Αφηρημένο

Ιστορικό

Το ογκοκατασταλτικό ομοπεδίου-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης κινάσης 2 (HIPK2) με φωσφορυλίωση σερίνης 46 (Ser46) είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της λειτουργίας ρ53 αποπτωτικών. HIPK2 είναι επίσης ένας μεταγραφικός συν-καταστολέα της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα-1α (HIF-1α) αγγειογένεση συγκράτησης όγκου και χημειοαντίσταση. HIPK2 μπορεί να απελευθερωθεί σε όγκους από διάφορους μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένων υποξία. Εδώ, επιδιώξαμε να στοχεύουν υποξία, με την αποκατάσταση της λειτουργίας HIPK2 και την καταστολή του HIF-1α, προκειμένου να προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία για τη συμμετοχή και των δύο HIPK2 και p53 στην αντιμετώπιση υποξία που προκαλείται από χημειοαντίσταση.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

κατά την έκθεση του παχέος εντέρου και του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων στην υποξία, είτε από χαμηλή οξυγόνο ή κοβάλτιο, λειτουργία HIPK2 ήταν μειωμένη επιτρέποντας την αυξημένη έκφραση HIF-1α και την αναστολή της ρ53-αποπτωτική απόκριση στο φάρμακο. Cobalt κατέστειλε την πρόσληψη HIPK2 πάνω υποστηρικτής HIF-1α. Η υποξία επάγεται η έκφραση του ΜΌΜ2 στόχου p53 που ρυθμίζει προς τα κάτω HIPK2, έτσι MDM2 αναστολή από siRNA αποκατέστησε το HIPK2 /p53Ser46 απόκριση στο φάρμακο. συμπληρώματα ψευδαργύρου σε κύτταρα υποξία επεξεργασμένα αυξημένη σταθερότητα της πρωτεΐνης HIPK2 και πυρηνική συσσώρευση, οδηγώντας σε αποκατάσταση της πρόσδεσης HIPK2 να HIF-1α υποκινητή, καταστολή του MDR1, Bcl2, και τα γονίδια VEGF, και ενεργοποίηση της απόκρισης της ρ53 αποπτωτικό στο φάρμακο. Συνδυασμός ψευδαργύρου και ADR έντονα κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

αναστέλλοντας HIF-1 μονοπατιού και προς τα πάνω ρύθμιση p53 αποπτωτικών γονιδίων στόχων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Δείχνουμε εδώ για το πρώτη φορά ότι η υποξία που προκαλείται από HIPK2 απορρύθμισης ήταν εξουδετερώθηκαν από τον ψευδάργυρο που αποκαταστάθηκε καταστολή HIPK2 του HIF-1 μονοπατιού και επανενεργοποιήθηκε p53 αποπτωτική απόκριση σε ναρκωτικών, υπογραμμίζοντας την πιθανή χρήση των συμπληρωμάτων ψευδαργύρου σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία για την αντιμετώπιση της υποξίας και να βελτιώσει τη θεραπεία των όγκων.

Παράθεση: Nardinocchi L, puca R, Sacchi Α, Rechavi G, Givol D, D’Orazi G (2009) Στόχευση υποξία στα καρκινικά κύτταρα αποκαθιστώντας ομοπεδίου πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης-κινάση 2 και p53 Δραστηριότητα και την καταστολή HIF-1α. PLoS ONE 4 (8): e6819. doi: 10.1371 /journal.pone.0006819

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Ιούλ 2009? Αποδεκτές: 3 Αυγούστου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 28 Αυγούστου 2009

Copyright: © 2009 Nardinocchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Grant από Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (GDO) και τους συνοδούς Ιατρικό Ινστιτούτο πτήσης Ερευνών (FAMRI) (GR)? RP έχει υποστηριχθεί από μια υποτροφία από το Ίδρυμα ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro -FIRC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στερεά όγκοι μπορεί να επιβιώσει κατάσταση υποξική (την υψηλή πυκνότητα των κυττάρων ενός όγκου περιορίζει τη διαθεσιμότητα του οξυγόνου. σε κύτταρα) με τη χρήση προστατευτικών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα-1α (HIF-1α) ένα παράγοντα μεταγραφής που επάγει, μεταξύ άλλων, αντιαποπτωτικών Bcl2, πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR), η γονιδιακή έκφραση του VEGF, και τον επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού της γλυκόζης που λογαριασμός για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την αγγειογένεση, και χημειοαντίσταση [1]. Επιπλέον, η υποξία εξασθενεί την απόκριση του oncosuppressor ρ53 σε κυτταρικές βλάβες. [2] Η πρωτεΐνη ρ53 παίζει σημαντικό ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης, την κυτταρική επισκευή, και κυτταρικό θάνατο, οι οποίες ελαχιστοποιούν τη διάδοση κακοήθων κυττάρων [3]. Η λειτουργία του p53 ως ογκοκατασταλτικό συνδέεται με την δραστηριότητα της ως παράγοντα μεταγραφής μέσω μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που επιτρέπουν την πρωτεΐνη να ξεφύγουν από τον έλεγχο MDM2, συσσωρεύονται, και να γίνει ενεργό [4]. Το γονίδιο p53 είναι μεταλλαγμένο στο -50% των ανθρώπινων καρκίνων, ενώ, σε καρκίνους που φέρουν άγριου τύπου (wtp53), η δραστηριότητά της μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο από άλλους μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένων απορρύθμιση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών [5], [6].

