονίδιο με γουανοσίνη τριφωσφορική (GTP) συνδετικές ιδιότητες [5]. Λόγω της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά με τα βασικά μόρια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT), φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ), και που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), το γονίδιο K-ras παρέχει μια βασική λειτουργία σε κυτταρική διαίρεση, την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων. Έτσι, οι μεταλλάξεις στο γονίδιο K-ras (ειδικά, απλές υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίου) εμπλέκεται σε περισσότερους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, καρκίνο του πνεύμονα, πορογενές καρκίνωμα του παγκρέατος, και ορθοκολικό καρκίνωμα [6].

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, απόδειξη έχει αποδείξει ότι οι ιντερλευκίνες εκτελούν σημαντικές λειτουργίες στην ανάπτυξη του όγκου, κυτταρική διαφοροποίηση, τη φλεγμονή και τη μετάσταση [7], [8]. Από αυτή την άποψη, η IL-17, το οποίο είναι σε μεγάλο βαθμό παράγεται από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα μνήμης, διεγείρει τόσο έμφυτη ανοσία και την άμυνα του ξενιστή, και διαδραματίζει ενεργό ρόλο σε φλεγμονώδεις ασθένειες, αυτοάνοσες ασθένειες, και καρκίνος. Πιο συγκεκριμένα, η IL-17 επάγει την έκφραση του πυρηνικού παράγοντα-κάπα Β (ΝΡ-κΒ), χημειοκίνες CXCL8, CXCL6 και CXCL1, αυξητικούς παράγοντες G-CSF, GM-CSF (παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων), IL-6 και μόρια προσκόλλησης (ICAM-1), οδηγώντας σε συσσώρευση ουδετερόφιλων επαυξημένης, granulopoeisis, και φλεγμονώδεις αποκρίσεις [9], [10]. Από την άλλη πλευρά, η IL-22 δρα ως μεσολαβητής της κυτταρικής φλεγμονώδους αποκρίσεων ενεργοποιώντας ενδοκυτταρικές κινάσες (JAK1, Tyk2, και κινάσες ΜΑΡ) και παράγοντες μεταγραφής όπως STAT3 [11]. Επιπλέον, η IL-22 παρουσιάζει αντι-αποπτωτική και ογκογόνο λειτουργίες, με πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η υπερ-έκφραση του εν λόγω μορίου προστατεύει τον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές από την απόπτωση μέσω α) ενεργοποίηση του STAT3 και κατάντη αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών της Bcl-2 και Bcl- xL, και β) αδρανοποίηση των εξωκυτταρικών κινασών σήματος ρυθμίζεται [12]. Παρομοίως, η IL-23 παίζει ένα ρόλο κλειδί στη χρόνια εντερική φλεγμονή και ανοδική ρύθμιση του σε κακοήθεις ιστούς παραλλήλους επαυξημένη επίπεδα της «μεταστατικό βιοδεικτών» μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας ΜΜΡ-9, παράγοντα νέκρωσης όγκων ΤΝΡ-α, και αυξημένα επίπεδα της αγγειογένεσης [13 ], [14], [15].

σε μια προσπάθεια να ανακαλύψουν μοριακή δεσμών μεταξύ ογκογόνο και ανοσο-φλεγμονή μονοπάτια στη φυσιολογία του καρκίνου, η έρευνα ξεκίνησε στα εργαστήριά μας να διερευνήσουν τις αλληλεπιδράσεις και τις πιθανές συνυφασμένες ρόλους που οι προαναφερόμενες μοριακοί στόχοι θα μπορούσαν να παίξουν στην παχέος πολλαπλών σταδίων εξέλιξης του καρκίνου. Για το σκοπό αυτό, αναφέρουμε εδώ για πρώτη φορά ότι α) τα συγκεκριμένα ιντερλευκίνες είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ορθοκολικό καρκίνωμα σε σύγκριση με υγιείς παχέος ιστούς, β) ιντερλευκίνες είναι πάνω εκφράζεται σε όλους τους ασθενείς K-ras και μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων και αναστέλλουν την κυτταρική απόπτωση σε Caco-2 με ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα μέσω των ras μονοπάτι σηματοδότησης, γ) η χρήση των K-ras αναστολέα Manumycin A μειώνει τα επίπεδα της ιντερλευκίνης, και μειώνει την απόπτωση σε Caco-2 με ορθοκολικό καρκίνο κυττάρων με αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων, και δ) GM-CSF και ΙΡΝ-γ (ιντερφερόνη γ) είναι διαμορφωμένα μέσω της έκφρασης ιντερλευκίνης είτε θετικά είτε αρνητικά. Οι συλλογικές παρατηρήσεις ρίξει φως πάνω στο λειτουργικό συσχέτιση μεταξύ ιντερλευκίνες σε φλεγμονή, ras-σηματοδότησης και του παχέος ογκογένεση, έτσι δυνητικά βοηθώντας στην ανάπτυξη των μελλοντικών ανίχνευσης και θεραπευτικής του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση του Διοικητικού συμβουλίου Institutional Review του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, Ιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Το χαρτί που ικανοποιεί PLoS ONE πολιτικές όσον αφορά τα ανθρώπινα αντικείμενο της έρευνας. Μια γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Γραπτές συγκαταθέσεις ελήφθησαν, πριν από τη χειρουργική επέμβαση, από ασθενείς που συμμετέχουν εθελοντικά στη χρήση των ιστών αποκλειστικά για ερευνητικούς σκοπούς. Οι ασθενείς είχαν διαβάσει και κατανοήσει το έγγραφο πληροφοριών του ασθενή που παρέχονται, καθώς και τους στόχους και τις μεθόδους αυτής της μελέτης είχε εξηγηθεί πλήρως σε αυτά. Οι ασθενείς που συμμετείχαν είχαν δώσει γραπτή συγκατάθεση για συγγραφείς αυτού του χειρογράφου για τη δημοσίευση των στοιχείων αυτών. Η κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που εκφράζονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Αντιδραστήρια

