Αφηρημένο

Με την ολοκλήρωση της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος, βιοϊατρικές επιστήμες έχουν εισέλθει στην η «-ωματικής» της εποχής, κυρίως λόγω της γονιδιωματικής υψηλής απόδοσης τεχνικές και η πρόσφατη εφαρμογή της φασματομετρίας μάζας για την πρωτεομική ανάλυση. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει χρονική υστέρηση μεταξύ αυτών τεχνολογικές εξελίξεις και την εφαρμογή τους στην κλινική. Η δουλειά μας έχει σχεδιαστεί για να χτίσει γέφυρες μεταξύ πρωτεομική υψηλής απόδοσης και την κλινική ρουτίνα. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης ελήφθησαν από φρέσκο ​​κατεψυγμένο φυσιολογικού πνεύμονα και του μη μικροκυτταρικού δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Εφαρμόσαμε μια εμπλουτισμό φωσφοπεπτιδίου που ακολουθείται από LC-MS /MS. Μεταγενέστερες αναλύσεις ετικέτας χωρίς ποσοτικοποίηση και της βιοπληροφορικής πραγματοποιήθηκαν. Εκτιμήσαμε μοτίβα πρωτεΐνης στα δείγματα αυτά, δείχνοντας δεκάδες απόκλιση δεικτών μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Γονιδιακή οντολογία και interactome αναλύει πανομοιότυπες οδούς σηματοδότησης μεταβληθεί σε καρκινικό ιστό. Έχουμε εντοπίσει δύο πρωτεΐνες, PTRF /Cavin-1 και ΜΙΡ, τα οποία εκφράζονται διαφορικά μεταξύ φυσιολογικού πνεύμονα και του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Αυτά τα δυνητικά βιοδείκτες επικυρώνονταν με κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία. Η εφαρμογή των πρωτεομική ανακάλυψη βασίζεται σε αναλύσεις σε κλινικά δείγματα μας επέτρεψε να εντοπίσει νέες δυνατότητες βιοδείκτες και θεραπευτικών στόχων σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Gámez-Pozo Α, Sánchez-Navarro I, Calvo Ε, Agullo-Ortuño MT, López-Vacas R, Díaz E, et al. (2012) PTRF /Cavin-1 και ΜΙΡ πρωτεΐνες χαρακτηριστεί ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Biomarkers με Label-Δωρεάν Πρωτεϊνωματική. PLoS ONE 7 (3): e33752. doi: 10.1371 /journal.pone.0033752

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu », Ιταλία

Ελήφθη: 1 Δεκεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 16 Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26 Μάρτη, 2012

Copyright: © 2012 Gámez-Pozo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις FIS cp05 /00248, PS09 /01597, Κόκκινο Temática de Investigación Cooperativa en καρκίνου (RTICC, RD06-0020-1022) από Carlos III Ινστιτούτο Υγείας (ισπανικό Υπουργείο Επιστημών και Καινοτομίας, Ισπανία) και ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα mutua Madrileña. ISN υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Λα Παζ Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. ΕΔ υποστηρίζεται από επιχορήγηση CA10 /01447 από Carlos III Ινστιτούτο Υγείας. Ισπανικό Εθνικό Κέντρο Καρδιαγγειακής Έρευνας υποστηρίζεται από το ισπανικό Υπουργείο Επιστημών και Καινοτομίας και το Ίδρυμα ProCNIC. Η IdiPAZ Βιοτράπεζα υποστηρίζεται από τον Carlos III Ινστιτούτο Υγείας, ισπανικό Υπουργείο Υγείας (RETIC RD09 /0076/00073) και Farmaindustria, μέσω του Προγράμματος Συνεργασίας στην κλινική και μεταγραφική έρευνα της Κοινότητας της Μαδρίτης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης σε 5 χρόνια είναι 15% και δεν έχει βελτιωθεί εδώ και δεκαετίες. Τα δύο τρίτα των ασθενών που διαγιγνώσκονται με προχωρημένη νόσο, όπου οι θεραπευτικές επιλογές είναι παρηγορητική, και έως 55% των ασθενών με περιορισμένη νόσο τελικά υποτροπιάζουν μετά από ριζική χειρουργική επέμβαση [1].