ομοπεδίου αλληλεπιδρώσες πρωτεϊνική κινάση-2 (HIPK2) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της λειτουργίας ρ53 αποπτωτικό, έτσι έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι HIPK2 φωσφορυλιώνει την ρ53 στη σερίνη 46 (Ser46) μετά από σοβαρή βλάβη του DNA, επάγοντας ρ53 ειδική αποπτωτική μεταγραφική δραστηριότητα [7] – [9]. Φωσφορυλίωση σε αυτό το site είναι μια καθυστερημένη εκδήλωση μετά από σοβαρές βλάβες στο DNA και συγκεκριμένα ρυθμίζει ρ53 απόπτωση μέσω, για παράδειγμα, προς τα πάνω ρύθμιση της γονιδιακής p53AIP1 αντί του κυτταρικού κύκλου συνελήφθη σχετικό γονίδιο και την έκφραση του γονιδίου MDM2 [10], [11]. Ένα σημαντικό αυτόματη ρυθμιστική, αρνητική ανάδραση βρόχου της ρ53 περιλαμβάνει την επαγωγή ΜΌΜ2 ρ53-εξαρτώμενη ότι με τη σειρά του συνδέεται και απενεργοποιεί το ρ53 με οδήγηση σε υποβάθμιση του πρωτεασώματος [12] – [14]. Από αυτή την άποψη, έχουμε δείξει ότι η αναστολή HIPK2 εξουδετερώνει MDM2 διάσωση δραστικότητα ρ53 μεταγραφής και αποπτωτική λειτουργία [15]. Συνεπώς, παράγοντες όπως HIPK2 που μπορούν να αυξήσουν δραστική ρ53 σε καρκινικά κύτταρα με εμποδίζουν την αλληλεπίδραση MDM2-p53 θα μπορούσε να έχει θεραπευτική χρησιμότητα στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων όγκου σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία.

HIPK2 είναι επίσης ένας μεταγραφικός συνεργασία καταστολέα συχνά σε πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο με άλλους συν-καταστολείς, όπως Groucho και hystone δεακετυλάσης 1 (HDAC1) [16]. Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι HIPK2 συν-καταστέλλει την υποξία παράγοντα-1α (HIF-1α) παράγοντα μεταγραφής συγκράτηση HIF-1-επαγόμενη αγγειογένεση όγκου και χημειοαντίσταση [17]. Έτσι, η αναστολή του HIF-1α δραστηριότητα με HIPK2 μειώνει VEGF, MDR1, και Bcl2 έκφραση και διεγείρει προκαλούμενη από φάρμακο απόπτωση σε ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη τρόπους [18]. Με δεδομένο τον κεντρικό ρόλο της στη στόχευση των κυττάρων προς την απόπτωση κατά γονοτοξικό στρες, η ρύθμιση της HIPK2 έχει αποτελέσει αντικείμενο έντονης έρευνας τα τελευταία χρόνια. HIPK2 βρέθηκε downmodulated σε θυρεοειδούς, μαστού [19] και του κόλου [20] σε σύγκριση με τις αντίστοιχες κανονικές ιστούς? μεταλλαγμένο μέσα στο σήμα κατακράτησης κηλίδων στο ανθρώπινο οξεία μυελοβλαστική λευχαιμία και σε μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο [21]? και εντοπισμένα στο κυτταρόπλασμα από την ομάδα υψηλής κινητικότητας Α1 (HMGA1) υπερέκφραση [22]. HIPK2 είναι ένα ασταθές πρωτεΐνη που διασπάται μέσω της οδού πρωτεασώματος ιδίως πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι μπορούν να HIPK2 downmodulated με ρ53 προκαλούμενη MDM2 [23] και από την υποξία προκαλούμενη πρωτεΐνες Siah2 [24]. Έχουμε δείξει πρόσφατα ότι HIPK2 νοκ ντάουν επάγει p53 misfolding που μπορεί να αναστραφεί με συμπληρώματα ψευδαργύρου [25], [26]. Ως εκ τούτου, όλες οι συνθήκες που οδηγούν σε HIPK2 απορρύθμιση θα καταλήξει σε μια πολυπαραγοντική απόκριση οδηγώντας σε χημειοαντίσταση όγκου με έντονα επηρεάζουν ρ53 μεταγραφική δραστηριότητα και την απόπτωση, αφενός, και δραστικότητα HIF-1 από την άλλη πλευρά. Ως εκ τούτου, η κατανόηση του τρόπου με τον μειωτικά HIPK2 θα μπορούσε να επανενεργοποιηθεί μπορεί να οδηγήσει σε νέες στρατηγικές τόσο συγκρατήσει HIF-1 μονοπάτι και να αποκαταστήσουν δραστηριότητα p53 να ξεπεράσει την αντίσταση των ναρκωτικών. Αυτό είναι επίσης σύμφωνο με τα πρόσφατα έργα που έχουν δείξει ότι η θεραπεία του καρκίνου με αντι-αγγειογενετική παράγοντες μπορεί να οδηγήσει σε υποξία που επιλέγει για το ραδιόφωνο και την ανθεκτικότητα στα φάρμακα, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για την αντιμετώπιση της υποξίας όγκου στον καρκίνο [27].

ο ψευδάργυρος είναι ένα σημαντικό συμπαράγοντα για δραστικότητα δέσμευσης DNA του ρ53, όπως μερικοί μεταλλάξεις ρ53 που διαταράσσουν την τοποθεσία σύνδεσης ψευδαργύρου στο αποτέλεσμα του ρ53 στην απώλεια της σύνδεσης DNA [28]. Ο ψευδάργυρος είναι ένα ιχνοστοιχείο που είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων και είναι ένας συμπαράγοντας για τη δομή και λειτουργία της ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων ενζύμων, μεταγραφικών παραγόντων, και δομικές πρωτεΐνες [29]. Έτσι, ο ψευδάργυρος αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την πρόοδο των πολλών διαδικασιών σηματοδότησης σε ευκαρυωτικά και απορρύθμιση του μεταβολισμού της μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου [30]. Η θεραπεία με ψευδάργυρο έδειξε να έχει πραγματικές δυνατότητες κλινική, μειώνοντας την ανάπτυξη του όγκου και την επιθετικότητα με περιορισμένη βιοτοξικότητα, για παράδειγμα στον καρκίνο του προστάτη [31].

