Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν μέσα σε ένα 3D μικροπεριβάλλον είναι σε θέση να εκδώσει είτε μεσεγχυματικά είτε amoeboid λειτουργία της μετανάστευσης. Αμοιβαδοειδή μετανάστευση χαρακτηρίζεται από διόγκωση της μεμβράνης που εξαρτάται από τις τελεστές Rho, ROCK1 /2. Εντοπίζουμε LIMK2 ως το προτιμώμενο υπόστρωμα για ROCK1 αλλά διαπιστώνουν ότι LIMK2 δεν προκάλεσε διόγκωση της μεμβράνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα μονοπάτι LIMK2 δεν εμπλέκεται στη μετανάστευση amoeboid-mode. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, μυθιστόρημα FRET δεδομένα καταδεικνύουν μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 στο πολωμένο, αλλά δεν διόγκωση των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ένα συγκεκριμένο ρόλο για την ROCK1:. LIMK2 μονοπάτι στη μετανάστευση μεσεγχυματικά-mode

Παράθεση: Shea KF, Wells CM, Garner AP, Jones GE (2008) ROCK1 και LIMK2 Interact στη Spread αλλά όχι διόγκωση καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 3 (10): e3398. doi: 10.1371 /journal.pone.0003398

Επιμέλεια: Carl-Philipp Heisenberg, Ινστιτούτο Max Planck της Βιολογίας Κυττάρου Μοριακής Γενετικής, Γερμανία

Ελήφθη: 8 Ιουλίου του 2008? Αποδεκτές: 16 του Σεπτεμβρίου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 14 Οκτωβρίου 2008

Copyright: © 2008 Shea et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο Ιατρικής Έρευνας (MRC), και την ανάθεση μιας υπόθεσης υποτροφία από BBSRC /AstraZeneca plc

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετάσταση του καρκίνου του μαστού εξαρτάται από τη μετανάστευση των κυττάρων, μια σύνθετη διαδικασία ρυθμίζεται στο χώρο, καθώς και χρονικά από την οικογένεια Rho ΘΤΡάσες Rho, Rac και Cdc42 [1]. Αυτές οι ΟΤΡάσες αποσπάσει μια απόκριση σε εξωκυτταρικά σήματα στην κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσω μιας ποικιλίας πρωτεΐνες τελεστές. Σε μια 3D μικροπεριβάλλον καρκινικά κύτταρα μπορούν να υιοθετήσουν τόσο μεσεγχυματικά και amoeboid όπως μεταναστευτικών φαινότυποι [2]. Αμοιβαδοειδή μετανάστευση χαρακτηρίζεται από διόγκωση μεμβράνη [3] – [5] μια εξειδικευμένη μορφή κυτταρικού προεξοχή η οποία είναι αναστρέψιμη και μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της κυτταρικής μετανάστευσης ή κατά την έναρξη της κυτοκίνησης [6]. διόγκωση της μεμβράνης έχει αποδειχθεί ότι προκαλείται από Rho πρωτεΐνη τελεστή ROCK [7] και amoeboid-σαν κίνημα εξαρτάται πλήρως από την αλληλεπίδραση μεταξύ Rho και ROCK [2], [5].

ROCK-1 και ROCK -2 είναι κινάσες σερίνης /θρεονίνης οι οποίες έχουν έναν αριθμό κυτταρικών υποστρωμάτων συμπεριλαμβανομένων μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας και LIM κινάσης (ΙΙΜΚ) [8]. ROCK-εξαρτώμενη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων είναι γνωστό να οδηγείται από ακτομυοσίνης συσπάσεις [9], [10]. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν ROCK εξαρτάται καρκινικών κυττάρων amoeboid μετακίνηση απαιτεί ROCK:. Αλληλεπίδραση ΙΙΜΚ

Ενεργός πρωτεΐνες ΙΙΜΚ φωσφορυλιώνει και απενεργοποιούν το F-ακτίνη πρωτεΐνη αποκοπής, κοφιλίνη και αυτό παρέχει έναν εναλλακτικό μηχανισμό για τη σηματοδότηση Rho-ROCK να μεσολαβήσει τα αποτελέσματά του στην κυτταροσκελετό F-ακτίνης [11]. σηματοδότηση ROCK-ΙΙΜΚ θεωρείται ότι προάγει την οπισθοχώρηση της νευρίτες μέσω της ρύθμισης της δραστηριότητας κοφιλίνη [12]. Επιπλέον, ένας ρόλος για τις πρωτεΐνες ROCK και ΙΙΜΚ στους ανθρώπινη επιδερμίδα έχει ταυτοποιηθεί [13]. Η αναστολή της δραστικότητας κοφιλίνη από ROCK-ΙΙΜΚ φαίνεται ότι απαιτείται για την κυτταρική συμπίεση όπου μια μείωση στην δραστηριότητα ΙΙΜΚ οδηγεί σε αύξηση της δραστηριότητας κοφιλίνη και μια μείωση στην κυτταρική συμπίεσης [13].

