Αφηρημένο

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Κλινικά, η θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) μπορεί να βελτιωθεί με την έγκαιρη ανίχνευση και διαλογή κινδύνου μεταξύ του πληθυσμού. Για να ανταποκριθεί σε αυτή την ανάγκη, εδώ περιγράφουμε την εφαρμογή της εκτεταμένης κλασματοποίησης επίπεδο πεπτίδιο σε συνδυασμό με ετικέτα δωρεάν ποσοτική πρωτεομική για την ανακάλυψη πιθανών βιοδεικτών του ορού για τον καρκίνο του πνεύμονα, και τη χρήση της ανάλυσης ιστού μικροσυστοιχιών (TMA) και έλεγχος πολλαπλής αντίδρασης (MRM) αναλύσεις για τις ακόλουθες επάνω επικυρώσεις στη φάση επαλήθευσης. Χρησιμοποιώντας αυτά τα state-of-art, επί του παρόντος διαθέσιμα κλινικά πρωτεομική προσεγγίσεις, κατά τη φάση της ανακάλυψης μπορούμε με σιγουριά εντοπίστηκαν 647 πρωτεΐνες ορού, και 101 πρωτεΐνες έδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με NSCLC σε 18 δείγματα ανακάλυψή μας. Αυτός ο ορός πρωτεομική σύνολο δεδομένων μας επέτρεψε να διακρίνουμε τα διαφορετικά πρότυπα και μη φυσιολογικές βιολογικές διεργασίες στο αίμα του καρκίνου του πνεύμονα. Από αυτές τις πρωτεΐνες, Αλφα-1Β-γλυκοπρωτεΐνη (A1BG) και πλούσιες σε λευκίνη α-2-γλυκοπρωτεΐνη (LRG1), επιλέχθηκαν δύο γλυκοπρωτεΐνες πλάσματος με προηγουμένως άγνωστη λειτουργία ως παραδείγματα για τα οποία έγιναν ΤΜΑ και MRM επαλήθευση σε ένα μεγάλο σύνολο του δείγματος που αποτελείται περίπου 100 ασθενείς. Εμείς αποκάλυψε ότι A1BG και LRG1 υπερεκφράστηκαν τόσο στο επίπεδο του αίματος και τα τμήματα όγκου, η οποία μπορεί να αναφέρεται για το διαχωρισμό των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα από υγιείς περιπτώσεις

Παράθεση:. Liu Υ, Luo Χ, Hu Η, Wang R, Sun Υ, Zeng R, et al. (2012) Ολοκληρωμένες Πρωτεομική και ιστών μικροσυστοιχιών Profiling Αναφέρατε τον Σύνδεσης μεταξύ υπερεκφράζεται στον ορό Πρωτεΐνες και μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (12): e51748. doi: 10.1371 /journal.pone.0051748

Επιμέλεια: Giuseppe Viglietto, Πανεπιστήμιο Magna Graecia, Ιταλία

Ελήφθη: 25, Ιούνη του 2012? Αποδεκτές: 5, Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας (2010CB912100, 2011CB910200), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (91029301, 30821065, 81101760, 81172218, 81101761), Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (09JC1416302), κινεζική Ακαδημία Επιστημών του έργου (KSCX2-YW-R-106, KSCX1-YW-02), το Πανεπιστήμιο Fudan (09FQ78) και Πανεπιστήμιο Fudan Αντικαρκινικό Νοσοκομείο (YJ200804, YJ200701). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η συχνότερη μορφή καρκίνου στον κόσμο, όσον αφορά τόσο επίπτωσης και θνησιμότητας. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει το 80-85% του καρκίνου του πνεύμονα με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών λιγότερο από 14% [1]. Συγκεκριμένα, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 3% έως 7% για το στάδιο ΙΙΙΒ, και λιγότερο από 1% για το στάδιο IV της νόσου [2]. Ωστόσο, οι ασθενείς διαγιγνώσκονται σε πρώιμο στάδιο και να έχουν τη χειρουργική επέμβαση εμπειρία αποτελεί το 86% της συνολικής επιβίωσης 5 ετών [3]. Ως εκ τούτου, οι νέες διαγνώσεις που απαιτούνται για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα πρώιμο στάδιο διότι μπορεί να θεραπευτεί με χειρουργική επέμβαση. Διάφοροι πιθανοί πρωτεΐνη υπογραφές όπως καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο, CYFRA21-1, πλάσμα καλλικρεΐνης Β1 και νευρώνα ενολάση έχουν ανακαλυφθεί και χρησιμοποιηθεί κλινικά ως υποψήφιοι βιοδείκτη για τον καρκίνο του πνεύμονα. Παρ ‘όλα αυτά, καμία από αυτές δεν έδειξαν αρκετή ευαισθησία, ειδικότητα ή αναπαραγωγιμότητας [4]. Ως εκ τούτου, βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα χρειάζονται επειγόντως.

Μοριακοί βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να πάρει πολλές μορφές. Ιστολογική βιοδείκτες είναι υψίστης σημασίας επειδή μπορούν να συνδέονται άμεσα με τις παθολογικές μεταβολές, ο κίνδυνος της συστολής, η παρουσία ή το στάδιο της νόσου. Αυτές πιστεύεται ότι έχουν τη δυνατότητα να διακρίνει τους διάφορους μηχανισμούς μοριακής ασθένεια του NSCLC. Από την άλλη πλευρά, βιοδείκτες ορού για τον καρκίνο του πνεύμονα είναι ακόμη πιο ελκυστικό, επειδή το αίμα είναι εύκολα προσιτή και πιστεύεται ότι αποκτούν πρωτεΐνες που εκκρίνονται, υπόστεγο, ή αλλιώς απελευθερώνονται από τους ιστούς μέσω των οποίων κυκλοφορεί το αίμα. Ακόμη και μερικές μέτριες άφθονες πρωτεΐνες του πλάσματος θα μπορούσε να είναι δείκτες του ειδικού καθεστώτος του σώματος και έχουν αναφερθεί να παρουσιάζουν διακυμάνσεις σε απάντηση σε ορισμένους τύπους ασθενειών [5].

