Abstract

Podoplanin (PDPN), ένα τύπου βλεννίνης διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη ειδικά για το λεμφικό σύστημα εκφράζεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, και θεωρείται ως ένα παράγοντα για την προώθηση της προόδου του όγκου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινιστεί η μοριακή ρόλος του PDPN στη βιολογία του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων. έκφραση PDPN αξιολογήθηκε σε πρωτογενή καρκινώματα του θυρεοειδούς και κυτταρικές γραμμές καρκινώματος του θυρεοειδούς με RT-qPCR, κηλίδωση Western, IF και IHC. Για να εξεταστεί ο ρόλος των podoplanin στον καθορισμό κακοήθους δυναμικού του κυττάρου (κυτταρική μετανάστευση, εισβολή, πολλαπλασιασμό, προσκόλληση, κινητικότητα, απόπτωση), χρησιμοποιήθηκε μια κυτταρική σειρά καρκίνου του θυρεοειδούς με σιγήσει έκφραση PDPN. Παρατηρήσαμε ότι PDPN ήταν αποκλειστικά εκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα του 40% του θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς (PTC) ιστούς. Επιπλέον,

PDPN

mRNA και πρωτεΐνη εκφράζεται υψηλά σε PTC προερχόμενα TPC1 και κυτταρικές σειρές BcPAP αλλά δεν ανιχνεύθηκαν σε θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς που προέρχονται κυτταρικές γραμμές.

PDPN

knock-down σημαντικά μειωμένη κυτταρική εισβολή, και μέτρια μειωμένη κυτταρική μετανάστευση, ενώ ο πολλαπλασιασμός και η πρόσφυση δεν επηρεάστηκαν. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι PDPN διαμεσολαβεί τις επεμβατικές ιδιότητες των κυττάρων που προέρχονται από θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι podoplanin θα μπορούσε να προωθήσει PTC εξέλιξη

Παράθεση:. Rudzińska Μ, Gawel D, Sikorska J, Καρπίνσκα ΚΜ, Kiedrowski Μ, Stępień Τ , et al. (2014) Ο ρόλος της Podoplanin στη Βιολογία της Διαφοροποιημένες του θυρεοειδούς. PLoS ONE 9 (5): e96541. doi: 10.1371 /journal.pone.0096541

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 24η Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 9 Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαΐου του 2014

Copyright: © 2014 Rudzińska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση 2012/07 /Β /NZ5 /02444 από το Εθνικό Κέντρο Επιστήμης, Πολωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

διαφοροποιημένο καρκίνωμα του θυρεοειδούς (DTC) είναι η πιο κοινή ανθρώπινη ενδοκρινική κακοήθεια. Θηλώδες (PTC) και των ωοθυλακίων (FTC) καρκινώματα του θυρεοειδούς είναι δύο μεγάλες DTC παραλλαγές, με την πρώην αντιπροσωπεύει την πιο κοινός τύπος (80% του συνόλου των DTC περιπτώσεις) [1]. Η μοριακή παθογένεση του καρκίνου του θυρεοειδούς περιλαμβάνει αρκετές πορείες μοριακής σηματοδότησης κατά προτίμηση μεταβάλλεται σε PTC και FTC. PTCs φέρουν ογκογόνων μεταλλάξεων σημείου στο

B-RAF

και

RAS

, και χρωμοσωμικές αναδιατάξεις με αποτέλεσμα

RET

και

TrkA

χιμαιρικά γονίδια, τα οποία μπορεί να ενεργοποιήσει την οδό που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [2]. Ενεργοποίηση

BRAF

σημείο V600E μετάλλαξη εμφανίζεται στο, κατά μέσο όρο, το 45%, ενώ

RET PTC

αναδιατάξεις /και

RAS

μεταλλάξεις στο 10-20% των περιπτώσεων PTC [3] , [4],. Σε FTCs, εκτός από

RAS

μετάλλαξη, η

PAX8 /PPARγ

αναδιάταξη και η απορρύθμιση της /ATK /PTEN (φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάσης /ATK /φωσφατάση και tensin ομόλογο PI3K διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10) καταρράκτη σηματοδότησης συχνά ανιχνεύονται, που σχετίζονται με την εξέλιξη και την αποδιαφοροποίηση μέσω της ενεργοποίησης των PI3K και AKT και αδρανοποίηση ή απώλεια

PTEN

έκφραση του γονιδίου καταστολέα [5], [6]. Αν και PTC θεωρείται ότι είναι ένα βραδείας βλάβη με ευνοϊκή πρόγνωση, η ανάπτυξη των μεταστάσεων λεμφαδένων επηρεάζει μέχρι το 50% των ασθενών PTC και την περαιτέρω ανάπτυξη των απομακρυσμένων μεταστάσεων σε ορισμένες διαγνωστεί καρκίνους μειώνει τα ποσοστά επιβίωσης [7], [8]. Ένα κοινό χαρακτηριστικό της επέκτασης του όγκου είναι η διάδοση των πρωτογενών καρκινικών κυττάρων, τα οποία μπορεί να προκύψει