Μια αύξηση των επιπέδων ROCK έχει ανιχνευθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [14] – [16] και τα επίπεδα των ΙΙΜΚ-1 αύξηση στη διεισδυτική και μεταστατική μαστού και του προστάτη κυτταρικές γραμμές [17], [18]. Ως εκ τούτου, προσπαθήσαμε να κατανοήσουμε καλύτερα τη συμβολή ενός ROCK:. Αλληλεπίδραση ΙΙΜΚ για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων με την απεικόνιση της χωρικής αλληλεπίδρασης μεταξύ ROCK και ΙΙΜΚ σε κύτταρα καρκίνου του μαστού που παρουσιάζουν τόσο τα μεσεγχυματικά και amoeboid (διόγκωση) μορφολογίες

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Anti-ROCK1 αγοράστηκε από την Transduction Laboratories, Anti-LIMK2, αντι-φωσφο-LIMK1 /2 (Thr508 /Thr505) από την Cell Technology σηματοδότηση. Συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα από DAKO και Alexa-φαλλοειδίνη από την Molecular Probes. Τα πλασμίδια έκφρασης που κωδικοποιούν GFP, ΚΑΠ, YFP και mRFP1 ετικέτα LIMK1, LIMK2 και ROCK1 παρήχθησαν χρησιμοποιώντας τη Gateway Technology ™ (Invitrogen) και όλα τα πλασμίδια αλληλουχήθηκαν. Η Y27632 αναστολέας ROCK αγοράστηκε από την Calbiochem.

Cell Culture

MDA-ΜΒ231 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM (Sigma) συμπληρωμένο με 10% FBS (Helena Biosciences), L-γλουταμίνη και 100 U /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen)

Η φωσφορυλίωση δοκιμασία

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ40 ρυθμιστικό λύσης (1% ν /ν ΝΡ40?. 50 mM HEPES ρΗ 7.5? 0.5% β /ο δεοξυχολικό νάτριο? 150 mM NaCl? 1 mM EDTA). Τα δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν. Αυτοραδιογραφήματα σαρώθηκαν και ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού της Adobe. Σημαίνει και S.E.M. τιμές υπολογίστηκαν από τα δεδομένα του 3 ανεξάρτητων πειραμάτων

Ανοσοφθορισμός και ανάλυση

κύτταρα εμβολιάζονται σε γυάλινες καλυπτρίδες καθηλώθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη:. PBS και περατά με 0,2% Triton Χ-100: PBS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με TRITC-συζευγμένο φαλλοϊδίνη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Εικόνες από κύτταρα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 συνεστιακό λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο (Welwyn Garden City, Ηνωμένο Βασίλειο) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Adobe Photoshop 7.0 ™. Το αντιστοιχισμένο Student t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή για p ≤ 0,05

FRET: FLIM Μικροσκοπία

Τα κύτταρα με μικροένεση με τα κατάλληλα πλασμίδια 24 ώρες πριν από τον καθορισμό. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν όπως ανωτέρω και επωάστηκαν με φρέσκο ​​βοροϋδρίδιο νατρίου (1 mg /ml σε PBS) για την απόσβεση του φθορισμού υποβάθρου όπως περιγράφηκε προηγουμένως. FLIM διεξήχθη σε πολυφωτονικών μικροσκόπιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. FLIM ανάλυση για τον υπολογισμό GFP διάρκεια ζωής και FRET αποδοτικότητα διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό TRI2 [19]. Ο αριθμός των pixels για κάθε τιμή απόδοσης FRET ελήφθησαν από TRI2 και ομαλοποιήθηκε με διαιρεμένο με το άθροισμα των pixels για την εικόνα αυτή. Αυτή η κανονικοποιημένη αριθμό pixel είχε κατά μέσο όρο πάνω από έξι κύτταρα ανά συνθήκη και, στη συνέχεια, συναρτήσει της απόδοσης FRET να δημιουργήσει FRET ιστογράμματα απόδοσης.