Επί του παρόντος, οι πρωτεομική νόσου με γνώμονα βασίζεται σε φασματομετρία μάζας έχει εισαχθεί στην ανακάλυψη των δύο ιστολογικών και ορολογικών βιοδείκτες. Παρά τη σημασία του βιοδεικτών του ορού ανακάλυψη, μία από τις σημαντικές τεχνικές προκλήσεις ήταν το γεγονός ότι πρωτεώματος αίμα είναι εξαιρετικά πολύπλοκη, που εκτείνονται σε μια περιοχή συγκέντρωσης από τουλάχιστον δέκα τάξεις μεγέθους. Αναμένεται ότι αποτελεσματικές μέθοδοι εξάντληση και συστήματα πολλαπλών διαστάσεων κλασματοποίησης μπορεί να είναι χρήσιμη για το διαχωρισμό χαμηλής πρωτεΐνες αφθονία και εκτείνονται από το όριο ανίχνευσης [6]. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ένα εκτεταμένο κλασμάτωση σε επίπεδο πεπτιδίου στο προφίλ της λευκωματίνης εξαντλημένο πρωτεώματος ορού, με ένα μοναδικό ολοκληρωμένο σύστημα πολυδιάστατης υγρής χρωματογραφίας (IMDL) αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας [7]. Μια άλλη τεχνική εμπόδιο είναι το πώς να γρήγορα και αποτελεσματικά συγκρίνουν τα επίπεδα πρωτεΐνης σε όλη ιστούς ή δείγματα πλάσματος. Συνήθως, αυτά τα δείγματα δεν είναι συμβατές με in vivo στρατηγική επισήμανση σταθερές ισοτοπικές MS-based ποσοτικοποίηση. Διαδοχικά, οι in vitro στρατηγικές σήμανσης όπως iTRAQ [8] και ακρυλαμιδίου ισότοπα [9] αναδύεται ως εναλλακτικές λύσεις. Παρ ‘όλα αυτά, οι τεχνικές αυτές έχουν περιορισμούς που σχετίζονται με το κόστος, συνήθως μικρότερη κάλυψη proteome λόγω επισήμανση επιλεκτικότητα, την εφαρμοσιμότητα και τις διαφορές στην απόδοση επισήμανση. Σε αυτή τη μελέτη, ως εκ τούτου, χρησιμοποίησε μια απλή και ισχυρή ετικέτα χωρίς ποσοτικοποίηση (LFQ) στρατηγική με φασματική καταμέτρηση στη φάση ανακάλυψης. Επιπλέον, η πιεστική ανάγκη για αναπαραγώγιμη MS ανάλυση έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη πολλαπλών παρακολούθησης αντίδρασης τεχνική (MRM). Αυτή η τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων πρωτεΐνης στα κλινικά δείγματα πλάσματος όταν ενσωματωθεί με συντίθενται πρότυπα πεπτίδιο και απόλυτη ποσοτική ανάλυση (AQUA). Καλύτερη εκλεκτικότητα, η ευαισθησία και δυναμικό εύρος μπορεί να επιτευχθεί με την MRM, τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για την κλινική επικύρωση [10].

Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι, πρώτον, να χρησιμοποιήσει πρωτεομική κυνηγετικό όπλο για να διακρίνει άμεσα τα πρότυπα proteome διαφορικό στον ορό σχετίζονται με NSCLC ασθένειες, να κατανοήσουν τις ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες ορού από άποψη βιολογική σημασία τους, όπως το μοριακό δραστηριότητες, καθώς και για τη δημιουργία μιας βάσης δεδομένων των δεικτών ορού για NSCLC. Δεύτερον, να επικυρώσει την προσπάθεια ανακάλυψης μας, επιλέξαμε δύο νέων βιοδεικτών υποψήφιοι -A1BG και LRG1-, από τα μέσα του παραδοσιακές προσεγγίσεις επαλήθευσης, όπως τα συμβατικά Western και /ή μικροσυστοιχιών ιστού (ΤΜΑ), καθώς και μετρήσεων MRM σε μεγαλύτερο δείγμα ομάδες.

Μέθοδοι

Ηθική και συλλογή δειγμάτων ορού

τα δείγματα αίματος από νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς ελήφθησαν πριν από κάθε θεραπεία στην Κλινική θώρακος στη Σαγκάη Αντικαρκινικού Νοσοκομείου. Τα κριτήρια ένταξης των θεμάτων που αποτελούνταν από επιβεβαιωμένη διάγνωση NSCLC, χωρίς μακρινή μετάσταση ή άλλες χειρουργικές αντενδείξεις. Οι γραπτές συγκαταθέσεις ενημέρωσε δόθηκαν από όλα τα άτομα που συμμετέχουν σε αυτή τη μελέτη. δείγματα ανώνυμα από τους ασθενείς επιλέχθηκαν τυχαία. Αυτή η μελέτη έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου.

Τα δείγματα ορού συλλέγονται και υφίστανται επεξεργασία χρησιμοποιώντας το ίδιο τυποποιημένο πρωτόκολλο. Εν συντομία, τα δείγματα αίματος αφέθηκαν να πήξουν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε στα 3000 g για 20 λεπτά (4 ° C), και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν, γίνεται σε κλάσματα και αποθηκεύτηκε σε -80 ° C μέχρι να αναλυθεί. Χρονικό διάστημα μεταξύ της επεξεργασίας και κατάψυξης δεν ήταν πάνω από 2 ώρες για κάθε δείγμα. Κανένα από τα δείγματα αποψύχθηκε πάνω από δύο φορές πριν από την ανάλυση.