Manumycin Α αγοράστηκε από την Sigma (Sigma Γερμανία, την Ευρώπη). DMEM-Hepes, PBS (φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα), FBS (ορός εμβρύου βοός), και θρυψίνη-ΕϋΤΑ αντιδραστήρια αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Invitrogen, Darmstadt, Germany). DMSO (Διμεθυλοσουλφοξείδιο) και Tris-EDTA (Tris-αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ) αγοράσθηκαν από Applichem (Applichem, Darmstadt, Germany). Οι K-ras (Α-18) κατσίκα πολυκλωνικό IgG-υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP), ποντικού αντι-κατσίκα IgG-HRP, και GAPDH (L-20) κατσίκα πολυκλωνικό IgG-HRP αντισώματα για ανάλυση στυπώματος Western αποκτήθηκαν από την Santa Cruz ( Σάντα Κρουζ, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Η ανθρώπινη IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF και ΙΡΝ-γ ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα από την Santa Cruz. Για την παρασκευή των υδατικών διαλυμάτων αποθέματος (1.0 Μ), Manumycin Α διαλύθηκε σε 10 mM Tris, ρΗ 7.4. Το διάλυμα στοκ Manumycin Α διηθείται μέσω ηθμού σύριγγας 0.22 μm και στη συνέχεια διαιρείται και να αποθηκεύεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Τρις-EDTA ρυθμιστικό (ΤΕ) παρασκευάστηκε από 1 Μ Tris, ρΗ 8, και ένα διάλυμα αποθέματος 100 mM EDTA. Οι τελικές συγκεντρώσεις ήταν 50 mM Tris και 1 mM EDTA. Το έτσι προετοιμασμένο απόθεμα διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου 0,22 μm, τότε διαιρείται και να αποθηκεύεται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου.

Ασθενείς

Ένα σύνολο 92 ορθοκολικού καρκίνου (CRC) ασθενείς, 37-88 ετών, ήταν από το Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ, Ιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (Πίνακας S1). Από αυτούς τους ασθενείς, 28 harbored μεταλλάξεις K-ras (24 με G12V και 4 με G12D). Αυτοί οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε εκτομή του καρκίνου του παχέος εντέρου (στάδια Β1-D) μεταξύ 2009 και 2012. Επιπλέον, 56 υγιείς εθελοντές, οι οποίοι α) πληρούν τις απαιτήσεις του έχουν συμφωνημένα φύλου και παρόμοιας ηλικίας με τα δείγματα των ασθενών CRC, και β) δεν παρουσίασαν καμία παχέος εντέρου αδενώματα, επιλέχθηκαν ως έλεγχοι. Ασθενείς με φλεγμονώδεις καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων των μολυσματικών ή νόσοι του κολλαγόνου, αποκλείστηκαν. Όλοι οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σύμφωνα με την UICC ταξινομήσεις στάδιο χρησιμοποιώντας εκτομή δείγματα. Ελήφθησαν δείγματα αίματος με φλεβική παρακέντηση πριν παχέος χειρουργική επέμβαση. Κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκε στα 3000 g για 5 λεπτά, και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση.