προφίλ γονιδιακής έκφρασης οδήγησε στην ταυτοποίηση των ομάδων των ασθενών με διαφορετικό αποτέλεσμα, αντανακλώντας έτσι την ετερογένεια της ασθένειας αυτής [2]. Ωστόσο, το γονίδιο-επίπεδο αναλύσεις δεν ανιχνεύουν ανεπαίσθητες αλλαγές που προκαλούνται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών [3]. Μια βαθιά κατανόηση των διαδικασιών της καρκινογένεσης, την εξέλιξη του όγκου και της μετάστασης απαιτεί την ανάλυση τόσο του γονιδιώματος και του πρωτεώματος [4]. Πρωτεομική τεχνολογίες που βασίζονται σε φασματομετρία μάζας (MS) έχουν αναδειχθεί ως προτιμώμενα συστατικά μιας στρατηγικής για να ανακαλύψετε διαγνωστικές, προγνωστικές και θεραπευτικές πρωτεϊνικών βιοδεικτών [5]. Συνεχίζοντας προόδους στον τομέα αυτό να δώσει αυτή τη στρατηγική ένα τεράστιο δυναμικό για τέτοιες έρευνες [6], [7].

Πρόσφατες κλινικές μελέτες που να καταδεικνύουν καλή ανταπόκριση σε νέα φάρμακα σε συγκεκριμένες υποομάδες ασθενών υπογραμμίζουν την ανάγκη για μοριακές δοκιμές που συμπληρώνουν κλασική ιστοπαθολογική διαδικασίες [8]. Σε αυτό το πλαίσιο, πρωτεομική προφίλ μπορούν να παρέχουν πολύτιμα εργαλεία βιοδείκτη για αποτελεσματική διαστρωμάτωση των ασθενών και την επιλογή της θεραπείας.

Αν και είναι δυνατόν να αναλυθούν πρωτείνες από ιστούς χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας [3], [9], η πολυπλοκότητα της κλινικής δείγματος και η ποσότητα του διαθέσιμου πρωτεΐνης περιοριστικοί παράγοντες. Ως εκ τούτου, απαιτείται εμπλουτισμός του δείγματος σε βιολογικά σχετικό αναλυτών [5]. Τα περισσότερα ευκαρυωτικά κυτταρικών διεργασιών που ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση πρωτείνης, και η απορρύθμιση αυτού του κλειδιού μετα-μεταφραστική τροποποίηση είναι κοινή σε καρκίνο και άλλες ασθένειες. Αυτό εξηγεί γιατί οι κινάσες πρωτεΐνης έχουν αναδειχθεί ως η κύρια κατηγορία νέων φαρμακευτικών στόχων στην ογκολογία και σε άλλους τομείς [10]. Στην παρούσα εργασία έχουμε εφαρμόσει εμπλουτισμό φωσφοπεπτιδίου σε συνδυασμό με την ετικέτα χωρίς τεχνικές MS για τον εντοπισμό ήδη γνωστές και νέες δυνατότητες βιοδείκτες σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κλινική ιστούς και την επικύρωσή τους, χρησιμοποιώντας κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική δήλωση

Θεσμικό έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας μας ελήφθη για τη διεξαγωγή της μελέτης (Comité Ético de Investigación Clínica, Νοσοκομείο Universitario Λα Παζ). Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα. Οι ασθενείς κατόπιν γραπτής συγκατάθεσης έτσι ώστε τα δείγματα και τα κλινικά δεδομένα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για ανακριτικούς σκοπούς.

Η επιλογή δειγμάτων

Τα κατεψυγμένα δείγματα από ασθενείς που διαγνώστηκαν με καρκίνο του πνεύμονα ανακτήθηκαν από το Τμήμα Παθολογίας του Νοσοκομείου Universitario Λα Παζ (Μαδρίτη, Ισπανία): αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα 5 (AC), 5 πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SC) και 5 φυσιολογικού πνεύμονα (NL) δείγματα. Τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του κάθε δείγματος επανεξετάστηκαν από έναν έμπειρο πνεύμονα παθολόγο για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και το περιεχόμενο των όγκων. Τουλάχιστον το 50% του δείγματος έπρεπε να αποτελείται από τα καρκινικά κύτταρα για να είναι επιλέξιμες. Τα δείγματα από ασθενείς ευγενικά παρέχεται από το IdiPAZ Βιοτράπεζας (RD09 /0076/00073) ενσωματώνονται στην ισπανική Νοσοκομείο Δίκτυο βιολογικής τράπεζας (RetBioH? Www.redbiobancos.es). Δείγματα καταχωρηθεί και η επεξεργασία μετά από τις τρέχουσες διαδικασίες και σταθερό /κατεψυγμένα αμέσως μετά τη λήψη τους.