Ο σκοπός της έρευνας μας ήταν να αξιολογηθεί κατά πόσον η υποξία μπορεί να απορρυθμίσει την HIPK2- που προκαλείται από ρ53 εξαρτάται αποπτωτική μεταγραφική δραστηριότητα για την αντιμετώπιση των ναρκωτικών και, επομένως, συμβάλλουν στην χημειοαντίσταση και κατά πόσον ο ψευδάργυρος μπορεί να εξουδετερώσει αυτή την HIPK2 /p53Ser46 αναστολή. Βρήκαμε ότι η έκθεση των καρκινικών κυττάρων στην υποξία, είτε από χαμηλή οξυγόνο ή κοβάλτιο, ανέστειλε p53Ser46 φωσφορυλίωση και ρ53 αποπτωτική μεταγραφική δραστικότητα σε απόκριση στο φάρμακο. Αυτή η αναστολή ήταν η συνέπεια της HIPK2 μειορύθμιση οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην υποξία-επαγόμενη MDM2 αυξητική ρύθμιση. Από την άλλη πλευρά, το κοβάλτιο ανέστειλε την πρόσληψη HIPK2 πάνω υποκινητή HIF-1α. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η συμπλήρωση ψευδαργύρου σε κύτταρα υποξία επεξεργασμένα παρεμπόδισαν την αναστολή της HIPK2 επιτρέποντας πυρηνική συσσώρευση του που συσχετίζεται με HIF-1α προς τα κάτω ρύθμιση και καταστολή της οδού HIF-1 και με την αποκατάσταση της αποπτωτικής p53Ser46 μεταγραφική δραστικότητα σε απόκριση στο φάρμακο. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υποξία-κατάσταση μπορεί να επηρεάσει την οδό HIPK2 /p53Ser46, ιδίως δείχνουμε εδώ για πρώτη φορά, ότι ο ψευδάργυρος μπορεί να εξουδετερώσει την υποξία προκαλούμενη αναστολή HIPK2. Δεδομένου ότι οι όγκοι περιέχουν περιοχές με συνθήκες υποξίας, όπου wtp53 είναι ανενεργό, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την πιθανή χρήση των συμπληρωμάτων ψευδαργύρου στη χημειοθεραπεία στη θεραπεία των όγκων με μη λειτουργία wtp53 ή HIPK2.

Αποτελέσματα

κυττάρων έκθεσης σε κοβάλτιο καταργεί την μεταγραφή ρ53 αποπτωτικό-γονιδίου και μειώνει την πρόσληψη HIPK2 πάνω υποκινητή HIF-1α

Ζητήσαμε αν χλωριούχο κοβάλτιο (COCI

2), ότι σταθεροποιεί HIF-1α και επάγει HIF-1 γονιδίων που αποκρίνονται με κινητική παρόμοια με εκείνη της υποξίας [32], θα μπορούσαν να επηρεάσουν γονίδιο p53 αποπτωτική μεταγραφής που προκαλείται από φάρμακα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, κοβάλτιο κατάργησε έντονα τη διάσπαση PARP ADR επαγόμενη φωσφορυλίωση και Ser46. Κοβάλτιο και μόνο που προκαλείται από ρ53 επίπεδα, αν και το έκανε ούτε επάγει φωσφορυλίωση Ser46 ούτε διάσπαση PARP (Σχήμα 1Α). Η μεταγραφική δραστικότητα της ρ53 αποπτωτικό αξιολογήθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, το ADR επαγόμενη p53AIP1-Luc δραστικότητα ήταν σημαντικά μειωμένη από κοβάλτιο, ενώ κοβάλτιο μόνο του δεν επηρεάζει, και

in vivo

ανάλυση των επιπέδων mRNA έδειξαν ότι προκαλούμενη από φάρμακο προς τα πάνω ρύθμιση της ρ53 αποπτωτικό γονίδια TARGET

Bax

και

Puma

έντονα επηρεαστεί από κοβάλτιο (σχήμα 1Γ), όπως φαίνεται και από την αναλογία έκφραση GAPDH. Αντίθετα, είχαμε προηγουμένως δείξει ότι το κοβάλτιο μπορεί να προκαλέσει

MDR1

, και

Bcl2

γονιδιακής έκφρασης [18].

(Α) κύτταρα RKO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CoCl

2 και ADR για 16 ώρες, μόνο του ή σε συνδυασμό. Ίση ποσότητα του ολικού κυττάρου εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western με ειδικά αντισώματα ανίχνευσης φωσφορυλίωσης Ser46 και διάσπαση PARP (βέλη: διασπασμένο και διασπασμένης μορφής)? συνολικού ρ53 δείχνεται επίσης. Αντι-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (Β) κύτταρα RKO, σταθερά επιμολυσμένα με p53AIP1-Ιυο ανταποκριτή, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CoCl

2 και ADR για 16 ώρες πριν από την προσδιορίστηκε δραστικότητα λουσιφεράσης. RLU: σχετική μονάδα λουσιφεράσης.

Στήλες

, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν?