DNA και

φορμαλίνη σταθερές, επιλέχθηκαν RNA Extraction

τομές ασθενή με όγκο εγκλεισμένα σε παραφίνη από έναν παθολόγο για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και τον προσδιορισμό των περιοχών του όγκου εμπλουτισμένο για τεμαχισμό. Τα απομονωμένα καρκινικά κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (0.2 Μ Tris HCI, 0,5 Μ NaCl, 0,01 Μ EDTA, 1% SDS, 1 Μ οξικού νατρίου) που περιέχει πρωτεϊνάση Κ στους 60 ° C για 72 hr και το DNA εκχύλιση διεξήχθη με τη χρήση του ο Qiagen DNA και RNA καθαρισμός Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen, Αθήνα, Ελλάδα). Για εκχύλιση RNA, τα καρκινικά κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 400 μΙ ρυθμιστικού λύσης RNA (0,5 Μ EDTA, 10% SDS, 1 Μ Tris ρΗ 7.5) συμπληρωμένο με 300 mg πρωτεϊνάσης Κ και επωάστηκε στους 60 ° C για 16 ώρες έως ότου ο ιστός είχε πλήρως διαλυτοποιηθεί. RNA καθαρίστηκε από το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Paisley, UK), στη συνέχεια κατεργάζεται με DNase για να αποφευχθεί η μόλυνση γονιδιωματικό DNA, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Ενζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασίες (ELISA)

Πριν από τον προσδιορισμό, τα δείγματα κατεψυγμένου ιστού μεταφέρθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, αυτά πλύθηκαν σε ένα ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου (Sigma), κομμένο σε κομμάτια, ζυγίζονται και ομογενοποιούνται στους 4 ° C σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM HEPES ρΗ 7,4, 5 mM CHAPS, 5 mM 1 DTT). Η επεξεργασία των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε μια μαζική κλίμακα 1 g ιστού /10 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Τα ομογενοποιημένα ιστοί παρέμειναν στους -20 ° C για 24 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 20.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα (10 μΐ ανά φρεάτιο) χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική στάδιο-ειδικό (Β1, Β2, C1, C2, D) ανίχνευση της IL-17, IL-22 και IL-23 μέσω ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασίες από Cytoscreen (BioSource International , Camarillo, CA). Τα όρια ανίχνευσης για τα κιτ ELISA, όπως καθορίζεται από τον κατασκευαστή, ήταν 9 pg /ml (IL-17), 8 pg /ml (IL-22) και 4 pg /ml (IL-23). Manumycin Μια θεραπεία εφαρμόστηκε σε όλα τα δείγματα των ασθενών στάδιο D για τις τρεις ιντερλευκίνες διερευνήθηκαν.

Αντίστροφη Μεταγραφάση αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε δείγματα ασθενών ιστού για IL -17, IL-22, IL-23, GM-CSF και ΙΡΝ-γ. GAPDH (γλυκεραλδεΰδης αφυδρογονάση 3-φωσφορικής) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Διεξήχθη ενίσχυση σε ένα συνολικό όγκο 20 μΙ ανά αντίδραση, που περιέχει 10 μΙ PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 5 μΙ εκκινητές (1 pmol /μl), και 5 μΐ cDNA (40 ng RNA) . RT-PCR εκκινητές για IL-17, 1L-22, IL-23, GM-CSF, ΙΡΝ-γ και GAPDH παρατίθενται στον Πίνακα S2. Οι παράμετροι της αντίδρασης PCR καθορίστηκαν ως εξής: 95 ° C για 15 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους PCR αντίδραση στους 94 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Ανάλυση καμπύλης τήξης των προϊόντων ενίσχυσης πραγματοποιήθηκε στο τέλος κάθε αντίδρασης PCR με την αύξηση της θερμοκρασίας από 60 έως 95 ° C με ένα ρυθμό μεταβολής της θερμοκρασίας του 0,1 ° C ανά δευτερόλεπτο, που μας επιτρέπει να διακρίνουμε γνήσια προϊόντα από μη-ειδικά προϊόντα και εκκινητή διμερή. PCR προϊόντα επίσης διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 1,5% για να απεικονίσει το σχηματισμό των σωστών προϊόντων PCR. Η σχετική ποσοτικοποίηση (RQ) της έκφρασης του γονιδίου υπολογίστηκε υποθέτοντας 100% αποτελεσματική PCR, στην οποία κάθε τιμή CT από τις αντιδράσεις ομαλοποιήθηκε για έκφραση GAPDH mRNA.