μέσω

έναν αριθμό διαδρομών. Κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα έχουν δείξει ότι θηλώδη καρκινώματα είναι επιρρεπείς σε μεταστάσεις στην περιφερειακή λεμφαδένες, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα απλώνονται

μέσω

του λεμφικού συστήματος [9], [10]. Οι μοριακοί μηχανισμοί και γενετικών παραγόντων που εμπλέκονται στη διάδοση των κυττάρων PTC, η οποία τον προσδιορισμό του μεταστατικού δυναμικού του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

μετάσταση των καρκινικών κυττάρων είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων και διάφορους κυτταρικούς παράγοντες που εκφράζονται σε όγκοι μπορούν να συμμετέχουν. Αρκετές μελέτες έχουν τονίσει τη σημασία των παραγόντων lymphangiogenic στην εξέλιξη των διαφορετικών όγκων και ένας αριθμός ρυθμιστικών μορίων που συμμετέχουν στη λεμφαγγειογένεση έχουν ταυτοποιηθεί [11], [12], [13]. Ένα από τα βασικά lymphangiogenic μόρια είναι podoplanin (PDPN). Ανθρώπινα PDPN, επίσης γνωστή ως T1α -2, PA2.26, gp38 ή aggrus, είναι ένα είδος 38-kDa Ι βλεννίνη σαν διαμεμβρανική σιαλογλυκοπρωτεϊνη αποτελείται από ένα εντόνως Ο-γλυκοζυλιωμένη εξωκυτταρική περιοχή, μία περιοχή ενιαίο μεμβρανοδιατρέχουσας και σε μικρή κυτταροπλασματική ουρά [14]. Σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς, podoplanin εκφράζεται σε ποδοκύτταρα νεφρό, σκελετικό μυ, καρδιά, πλακούντα, πνεύμονα, και αλλού [15], [16], [17]. PDPN εκφράζεται στα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα (LEC), αλλά όχι στα ενδοθηλιακά κύτταρα του αίματος (BEC) και έτσι αντιπροσωπεύει ένα ειδικό δείκτη του λεμφικού ενδοθηλίου και λεμφαγγειογένεση [11]. Παρά την ιδιαιτερότητα της έκφρασης του σε λεμφικό ενδοθήλιο, PDPN έχει επίσης ανιχνευθεί σε διάφορους καρκίνους [18], [19], [20]. Η βιολογική λειτουργία του PDPN δεν έχει πλήρως καθοριστεί, αλλά τα διαθέσιμα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο ως μεσολαβητής των καρκινικών κυττάρων εισβολής [21]. Η λεπτομερής μηχανισμός βασίζεται η εξάπλωση των διαφοροποιημένων κυττάρων θυρεοειδούς όγκου και της εξέλιξης του καρκίνου, και ιδιαίτερα η συμβολή των προ-lymphangiogenic μόρια σε αυτή τη διαδικασία είναι ελάχιστα κατανοητή. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να χαρακτηρίσει την έκφραση και τη λειτουργία των podoplanin σε όγκους του θυρεοειδούς βιολογία. έκφραση PDPN εξετάστηκε σε πρωτογενείς όγκους και σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του θυρεοειδούς που προέρχονται από θηλώδη (TPC1 και BcPAP) και θυλακιώδη (FTC133 και CGTH-W-1) καρκινώματα του θυρεοειδούς. Διερευνήσαμε επίσης το ρόλο του στη ρύθμιση PDPN χαρακτηριστικά του φαινοτύπου κακοήθους κυττάρου: πολλαπλασιασμός, προσκόλληση, ποσοστό επιβίωσης, την κινητικότητα, τη μετανάστευση και εισβολή. Για να προσδιοριστεί η λειτουργία αυτού του διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη στην μεταστατική συμπεριφορά των θηλώδους καρκινικών κυττάρων, εκτελέσαμε RT-qPCR, ανοσοφθορισμό και ανοσοϊστοχημεία, καθώς και αναλύσεις Western blot-και εξετάστηκαν

PDPN

knock-down σε καλλιεργημένα κύτταρα . Τα ληφθέντα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι PDPN μπορεί να θεωρηθεί ένα προ-μεταστατική παράγοντας που επηρεάζει την εξάπλωση της PTC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από το Επιτροπή Ηθικής των Ανθρωπίνων Μελετών στο Κέντρο Μεταπτυχιακών Ιατρικής Εκπαίδευσης. δείγματα ιστού ελήφθησαν με την άδεια των αντίστοιχων Ηθικής Επιτροπές (στο Κέντρο Καρκίνου και το Ινστιτούτο Ογκολογίας, στο Memorial Hospital Κοπέρνικος, και στο Κέντρο Μεταπτυχιακών Ιατρικής Εκπαίδευσης). Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετέχουν σε αυτή τη μελέτη. Αριθ βιομηχανία έδωσε υποστήριξη για αυτή τη μελέτη.