απολιπιδίωση και εξάντληση λευκωματίνης σε δείγματα ορού

Η εξάντληση απολιπίδωση και αλβουμίνη στη φάση ανακάλυψη τροποποιήθηκαν σύμφωνα με προηγουμένως αναφερθεί πρωτόκολλα [11] , [12]. Εν συντομία, για κάθε δείγμα, 50 μL ακατέργαστος ορός αραιώθηκε με 250 μί ρυθμιστικού διαλύματος (100 mM NaCl, 10 mM HEPES, ρΗ 7.4), και φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 g για 30 λεπτά μέσω ενός φίλτρου 0,22 μm (Millipore) για την απομάκρυνση των λιπιδίων. Στη συνέχεια, 260 μλ απολιπιδωμένο ορό καταβυθίστηκε με 180 μλ προ-ψύξη αιθανόλη (Sigma), επωάστηκε για μία ώρα στους 4 ° C με ήπια ανάμιξη, και φυγοκεντρήθηκε στα 16.000 g για 45 λεπτά. Τα σφαιρίδια αλβουμίνης αφαιρεθεί συλλέχθηκαν, λυοφιλίσθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 100 μL ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 8 Μ ουρία, 4% CHAPS, 40 mM Τρις-βάση, 65 mM DTT και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Ltd.).

σε διάλυμα πέψης πρωτεΐνης

μίγματα πρωτεϊνών επωάστηκαν με 10 mM διθειοθρεϊτόλης (DTT) σε 37 ° C για 2.5 ώρες, και carbamidomethylated με 20 mM ιωδοακεταμίδιο (ΙΑΑ) για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα αλκυλιωμένα πρωτεϊνικά διαλύματα καταβυθίστηκαν με πέντε όγκους προ-ψυχρή ακετόνη /αιθανόλη (1:01, ν /ν) με 0,1% οξικό οξύ στους -20 ° C για 12 ώρες [13]. Τα σφαιρίδια πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν σε 50 mM ρυθμιστικό χλωριούχο αμμώνιο (ρΗ 8.3), και επωάστηκαν με τρυψίνη (25:1, Promega) για 20 ώρες στους 37 ° C. Υποστεί πέψη τα πεπτίδια λυοφιλοποιήθηκαν και αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C για ανάλυση φασματομετρίας μάζας.

Online δισδιάστατη ανάλυση MS /MS από το Ολοκληρωμένο πολυδιάστατης χρωματογραφίας υγρού

Η εκτεταμένη κλασματοποίηση για πεπτίδια του ορού διεξήχθη σε το σύστημά μας Ολοκληρωμένο πολυδιάστατο υγρή χρωματογραφία (IMDL) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Βασικά, ένα διφασικό ολοκληρωμένη στήλη χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί on-line δισδιάστατη διαχωρισμού HPLC. Αυτή η ολοκληρωμένη στήλη περιελάμβανε μια ισχυρή στήλη κατιόντων (SCX, 320-μm id, μήκος 50 mm, στις Στήλη Technology Inc., CA) και ένα (RP) στήλη χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης (150-μm id, μήκος 100 mm, στις Στήλη Technology Inc.). Το μίγμα πεπτιδίων ήταν αρχικά εγχύθηκε από τον επιθεωρητή αυτόματο δειγματολήπτη (ThermoFinnigan, San Jose, CA) και στη συνέχεια κλασματώθηκαν με 11 βήματα ρΗ (ρΗ 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 8,0, 8,5) με τη χρήση μια σειρά από ρυθμιστικά ρΗ (ρυθμισμένο με 5 mM κιτρικού οξέος ρυθμίζεται από NH

4OH). Διαφορετικές ρυθμιστικά του ρΗ εφαρμόστηκαν στο ολοκληρωμένο στήλη χρησιμοποιώντας μια ένεση πλήρη βρόχο 100 μL σε 3 μL /min πριν από την κλίση RP-HPLC on-line. Οι διαλύτες RP-HPLC που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0.1% μυρμηκικό οξύ (ν /ν) υδατικού (Α) και 0,1% μυρμηκικό οξύ (ν /ν) ακετονιτρίλιο (Β), με την κλίση από 2 έως 40% κινητή φάση Β σε 115 λεπτά σε 2 μL /min μετά την διάσπαση. Το φασματόμετρο μάζας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ένα LTQ παγίδα γραμμική ιόντων (Θέρμο). Μια τάση 3,0 kV εφαρμόστηκε στη βελόνα ESI, και η κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης ήταν 35,0. Ο αριθμός των ιόντων που αποθηκεύονται στην παγίδα ιόντων ρυθμιζόταν από τον αυτόματο έλεγχο απολαβής. Τα φάσματα αποκτήθηκαν σε λειτουργία εξαρτώμενη από τα δεδομένα, με την επιλογή που 10 πιο έντονη ιόντα του κάθε φάσματος MS για ανάλυση MS /MS. Η δυναμική λειτουργία αποκλεισμού ορίστηκε ως εξής? επανάληψη μετράνε 3, επαναλάβετε τη διάρκεια 0,5 λεπτά, και η διάρκεια του αποκλεισμού 1.5 λεπτά.

Πρωτεΐνη ταυτοποίηση

Οι BioWorks ™ 3.2 σουίτα λογισμικού χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει τις λίστες κορυφή όλων των αποκτήθηκαν MS /MS φάσματα ( προεπιλεγμένες παραμέτρους), τα οποία στη συνέχεια έψαξε αυτόματα κατά του Ανθρώπου Διεθνές πρωτεΐνη Δείκτης βάση δεδομένων αλληλουχίας πρωτεΐνης (έκδοση 3.22, που περιείχε 57.867 πρωτεΐνες), χρησιμοποιώντας το SEQUEST έκδοση 2.7 (Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, την άδεια να Thermo Finnigan) την αναζήτηση προγράμματος. Για να εκτιμηθεί η ταχύτητα εσφαλμένων ταυτίσεων (false positives), όλα τα φάσματα διηθείται υποβλήθηκαν σε έρευνα σε βάσεις δεδομένων ενάντια σε ένα σύνθετο βάση δεδομένων που περιέχει ανθρώπινες αλληλουχίες πρωτεΐνης σε τόσο η προς τα εμπρός (σωστό) και αντίστροφη (εσφαλμένη) προσανατολισμού [14]. Σε όλες τις αναζητήσεις δεδομένων, θρυψίνη ορίστηκε ως η πρωτεάση, και μόνο μία χαμένη διάσπαση επιτράπηκε. Η μέγιστη μάζα ανοχή ορίστηκε ως 3 Da για τον πρόδρομο ιόν και 1,0 Da για το θραύσμα ιόντων. Carbamidomethylation (57.0125 Da) ερευνήθηκε ως σταθερό τροποποίηση σε κυστεΐνη, και την οξείδωση (15.99492 Da) ορίστηκε ως μεταβλητή τροποποίηση στις μεθειονίνη. Ένα σπιτικό λογισμικό Buildsummary χρησιμοποιήθηκε για να διαγράψετε τα περιττά δεδομένα όπως ορίζονται προηγουμένως [15].