μπαρ

, Τ.Α. *

P

& lt? 0,01. (C) Συνολική mRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα από κύτταρα RKO σε επεξεργασία με CoCl

2 και ADR μόνο του ή σε συνδυασμό, για 16 ώρες για την PCR αναλύσεις των γονιδίων στόχων του ρ53

Bax

και

Puma

. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. αναλογία Έκφραση προς GAPDH αξιολογήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης. *

P

& lt?. 0.01

Η

Όπως κατάσταση υποξίας προωθεί, τουλάχιστον εν μέρει, την υποβάθμιση πρωτεΐνη HIPK2 [24] ρωτήσαμε αν κοβαλτίου ήταν σε θέση να επηρεάσει ομοίως HIPK2 έκφρασης και δραστηριότητας. Για το σκοπό αυτό, τα επίπεδα πρωτεΐνης HIPK2 εξετάστηκαν σε RKO και Α549 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με CoCl

2 παρουσία ή απουσία του αναστολέα πρωτεασώματος MG132. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, κοβάλτιο μειωτικά επίπεδα πρωτεΐνης HIPK2 που θα μπορούσαν να διασωθούν με κατεργασία MG132. Ανάλυση της έκφρασης του mRNA έδειξαν ότι η γονιδιακή μεταγραφή HIPK2 δεν επηρεάστηκε από κοβάλτιο (Σχήμα 2Β). Εμείς αιτιολογημένη ότι με τη διατήρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης HIPK2 χαμηλά, κοβάλτιο θα μπορούσε να επηρεάσει την πρόσληψη HIPK2 σε υποστηρικτές στόχο, επηρεάζοντας έτσι δραστηριότητα HIPK2 συν-καταστολέα. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό ChIP ενώ χρωματίνη ανοσοσύμπλοκα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-HIPK2 και αντι-ιστόνης 1 (HDAC1) αντισωμάτων αποακετυλάσης και ανάλυση PCR διεξάγεται χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές που πλευρίζουν τον προαγωγό HIF-1α [17]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ (αριστερό πάνελ), το HIPK2 και HDAC1 στρατολόγηση σε

HIF-1α προωθητής

έντονα παρεμποδίζεται από κοβάλτιο. Σαν ένας έλεγχος HIPK2 ειδικότητα σύνδεσης προς το

HIF-1α

υποκινητή, χρησιμοποιήσαμε ειδικούς εκκινητές που καλύπτουν το ανθρώπινο

GAPDH

περιοχή προαγωγού. Όπως αναμενόταν (Σχήμα 2C, δεξιό πλαίσιο), δεν

GAPDH

ενίσχυση παρατηρήθηκε μετά χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση με αντι-HIPK2 και αντι-HDAC1 αντισώματα ενώ μια σαφής ζώνη PCR ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας το γενωμικό DNA ως πρότυπο. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το κοβάλτιο θα μπορούσαν να επηρεάσουν τόσο την δραστικότητα ρ53 και HIPK2.

(Α) και RKO κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με κοβάλτιο για 16 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία αναστολέα πρωτεασώματος MG132 (40 μmol /L για το 6 h) και το όχημα DMSO. Ίση ποσότητα του ολικού κυττάρου εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western με ειδικό αντίσωμα ανίχνευσης ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης HIPK2? αντι-Hsp70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (Β) Συνολική mRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα από RKO και Α549 κυττάρων σε κατεργασία με κοβάλτιο για 16 ώρες για την PCR αναλύσεις της έκφρασης του γονιδίου HIPK2. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. ανάλυση (C) χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (chip) θα εκτελούνται με αντι-HIPK2 και αντι-HDAC1 αντισώματα επί κυττάρων RKO σε επεξεργασία με κοβάλτιο για 8 και 16 ώρες. PCR αναλύσεις διεξήχθησαν επί των ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα DNA χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για την ανθρώπινη

HIF-1α

υποκινητή. Ενίσχυση του

GAPDH

προαγωγό (δεξί πάνελ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος του HIPK2 ειδικότητα σύνδεσης προς το

HIF-1α

υποκινητή. Ένα δείγμα που αντιπροσωπεύει γραμμική ενίσχυση της συνολικής χρωματίνης εισόδου (Input) συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος. Συμπληρωματικούς ελέγχους περιλαμβάνονται ανοσοκαθίζησης που εκτελούνται με μη-ειδικές ανοσοσφαιρίνες (Όχι Ab).

Η

υποξία που προκαλείται από την αναστολή της δραστηριότητας της μεταγραφής p53 μπορεί να επανέλθει από MDM2 εξάντληση

HIPK2 μεσολάβηση p53Ser46 φωσφορυλίωση είναι που προκαλείται από σοβαρή βλάβη του DNA [7] – [9] ότι, σε μια ανάδραση ρυθμιστική βρόχο, ενισχύει τη δραστηριότητα HIPK2 μέσω μιας ρ53-διαμεσολαβούμενη κασπάσης που επάγεται μηχανισμός [33] και επιλεκτικά επάγει αποπτωτικών γονιδίων και αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο σύλληψης που σχετίζονται και τα γονίδια MDM2 [10], [11]. Από την άλλη πλευρά, μία μη σοβαρή πίεση μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIPK2 μέσω ρ53 επαγόμενης από MDM2 αυξητική ρύθμιση [23]. Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν η υποξία θα μπορούσαν να δράσουν ως μη σοβαρή πίεση μπορεί να ενεργοποιήσει p53-στόχο MDM2 και συνεπώς αναστέλλει HIPK2 και προδιαθέτουν για αντοχή στα φάρμακα. Οι αναλύσεις ημι-ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι το κοβάλτιο καθώς και χαμηλή επαγόμενη οξυγόνο αυξορρύθμιση MDM2 (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε κατά πόσον MDM2 ήταν υπεύθυνος για την αναστολή της δραστικότητας της ρ53 αποπτωτικά. Ανάλυση της δραστηριότητας της μεταγραφής ρ53 θεραπεία μετά κοβάλτιο διεξήχθη σε 293 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το p53AIP1-Ιυο ανταποκριτή και είτε HIPK2-Flag ή το σημείο μεταλλαγμένο HIPK2-K1182R-Flag που δεν μπορούν να αποικοδομούνται από MDM2 [23]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ο AIP1-Ιυο δραστικότητα HIPK2 επαγόμενη μειώθηκε σημαντικά από κοβάλτιο, ενώ η K1182R επαγόμενη AIP1-Luc δραστηριότητα δεν άλλαξε. Ανοσοκηλίδωση Western έδειξε ότι η έκφραση HIPK2 μειώθηκε κατά κοβάλτιο, ενώ η έκφραση της αποικοδόμησης ανθεκτικού K1182 μετάλλαγμα δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 3C). Σε συμφωνία, επίσης, η HIPK2 που προκαλείται Ser46 φωσφορυλίωση μειώθηκε κατά κοβάλτιο, ενώ δεν άλλαξε μετά από K1182 υπερέκφραση (Σχήμα 3C). Και τα δύο αποτελέσματα πρότειναν μια συμμετοχή της MDM2 στη ρύθμιση HIPK2 που με τη σειρά τους επηρεάζονται δραστηριότητα p53Ser46. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα RKO αφαιρέθηκαν της συνάρτησης MDM2 με siRNA (Σχήμα 3D) και αυτό εξάντληση MDM2 ήταν επαρκής για να διασώσει ADR επαγόμενη φωσφορυλίωση Ser46 και διάσπαση PARP αναστέλλεται από κοβάλτιο (Σχήμα 3Ε και συγκρίνετε με 1Α). Επιπλέον, η εξάντληση MDM2 παρεμπόδισαν την κοβάλτιο-που προκαλείται από την αναστολή της δραστηριότητας p53AIP1-Luc σε απάντηση ADR (Σχήμα 3F και συγκρίνετε με 1Β). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η υποξία προκαλούμενη αντοχή φαρμάκου ήταν εξαρτάται, τουλάχιστον εν μέρει, στην προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης MDM2 που με τη σειρά ανέστειλε HIPK2 /p53Ser46 αποπτωτική δραστικότητα σε απόκριση στο φάρμακο.