Αποτελέσματα

ROCK1 φωσφορυλιώνει LIMK1 και LIMK2 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού

Ένας αριθμός εργαστηρίων έχουν προτείνει ότι ROCK μπορεί να φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν LIMK1 και LIMK2 [20] – [26] και, επομένως, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν αυτή είναι η ίδια για τα κύτταρα MDA-MB231. Η προ-επώαση με τον αναστολέα Y27632 ROCK μείωσε το επίπεδο της φωσφορυλίωσης LIMK2 σε κύτταρα με ενδογενείς και υπερεκφράζεται CFP-ROCK1. Σε αντίθεση, Y27632 μειώνει την αναλογία της φωσφο προς το σύνολο LIMK1 σε κύτταρα με υπερεκφράζεται CFP-ROCK1 αλλά όχι σε εκείνους με ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης ROCK (Εικ. 1). Η επεξεργασία των κυττάρων με Y27632 προκάλεσε μια μικρή μείωση στα επίπεδα υπερέκφρασης LIMK1 και LIMK2 (Εικ. 1Α και Β). Ωστόσο, ενώ η φωσφορυλίωση LIMK2 είναι πάντα ευαίσθητη σε δραστηριότητα ROCK LIMK1 φωσφορυλίωση είναι ευαίσθητη μόνο για δραστηριότητα ROCK όταν ΚΑΠ-ROCK1 υπερεκφράζεται. Έτσι, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του ROCK1 μεταβάλλει το επίπεδο της φωσφορυλίωσης τόσο LIMK1 και 2, αλλά δείχνουν ότι LIMK2 είναι το προτιμώμενο υπόστρωμα των ROCK1 σε αυτά τα κύτταρα.

Α) και Β) CFP-LIMK1 ή 2 και είτε ΚΑΠ-ROCK1 ή CFP και μόνο επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα MDA-ΜΒ231 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ Y27632 για 24 ώρες. Τα προκύπτοντα προϊόντα λύσης ανοσοστυπώθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ΙΙΜΚ, -LIMK1, -LIMK2 και -ROCK1 αντισώματα. (NSB = μη ειδική δέσμευση του αντισώματος αντι-ROCK1 σε μία πρωτεΐνη /s στα 220 kDa). Γ) Αναλογία φωσφο /συνολική LIMK1 ΚΑΠ-LIMK1 και D) Αναλογία φωσφο /σύνολο LIMK2. (* = P & lt? 0,05).

Η

ROCK1 αλλά όχι LIMK2 induces διόγκωση στα καρκινικά κύτταρα του μαστού

Βρήκαμε ότι ενώ η υπερέκφραση της GFP μόνη της προκαλεί μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση του αριθμός κυττάρων διόγκωση υπερέκφραση του GFP-ROCK1 προκαλεί μία εξαιρετικά σημαντική αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων διόγκωση (Εικ. 2Α και Β). Αν και δεν φαίνεται πριν σε κύτταρα MDA-ΜΒ231 αυτό έχει αναφερθεί σε άλλους τύπους κυττάρων [9], [27] – [30]. Σε αντίθεση υπερέκφραση του GFP-LIMK2 δεν προκάλεσε υψηλό επίπεδο διόγκωση μεμβράνης, είδαμε επίσης καμία ένδειξη κυτταρικού διόγκωση εξής υπερέκφραση LIMK1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε όλες τις περιπτώσεις διόγκωση κύτταρα είχαν μια άθικτη πυρήνα που δεν έκανε θραύσμα (Σχ. 2Α) που δείχνει ότι αυτό δεν μεμβράνη διόγκωση που σχετίζεται με την απόπτωση [31].

Α) κύτταρα MDA-ΜΒ231 επιμολύνθηκαν με GFP-ROCK1 ή GFP-LIMK2, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Alexa Fluor 594-φαλλοειδίνη και DAPI. 150 κύτταρα πάνω από 3 ανεξάρτητα πειράματα βαθμολογήθηκαν για την ορατή διόγκωση +/- s.e.m. P & lt? 0,05? *** P & lt? 0.001. Β) Εκπρόσωπος εικόνες από διαφορετικές οπτικές τομές ενός κυττάρου διόγκωση υπερεκφράζουν GFP-ROCK1. (Bar = 20 μm).