Οι πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με αυστηρά κριτήρια. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε την συντηρητική αφελή στρατηγική στόχος-δόλωμα, το οποίο εκτιμά ταυτοποίηση πρωτεϊνών ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) αναλόγως με τον αγώνα πεπτίδιο-φάσματος (PSM) FDR, δηλαδή κατά προσέγγιση τον αναμενόμενο αριθμό των ψευδώς θετική ταυτοποίηση πρωτεϊνών από τον αριθμό των δολωμάτων πρωτεΐνης αναγνώρισης [16]. εφαρμόστηκαν κατώτατα όρια για Xcorr σύμφωνα με τα προκαταρκτικά PSM FDR μικρότερη από 1% και η τελική πρωτεΐνη FDR μικρότερη από 5%. Όλα γίνονται δεκτές αποτέλεσμα SEQUEST πρέπει να έχει ένα σκορ ΔCn τουλάχιστον 0,1 ανεξάρτητα από την κατάσταση φόρτισης [17].

Ετικέτα δωρεάν ποσοτικός προσδιορισμός με φασματική καταμέτρηση και τα στατιστικά στοιχεία

Μια απλή ετικέτα ελεύθερη προσέγγιση ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας φασματική καταμέτρηση χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ proteome ορού μεταξύ NSCLC και υποθέσεις ελέγχου [18]. αγώνες πεπτίδιο-σειράς ο οποίος αποδίδεται σε κάθε ομάδα πρωτεϊνών αθροίζονται και λαμβάνεται ως βάση της σχετικής ποσοτικοποίησης [13], [17]. Περιπτώσεις σε κάθε ομάδα αντιμετωπίστηκαν ως NSCLC που σχετίζονται με τη βιολογική επαναλήψεις. Υπολογίσαμε το συντελεστή σχετικής εμπλουτισμού, R

ε, ορίζεται ως R

e = (n

f /n) /(N

f /N) να δώσουν προτεραιότητα υπερεκφράζεται και υπό-εκφρασμένων πρωτεϊνών [19 ]. Σε αυτή την εξίσωση, η

f είναι ο αριθμός των πεπτιδικών επισκέψεων μίας πρωτεΐνης σε ένα δείγμα, η είναι ο συνολικός αριθμός των πεπτιδικών χτυπήματα σε αυτό το δείγμα, N

f είναι ο συνολικός χτυπά αριθμός αυτής της πρωτεΐνης σε όλα τα δείγματα , και Ν είναι ο συνολικός αριθμός των πεπτιδικών επιτυχίες όλων των πρωτεϊνών σε όλα τα δείγματα. Βάσει των R

e, εκτελέσαμε ANOVA και δοκιμή φοιτητή Τ, χρησιμοποιώντας ένα τεστ μετάθεση των 200.000 φορές σε Pomelo II [20]. Η χαρακτηριστική ανάλυση Receiver Operating (ROC) πραγματοποιήθηκε από το πακέτο Proc στην Ε [21]. Σε ROC ανάλυση ενός πάνελ βιοδεικτών, χρησιμοποιήσαμε μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του πίνακα, η οποία ενσωματώθηκε με τους υποψηφίους που θέλετε να συμπεριλάβετε στον πίνακα (δηλαδή χρησιμοποιώντας την είσοδο μπλοκ των μεταβλητών) μαζί με πιθανότητες. Αυτή η μοντελοποίηση διεξήχθη σε SPSS (v13.0). Οι προβλεπόμενες πιθανότητες εμφάνισης του συμβάντος (όπως ο καρκίνος ή κανονική) ενσωματώθηκαν ως προγνωστικοί δείκτες σε οικόπεδο ROC? και εμβαδόν υπό την καμπύλη ROC (AUC) υπολογίστηκε για να εκτιμηθεί η ισχύς του πίνακα [22]. Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης (HCA) και ανάλυση κύριων τμημάτων (PCA) πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό R (https://www.r-project.org/), χρησιμοποιώντας quantile κανονικοποιημένες τιμές της λογαριθμικής μετατραπεί φασματικές μετρήσεις, δηλαδή, με την μετατροπή του αρχείου καταγραφής

2 (φασματική μετράει 1) για κάθε πρωτεΐνη ορού σε κάθε δείγμα.

ανάλυση ιστού microarray (TMA)

η ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC) διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες ιστό αγοράστηκε από τη Σαγκάη ξεπεράσει Biotech Co .. Εν συντομία, στερεωμένοι με φορμαλίνη, ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές από 90 ασθενείς με NSCLC, που αποτελείται από 44 αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (AD), 38 πλακώδες καρκίνωμα (SCC), και 8 περιπτώσεις άλλων υποτύπων, αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Η ενδογενής υπεροξειδάση αποσβέστηκε με 3% Η

2O

2 (ν /ν). Μετά ανάκτηση αντιγόνου και μπλοκάρισμα, οι τομές επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-A1BG (1:100, διάρκεια ζωής Biosiences), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-USP1 (1:25 Abgent), μονοκλωνικό ποντικού αντι-Mucin5B (1:25 Millipore) και ποντικού μονοκλωνικό αντι-LRG1 (αραίωση 1:200, Abonva) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από μια έκπλυση με διάλυμα PBST, οι τομές επωάστηκαν διαδοχικά με βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα και το αντιδραστήριο ABC (Vectastain), ακολουθούμενη από κατεργασία με διάλυμα DAB (Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & amp? Υπηρεσία Co.). Τέλος, οι τομές με αιματοξυλίνη QS (Vectastain). Μεταξύ των 90 περιπτώσεων, μόνο μια φέτα χάθηκε κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, με αποτέλεσμα τμήματα 89 NSCLC ισχύει με αντίστοιχους μάρτυρες μη-όγκου τους.