(Α) Συνολική mRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα από RKO και Α549 κυττάρων σε κατεργασία με κοβάλτιο ή 2% O

2 για 16 ώρες για την PCR αναλύσεις της έκφρασης του γονιδίου MDM2. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. κύτταρα (Β) 293 συν-επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης p53AIP1-Ιυο ανταποκριτή και HIPK2-Flag ή K1182R-Flag (MDM2 αποικοδόμηση ανθεκτικά μετάλλαγμα) και 24 ώρες αργότερα σε επεξεργασία με CoCl

2 για 16 ώρες, πριν από την δραστικότητα λουσιφεράσης δοκιμάστηκαν. RLU: σχετική μονάδα λουσιφεράσης.

Στήλες

, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν?

μπαρ

, Τ.Α. *

P

& lt? 0,01. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Β) και μετά την επεξεργασία ίσες ποσότητες των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων υποβλήθηκαν σε Western ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα: αντι-Flag (για την ανίχνευση έκτοπη έκφραση HIPK2-Flag), αντι-Ser46 και αντι-p53 αντισώματα. (D) κύτταρα RKO επιμολύνθηκαν με siMDM2 και 36 ώρες αργότερα ίση ποσότητα των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western με ειδικό αντίσωμα αντι-MDM2. κύτταρα (Ε) RKO επιμολύνθηκαν με siMDM2 και 24 ώρες αργότερα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CoCl

2 και ADR για 16 ώρες. Ίση ποσότητα του ολικού κυττάρου εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western με ειδικά αντισώματα ανίχνευσης φωσφορυλίωσης p53Ser46 και διάσπαση PARP (βέλη δείχνουν διασπασμένο και μη διασπασμένη μορφή)? συνολικού ρ53 δείχνεται επίσης. Αντι-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. κύτταρα (F) RKO, σταθερά επιμολυσμένα με p53AIP1-Ιυο ανταποκριτή, επιμολύνθηκαν με siMDM2 και 24 ώρες αργότερα σε επεξεργασία με CoCl

2 και ADR για 16 ώρες πριν από την προσδιορίστηκε δραστικότητα λουσιφεράσης. RLU: σχετική μονάδα λουσιφεράσης.

Στήλες

, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν?

μπαρ

, SD

Η

Ψευδάργυρος αποκαθιστά ADR επαγόμενη μεταγραφή αποπτωτικό γονίδιο p53 στα κύτταρα του κοβαλτίου-επεξεργασία

Έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η εξάντληση HIPK2 είναι υπεύθυνη για την p53 πρωτεΐνη misfolding που μπορεί να αναστραφεί με συμπληρώματα ψευδαργύρου [25], [26]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε εδώ ότι η υποξία που προκαλείται από HIPK2 απορρύθμιση θα μπορούσε να αντικατοπτρίζει την HIPK2 νοκ ντάουν κατάσταση και ως εκ τούτου να επηρεάσει p53 DNA-δεσμευτικές και μεταγραφικές δραστηριότητες. Βρήκαμε ότι το κοβάλτιο αύξησε την αντιδραστικότητα της ρ53 με το αντίσωμα το Pab240 (μετάλλαξη, εκτυλίχθηκε μορφή ρ53) και μείωσε την δραστικότητα ρ53 με το αντίσωμα Pab1620 (άγριου τύπου, διπλωμένη μορφή) (Σχήμα 4Α) υποδεικνύοντας πρωτεΐνη ρ53 εσφαλμένη αναδίπλωση, και ως εκ τούτου δοκιμαστεί εάν ψευδαργύρου συμπλήρωση ήταν σε θέση να αποκαταστήσει wtp53 δραστηριότητα σε απόκριση στο φάρμακο. Για το σκοπό αυτό θα αξιολογηθεί για πρώτη φορά το

in vivo

ννίρ53 δραστηριότητα δέσμευσης του DNA με τη χρήση ανάλυσης chip. RKO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κοβάλτιο και ADR παρουσία ή απουσία του ψευδαργύρου και ενδογενούς ρ53 immunorecipitated με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ρ53 (FL393). Η ποσότητα του συν-καθιζάνει στοιχεία p53-δεσμευτικός προαγωγούς στόχου προσδιορίσθηκε με PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το κοβάλτιο μειώνεται σημαντικά p53 σύνδεση με υποστηρικτές των αποπτωτικών γονιδίων, όπως