δείγματα θυρεοειδούς ιστών και κυτταρικών σειρών

Για πειράματα γονιδιακής έκφρασης, κατεψυγμένα ιστούς δείγματα του θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς (Τ) και γειτονικό φυσιολογικό θυρεοειδούς ιστού από τον ετερόπλευρο λοβός (ΝΤ) συλλέχθηκαν κατά τη Maria Skłodowska-Curie Memorial Κέντρο Καρκίνου και το Ινστιτούτο Ογκολογίας, στο Τμήμα Γενικής και Ενδοκρινολογικό Χειρουργικής, Memorial Hospital Κοπέρνικος (Βαρσοβία και το Lodz, Πολωνία). Για ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC), αρχειοθετούνται φορμόλη σταθερά, ιστούς παραφίνης (διαφορετικές από εκείνες που χρησιμοποιούνται στην RT-qPCR) από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε ολική θυρεοειδεκτομή χρησιμοποιήθηκαν

Η σειρά των 173 αρχειοθετούνται ιστών αποτελείται.: 112 θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (94 κλασική PTC με θηλώδες ή μικτές θηλώδη-θυλακιώδη πρότυπο ανάπτυξης και 18 ωοθυλακίων variants- θηλώδες καρκίνωμα FvPTC), 27 θυλακιώδη καρκινώματα του θυρεοειδούς (FTC), 24 θυλακιώδη αδενώματα (FA) και 10 φυσιολογικούς ιστούς του θυρεοειδούς (ΝΤ). δείγματα ιστού ελήφθησαν με την άδεια των αντίστοιχων Ηθικής Επιτροπές (στο Κέντρο Καρκίνου και το Ινστιτούτο Ογκολογίας, στο Memorial Hospital Κοπέρνικος, και στο Κέντρο Μεταπτυχιακών Ιατρικής Εκπαίδευσης).

Για λειτουργικές μελέτες χρησιμοποιήθηκαν θυρεοειδούς κυτταρικές γραμμές καρκινώματος που προέρχονται από θηλώδες (TPC1 και BcPAP) και των ωοθυλακίων (FTC133 και CGTH-W-1) καρκινώματα του θυρεοειδούς και SV40-αθανατοποιημένα ανθρώπινα γραμμή του θυρεοειδούς επιθηλιακά Nthy-ori 3-1 (εφεξής εμάς ως NTHY) να εκπροσωπεί την κανονική θυρεοειδούς κύτταρα. Οι κυτταρικές σειρές που ελήφθησαν από τη Συλλογή γερμανική Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (BcPAP και CGTH-W-1), και από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Κυτταροκαλλιεργειών (FTC 133 και Nthy-ori 3-1). Η TPC1 κυτταρική γραμμή [22] παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. M. Santoro (The Πανεπιστήμιο της Νάπολης, Ιταλία) [23]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS (Roche, Ελβετία), με την εξαίρεση των FTC133 κύτταρα, τα οποία αναπτύχθηκαν σε πλήρες DMEM /F-12 συμπληρωμένο με 10% FBS (Life Technologies, Invitrogen, USA). Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

απομόνωση RNA και σε πραγματικό χρόνο (RT) -qPCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από ανθρώπινο θυρεοειδή δείγματα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς με χρήση RNA Mini Kit (Α & amp? A Biotechnology, Πολωνία) σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο, και η ακεραιότητα του RNA επαληθεύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Ολικό RNA (1 μg) χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA με υψηλή ικανότητα cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Applied Biosystems, USA). Η έκφραση του ανθρώπινου

PDPN

και

18S rRNA γονίδια

ποσοτικοποιήθηκε με RT-qPCR χρησιμοποιώντας τα cDNA ως μήτρα σε αντιδράσεις που περιέχουν το DNA-ειδική χρωστική δίκλωνου SYBR Green Ι και Maxima Φλουορεσκεΐνη RT -qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Καναδάς) και ειδικούς εκκινητές (αναφέρονται παρακάτω), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

PDPN

(NM_006474)

Προώθηση : 5′-CGAAGATGATGTGGTGACTC-3 ‘

Αντίστροφη: 5′-CGATGCGAATGCCTGTTAC-3′

18S rRNA

(NM_02255)

Προώθηση: 5 ‘ -CCAGTAAGTGCGGGGTCATAAG-3 ‘

Αντίστροφη: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′.

ενίσχυση, απόκτηση δεδομένων και η ανάλυση των δεδομένων έγιναν με τη χρήση του iQ5 Real-Time System και το λογισμικό ανίχνευσης PCR (βιο- Rad, USA).

PDPN φίμωση με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

κύτταρα TPC1 επιμολύνονται με siRNA (τελική συγκέντρωση 30 nM) με στόχο την ανθρώπινη

PDPN

, (siPDPN , 5′-CGAAGACCGCUAUAAGUCUTT-3 ‘? Life Technologies, Ambion, USA) και ένα καθολικό αρνητικό έλεγχο siRNA (Sigma-Aldrich, USA) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Invitrogen, USA) σε Opti-ΜΕΜ (Roche, Ελβετία) μέσο , σύμφωνα με τα συνιστώμενα πρωτόκολλα. Η αποτελεσματικότητα του

PDPN

αναστολή γονίδιο αξιολογήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με RT-qPCR, κηλίδωση Western και ανοσοφθορισμό. Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές.