IHC διαφάνειες αναθεωρήθηκαν από δύο παθολόγους (XL, και HC), τυφλωμένοι να όλα τα κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων. Τα αποτελέσματα τέθηκαν στον μέσο όρο από ανεξάρτητες αξιολογήσεις τους, και σημείωσε με αξιολόγηση του ποσοστού (Ρ) των κυττάρων που εμφανίζει χαρακτηριστικές χρώση (από μη ανιχνεύσιμο επίπεδο ή 0%, σε ομοιογενή χρώση ή 100%) και με εκτίμηση της έντασης (Ι) της χρώσης (0, καμία οπτική χρώση, 1, ασθενής χρώση? 2, μέτρια χρώση? ή 3, ισχυρή χρώση). Το ποσοστό αυτό καθορίζεται από το ποσοστό του συνόλου των θετικών κυττάρων, χωρίς διαισθητική αποφάσεις κυτταρικών τύπων. Οι ποσοστιαίες τιμές στη συνέχεια κατέρρευσε σε μία Ρ σκορ 0 έως 9, που αντιστοιχούν στις σειρές από 0-5%, 5-15%, 15-25%, 25-35% έως 85-100% τελικά. Όπως προτείναμε σε μια προηγούμενη μελέτη [13], η σχετική έκφραση της πρωτεΐνης σε ιστολογικές επίπεδο βαθμολογήθηκαν με τον πολλαπλασιασμό βαθμολογίας Ρ από την τιμή έντασης Ι, δηλαδή από τον λεγόμενο γρήγορο βαθμολογία (Q) (Q = P × I? Ελάχιστο = 0 και μέγιστο = 27).

κηλίδωση Western

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση Western blot σε 12 τυχαία επιλεγμένα τρίδυμα της κανονικής, AD και SCC ορούς. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν επί πηκτής πολυακρυλαμιδίου 12% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (ΡβΙΙ Inc.). Πολυκλωνικός αντι-A1BG (διάρκεια ζωής Biosiences) αραιώνεται ως τις οδηγίες του κατασκευαστή και να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση της κηλίδα. Immunodection πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ECL συν αντιδραστήρια (Amersham Biosciences) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Kodak). Μετά την τελική WB εικόνες που αποκτήθηκαν, ένα λογισμικό που ονομάζεται εικόνα πολλαπλών Gauge (v3.0, FUJI FILM CO. LTD) χρησιμοποιήθηκε για να εξαγάγετε τα δεδομένα έκφρασης πρωτεϊνών με βάση την αξία IOD.

μέτρηση LC-MRM

Τέσσερις ισοτοπική πεπτίδια εκχωρηθεί σε A1BG και LRG1 (δύο ανά κάθε πρωτεΐνη) συντέθηκαν χρησιμοποιώντας τυπική χημεία Fmoc ενσωματωθεί με καθαρό, βαρύ [

13C

6] λευκίνη (Sigma-Aldrich). Μη επισημασμένη [

12C] μορφές του κάθε πεπτιδίου συντέθηκαν επίσης (GL Biochem, Κίνα). Όλα τα συνθετικά πεπτίδια καθαρίστηκαν σε & gt?. 95% καθαρότητα με το ποσό που αναφέρεται από τον προμηθευτή

Τα πεπτίδια πέψη από 0,1 μι ακατέργαστο ορό (για 70 NSCLC δείγματος και 30 μάρτυρες ίδιας ηλικίας, βλέπε Πίνακα S1) έχουν επαναδιαλυτοποιήθηκε σε 0.1% μυρμηκικό οξύ, ενισχυμένο με εσωτερικό πρότυπο πεπτίδια, και χωρίζονται από μικρο υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης σε σύστημα HPLC 1200 σε συνδυασμό με ένα φασματόμετρο μάζας 6410 QQQ (Agilent Technologies). Ο διαχωρισμός διεξήχθη σε ρυθμό ροής της κινητής φάσης 1.5 μL /min με ρυθμιστικό Α (0,1% μυρμηκικό οξύ) και Ρυθμιστικό Β (90% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ), σε μία C18 στήλη παγίδα (300 μm × 5 mm, Agilent Technologies ) που ακολουθείται από μια αναλυτική στήλη C18 (150 μm Χ 100 mm, στήλη Technology Inc., CA). Η δυαδική κλίση αποτελούνταν από 3-17% Β σε 2,5 min, 17-23% Β σε 25 λεπτά, 23-40% Β σε 5 λεπτά, 40-100% Β σε 5 λεπτά και σε 100% Β για 2.5 min. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με τριχοειδή τάση 4000 V, ξήρανση αερίου 300 ° C σε 3,0 L /min, και το αέριο εκνεφωτή 18 psi. τάσης θραυσματοποιητή και η ενέργεια σύγκρουσης (CE) έχουν βελτιστοποιηθεί με την έγχυση του κάθε πεπτιδίου. Σε πειράματα MRM, οι χρόνοι του κύκλου δεν υπερβαίνει τα 1,2 sec και τουλάχιστον 20 σημεία δεδομένων συλλέχθηκαν ανά αιχμής.

Η απόλυτη ποσοτικοποίηση των επιπέδων στον ορό A1BG και LRG1

ανάλυση δεδομένων MRM πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Masshunter ποιοτική λογισμικού (Agilent). [

12C] /[

13C] εμβαδά των κορυφών καταγράφηκαν από το εγχειρίδιο ελέγχου των αυστηρών συνεκλουόμενες συμπεριφορά, λαμβάνοντας όλα τα [

13C] μεταβάσεις ως αναφορά. Για A1BG και LRG1, οι επαληθεύσεις της αφθονίας τους σε διάφορες πληθυσμιακές ομάδες έχουν επιτευχθεί από όλα τα ζεύγη μετάβαση, αλλά μόνο οι καλύτερες μεταβάσεις που έτρεφε καλύτερο γραμμικότητας της απόκρισης χρησιμοποιήθηκε για την απόλυτη ποσοτικοποίηση. Η γραμμικότητα της δοκιμασίας που χαρακτηρίζεται από αραίωση ένα τρυπτική πέψη ενός δείγματος ορού η οποία ενσωματώθηκε με το φως πεπτίδια για να δημιουργήσει μια σειρά από ενδογενείς συγκεντρώσεις αναλύτη που εκτείνονται σε 3