μετάλλαξης K-RAS Ανίχνευση και ανάλυση αλληλουχίας του Κ-ras G12 κωδικονίου

Όλα τα δείγματα καρκινικού ιστού ασθενών καταψύχθηκαν και διατηρούνται σε υγρό άζωτο πριν από τη χρήση. Οι τομές παραφίνης συνέχεια παρασκευάζονται και ένα τμήμα από κάθε περίπτωση επελέγη για χρώση αιματοξυλίνης-Ηωσίνη. Ένας έμπειρος παθολόγος ανέλυσε το τμήμα αιματοξυλίνης-Ηωσίνη για να επιβεβαιώσει την παρουσία του καρκινικού ιστού. Στη συνέχεια, τα δείγματα ιστών από τουλάχιστον πέντε σειριακές τομές macrodissected να εξασφαλιστεί ότι τα δείγματα περιείχαν τουλάχιστον 80% των κυττάρων του όγκου. DNA απομονώθηκε από αυτά τα δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας το Qiagen κιτ εκχύλισης DNA (Qiagen, Βερολίνο, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, οι μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 του Κ-ras εξονίου 1 ανιχνεύθηκαν σε αυτές τις γονιδιωματικό δείγματα DNA με άμεση αλληλούχιση βασίζεται σε PCR. Οι εκκινητές PCR για K-ras που χρησιμοποιήθηκαν ήταν K-ras-Forward: 5′-AAGGCCTGCTGAAAGTGACTG-3 ‘και Κ-ras-Reverse: 5′-CTGGTGCAGGACCATTCTTCAG-3’. Η αντίδραση PCR διεξήχθη σε ένα συνολικό όγκο 50 μΐ που περιέχει 150 ng του εκχυλισμένου γενωμικού DNA. συνθήκες ενίσχυσης PCR ήταν ως ακολούθως: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 1 min, ακολουθούμενο από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 s, ανόπτηση στους 55 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s, με ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72 ° C για 5 λεπτά σε έναν θερμικό κυκλοποιητή TP-600 (Takara). PCR προϊόντα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 2,5% και καθαρίζονται για περαιτέρω άμεση αλληλούχιση του DNA μέσω DNA Analyzer ΑΒΙ-3730XL (Applied Biosystems, Ευρώπη).

ανοσοϊστοχημική ανάλυση της IL-17, IL-22, και IL-23

Κερωμένο τμήματα ανθρώπινου βιοψίες του κόλου από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντι-ανθρώπινο IL-17, αντι-ανθρώπινης IL-22 και IL-23 μονοκλωνικών αντισωμάτων αντι-ανθρώπου (mAb) ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Χρώση με IgG1 ποντικού ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Οι εικόνες που λαμβάνονται μέσω ενός Carl Zeiss μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Carl Zeiss, Βερολίνο, Γερμανία).

Western Blot ανάλυση των IL-17, IL-22 και IL-23

Συνολικές ορθοκολικό δείγματα ιστού ασθενών πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και λύθηκαν σε 100 μL παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ανά 1 × 10

6 κύτταρα. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά, περιδινήθηκε για 45 s και διατηρείται επί πάγου για άλλα 10 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση σε 14.000 g και 4 ° C για μία περίοδο 15 λεπτών, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν με τη μέθοδο Bradford. πρωτεΐνες Lysate διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος 6xLaemmli διαχωρίστηκαν (30 μg /λωρίδα) με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (10% ακρυλαμίδιο) και ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε PVDF (διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου) μεμβράνες. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα εντός ρυθμιστικού TBST (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, ρΗ 7,6), οι μεμβράνες επωάστηκαν για 90 λεπτά με την κατάλληλη αραίωση του πρωτογενούς αντισώματος σε TBST συν 1% μη λιπαρά γάλα. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με την κατάλληλη αραίωση του δευτερογενούς αντισώματος συζευγμένου με υπεροξειδάση της αγριοραπανίδας σε TBST συν 1% μη-λιπαρά γάλακτος. Τέλος, οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια) και ψηφιοποιούνται μέσω ενός BioSpectrum 500 Σύστημα Απεικόνισης. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος σε όλα τα πειράματα.