κηλίδωση Western

Τα συλλεγμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και επαναιωρήθηκαν σε 1% ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM χλωριούχο νάτριο? 1.0% ΝΡ-40? 0.5% δεοξυχολικό νάτριο? 0.1% SDS? 50 mM Tris, ρΗ 8.0) συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης 1% και 1% κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (Roche, Ελβετία). Πρωτεΐνες στα προϊόντα λύσης κυττάρων ποσοτικοποιούνται και τα δείγματα των 30 μg διαχωρίστηκαν επί 8% γέλες SDS-PAGE και στη συνέχεια τα ηλεκτρολογικά μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με επώαση με 5% άπαχο γάλα σε TBS (0.1% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντι-podoplanin μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (D2-40, αραιωμένο 1:1000? Abd Serotec, USA). Μετά από εντατική πλύση, οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP καθαρισμένο με συγγένεια κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Σήματα από αντιδραστικά ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένη ανίχνευση χημειοφωταύγειας (SuperSignal

® West Dura, Pierce Chemical, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Ως έλεγχος φόρτωσης, οι μεμβράνες επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (αραιωμένο 1:5000? Sigma-Aldrich, USA) με τον ίδιο τρόπο

χρώση ανοσοφθορισμού

κύτταρα. σε γυάλινες καλυπτρίδες μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη μεθανόλη, αποκλείστηκαν με 2% ορό κατσίκας /2% BSA, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντι-podoplanin μονοκλωνικό D2-40 αντίσωμα ποντικού (1:50? Abd Serotec, USA). Μετά από αρκετές πλύσεις, τα κύτταρα επωάστηκαν με DyLight

TM549-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με το πυρηνικό βαφή ϋΑΡΙ και οπτικοποιούνται με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (AxioObserver D1, Zeiss, Germany) χρησιμοποιώντας ένα 100x φακό ελαίου εμβάπτισης.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρώσης εκτελέστηκε σε 4-μm πάχους τομές του αρχειοθετηθεί μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς θυρεοειδούς: PTC (112 περιπτώσεις), FTC (27 περιπτώσεις), FA (24 περιπτώσεις), και ΝΤ (10 περιπτώσεις). Οι τομές αποπαραφινώθηκαν και ανάκτηση αντιγόνου θερμότητα επαγόμενη διεξήχθη σε διάλυμα ανάκτησης στόχο (TRS, ρΗ 9.0? ΫΑΚΟ, Denmark), θέρμανση για 20 λεπτά σε μια χύτρα ταχύτητας. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-αντίσωμα podoplanin D2-40 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, το αντιδραστήριο Envision + αντίσωμα εφαρμόστηκε (DAKO, Denmark). Οι αντιδράσεις αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη (DAB) ως χρωμογόνο υπόστρωμα. Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, τοποθετημένα και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Οι αρνητικοί έλεγχοι παρασκευάστηκαν ακολουθώντας την ίδια διαδικασία, αλλά παραλείποντας την επώαση με πρωτογενές αντίσωμα. χρώση IHC αξιολογήθηκε από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές (MK και BC) και βαθμολογήθηκαν ως «αρνητική» ή «θετικές», σύμφωνα με την σχετική ένταση της χρώσης PDPN. Οι ανοσοϊστοχημικές δεδομένα υποβλήθηκαν σε στατιστική ανάλυση.

Η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες

Η μετανάστευση των κυττάρων και τη δραστηριότητα εισβολή προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Boyden θάλαμο ένθετο (8-μm μέγεθος πόρων, BD Falcon ™ Cell Culture ένθετα, USA) και BD BIOCOAT Matrigel εισβολή Επιμελητήριο 8-μm (BD Bioscience, USA), αντίστοιχα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού, στη συνέχεια μετρήθηκαν με ένα μετρητή κυττάρων EVA Automatic (Nano ENTEK, Κορέα). Ένα σύνολο 2 χ 105 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 (και για τις δύο δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής) προστέθηκαν στους θαλάμους και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2. RPMI μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει ή εισβάλει μέσω της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Diff-Quik (Medion Diagnostics, Ελβετία), απεικονίζεται στο 40x μεγέθυνση με ένα μικροσκόπιο Olympus BX41, και μετρήθηκαν. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