Puma

και

DR5

σε απάντηση ADR και ότι αυτή η αναστολή έντονα επανήλθε με συμπληρώματα ψευδαργύρου (Εικόνα 4Β). Η ειδική σύνδεση προς ρ53

Puma

και

DR5

υποκινητές επιβεβαιώθηκε με

GAPDH

ενίσχυση προαγωγού μετά χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση με αντι-ρ53 αντίσωμα (Σχήμα 4Β). Έτσι, p53 αποπτωτική μεταγραφική δραστηριότητα ειδικά προκαλείται από ADR (Noxa-Luc έναντι p21-Luc), ανεστάλη από κοβάλτιο και αποκαταστάθηκε από συμπληρώματα ψευδαργύρου (Σχήμα 4C). Αξιοσημείωτα, ο ψευδάργυρος μόνη δεν επάγει p53 μεταγραφική δραστηριότητα. Επιπλέον, αξιολογήσαμε εάν HIPK2 επαγόμενη μεταγραφική δραστικότητα της ρ53 αναστέλλεται από κοβάλτιο (Σχήμα 3Β) θα μπορούσε να αποκατασταθεί με ψευδάργυρο. Για το σκοπό αυτό, 293 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με p53AIP1-Ιυο ανταποκριτή και HIPK2 φορέα έκφρασης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, συμπληρώματα ψευδαργύρου αποκατασταθεί πλήρως p53AIP1-Luc δραστικότητα HIPK2 επαγόμενη μειώνεται κατά κοβάλτιο, ενώ θεραπείες με κοβάλτιο ή ψευδάργυρος μόνος δεν προκάλεσε δραστικότητα λουσιφεράσης p53AIP1. Σε συμφωνία, η ADR που προκαλείται από τη μεταγραφή του γονιδίου αποπτωτικών p53 ανεστάλη από κοβάλτιο (Σχήμα 4Ε, συγκρίνετε λωρίδα 2 με λωρίδα 3) και αποκαταστάθηκε από συμπληρώματα ψευδαργύρου (Σχήμα 4Ε, συγκρίνετε λωρίδα 3 με 4) στα ίδια επίπεδα της θεραπείας ADR (Σχήμα 4Ε συγκρίνετε λωρίδα 4 με διαδρομή 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η συμπλήρωση ψευδαργύρου προς κοβάλτιο δεν επάγει αποπτωτικό γονίδιο μεταγραφή (Σχήμα 4Ε, λωρίδα 5). Τέλος, αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο αξιολογήθηκε από Western ανοσοαποτύπωση που δείχνει ότι η αναστολή της διάσπασης PARP και φωσφορυλίωση Ser46 από την έκθεση κοβαλτίου της ΕΕΔ-κατεργασμένων κυττάρων (Σχήμα 4F, συγκρίνετε λωρίδα 2 με λωρίδα 4) ήταν έντονα αποκαταστάθηκε από τον ψευδάργυρο (Σχήμα 4F, συγκρίνετε λωρίδα 4 με λωρίδα 5). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο ψευδάργυρος ήταν σε θέση να επανενεργοποιήσει τις υποξία-ανέστειλε την ενδογενή wtp53 DNA-δεσμευτικές και αποπτωτικών μεταγραφική δραστηριότητα για την αντιμετώπιση των ναρκωτικών, εξουδετερώνοντας, τουλάχιστον εν μέρει, την απορρύθμιση HIPK2.

(Α) κύτταρα RKO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κοβάλτιο για 16 ώρες και ίση ποσότητα συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων ανοσοκαταβυθίστηκαν με διαμόρφωση ειδικών Pab1620 (για άγριου τύπου, διπλωμένη μορφή ρ53) και το Pab240 (για μετάλλαξη, εκτυλίχθηκε μορφή ρ53) αντισωμάτων και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western με αντι- αντίσωμα p53 πολυκλωνικά (FL393). Οι αντιπροσωπευτικές λωρίδες από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται, δείχνοντας αύξηση το Pab240 αντιδραστικότητα και μείωση του Pab1620 αντιδραστικότητας μετά τη θεραπεία κοβάλτιο. Ένα σήμα μη ειδική (N.S.) παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (Β) Ανάλυση χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (chip) θα εκτελείται με αντίσωμα αντι-ρ53 σε κύτταρα που εκτίθενται σε RKO ΖηΟΙ

2 και CoCl

2 για 24 ώρες και Αδριαμυκίνη για 16 ώρες. PCR αναλύσεις διεξήχθησαν επί των ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα DNA χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για το στόχο ρ53

Puma

και

DR5

προαγωγούς. Ενίσχυση του

GAPDH

υποκινητή (δεξιά πλευρά) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της εξειδίκευσης σύνδεσης στο

Puma

και p53

DR5

υποστηρικτές. Ένα δείγμα που αντιπροσωπεύει γραμμική ενίσχυση της συνολικής χρωματίνης εισόδου (Input) συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος. Πρόσθετοι μάρτυρες περιλαμβάνουν ανοσοκαθίζηση πραγματοποιήθηκε με μη-ειδικές ανοσοσφαιρίνες (αριθ Ab). (Γ) RKO κύτταρα επιμολύνθηκαν με ρ21-Ιυο και Noxa-Luc ρεπόρτερ και 24 ώρες αργότερα σε επεξεργασία με ΖηΟ

2 και CoCl

2 για 24 ώρες και Αδριαμυκίνη για 16 ώρες αντίστοιχα, πριν προσδιορίστηκε δραστικότητα λουσιφεράσης. Αποτελέσματα, δραστικότητα κανονικοποιήθηκε ως προς β-γαλακτοσιδάση δείχνονται ως φορές επαγωγής έναντι των μη κατεργασμένων κυττάρων?