ELISA SPOT για GM-CSF και ΙΡΝ-γ

IFN-γ-κύτταρα που παράγουν από δείγματα αίματος ασθενών ποσοτικοποιήθηκαν με ΙΡΝ-γ ELISPOT σετ (Diaclone, Μπεζανσόν, Γαλλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με μικρές τροποποιήσεις. Οι μεμβράνες επικαλύπτονται με αντισώματα ανθρώπινου IFN-γ και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Στη συνέχεια, 1 × 10

5 PBMCs (μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος) από ασθενείς με καρκίνο του παχέος προστέθηκαν επί των πλακών και επωάστηκαν για 26 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα απομακρύνθηκαν και τα βιοτινυλιωμένα αντισώματα έναντι ανθρώπινου ΙΡΝ-γ προστέθηκαν πάνω στις μεμβράνες. Οι κηλίδες μετρήθηκαν με ένα αυτοματοποιημένο μετρητή πλάκα από την Applied Biosystems (Applied Biosystems, Ευρώπη)

κύτταρα που παράγουν από PBMCs ασθενών ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ GM-CSF ELISPOT (R & GM-CSF?. Biosystems D, Minneapolis , USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, πλάκες ELISPOT διήθησης των 96 φρεατίων επικαλύφθηκαν με 4 μg /ml του αντισώματος GM-CSF σε 100 μΙ αντιδραστηρίου αραιωτικού όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Οι πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (PBS με 0,5% Tween 20) και αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα δεσμεύσεως που περιέχει PBS, συμπληρωμένο με 1% BSA και 5% σακχαρόζη. πλάκες ELISPOT επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2, και 100% υγρασία. Φρεάτια που περιέχουν κύτταρα εξυπηρετούνται μόνο ως αρνητικός μάρτυρας. Οι κηλίδες απαριθμήθηκαν με αυτοματοποιημένο μετρητή πλάκα (Applied Biosystems).

Cell Culture

Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος Caco-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) και αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (τροποποιημένο Eagle Medium του Dulbecco) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Biochrom, Germany). Οι κυτταρικές καλλιέργειες αναπτύχθηκαν προς συρροή και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C και 5% CO

2. Τα κύτταρα Caco-2 επωάστηκαν με εμβρυϊκό βόειο ορό μέσο ελεύθερο για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με Manumycin Α σε μια τελική συγκέντρωση στο εύρος 50-300 μΜ. Τρεις ανεξάρτητες σειρές πειραμάτων εκτελέστηκαν σε Manumycin τη θεραπεία.

ΜΤΤ την Κυτταρική Βιωσιμότητα Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα σε κύτταρα Caco-2 διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ -2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) δοκιμασίας. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από θεραπεία 24 ώρες με Manumycin Α, ένα διάλυμα ΜΤΤ προστίθεται (10 μΐ /φρεάτιο) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε, και οι κατακρημνισθέντες κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100 μΙ DMSO. Μετά από ανακίνηση επί 30 λεπτά, η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροπλάκας αναγνώστη ELISA (Biorad, Ευρώπη). Η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως εξής: σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων = (μέση πειραματική απορροφητικότητα /μέση απορρόφηση ελέγχου) χ 100%. Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

TUNEL Δοκιμασία

Κινητή απόπτωση σε κύτταρα Caco-2 οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το TUNEL (τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση βιοτινυλιωμένο UTP nick τέλος σήμανσης) ανίχνευση δοκιμασία (Roche, Αθήνα, Ελλάδα). Τα κύτταρα επωάστηκαν με Manumycin για 24 ώρες και στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με PBS. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ και ξεπλένονται δύο φορές με PBS. Προστέθηκε ρυθμιστικό ισορροπίας που περιέχει το επισημασμένο μείγμα νουκλεοτιδίου και ένζυμο TdT? το μίγμα αφέθηκε να επωαστεί στους 37 ° C για 1 ώρα σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο θάλαμο και, στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η χρώση. Παρατηρήθηκε μέσω μικροσκοπίου φθορισμού Carl Zeiss, με ανίχνευση στα 570 nm, τα φυσιολογικά κύτταρα δεν χρωματίζονται ενώ αποπτωτικά κύτταρα έχουν ένα έντονο κόκκινο φθορισμό.

Στατιστική Ανάλυση

δοκιμασία t του Student και μονόδρομη και αμφίδρομη τεστ ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για στατιστικές αναλύσεις των δεδομένων. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad 5.1 (GraphPad, La Jolla, USA). Περιπτώσεις με τιμές P & lt? 0,05 ή & lt? 0,01 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001).

Αποτελέσματα

Η ιντερλευκίνη και Κ-ras αντιστοιχίας του καρκίνου του παχέος εντέρου Στάδιο εξέλιξη

Τα επίπεδα της IL-17, IL-22 και IL-23 σε ασθενείς με καρκίνο και υγιείς μάρτυρες προσδιορίσθηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινη ιντερλευκίνη ELISA Immunoassay, Western Blot, και RT- τεχνικές PCR.