Η

ROCK1 και LIMK2 δεν αλληλεπιδρούν σε διόγκωση καρκινικών κυττάρων του μαστού

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 αλλά δείχνουν ότι αυτή η αλληλεπίδραση δεν εμπλέκεται στη διόγκωση της μεμβράνης. Επιδιώξαμε να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση με την άμεση απεικόνιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ ROCK1 και LIMK2 στα κύτταρα διόγκωση και μη διόγκωση χρησιμοποιώντας FRET: FLIM μικροσκόπιο. Η μέθοδος αυτή δεν επιτρέπει μόνο μια αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 να ανιχνευθεί, αλλά και ο εντοπισμός μιας τέτοιας αλληλεπίδρασης που θα καθοριστεί χωρικά σε ολόκληρη κυττάρου. Για να συγκρίνετε την αλληλεπίδραση των ROCK1 και LIMK2 στην εξάπλωση και την διόγκωση των κυττάρων που χρησιμοποιούνται για μικροένεση έως μέτρια το επίπεδο έκφρασης ROCK1. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο η πλειονότητα των κυττάρων, (63%), παρουσίασαν εξάπλωση /πολωμένο μορφολογία, με μικρότερο αριθμό κυττάρων διόγκωση (23%). Σε κύτταρα διόγκωση εντοπίσαμε κανένα FRET μεταξύ GFP-ROCK-1 και mRFP-ΙΙΜΚ-2 (Εικ. 3).

κύτταρα MDA-MB231 μικροεγχύθηκαν με GFP-ROCK1 και mRFP-LIMK2, σταθερό, απεικόνιση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FLIM μικροσκοπία και το πρόγραμμα ανάλυσης TRI2. Α) Οι εικόνες της ζωής GFP και GFP και mRFP εντάσεις σε ένα τυπικό κύτταρο διόγκωση εκτέθηκε για ένα κύτταρο που εκφράζει τόσο ο δότης GFP-ROCK1 και το mRFP-LIMK2 δέκτη και για σύγκριση, μόνο η GFP -ROCK1 δότη. Β) Ιστόγραμμα του αριθμού των κανονικοποιημένων αριθμούς pixel ανιχνεύεται σε κάθε διάρκεια ζωής GFP. n = 9.

Η

ROCK1 και LIMK2 αλληλεπιδρούν σε πολωμένα κύτταρα καρκίνου του μαστού

Αφού διαπιστώθηκε ότι ROCK1 και LIMK2 δεν αλληλεπιδρούν με κύτταρα διόγκωση αναλύσαμε τον εντοπισμό και την αλληλεπίδραση των ROCK1 και LIMK2 στα κύτταρα εξάπλωση. Σε κύτταρα εξάπλωση η πλειονότητα της έκφρασης LIMK2 και ROCK εντοπίζεται στην κυτταρόπλασμα, αλλά η έκφραση και των δύο πρωτεϊνών μπορεί να ανιχνευθεί στον πυρήνα (Εικ. 4). Σε MDA-MB231 κυττάρων με την εξάπλωση /πολωμένο φαινότυπο ανιχνεύσαμε μειωμένη διάρκεια ζωής GFP όταν ROCK1 και LIMK2 ήταν συν-εκφράζεται, δείχνοντας ότι ROCK1 και LIMK2 αλληλεπιδρούν με κύτταρα εξάπλωση (Εικ. 4). Η μείωση GFP ζωής φαίνεται σε όλη την κυτταρόπλασμα σε μια κατανομή στικτή. Σε σύγκριση, δύο πολωμένα κύτταρα με μικροένεση με μόνο GFP-ROCK1 δεν εμφανίζουν οποιαδήποτε μείωση στην GFP διάρκεια ζωής (Εικ. 4). Δεν υπάρχει σημαντική πτώση της GFP διάρκεια ζωής κάτω από τα επίπεδα ελέγχου, όταν τα κύτταρα που εκφράζουν ROCK1 και LIMK2 προ-επωάζονται με τον αναστολέα ROCK Y27632 (Σχήμα 4). Είναι ενδιαφέρον, σε πολλά κύτταρα υπάρχει έλλειψη οποιασδήποτε ανιχνεύσιμης αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 στην περιφέρεια των κυττάρων (επισημαίνεται από βέλη στο Σχ. 4).