7 και 3

8-πλάσια περιοχή συγκέντρωσης (τροποποιημένη μέθοδο από τον Michael et al., [23]) για LRG1 και πεπτίδια αναφοράς A1BG αντίστοιχα. Το ποσό των [

12C] πεπτίδιο μετρήθηκε από το σημείο συγκέντρωσης στο οποίο οι αναλογίες περιοχή [

12C] /[

13C] ήταν πιο κοντά στο 1 (1.029 για A1BG και 0,922 για LRG1). αναλογίες περιοχής χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό ενδογενείς συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών στόχων σε ορούς, από τον τύπο εφοδιασμένα την καμπύλη γραμμικότητα. Συντελεστής Inter-δοκιμασίας διακύμανσης (CV) αξιολογήθηκε με πέντε διαχωρίζεται επεξεργασία και MRM αντιγράφει ενός μικτού δείγματος και όριο ανίχνευσης (LOD) ορίστηκε ως τις συγκεντρώσεις στις οποίες το S /N του αναλύτη είναι ίση με 3 [24 ]. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) ήταν εμπειρικά προσδιορίζεται ως η χαμηλότερη συγκέντρωση αναλύτη που μπορεί να κρατήσει την αποδεκτή γραμμικότητα (Pearson συσχέτισης, R & gt? 0,99) και μπορεί να μετρηθεί με & lt?. 20% CV [23]

Αποτελέσματα

Μια βάση δεδομένων υψηλής ποιότητας NSCLC που σχετίζονται πρωτεΐνες ορού

Pre-θεραπεία με ορούς από 13 ασθενείς με NSCLC (8 διαφημίσεις και 5 κλώνοι ενός κυττάρου) και 5 υγιείς μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για IMDL-MS /MS ανάλυση ( Φιγούρα 1). Για να διαλευκάνουν την πολυπλοκότητα των proteome ορού, έχουμε βελτιωθεί μια προηγούμενη μέθοδο κατακρήμνισης για την αφαίρεση ανθρώπινη λευκωματίνη ορού και να χρησιμοποιηθούν δύο διαστάσεων κλασματοποίησης HPLC. Η διαδικασία εξάντληση ήταν γρήγορη και με χαμηλό κόστος, και ήταν αρκετά αναπαραγώγιμη και αποτελεσματική, όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα S1. Μια νέα σειρά ρυθμιστικών έντεκα διαφορετικές τιμές ρΗ χρησιμοποιήθηκε σε IMDL, λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα του ανθρώπινου πρωτεώματος ορού (Σχήμα 1, μεσαίο πλαίσιο). Σε σύγκριση με ένα παραδοσιακό μονοδιάστατο διαχωρισμό RP-LC, κάλυψη πρωτεώματος βελτιώθηκε, θεωρώντας ότι περισσότερο από τρεις φορές όσες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από IMDL υπό τα ίδια κριτήρια PSM FDR (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Αριστερό πλαίσιο , συλλογή και εξάντληση δείγματα ορού για την απομάκρυνση του αλβουμίνη ανθρώπινου ορού (HSA)? Μέση πάνελ, IMDL κλασματοποίησης η οποία διαχωρίζει τα πεπτίδια ορού με pIs τους (2.5~8.5) και υδροφοβικότητας, με ένα παράδειγμα HPLC-MS /MS έδειξε χρωματογραφία για κάθε βήμα ρΗ έκλουσης? Δεξιό πίνακα, ο αριθμός των ασθενών με NSCLC και ο αριθμός των ίδιας ηλικίας υγιείς μάρτυρες στη φάση επαλήθευσης με αποτύπωμα western, TMA και μέτρηση MRM. SCX, ισχυρός ανταλλάκτης κατιόντων, RP αντίστροφης φάσης χρωματογραφία. AD: αδενοκαρκίνωμα? SCC: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? NSCLC:. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα

Η

Με σεβασμό στην αυξανόμενη ανησυχία για το θέμα της εμπιστοσύνης των πρωτεϊνών του αίματος εντοπίστηκαν [25], χρησιμοποιήσαμε τα αυστηρότερα κριτήρια, αφελής στόχο-δόλωμα FDR σε πρωτεΐνη επίπεδο για να προκριθεί proteome ορό [16]. Συλλογικά, 629.804 πεπτίδιο επιτυχίες του 4456 μοναδικά πεπτίδια, αναθέτοντας σε 647 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από τον ορό (πρωτεΐνη FDR & lt? 4,6%) και ενσωματώνονται σε ετικέτα δωρεάν ποσοτικοποίηση. Στη συνέχεια παρατηρείται η κατανομή XCorr αναγνώρισης πεπτιδίου σε proteome ορό. Όπως υποδεικνύεται Σχήμα S2, όλα από τα φάσματα ήταν ένας XCorr υψηλότερο από 2,25, και κυριάρχησε ταυτοποίηση πολύ υψηλότερες βαθμολογίες τόσο για χρέωση 2+ και 3+ φορτίο ιόντα. Να εξακριβώσει περαιτέρω την απόδοση της στρατηγικής στόχου-δόλωμα και προέρχεται FDR του, ένα άλλο ευρέως χρησιμοποιούμενο ταυτοποίηση πρωτεϊνών ροή εργασίας, Trans-πρωτεομικής Pipeline (TPP) [26], εφαρμόστηκε επίσης σε όλες τις πρώτες φάσματα που προέρχεται από ένα υγιές δείγμα ορού. Όλα τα PSMs με PeptideProphet ≥0.75 διατηρήθηκαν και να ανατίθενται σε πρωτεΐνες. Επιπλέον, 89,7% πρωτεΐνες στην ταυτοποίηση αποτέλεσμα μας είχε μια ProteinProphet ≥0.9, και περίπου 65,1% πρωτεΐνες είχαν ProteinProphet ισοφάρισε 1. Αντίθετα, αν διατήρησε την ετικέτα δόλωμα στο TPP, πρωτεΐνες ορού με ProteinProphet ≥0.9 είχε FDR υψηλότερο από 10,7 %. Αυτά πρότεινε την αρκετά υψηλή εμπιστοσύνη των proteome ορό μας.