IL-17

Αρχικά, η IL-17 επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν σε διαδοχικά στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου και σε υγιείς ιστούς ελέγχου χρησιμοποιώντας ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η IL-17 επίπεδα έκφρασης ήταν γενικά υψηλότερες σε K-ras θετικούς ιστούς καρκίνου (από 170 pg /ml σε Β1 έως 247 pg /ml σε D) σε σύγκριση με K-ras αρνητικά δείγματα (από 150 pg /ml σε B1 έως 225 pg /ml σε D) (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 1Α). Ανάλυση της IL-17 επίπεδα πρωτεΐνης μαζί καρκίνος στάδια Β1-D σε ασθενείς έδειξαν ότι ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με το α) αντίστοιχα επίπεδα των αρνητικών ασθενών K-ras (62% έναντι 38%), και β) υγιείς μάρτυρες ( 62% έναντι 16%) (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, το επίπεδο του mRNA της IL-17 προσδιορίστηκε σε K-ras θετικά δείγματα. Μία σημαντική αύξηση σε mRNA της IL-17 επίπεδα παρατηρήθηκε (Σχήμα 2Β). Για να εξεταστεί η επίδραση της μετάλλαξης K-ras (G12V) σχετικά με έκφραση ιντερλευκίνης, το ras τρανσφεράσης του φαρνεσυλίου αναστολέα Manumycin Α εφαρμόστηκε σε κανονική και το στάδιο D δείγματα ασθενούς, λόγω της επιλεκτικής υπερέκφραση της εν λόγω ιντερλευκίνης τη συγκεκριμένη φάση. Στο τέλος της θεραπείας Manumycin Α (10 μΜ), μια σημαντική μείωση (Ρ & lt? 0.001) σε IL-17 επίπεδα παρατηρήθηκε (Σχήμα 1Α). Μια παρόμοια μείωση σε δείγματα D θετικό στάδιο K-ras ήταν παραδειγματικά με πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA (Ρ & lt? 0,001 για τα επίπεδα πρωτεϊνών, Ρ & lt? 0,01 για τα επίπεδα mRNA) (Σχήμα 3Α-Β). Τα πειράματα δείχνουν τη σημασία της μεταλλαγμένης K-ras σηματοδότησης σε IL-17 έκφρασης.

Προσδιορισμός της ιντερλευκίνης (Α) IL-17, (Β) IL-22, και (C) IL-23 συγκεντρώσεις (pg /ml) στους ιστούς του όγκου του Κ-ras θετικό, οι ασθενείς αρνητικό καρκίνο του παχέος εντέρου K-ras, και οι ασθενείς ελέγχου στα διάφορα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Manumycin Μια εφαρμόστηκε σε κανονική και το στάδιο Δ δείγματα ασθενών. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD δειγμάτων για κάθε ομάδα που εμπλέκονται. Μεγάλο μπαρ δείχνει τη σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων θεραπεία Manumycin στάδιο D ασθενή και το στάδιο D +.

Η

(Α) επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης της IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, και IFN -γ. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για ανάλυση Western blot. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Η πυκνομετρική ανάλυση του κάθε επιπέδου πρωτεΐνης υπολογίστηκε από τον μέσο όρο τριών πειραμάτων. Κάθε τιμή εκφράστηκε ως η αναλογία του μετρούμενου πρωτεΐνης στο επίπεδο GAPDH (Ρ & lt? 0.001). (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, και IFN-γ από ιστούς καρκίνου του κόλον πραγματοποιείται με ανάλυση RT-PCR. 5 μg ολικού RNA απομονώθηκε από τους ιστούς του καρκίνου. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Επίδραση της Manumycin Μια θεραπεία (10 μΜ) για τα επίπεδα (Α) έκφραση του mRNA της IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, και IFN-γ σε K-ras θετικούς ασθενείς ορθοκολικό καρκίνο όπως εκτελείται με ανάλυση RT-PCR. κύτταρα του παχέος εντέρου Ασθενής στάδιο D υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Manumycin Α (10 μΜ) για 24 ώρες, πριν από την RT-PCR. 5 μg ολικού RNA απομονώθηκε από κατεργασμένα κύτταρα του παχέος εντέρου. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, και IFN-γ σε K-ras θετικούς ασθενείς ορθοκολικό καρκίνο όπως εκτελείται με ανάλυση Western Blot. κύτταρα του παχέος εντέρου Ασθενής στάδιο D υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Manumycin Α (10 μΜ) για 24 ώρες, πριν από την πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