κύτταρα MDA-MB231 μικροεγχύθηκαν με GFP-ROCK1 και mRFP- LIMK2, σταθερό, απεικόνιση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FLIM μικροσκοπία και το πρόγραμμα ανάλυσης TRI2. Α) Οι εικόνες της ζωής GFP και GFP και mRFP εντάσεις σε ένα τυπικό επίμηκες κυττάρων που εμφανίζεται για ένα κύτταρο που εκφράζει τόσο ο δότης GFP-ROCK1 και το mRFP-LIMK2 δέκτη και για σύγκριση, μόνο η GFP -ROCK1 δότη. Β) Ιστόγραμμα του αριθμού των κανονικοποιημένων αριθμούς pixel ανιχνεύεται σε κάθε διάρκεια ζωής GFP. Γ) Ένα ιστόγραμμα του μέσου αριθμού των κανονικοποιημένων αριθμούς pixel ανιχνεύονται σε κάθε ζωή GFP σε κύτταρα που εκφράζουν τόσο GFP-ROCK1 δότη και mRFP-LIMK2 δέκτη σε κύτταρα του επιμήκους ή διόγκωση μορφολογίες κατασκευάστηκε μαζί με κύτταρα που εκφράζουν μόνο το δότη GFP-ROCK1. 18 κύτταρα πάνω από τρία ανεξάρτητα πειράματα απεικονίστηκαν για κάθε χρονικό σημείο. Δ) Ένα ιστόγραμμα του αριθμού των κανονικοποιημένων αριθμούς pixel ανιχνεύεται σε κάθε διάρκεια ζωής GFP για κύτταρα που εκφράζουν τόσο GFP-ROCK-1 δότη και mRFP-ΙΙΜΚ-2 δέκτη σε κύτταρα MDA-ΜΒ231 προεπεξεργασία με Y27632. n = 9.

Η

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες δεν είχαν προσδιοριστεί αν ένα ROCK: οδός ΙΙΜΚ συνέβαλε στην πρόκληση της διόγκωση της μεμβράνης. Παρέχουμε εδώ για πρώτη φορά ενδείξεις για άμεση και συγκεκριμένη αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και ΙΙΜΚ 2 σε καλά εξαπλωθεί μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία είναι απούσα σε στρογγυλεμένες κύτταρα διόγκωση. Χρησιμοποιώντας FRET μικροσκοπία βρήκαμε καμία αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK-1 και ΙΙΜΚ-2 σε κύτταρα τα οποία εμφάνισαν φαινότυπο διόγκωση μεμβράνη, παρά τα δικά μας αποδείξεις ότι LIMK2 είναι το προτιμώμενο υπόστρωμα ROCK στα κύτταρα αυτά. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα ROCK1: LIMK2 αλληλεπίδραση δεν συμμετέχει στη διόγκωση /στρογγυλεμένες φαινότυπο και δεν θα απαιτείται για amoeboid μετανάστευσης. Πράγματι, η υπερέκφραση του LIMK2 δεν προκαλεί διόγκωση της μεμβράνης στα κύτταρα. Πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν ότι η κυτταρική γεγονότα κατάντη της ενεργοποίησης ROCK είναι πράγματι ξεχωριστά συντονίζονται αν MLC και φωσφορυλίωση κοφιλίνη [32].

Σε αντίθεση με τις μελέτες FRET μας εντόπισε μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 σε συμπυκνωμένη εστίες στο κυτταρόπλασμα του καρκίνου κυττάρων με ένα μεσεγχυματικά μορφολογία. Η φωσφορυλίωση του ΙΙΜΚ-2 από ROCK-1 στο κέντρο κύτταρο θα αυξήσει το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης κοφιλίνη, μειώνοντας έτσι F-ακτίνης αποκοπής. Αυτό θα σταθεροποιήσει τα νημάτια ακτομυοσίνης που υπάρχουν στο κυτταρικό σώμα και να προωθήσει την παραγωγή της συσταλτικής δύναμης που είναι απαραίτητη για συστολής ουράς και τη μετανάστευση των κυττάρων [33]. Πράγματι, έχει προηγουμένως δειχθεί ότι ο σχηματισμός ινιδίων του στρες που προκαλείται από ΤΟΡ ακτίνης διαμεσολαβείται από ένα βράχο-1 /ΙΙΜΚ-2 /κοφιλίνη μονοπάτι [26]. Πρόσφατα, ένας βράχος: LIMK1 οδός είχε εμπλακεί στο συντονισμό των δραστηριοτήτων κοφιλίνη στην πλασματική μεμβράνη των μεταστατικών κυττάρων καρκινώματος μαστού αρουραίου [34], [35]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια ξεχωριστή λειτουργία για την LIMK1 και LIMK2 κατάντη του ROCK κατά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Υποθέτουμε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην μεμβράνη που συνδέεται διόγκωση κυτταρική μετανάστευση ούτε στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης κοφιλίνη στο κύτταρο περιφέρεια. Μάλλον η αλληλεπίδραση μεταξύ ROCK1 και LIMK2 περιορίζεται στο κυτταρικό σώμα του πολωμένου κυττάρων καλά εξάπλωση όπου συμβάλλει στη σταθεροποίηση των νημάτων ακτομυοσίνης και την παραγωγή συσταλτικής δύναμης μέσω αδρανοποίησης των κοφιλίνη.