In vitro

επούλωσης πληγών δοκιμασία κινητικότητας

Οι γρατσουνιές συγκρίσιμων διαστάσεων έγιναν συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων (που καλλιεργούνται σε 6- φρεατίων) χρησιμοποιώντας ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 200 μΐ. Οι μονοστιβάδες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση αποσπασμένα κύτταρα και τα κυτταρικά υπολείμματα, και στη συνέχεια να ξαναγεμίζει με μέσο ανάπτυξης και επωάζονται στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Οι πλάκες παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός (10x, AxioObserver D1, Zeiss, και 20x Nikon Diaphot 300) κάθε 3 ώρες για να προσδιοριστεί η ταχύτητα του κλεισίματος του τραύματος. Το πλάτος των πληγών σε κάθε χρονικό σημείο μετρήθηκε σε 5 ανεξάρτητα πεδία χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (www.rsbweb.nih.gov). Η απόσταση κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με μέτρηση του πλάτους της πληγής διαιρείται δια δύο και αφαιρώντας αυτή την τιμή από την αρχική πλάτος μισού πληγή [26]. Απόσταση προσδιορίστηκε ποσοτικά ως εξής: με το 10x φακό, 1 pixel = 1.026 μm? με το 20x φακό, 1pixel = 0,43 μm.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Για την αξιολόγηση πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων στις 24 και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα 2, 3-δις- (2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο-5-καρβοξανιλίδιο (ΧΤΤ) κιτ πολλαπλασιασμού τετραζολίου κυττάρων (ez4u, Biomedica GmBH, Αυστρία). Εν συντομία, φρεάτια πλακών 96 φρεατίων ενοφθαλμίστηκαν με 8 × 10

3 κύτταρα (5 επαναλήψεις). Στη συνέχεια, 25 μΐ αντιδραστηρίου μίγματος ΧΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η απορρόφηση στο μήκος κύματος δοκιμής (450 nm για τη μέτρηση της παραγωγή φορμαζάνης) και το μήκος κύματος αναφοράς (620 nm) μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός Labsystems Multiscan RC (Thermo Fisher Scientific, USA).

προσδιορισμός απόπτωσης

η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρήση αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abcam, UK) ακολουθώντας το συνιστώμενο πρωτόκολλο. Εν συντομία, συλλέχθηκαν τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν με FITC-Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής (FACSCantoII, BD Biosciences, USA). Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές.

Ανάλυση δεδομένων

Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη παραμετρικό Mann-Whitney U και αντιστοιχισμένο t-test (GraphPad, Prizm, USA). Ένα

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Πολυπαραγοντικό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ των ανεξάρτητων συμπαράγοντες και podoplanin οιδηματώδης έκφρασης.

Αποτελέσματα

πρωτεΐνη PDPN έκφραση και την κυτταρική εντόπιση

Η έκφραση της podoplanin για πρώτη φορά αξιολογήθηκε σε δείγματα ιστών αρχειοθετημένα θυρεοειδούς όγκου. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση εκτελέστηκε σε μια σειρά 173 ιστούς παραφίνης (112 PTC, 27 FTC, 24 FA και 10 ΝΤ) χρησιμοποιώντας αντι-podoplanin D2-40 μονοκλωνικό αντίσωμα. Σε κανονική θυρεοειδούς ιστού χρώση PDPN απουσίαζε στο οζώδες κύτταρα και αντι-PDPN αντίσωμα σημασμένο αποκλειστικά και μόνο έντονα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα στα πολυάριθμα λεμφαγγείων, η οποία χρησίμευσε ως ένα καλό εσωτερικό έλεγχο (Σχήμα 1Α? Α). Όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν FTC και FA ήταν αρνητικά για PDPN ανοσοαντιδραστικότητα (Σχήμα 1Α?. Β, γ). Πλειονότητα των εξετασθέντων PTCs ήταν επίσης αρνητικά για την επισήμανση PDPN (Σχήμα 1Α? Δ.). Ωστόσο, το 40% (45 από 112) των PTCs εμφάνισαν θετική ανοσοχρώση για podoplanin (Σχήμα 1Α?. E-l). Διάφορα ένταση της επισήμανσης PDPN (από μέτρια έως ισχυρά) παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων και στην πιο περιπτώσεις, η χρώση ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένη σε όλη την καρκίνου. Σε αντίθεση, τα κύτταρα των ιστών περιογκική (θεωρείται ως «κανονική θυρεοειδούς ιστού») ήσαν εντελώς PDPN αρνητικά (βλέπε Σχ 1Α? Ε., J, k, l). Σε αυτά τα κανονικά περιθώρια θυρεοειδικό ιστό άνευ όγκου, D2-40 αντίσωμα σημασμένο αποκλειστικά και έντονα λεμφαγγείων διαφόρων μεγεθών και σχημάτων. Η συσχέτιση της έκφρασης PDPN σε καρκινικά δείγματα ιστού με κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων εκτιμήθηκε με πολυπαραγοντικό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης και συνοψίζονται στον Πίνακα 1. έκφρασης Cytoplasmic PDPN δεν ήταν στατιστικά σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών με μέγεθος μεγαλύτερο ή μικρότερο όγκο (PT) ή ιστολογική (FvPTC

vs

κλασικό PTC) υποτύπου. Αν και υπήρχε ένας μεγαλύτερος αριθμός περιπτώσεων (9 θετικούς όγκους μεταξύ 17 δοκιμάστηκε) με επαγόμενη podoplanin κυτταροπλασματική έκφραση στην ομάδα ρΤ3 και την ένταση της χρώσης ήταν ισχυρή σε όλους τους θετικούς όγκους, ο αριθμός των περιπτώσεων στην ομάδα ήταν πολύ μικρός για να είναι αναλύθηκαν στατιστικά. Εντούτοις, η έκφραση της πρωτεΐνης podoplanin συσχετίστηκε σημαντικά με την ηλικία του ασθενούς. Ηλικιωμένους ασθενείς PTC (≥45) έδειξε πιο συχνά (69%

vs

31%) PDPN neoexpression τότε νεότεροι (& lt? 45), (προσαρμοσμένη αναλογία πιθανοτήτων 4, 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1,76 έως 9,2,