IL-22

Tissue IL-22 ήταν σημαντικά επίπεδα ανέκυψαν στο K-ras αρνητική ομάδα σε σύγκριση με τους ασθενείς που φέρουν το μετάλλαξη K-ras (από 94 pg /ml έναντι 80 pg /ml σε Β1 έως 216 pg /ml έναντι 150 pg /ml σε D) (Ρ & lt? 0,05 για B1-C1, Ρ & lt? 0,01 για C2-D) ( Εικόνα 1Β). Επιπλέον, τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA της IL-22 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην K-ras αρνητική ομάδα. Συγκεκριμένα, μεταξύ αυτών των ασθενών, πρωτεΐνη IL-22 επίπεδα ήταν αυξημένα στην ομάδα αρνητικού K-ras (84% έναντι 60%) (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, τα επίπεδα IL-22 mRNA στο K-ras θετική ομάδα ήταν χαμηλότερες σε σύγκριση με το K-ras αρνητική ομάδα (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 2Β). Η προσθήκη Manumycin Α στα 10 μΜ σε κανονική και το στάδιο D δείγματα ασθενών προκάλεσε μείωση στα επίπεδα IL-22 (Ρ & lt? 0,001 για τα επίπεδα πρωτεϊνών, Ρ & lt? 0,01 για τα επίπεδα mRNA). (Εικόνα 1Β, 3Α-Β)

IL-23

Η ELISA, mRNA, και ανάλυση πρωτεϊνών αποκάλυψε ότι η K-ras θετικούς ασθενείς έδειξαν αύξηση στην IL-23 έκφραση σε σύγκριση με την Κ-ras αρνητικό (Ρ & lt? 0,01 για Β1, Ρ & lt? 0,05 για B2-D) και υγιή ομάδα ελέγχου (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 1C, 2Α-Β). Για τον προσδιορισμό της αντιστοιχίας μεταξύ παρουσία K-ras και IL-23 έκφραση, Manumycin Α προστέθηκε στο φυσιολογικό και το στάδιο δείγματα ασθενών Α και πρωτεΐνη IL-23 και τα επίπεδα mRNA σε K-ras θετικοί ασθενείς προσδιορίσθηκαν (Σχήμα 1 C, 3Α-Β) . Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του K-ras προκαλεί σημαντική μείωση στα επίπεδα IL-23 (Ρ & lt? 0,001 για τα επίπεδα πρωτεϊνών, Ρ & lt? 0,01 για τα επίπεδα mRNA), καθιερώνοντας έτσι ένα συσχετισμό μεταξύ της K-ras και τα επίπεδα IL-23

GM-CSF

Για να διερευνήσουν πιθανούς μηχανισμούς για συμμετοχή GM-CSF στα διάφορα στάδια της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου, η έκφραση του GM-CSF παρακολουθήθηκε και ποσοτικά, με ELISPOT, Western Blot, και RT- μέθοδοι PCR. Για το GM-CSF ELISPOT, κύτταρα από πρόσφατα απομονωμένα PBMCs παρασκευάσθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση GM-CSF. Τα ευρήματα δείχνουν μια σταδιακή αύξηση των επιπέδων GM-CSF κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου, ειδικά σε στάδια C2 και D (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Α, το Σχήμα S1). Επιπλέον, πρωτεΐνη GM-CSF και τα επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε K-ras θετικό, οι ασθενείς σταδίου D (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 2Α-Β) σε σύγκριση με K-ras ασθενείς αρνητικούς και υγιή ελέγχου, υποδεικνύοντας μια ενεργοποίηση GM-CSF που προκαλείται κατά τη διάρκεια του παχέος εντέρου εξέλιξης στάδιο του καρκίνου ογκογένεση (Σχήμα 4Α, το Σχήμα S1). Τα παρατηρούμενα αποτελέσματα είναι σε συμφωνία με τα πρόσφατα ευρήματα δείχνουν τη σημασία της GM-CSF στο K-ras θετικό καρκίνο του παχέος εντέρου ογκογόνο διαδικασίες (βλέπε κατωτέρω). Manumycin Α προστέθηκε σε κανονικό και το στάδιο D δείγματα ασθενούς (Σχήμα 4Α) και πρωτεΐνη GM-CSF και τα επίπεδα mRNA σε K-ras θετικοί ασθενείς προσδιορίσθηκαν (Σχήμα 3Α-Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή του K-ras προκαλεί μία σημαντική μείωση σε GM-CSF mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Ρ & lt? 0,001 για τα επίπεδα πρωτεϊνών, Ρ & lt? 0,05 για τα επίπεδα mRNA), καθιερώνοντας έτσι μια συσχέτιση μεταξύ των δύο μορίων