Σύνολο εκχύλιση πρωτεΐνης, διαλυτοποίηση και την πέψη

Τα δείγματα κόπηκαν σε ένα κρυοστάτη Leica CM3050S, απόκτηση 10 τμήματα των 10 μικρά πάχος το καθένα. Ο ιστός υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τις αναλύσεις MS, σφαιρίδια πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν σε υδροχλωρική γουανιδίνη 6Μ και θερμάνθηκαν 10 λεπτά στους 95 ° C με ανάδευση. Ακολούθως, προστέθηκαν 950 μΙ 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου (ρΗ 7-9) ανά δείγμα. συγκέντρωση δείγματος πρωτεΐνης μετρήθηκε με ΜϊογοΒΟΑ Kit Protein Assay (Pierce-Thermo Scientific). Η θρυψίνη MS βαθμού χρυσό (Promega) προστέθηκε σε κάθε δείγμα σε σχέση 1:50. Η πέψη διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 37 ° C. Το χωνεμένο δείγμα χωρίστηκε σε δύο κλάσματα.

Parallel IMAC (PIMAC)

εμπλουτισμός φωσφοπεπτιδίου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Εν συντομία, Fe (III) -με βάση IMAC πραγματοποιήθηκε σε ένα δείγμα από χωνεμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας το PHOS-Select σιδήρου Gel συγγένεια (Sigma-Aldrich) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ga (III) -με βάση IMAC πραγματοποιήθηκε σε ένα άλλο κλάσμα του πέψη πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη φωσφοπεπτιδίου Απομόνωση Kit (Pierce-Thermo Scientific) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα εκλούσματα αναμίχθηκαν, ξηραίνεται υπό κενό και αποθηκεύεται στους -20 ° C για μεταγενέστερη ανάλυση MS.

LC-MS /MS αναλύσεις

μιγμάτων πεπτιδίων υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία νανο-υγρό σε συνδυασμό με MS για ταυτοποίηση πρωτεϊνών. Τα πεπτίδια εγχύθηκαν σε μια C-18 αντίστροφης φάσης (RP) νανο-στήλη (100 μm ID και 12 cm, Mediterranea θάλασσα, Teknokroma) και αναλύθηκαν σε μια συνεχή βαθμίδωση ακετονιτριλίου που αποτελείται από 0-40% Β σε 90 λεπτά, 50-90 % Β σε 20 λεπτά (Β = 95% ακετονιτρίλιο, 0,5% οξικό οξύ). Στο τέλος της κλίσης, η στήλη πλύθηκε με 90% Β και ισορροπήθηκε με 5% Β επί 20 λεπτά. Ένας ρυθμός ροής 300 nl /min χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση των πεπτιδίων από το νανο-στήλη RP με μια βελόνα νανοψεκασμού εκπομπού για πραγματικού χρόνου ιονισμού και κατάτμηση πεπτιδίων σε φασματόμετρο μάζας LTQ-Orbitrap XL (Thermo-Fisher). Μια ενισχυμένη φάσμα FT-ανάλυση (resolution = 60000), ακολουθούμενη από την MS /MS φάσματα από τις πέντε πιο έντονη μητρικής ιόντα αναλύθηκαν κατά μήκος της χρωματογραφικής τρέξιμο (130 λεπτά). Δυναμική αποκλεισμού ορίστηκε σε 1 λεπτό. Για τα φάσματα ταυτοποίηση κατάτμηση πρωτεΐνης ερευνήθηκαν έναντι της βάσης δεδομένων MSDB (έκδοση 091509) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Mascot 2,1 (Matrixscience). Δύο αναπάντητες διαιρέσεις είχαν τη δυνατότητα, και ένα λάθος των 10 ppm ή 0,8 Da ορίστηκε για την πλήρη MS ή MS /MS αναζητήσεις φάσματα, αντίστοιχα. Όλες οι ταυτοποιήσεις έγιναν από Proteome Discoverer 1,0 λογισμικού (Thermo-Fisher). Δολώματα αναζήτηση δεδομένων για ψευδή ανάλυση ρυθμό ανακάλυψης ορίστηκε στο 0,05 με την εφαρμογή αντίστοιχων φίλτρων. Raw αρχεία δεδομένων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και σε σύγκριση με ΚΟΣΚΙΝΟ έκδοση 1.2 (Thermo-Fisher). ταυτοποιήσεις πρωτεΐνης επικυρωθεί χρησιμοποιώντας το εργαλείο BLAST από την σουίτα BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Για λεπτομερείς ρυθμίσεις πεπτιδίου μάζα δακτυλικών αποτυπωμάτων και ταυτοποίηση πρωτεϊνών, βλέπε Πίνακα S4.