P

& lt?. 0.001)

Α. ανίχνευση ανοσοϊστοχημεία του podoplanin διεξήχθη σε τομές ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα ανοσοχρώση λαμβάνονται με αντι-PDPN D2-40 μονοκλωνικό αντίσωμα. (Α) αποκλειστικά και ισχυρή χρώση των λεμφαγγείων σε φυσιολογικό ιστό του θυρεοειδούς? (Β) θυλακιώδες αδένωμα (FA) ιστού αρνητικά για podoplanin? (Γ) θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (FTC) των ιστών αρνητικό για podoplanin? (Δ) θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (PTC) περίπτωση αρνητικής για podoplanin? (E-l) έντονη κυτταροπλασματική χρώση PDPN σε κύτταρα PTC. Σε e, j και Ι έντονη χρώση των PDPN σε κύτταρα όγκου, με περινεοπλαστικό αρνητικό περιθώριο για podoplanin και ισχυρή χρώση των λεμφαγγείων ως εσωτερικός θετικός έλεγχος. Αρχική μεγέθυνση: α-100x, ένα-ένθετο -100x? β-200x, β-ένθετο -100x? c-200x? d-200x, e-100x, f-100x, g-200x? h-200x, i-100x, j-200x, k-200x, L-400x. Από 112 περιπτώσεις PTC, 45 (40%) εμφανίζονται έκτοπη έκφραση podoplanin στα καρκινικά κύτταρα. B. έκφραση Σχετική PDPN mRNA σε 21 PTCs (Τ) και αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς (ΝΤ) αναλύθηκαν με RT-qPCR. επίπεδα μεταγραφής PDPN και 18S rRNA ήταν ποσοτικά και της έκφρασης podoplanin ομαλοποιηθεί κατά εκείνη του γονιδίου καθαριότητας (18S rRNA). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM, **

P

& lt?. 0.001

Η

Η ανάλυσή μας επεκτάθηκε από μια έρευνα του

PDPN

γονίδιο έκφραση σε σειρά αφαιρεθεί χειρουργικά PTC /NT ζεύγη ιστών με τη χρήση RT-qPCR. Σε 14 από τα 21 που αναλύθηκαν περιπτώσεις PTC /NT, μια σημαντικά υψηλότερη (

P

& lt? 0.001) επίπεδο του

PDPN

μεταγραφής ανιχνεύθηκε σε δείγματα PTC σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς του θυρεοειδούς (Εικ . 1Β). Στις υπόλοιπες 7 ζεύγη PTC /NT, το επίπεδο του

PDPN

mRNA σε ιστούς PTC ήταν ίση ή ακόμη χαμηλότερη από ότι στα ζεύγη φυσιολογικούς ιστούς.

Έκφραση και κυτταρικό εντοπισμό του PDPN στον καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές

Για να διερευνήσει το λειτουργικό ρόλο της podoplanin στο θυρεοειδή κυτταρική βιολογία εξετάσαμε ένα φυσιολογικό θυρεοειδούς κυτταρικής σειράς (NTHY), και ένα πάνελ θηλώδη (TPC1 και BcPAP) και των ωοθυλακίων (FTC133 και CGTH- W-1) καρκίνο του θυρεοειδούς που προέρχονται από κυτταρικές σειρές. Το επίπεδο του

PDPN

mRNA ήταν πολύ χαμηλή στα αθάνατα κύτταρα NTHY (Εικ. 2Α). Στα κύτταρα καρκινώματος του θυρεοειδούς, παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες διαφορές στην σχετική

PDPN

μεταγραφής επίπεδο μεταξύ κυττάρων που προέρχονται από PTC και FTC. TPC1 και BcPAP κύτταρα εμφάνισαν το υψηλότερο επίπεδο

PDPN

έκφραση του mRNA μεταξύ όλων των δοκιμαζόμενων κυτταρικές γραμμές καρκινώματος του θυρεοειδούς. Σε αντίθεση, η

PDPN

μεταγραφή δεν ανιχνεύθηκε στα καρκίνωμα κυτταρικές γραμμές που παράγονται FTC133 και CGTH-W-1 των ωοθυλακίων (Σχ. 2Α). Κατά μέσο όρο, το επίπεδο των

PDPN

mRNA στις κυτταρικές γραμμές PTC ήταν περισσότερο από 3 φορές υψηλότερη από εκείνη στα κύτταρα ελέγχου NTHY.