μπαρ

, Τ.Α. κύτταρα (D) 293 συν-επιμολύνθηκαν με p53AIP1-Ιυο ανταποκριτή και φορέα έκφρασης HIPK2-Flag και 24 ώρες αργότερα σε επεξεργασία με ΖηΟ

2 και CoCl

2 για 16 ώρες, πριν από την προσδιορίστηκε δραστικότητα λουσιφεράσης. RLU: σχετική μονάδα λουσιφεράσης.

Στήλες

, σημαίνει τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις διπλούν?

μπαρ

, Τ.Α. *

P

& lt? 0,01. (Ε) Σύνολο mRNAs ήταν αντίστροφη μεταγραφή από κύτταρα RKO αντιμετωπίζονται όπως στο (C) για την PCR ανάλυση των γονιδίων στόχων p53

Noxa

και

Puma

. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (F) RKO κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΖηΟ

2 και CoCl

2 για 24 ώρες και ADR για 16 ώρες και ίση ποσότητα συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση Western με αντι-ΡΑΚΡ (τα βέλη δείχνουν την μη διασπασμένο και διασπασμένη PARP ), αντι-Ser46 και αντισώματα αντι-ρ53. Anti-Hsp70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης.

Η

Ψευδάργυρος επανέρχεται δυσλειτουργική HIPK2 σε υποξία-επεξεργασμένα κύτταρα

Στη συνέχεια προσπάθησε να αξιολογήσει κατά πόσον ο ψευδάργυρος μπορεί να αντισταθμίσει την υποξία που προκαλείται από HIPK2 ρύθμιση προς τα κάτω και να επηρεάσει HIPK2 σύνδεση με χρωματίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α (αριστερό πάνελ) η κοβάλτιο επαγόμενη πρωτεΐνη HIPK2 μειορρύθμιση διασώθηκε από συμπληρώματος ψευδαργύρου ενώ ο ψευδάργυρος μόνος δεν άλλαξε τα επίπεδα HIPK2. Αντιστρόφως, αγωγή κοβάλτιο προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση HIF-1α και το αποτέλεσμα αυτό με σθένος επανήλθε με συμπλήρωση ψευδαργύρου (Σχήμα 5Α, δεξιό πλαίσιο). Υποκυτταρική κλασματοποίηση έδειξαν ότι η θεραπεία κοβάλτιο μειώνεται τόσο κυτταροπλασματική και πυρηνική HIPK2 πυρηνική επίπεδα, αν και η πυρηνική επίπεδα HIPK2 επηρεάστηκαν περισσότερο έντονα από κοβάλτιο και ότι αυτή η επίδραση επανήλθε με συμπλήρωση ψευδαργύρου (Σχήμα 5Β). Ψευδάργυρος μόνη της δεν επηρέασε HIPK2 επίπεδα (Σχήμα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με χαμηλή θεραπεία οξυγόνου (Σχήμα 5C). Είμαστε δίπλα αναλύονται καταλυτική δράση HIPK2 μετά τη θεραπεία του κοβαλτίου. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα 293 διαμολύνθηκαν με Flag κενό φορέα ή φορέα έκφρασης HIPK2-Flag με την παρουσία ή απουσία του κοβαλτίου ή ψευδαργύρου, που ακολουθείται από ανοσοκαταβύθιση έκτοπη HIPK2 με αντι-Flag αντίσωμα και

in vitro δοκιμασία κινάσης

με τη βασική πρωτεΐνη γνωστή φωσφορυλίωση HIPK2 μυελίνης υποστρώματος (ΜΒΡ) [7]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, έκτοπη HIPK2 ήταν ακόμη σε θέση να φωσφορυλιώσει ΜΒΡ μετά τις θεραπείες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υποξία πιθανόν δεν επηρεάζει HIPK2 καταλυτική δραστηριότητα, τουλάχιστον στην πειραματική μας κατάσταση.

(Α, αριστερό πάνελ) κύτταρα Υποσυρρέουσες RKO εκτέθηκαν σε CoCl

2 και ΖηΟ

2 μόνο ή σε συνδυασμό για 16 ώρες, και ίση ποσότητα συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση Western με ειδικό αντίσωμα που δείχνει ενδογενές επίπεδο HIPK2. Αντι-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης (δεξιό πλαίσιο). Ίση ποσότητα πυρηνικά εκχυλίσματα κυττάρων RKO επεξεργασμένο όπως παραπάνω, αναλύθηκαν με Western ανοσοαποτύπωση με ειδικά αντισώματα ανίχνευση επιπέδων HIF-1α. Anti-Hsp70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (Β) RKO κύτταρα κατεργασμένα όπως στο (Α) λύθηκαν για πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλασματοποίηση και αναλύθηκαν με Western ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-HIPK2 αντίσωμα. Αντι-τουμπουλίνης και αντι-NFYB αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο πρωτεΐνη φόρτωση των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλάσματα, αντίστοιχα. (Γ) RKO και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2% O

2 παρουσία ή απουσία του ψευδαργύρου για 16 ώρες, και ίση ποσότητα εκχυλισμάτων πυρηνικών κυττάρων αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση Western με ειδικά αντισώματα ανίχνευσης HIF-1α και πυρηνική επίπεδα HIPK2 . Anti-Hsp70 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. (D) κινάσης δοκιμασία έκτοπου HIPK2 σε 293 κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο Flag ή HIPK2-Flag φορέα έκφρασης αφεθεί χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με κοβάλτιο ή ψευδάργυρος για 16 ώρες. Ίση ποσότητα του ολικού κυττάρου εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Flag και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα κινάσης χρησιμοποιώντας ΜΒΡ σαν υπόστρωμα. Ίση έκφραση της ΜΒΡ πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με Comassie-χρώση δοκιμασίας κινάσης. ανάλυση (Ε) χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (chip) θα εκτελούνται με αντι-HIPK2 αντίσωμα σε κύτταρα RKO αντιμετωπίζονται όπως στο (Α). PCR αναλύσεις διεξήχθησαν επί των ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα DNA χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για την ανθρώπινη