(Α) GM-CSF ELISPOT των PBMCs ελήφθησαν από ασθενείς πριν την επέμβαση. Μονοπύρηνα κύτταρα διεγέρθηκαν και ερευνήθηκαν για την έκκριση GM-CSF. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τις διαφορετικές ομάδες. (Β) ΙΡΝ-γ ELISPOT των PBMCs ελήφθησαν από ασθενείς πριν την επέμβαση. Τα μονοπύρηνα κύτταρα διεγείρονται και ερευνήθηκαν για την έκκριση IFN-γ. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τις διαφορετικές ομάδες. Μεγάλο μπαρ δείχνει τη σύγκριση μεταξύ των δειγμάτων θεραπεία Manumycin στάδιο D ασθενή και το στάδιο D +.

Η

IFN-γ

Για να εξεταστεί η επίδραση της μετάλλαξης K-ras σε IFN-γ κατά τη διάρκεια των σταδίων εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου, προσδιορίστηκε το επίπεδο έκφρασης της IFN-γ. Όπως φαίνεται (σχήμα 4Β, 2Α-Β, Εικόνα S1), ΙΡΝ-γ είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Επιπλέον, υπάρχει μια σημαντική μείωση στην IFN-γ επίπεδα πρωτεΐνης και του mRNA μεταξύ K-ras αρνητικά και K-ras θετικά άτομα (Ρ & lt? 0.001), με τον τρόπο αυτό επισημαίνοντας την επίδραση της K-ras σηματοδότησης επί ΙΡΝ-γ κάτω ρύθμιση . Επιπλέον, η θεραπεία με Manumycin Α προκάλεσε μία αύξηση στα επίπεδα έκφρασης IFN-γ, όπως φαίνεται από Western Blot και πειράματα RT-PCR (Ρ & lt? 0,001 για τα επίπεδα πρωτεϊνών, Ρ & lt? 0,01 για τα επίπεδα mRNA) (Σχήμα 3Α-Β). Τα αποτελέσματα δείχνουν μια ανάδραση K-ras μηχανισμού σηματοδότησης στην IFN-γ, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου.

Manumycin καταστολή της βιωσιμότητας και της ανάπτυξης των κυττάρων του Caco-2 κύτταρα

Τα παρατηρούμενα αποτελέσματα δείχνουν για πρώτη φορά ότι ο αναστολέας ras Manumycin Α μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε Caco-2 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Το αποτέλεσμα αυτής της ειδικής μορφής του αναστολέα στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου εξετάστηκε μετά από επώαση σε ένα μέσο που περιέχει Manumycin Α με συγκεντρώσεις στην περιοχή 10-300 μΜ για 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάζονται στο μέσο εν απουσία Manumycin Α χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Η απασχόληση της δοκιμασίας ΜΤΤ έδειξε ότι η αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας σε όλες τις Caco-2 κόλον αδενοκαρκίνωμα κύτταρα ελέγχθηκαν εμφανίστηκαν κατά ένα τρόπο εξαρτώμενο από την δόση (Σχήμα 5Α-Β). Λεπτομερώς, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά από 90% (στα 10 μΜ) έως 40% (στα 300 μΜ) (Ρ & lt? 0.001), σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι παρατηρούμενες πρότυπα αναστολής ως συνάρτηση της Manumycin Μια συγκέντρωση αποκαλύπτουν τα κατά του όγκου ιδιότητες των αναστολέων ras σε K-ras επαγόμενη σηματοδότηση καρκίνου του παχέος εντέρου.

(Α) δοκιμασία ΜΤΤ που δείχνει την επίδραση του Manumycin Α στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε Caco-2 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Manumycin Α για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με αναγνώστη πλάκας ELISA στα 570 nm. μεγέθυνση της εικόνας × 200. (Β) Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Manumycin Α αναστέλλει τη βιωσιμότητα του αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλου Caco-2 κύτταρα σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Manumycin Α προκαλεί απόπτωση σε (C) Caco-2 ανθρώπινου κόλον αδενοκαρκίνωμα κύτταρα. Caco-2 απόπτωση των κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό ανίχνευσης TUNEL από τη Roche. Οι συγκεντρώσεις Manumycin Α: 10, 50, 100, 200, και 300 μΜ. Το καρκινικό κύτταρο γραμμή εκτέθηκε σε Manumycin Α σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες και χρωματίζονται. Κόκκινο αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φακό Carl Zeiss (Zeiss Ευρώπη) μικροσκόπιο φθορισμού. μεγέθυνση της εικόνας × 200. (Δ) Οι γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν τα ποσοτικά αποτελέσματα της απόπτωσης.