A. έκφραση PDPN mRNA σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές του θυρεοειδούς. RT-qPCR χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τα επίπεδα της μεταγραφής που κωδικοποιεί podoplanin σε ολικό RNA παρασκευάζεται από κύτταρα NTHY ελέγχου, PTC προερχόμενο TPC1 και κυτταρικές σειρές BcPAP, και FTC προερχόμενο FTC133 και κυτταρικές σειρές CGTH-W-1. Τα δεδομένα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM, **

P

& lt? 0.001. B. Podoplanin επίπεδα πρωτεΐνης σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές του θυρεοειδούς. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (30 μg) υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western με αντι-PDPN μονοκλωνικό αντίσωμα D2-40 και αντίσωμα β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. C. Ανοσοφθορισμός ανάλυση της έκφρασης podoplanin σε καρκινικές κυτταρικές σειρές CGTH-W-1 θυρεοειδούς TPC1, BcPAP, FTC133 και. PDPN οπτικοποιήθηκε με χρώση χρησιμοποιώντας αντι-PDPN D2-40 μονοκλωνικό αντίσωμα που ακολουθείται από DyLight549-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (κόκκινο), και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). Μεγέθυνση 1000x.

Η

έκφραση της πρωτεΐνης Podoplanin και την κυτταρική εντόπιση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς

Για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα RT-qPCR, θα πραγματοποιηθεί Western και ανοσοφθορισμός αναλύσεις για την αξιολόγηση της έκφρασης της πρωτεΐνης PDPN και να καθορίσει κυτταρικό εντοπισμό της σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης podoplanin υπολογίζεται από ανοσοαποτύπωση ήταν απόλυτα συνεπής με τα αποτελέσματα RT-qPCR. PDPN πρωτεΐνη έντονα επάγεται σε κυτταρικές σειρές TPC1 και BcPAP, αλλά δεν ανιχνεύθηκε σε FTC καταγόμενες κύτταρα (Σχ. 2Β). Ανάλυση ανοσοφθορισμού επιβεβαίωσε τα υψηλά επίπεδα PDPN στα κύτταρα TPC1 και BcPAP. Η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες των κυττάρων και στην κυτταροπλασματικό διαμέρισμα των κυτταρικών σειρών PTC-καταγωγής (Σχ. 2C). Οι-CGTH-W 1 γραμμές FTC133 και ήταν αρνητικά για PDPN ανοσοχρώση, επικύρωση και πάλι τα δεδομένα RT-qPCR.

Επίδραση της PDPN στον κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων

Υπό το φως της της φιλο-επεμβατική ιδιότητες που αναφέρθηκαν σε άλλους τύπους ανθρώπινων όγκων και τα υψηλά επίπεδα που ανιχνεύονται σε δείγματα PTC, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε αν PDPN εμπλέκεται στη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων του θυρεοειδούς όγκου. κύτταρα TPC1 επιμολύνονται με στόχευση siRNA

PDPN

(TPC1 /siPDPN) και με έλεγχο καθολική αρνητική siRNA (TPC1 /siNEG). Κάθε μεταγενέστερη ρύθμιση προς τα κάτω του podoplanin αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας RT-qPCR, Western blotting μεθόδους και ανοσοφθορισμό. Μόνο -15% της αρχικής

PDPN

μεταγραφής επίπεδο ανιχνεύθηκε σε κύτταρα TPC1 /siPDPN 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, επιβεβαιώνοντας ότι η ειδική siRNA που παράγεται αποδοτική αποσιώπηση του

PDPN

(Εικ. 3Α). δοκιμασίες κηλίδωση και ανοσοφθορισμός Western κατέδειξε την knock-down της γονιδιακής έκφρασης podoplanin σε αυτά τα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β και 3C, η πρωτεΐνη PDPN ανιχνεύθηκε μόνο σε TPC1 κύτταρα επιμολυσμένα με τον αρνητικό μάρτυρα siRNA. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, την προσκόλληση και την επιβίωση στη συνέχεια αξιολογήθηκαν για τα κύτταρα TPC1 επιμολύνθηκαν με τα

PDPN

-ειδικές και ελέγχου siRNAs. Καμία αύξηση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων με σιγήσει

PDPN

βρέθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 3D, αριστερό πάνελ). Επίσης, δεν τήρησε καμία διαφορά στις ιδιότητες πρόσφυσης του

PDPN

-silenced και ελέγχου κύτταρα (3Ε). Επιπλέον, δεν υπήρχαν διαφορές στον αριθμό των βιώσιμων (& gt? 90%), αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα μεταξύ ειδικών και μη-ειδικών siRNA επεξεργασμένα TPC1 κύτταρα (Εικ. 3D, δεξί πάνελ), υποδηλώνοντας ότι η έκφραση του PDPN δεν αυξάνουν την ευαισθησία των κυττάρων αυτών σε απόπτωση.