HIF-1α

υποκινητή. Ενίσχυση του

GAPDH

προαγωγό (δεξί πάνελ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος της εξειδίκευσης δέσμευσης HIPK2 στο

HIF-1α

υποκινητή δείγμα που αντιπροσωπεύει γραμμική ενίσχυση της συνολικής χρωματίνης εισόδου (Input) συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος. Πρόσθετοι μάρτυρες περιλαμβάνουν ανοσοκαθίζηση πραγματοποιήθηκε με μη-ειδικές ανοσοσφαιρίνες (αριθ Ab). (F, άνω πάνελ), Σύνολο mRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα από κύτταρα RKO σε επεξεργασία με ΖηΟ

2 και CoCl

2 για 24 ώρες και ADR για 16 ώρες αντίστοιχα, για PCR αναλύσεις των γονιδίων HIF-1 TARGET

BCL2

,

MDR1

, και

VEGF

. Λόγος: αναλογία έκφραση GAPDH. (F, κατώτερο επίπεδο) πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου απεικονίζονται ως η αναλογία έκφρασης για να GAPDH, που χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Μαθητή

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση των σύγκριση μεταξύ των τιμών του κοβαλτίου και κοβαλτίου συν ψευδάργυρο, και CoCl

2 /ADR και CoCl

2 /ADR /ΖηΟ

2, όπως απεικονίζεται. *

P

& lt? 0,01. (G) RKO κύτταρα εξαντλούνται της λειτουργίας HIPK2 με siHIPK2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΖηΟ

2 και CoCl

2 για 24 ώρες και ADR επί 16 ώρες, αντίστοιχα και συνολική mRNAs μεταγράφεται ανάστροφα για PCR αναλύσεις όπως στο (F).

Τα αντίθετα αποτελέσματα της υποξίας σε HIPK2 και HIF-1α επίπεδα συνδέονται μεταξύ τους με την επίδραση καταστολέα της HIPK2 στο

HIF-1α

υποκινητή. Έτσι, το κοβάλτιο-που προκαλείται κατάργηση των προσλήψεων HIPK2 σε

HIF-1α

υποστηρικτής έντονα επανήλθε από τον ψευδάργυρο (Σχήμα 5Ε). Η HIPK2 ειδική σύνδεση με

HIF-1α προωθητής

επιβεβαιώθηκε με

GAPDH

ενίσχυση προαγωγού μετά χρωματίνης ανοσοκαθίζηση με αντίσωμα αντι-ρ53. Κατά συνέπεια, η ανάλυση RT-PCR έδειξε ότι το κοβάλτιο επαγόμενη

Bcl-2

,

MDR1

και

VEGF

γονιδιακή έκφραση ήταν σημαντικά κατασταλεί από τον ψευδάργυρο (Σχήμα 5FD, συγκρίνετε CoCl

2 λωρίδες με CoCl

2 /ΖηΟ

2 λωρίδες), όπως φαίνεται και από την αναλογία έκφραση GAPDH (Σχήμα 5F, κάτω πάνελ). Επιπλέον, η θεραπεία ADR σε συνδυασμό με κοβάλτιο δεν ήταν σε θέση να αναστέλλουν την κοβάλτιο-επαγόμενη HIF-1 οδού (Σχήμα 5Ε, συγκρίνετε CoCl

2 λωρίδες με CoCl

2 λωρίδες /ADR), εκτός αν σε συνδυασμό με ψευδάργυρο (Σχήμα 5F , συγκρίνετε CoCl

2 λωρίδες /ADR με CoCl

2 /ADR /ΖηΟ

2 λωρίδες). Ο ρόλος των HIPK2 σε κοβάλτιο επαγόμενη στόχων HIF-1 αξιολογήθηκε περαιτέρω παρακάτω εξάντληση HIPK2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5G, το βασικό επίπεδο

MDR1

και

Bcl2

γονιδιακής έκφρασης ήταν ήδη υψηλή σε κύτταρα siHIPK2, σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα μας την δραστηριότητα καταστολέα HIPK2 του HIF-1α [17 ], [18], και δεν θα μπορούσε να κατασταλεί με κατεργασία με ψευδάργυρο (Σχήμα 5G και συγκρίνετε με 5F). Η επίδραση του ψευδαργύρου εξουδετερώνοντας αποτέλεσμα υποξία ήταν ειδική ως ένα άλλο αντιοξειδωτικό, δηλαδή, η βιταμίνη C, το έκανε ούτε HIF-1 ρυθμίζει προς τα κάτω γονιδίων στόχων ούτε επηρεάζεται απόκριση φαρμάκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο ψευδάργυρος εξουδετερωθούν υποξία που προκαλείται από HIPK2 προς τα κάτω ρύθμιση, ανακτάται η πρόσληψη HIPK2 πάνω χρωματίνης και οδήγησε στην καταστολή του HIF-1 μονοπάτι.

Ο ψευδάργυρος βελτιώνει χημειοθεραπευτικών απάντηση in vivo

Για να αξιολογηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα του συνδυασμού του ψευδαργύρου και χημειοθεραπείας

in vivo

δημιουργήσαμε ξενομοσχεύματα όγκου σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Οι ποντικοί στη συνέχεια με προ-αγωγή με ΖηΟ

2 για 8 ώρες πριν από την ένεση ADR και στη συνέχεια κατεργάζεται κάθε μέρα με ψευδάργυρο. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ADR μόνο του κατά τη διάρκεια των 2 εβδομάδων που εμφανίζεται μείωση του όγκου του όγκου κατά συγκρίσιμο τρόπο με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με ψευδάργυρο μόνο (Σχήμα 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η προσθήκη ψευδαργύρου ενίσχυσε σημαντικά την επίδραση της ADR που οδηγεί σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (Adriamycin + ψευδάργυρος

έναντι

Αδριαμυκίνη:

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 6Α και 6Β).