Ο χαρακτηρισμός και βιολογικός δείκτης ελέγχου στον NSCLC proteome ορό

Είμαστε δίπλα υπολογίζεται το δυναμικό εύρος της ετικέτας δωρεάν προφίλ. Μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ φασματικής μετράει πρωτεΐνη και είναι γνωστές αντίστοιχες συγκεντρώσεις τους [27], [28] λήφθηκε (Πίνακας S2). Έτσι, πρωτεομική προσέγγιση μας επέτρεψε ευκαιρίες της ταυτότητας και τη σχετική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών του ορού σε έξι τάξεις μεγέθους (τόσο χαμηλά όσο αρκετές νανογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο).

Για να πραγματοποιήσετε μια σχετίζεται NSCLC proteome ορού, ξεκινήσαμε με την εκτέλεση Ιεραρχική ομαδοποίηση ανάλυση (HCA) και ανάλυση κύριων τμημάτων (PCA) επί του συνόλου proteome να αντιμετωπίσει ότι, εάν σημαντικές πρωτεΐνες ορού ρυθμίζεται λόγω NSCLC εμφάνιση. HCA και PCA και οι δύο πραγματοποιήθηκαν στην φασματική καταμέτρηση των πληροφοριών όλων των 647 πρωτεΐνες ορού (βλέπε μέθοδο). Η HCA υπονοείται ότι NSCLC και φυσιολογικά άτομα ενσωματώθηκαν σε δύο μεγάλες συστάδες (Σχήμα 2Α). Ομοίως, στην ανάλυση PCA, NSCLC ορός θα μπορούσε να διαχωριστεί από 5 φυσιολογικούς ελέγχους από ένα μόνο κύριο συστατικό, και η μεταβολή στην ομάδα του καρκίνου ήταν πολύ περισσότερο από ότι στην ομάδα με φυσιολογική (Εικόνα 2Β). Επειδή το MS ανάλυση των περιπτώσεων ελέγχου εισήχθησαν τυχαία στα τρεξίματα αλληλουχίας των 13 NSCLC ορούς, οι προ-αναλυτική παράγοντες θα πρέπει να είναι αβέβαιες και λιγότερο σημαντική από ό, τι το φαινότυπο του καρκίνου. Αν και οι σχετικές θέσεις του κάθε NSCLC περίπτωση HCA και PCA δεν ήταν το ίδιο, παρατηρήσαμε μέτρια απόκλιση μεταξύ AD και SCC ασθενείς. Για να απαντηθεί εάν ο διαχωρισμός μεταξύ ομάδων ερχόταν από μόνο ένα ή δύο σημαντικά αλλάξει άφθονες πρωτεΐνες, χρησιμοποιήσαμε επίσης PCA για όλες τις πρωτεΐνες ταυτότητες (βλέπε τα κόκκινα βέλη στο Σχήμα 2Β). Αυτό το «bi-πλοκή» πρότεινε ότι σημαντικές πρωτεΐνες, παρά ένα μικρό αριθμό πρωτεϊνών, συνέβαλαν στο διαχωρισμό.

(Α) Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης και (Β) ανάλυση Κύρια συνιστώσα όλων των πρωτεϊνών 647 ποσοτικά σε όλη την τα 18 δείγματα ορού. Άκρα κόκκινα βέλη στο (Β) αντιπροσωπεύουν το PCA αποτέλεσμα για κάθε πρωτεΐνη.

Η

Από το εντοπίστηκαν πρωτεΐνη ορού μπορεί να κρατήσει ευκαιρίες για να οριοθετηθούν ή να προβλέψει NSCLC, παραλλαγμένα ANOVA και δοκιμασία Student t test μεταξύ ομάδων είχαν προσληφθεί. Ένα σύνολο 101 πρωτεϊνών διηθούνται ως σημαντικά διαφορική πρωτεΐνες (ρ & lt? 0,01, βλέπε λεπτομέρειες στον Πίνακα S3) και η σχετική πρότυπο εμπλουτισμό τους, όπως ένας θερμικός χάρτης δείχθηκε στο Σχήμα 3Α. Μεταξύ 101 πρωτεΐνες διηθείται, περισσότερο από το 25% είχαν προηγουμένως υποδεικνύονται ως υποψήφιοι βιοδείκτη NSCLC. Η σημαντική αυτή η συνέπεια επικυρωθεί έντονα πειραματική προσέγγιση μας στη φάση ανακάλυψης. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι περισσότερες από τις προηγούμενες μελέτες βασίζονταν σε 2D πήγματος και αναφέρθηκαν πολύ λιγότερο απόκλιση πρωτεΐνες από το αποτέλεσμα μας [29], [30], [31]. Επίσης, η πρωτεΐνη μας 101 που επιτυχώς καλύπτεται ένα σημαντικό ποσοστό των υποψηφίων που αναφέρθηκαν από μια προηγούμενη εργασία επίπονη [32], η οποία σε συνδυασμό εκτεταμένη πολυδιάστατη υγρή χρωματογραφία και ηλεκτροφόρηση πηκτής δύο διαστάσεων διαφορά για κάθε κλάσμα χρωματογραφίας. Αυτά τα αποδεικτικά στοιχεία που έδειξαν ότι σε απευθείας σύνδεση κλασματοποίησης IMDL μας δεν ήταν μόνο βολικό, αλλά και σχετικά ευαίσθητο στην διαλογή πιθανών βιοδεικτών στο αίμα. Εκτός από τις αναφερόμενες υποψήφιες δείκτες NSCLC, βρήκαμε σημαντικές αξιοσημείωτο πρωτεΐνες συνδέονται στενά με άλλους καρκίνους, όπως άλφα-1Β-γλυκοπρωτεΐνη [33], Συμπλήρωμα C1q υποσυνιστώσα υπομονάδας Α [34], το ινωδογόνο άλφα /γάμμα αλυσίδα [35], [36] , fibulin-1 [37], παράγοντα αιμοπεταλίων 4 και παραλλαγή του [38]. Παρόλα αυτά, υπήρχαν αρκετές πρωτεΐνες που έτρεφε πολύ καλές στατιστικές, αλλά δεν είχε τα προηγούμενα στοιχεία που να τους συνδέουν με το καθεστώς του καρκίνου, όπως η πρωτεΐνη AMBP (εναλλακτική ονομασία, άλφα-1-μικροσφαιρίνη), Πολυκυψελιδωτού υπομονάδα του σώματος 12Β και V-τύπου πρωτονίων ΑΤΡ 116 kDa υπομονάδας. Ενδιαφέρουσες πρωτεΐνες που συνδέονται άμεσα με μια καρκινική κατάσταση (είτε NSCLC ή άλλο καρκίνο στον άνθρωπο) από την εξόρυξη βιβλιογραφία έχουν περιληφθεί στον πίνακα 1.