Α. RT-qPCR ανάλυση των επιπέδων PDPN mRNA σε TPC1 καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με 30 ηΜ siRNA ειδικό για PDPN (siPDPN) ή αρνητικός έλεγχος siRNA (siNEG). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο 18S rRNA και ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση αλλαγή φορές σε PDPN μεταγραφή αφθονία σε κύτταρα επιμολυσμένα με siPDPN σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siNEG. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM, **

P

& lt? 0.001. Η ανάλυση στυπώματος Western Β του podoplanin και β-ακτίνης πρωτεϊνών σε κύτταρα TPC1 πριν (0 h) και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με siPDPN και τον έλεγχο siNEG. Γ ανοσοφθορισμού χρώση των πρωτεϊνών podoplanin στα κύτταρα TPC1 επιμολυσμένα με siPDPN και τον έλεγχο siNEG. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-PDPN μονοκλωνικό αντίσωμα D2-40 που ακολουθείται από DyLight549-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (κόκκινο), και αντίθετα με ϋΑΡΙ (μπλε). Μεγέθυνση 1000x. Δ Επίδραση της PDPN στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Α, αριστερό πάνελ. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε σε 24 και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων με TPC1 siPDPN ή ελέγχουν siNEG. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιδραστήριο μίγμα ΧΤΤ και σχηματισμός φορμαζάνης μετρήθηκε στα 450 nm για να προσδιοριστεί ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε quintuplicate. Α, δεξιό πίνακα. Η απόπτωση μετρήθηκε στις 48 ώρες μετά την διαμόλυνση των κυττάρων με TPC1 siPDPN ή ελέγχουν siNEG. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με FITC Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο, που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Οι αντιπροσωπευτικές μετρήσεις του ποσοστού της αννεξίνης V + κύτταρα παρουσιάζονται. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τετραπλούν. Ε Λειτουργία podoplanin στην κυτταρική προσκόλληση. κύτταρα TPC1 επιμολυσμένα με ικανότητα προσκόλλησης siPDPN οθόνη συγκρίσιμες με εκείνες του siNEG-επιμολυσμένα κύτταρα. Εν συντομία, 8000 επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε φρεάτια πλακών 96 φρεατίων. Μετά από επώαση για 24 ή 48 ώρες, οι κυτταρικές μονοστιβάδες πλύθηκαν, μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (Merck, USA). Τα βαμμένα κύτταρα λύθηκαν με επεξεργασία με 2% SDS, στη συνέχεια, η ένταση της χρώσης που απελευθερώνεται ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία στα 550 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός Labsystems Multiscan RC (Thermo Fisher Scientific, Canada). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία διαφορετικά πειράματα.

Η

Μετανάστευση και την εισβολή

Για να αναλύσει τον τρόπο με μειωμένη έκφραση PDPN επηρεάζει το μεταναστευτικό δυναμικό των κυττάρων TPC1, πραγματοποιήσαμε μια

in vitro

μηδέν τραυμάτων δοκιμασία επούλωσης με κύτταρα επιμολυσμένα με siPDPN ή με έλεγχο siNEG. Μια γρατσουνιά έγινε σε μονοστοιβάδες σπαρμένα κύτταρα και τυχόν διαφορές στην επούλωση των πληγών παρακολουθούνταν. Σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, η επούλωση με αυξημένη κυτταρική κινητικότητα βρέθηκε να είναι ταχύτερη για τα κύτταρα ελέγχου από ότι για την

PDPN

-silenced κύτταρα (Σχ. 4Α). Η κινητικότητα των επιμολυσμένων κυττάρων στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης θάλαμο. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μετανάστευση των κυττάρων με μειωμένη

PDPN

σαφώς μεταβληθεί (Σχ. 4Β, αριστερό πάνελ), όντας κατά μέσο όρο 2 φορές χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση του

PDPN

knock-κάτω στην επεμβατική δυναμικό των κυττάρων με τη χρήση της δοκιμασίας εισβολή Matrigel. Σίγηση του

PDPN

γονίδιο βαθιά διαταραγμένη την επεμβατική ικανότητα των TPC1 κύτταρα (Εικ. 4Β, δεξιά πλευρά). Σε κάθε πειραματική εκτελούνται επαναληπτικές, παρατηρήσαμε μια συνεπή και ισχυρή μείωση της ικανότητας εισβολής του

PDPN

-silenced κύτταρα σε σύγκριση με τους ελέγχους ή γονικών TPC1 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ΈΝΑ. Scratch πληγή δοκιμασία επούλωσης. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μικροσκόπιο φωτός που δείχνει την επούλωση των πληγών σε μονοστιβάδες κυττάρων TPC1 επιμολυσμένα με siPDPN ή ελέγχουν siNEG, σε 0 και 24% FBS ως χημειοελκυστικό και μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης μεγέθους πόρου 8-μm χρωματίστηκαν και φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 40x. Η αναλογία των κυττάρων που μεταναστεύουν παρουσιάζεται σε γραφική μορφή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα, **

P

& lt? 0.001. Β, δεξιά πάνελ. Η εισβολής των TPC1 κύτταρα επιμολυσμένα με siPDPN ή τον έλεγχο siNEG αναλύθηκε με την προσθήκη των κυττάρων σε ένα BD BIOCOAT Matrigel εισβολής Επιμελητήριο, 8-μm. Η κάτω δεξαμενή πληρώθηκε με 10% FBS ως χημειοελκυστικό και μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μετακινηθεί μέσω του Matrigel στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και το φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 40x. Η αναλογία των μεταστατικών κυττάρων παρουσιάζεται σε γραφική μορφή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα, ***

P

& lt?. 0.0001

Η

Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι podoplanin δρα ως proinvasive