(Α) Ιεραρχική ομαδοποίηση heatmap από 101 σημαντικά μεταβληθεί πρωτεΐνες. Οι τιμές έκφρασης εμφανίζεται ως χρώμα κλίμακα με τις υψηλότερες τιμές που αντιπροσωπεύεται από κίτρινο και λιγότερο όπως αντιπροσωπεύεται από το μπλε. (Β) Γονιδιακή Οντολογία βιολογικές διεργασίες εμπλουτίζεται σημαντικά σε 101 σύνολο πρωτεϊνών. σύμβολα γονιδίου σε μπλε ή κόκκινο κύκλους (θα μπορούσε να αναφέρεται στον πίνακα S3) υποδεικνύουν τις αντίστοιχες πρωτεΐνες σε καθοδική ή up-ρυθμίζονται σε NSCLC ορούς.

Η

βιολογικών διεργασιών εμπλουτισμένο σε διαφορική proteome του ορού NSCLC

Είμαστε δίπλα προσπάθησαν να χαρακτηρίσουν τις πρωτεΐνες 101 στο πλαίσιο των βιολογικών τους λειτουργιών. Με τη σύγκριση GO βιολογική διεργασία σχολιασμένη από BINGO, βρήκαμε αρκετές διαδικασίες ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη (προσαρμοστεί σ & lt? 0,05 μετά τη διόρθωση BH, Εικόνα 3Β). Συγκεκριμένα, οι διαδικασίες των απαντήσεων οξείας φάσης (ρ = 5.26E-10) και την ομοιόσταση κυτταρική κατιόν (ρ = 1.31E-6) σε κυκλοφορικό σύστημα έτεινε να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε καρκινικούς ορούς. Διαδικασιών που σχετίζονται με ενεργοποίηση συμπληρώματος (p = 1.28E-7), τον κυτταρικό θάνατο (ρ = 1.15E-2) και την απόπτωση (ρ = 1.27E-3) ήταν επίσης σημαντικά ρυθμιστεί. Εκτός αυτού, βρήκαμε μια σειρά δραστηριοτήτων πρωτεΐνη δεν προηγουμένως γνωστή να διαμένουν στον καρκίνο του πνεύμονα, όπως αναστολέα πρωτεάσης και δραστικότητα υποδοχέα συζευγμένο με G πρωτεΐνη δέσμευσης, των οποίων οι σχετικές πρωτεΐνες ήταν ως επί το πλείστον κάτω ρυθμισμένα (ρ = 1.56E-11 και 3.24E -6). Συλλογικά, οι παρατηρήσεις αυτές εμπλέκουν NSCLC όχι μόνο στις οξείες αντιδράσεις φάσης και της ασυλίας, αλλά και σε ειδικές μεταγωγές σήματος και διαδικασίες θάνατο.

TMA και βαθμολόγησης για να επικυρώσετε την ιστολογική έκφραση A1BG, USP1 και βλεννίνη 5Β στους ιστούς NSCLC

Για να δείξουμε ότι ορισμένες, αν όχι όλες, από τις πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν είναι πράγματι συνδέονται με NSCLC κίνδυνο, κατά τη φάση της επαλήθευσης που χρησιμοποιούνται διαφορετικές προσεγγίσεις επικύρωσης. Επειδή η υψηλή αντιστοιχία στο παρελθόν παρατηρήθηκε μεταξύ μέτρηση TMA και RT-PCR [39] ή πρωτεομική προφίλ [40], ρωτήσαμε αν η ΤΜΑ θα μπορούσε να επιτρέψει μια γρήγορη, αυστηρή και ημι-ποσοτική εκτίμηση των ιστολογικών βιοδεικτών. Σε αυτό το τμήμα, εκτός από άλφα-1Β-γλυκοπρωτεΐνη (A1BG) και πλούσιες σε λευκίνη α-2-γλυκοπρωτεΐνη (LRG1) οι οποίες είναι από mid-range αφθονία στον ορό, επιλέξαμε ένα χαμηλό άφθονη πρωτεΐνη ορού ουβικιτίνης καρβοξυτελικές υδρολάση 1 ( USP1) που εντοπίστηκε σε NSCLC ορούς. Επιπλέον, επειδή κυτταρική γραμμή λύματος θα μπορούσε να είναι βιολογικά πιο κοντά σε δείγμα ιστού, επιλέξαμε τις υποψήφιες βλεννίνη-5B που ανιχνεύεται στο κυτταρικό επίπεδο NSCLC σύμφωνα με ένα σύνολο δεδομένων προηγούμενη μελέτη μας [17]. TMA μας προς αυτές τις τέσσερις πρωτεΐνες παρείχε μια ομοιογενή και σύγχρονο προφίλ της σε 90 ζεύγη τμήματα NSCLC. Όλες οι δοκιμασμένες πρωτεϊνών απέδειξε υψηλότερο επίπεδο έκφρασης σε τομές όγκων NSCLC (Σχήμα 4Α). Για πρόσβαση στενά την απόκλιση επιπέδου μεταξύ NSCLC και γειτονικά τμήματα μη-όγκου τους, το IHC ένταση χρώσης (Ι, 0-3) και το ποσοστό (Ρ, 0-9) των θετικών χρώση κύτταρα κατανεμήθηκαν (Σχήμα 4Β και σχ S3) . Οι περισσότερες τομές όγκων χαρακτηρίστηκαν με μεγαλύτερη ένταση (I≥2) και περισσότερο θετικά κύτταρα (Ρ & gt? 60%).