Inmunoblotting δοκιμασίες

Για inmunoblotting προσδιορισμούς, σφαιρίδια πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν σε 2% SDS και θερμαίνεται 10 λεπτά στους 95 ° C με ανακίνηση . συγκέντρωση δείγματος πρωτεΐνης μετρήθηκε με ΜϊογοΒΟΑ Kit Protein Assay (Pierce-Thermo Scientific) .western κηλίδες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του συστήματος WesternDot (Invitrogen) σε ένα i.d. SNAP συσκευής (Millipore). χρησιμοποιήθηκαν και PTRF αντισώματος 1:125 αραίωση (BD Biosciences)? ΠΔΠ αντισώματος 1: 250 αραίωση (R & D Systems amp). αναλύσεις πυκνότητας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό 1.38e ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/) για τη μέτρηση της έντασης των ζωνών. Για εξομάλυνση κηλίδος western, συνολικό φορτίο πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την Novex Αναστρέψιμη μεμβράνης Stain Kit (Invitrogen).

Η ανοσοϊστοχημεία

φορμόλη-σταθερό, μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη, εκπρόσωπος του φυσιολογικού πνεύμονα και μη -μικρό πνεύμονα διάγνωση του καρκίνου, ανασύρθηκαν ακόλουθη ρουτίνα ιστοπαθολογική αξιολόγηση. Τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας έναν καθολικό σύστημα χρώσης Dako Autostainer (Dako). Για τη μελέτη αυτή, 3,5-μm τομές ανοσοχρώση με αντι-ΜΙΡ 1:2000 (R &? D Systems) ή αντι-PTRF 1:100 (BD Biosciences). Εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο Leyca με μεγέθυνση × 40. Το ποσοστό των χρωματισμένο ιστού και την ένταση χρώσης (0, +, ++ ή +++) ελήφθη για κάθε δείγμα και δείκτη αξιολογούνται. χρώση IHC θεωρήθηκε θετική όταν τουλάχιστον το 50% του ιστού (κανονική ή καρκινικών) χρωματίστηκε με τουλάχιστον ++.

Στατιστικές Αναλύσεις

Οι τιμές έκφρασης μεταξύ των ομάδων δείγματος συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας Kruskal -Wallis δοκιμής (Gaussian προσέγγιση). Για την εκτίμηση των διαφορών μεταξύ των ζευγών των ομάδων χρησιμοποιήθηκε Πολλαπλές Test Σύγκριση Dunn του. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Κόσκινο και πυκνότητας τιμές συγκρίθηκαν με τη χρήση συντελεστή συσχέτισης του Pearson

Βιοπληροφορική

καταλόγους πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) έκδοση 2.0 (http:. //David. abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) [12], [13]. Για τον προσδιορισμό των επιχειρήσεων και υπερεκπροσωπούνται λειτουργικές κατηγορίες που χρησιμοποιούνται Πρωτεΐνη ανάλυση μέσω εξελικτικές σχέσεις (PANTHER) της βάσης δεδομένων κατά 6.1 (www.pantherdb.org) [14]. κατάλογος πρωτεΐνη όγκων σε σύγκριση με την κανονική λίστα πνεύμονα χρησιμοποιώντας το διωνυμικό τεστ [15] για κάθε μοριακή λειτουργία, ή βιολογική διεργασία όρος πορείας στα πάνθηρα. αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών ελήφθησαν από το εργαλείο αναζήτησης για την ανάκτηση αλληλεπιδρώντων Genes /Πρωτεΐνες (STRING) v9.0 βάση δεδομένων που περιέχει γνωστών και προβλεφθέντων φυσική και λειτουργική αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης [16]. STRING στη λειτουργία της πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε, και μόνο οι αλληλεπιδράσεις που βασίζονται στην αλληλεπίδραση πειραματική πρωτεϊνών και επιμέλεια Βάσεις δεδομένων με τα επίπεδα εμπιστοσύνης πάνω από 0,5- κρατήθηκαν.

Αποτελέσματα

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τις διαφορές στο επίπεδο της πρωτεΐνης μεταξύ των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και των πνευμόνων φυσιολογικό ιστό χρησιμοποιώντας μια στρατηγική εμπλουτισμού φωσφοπεπτιδίου και μία ετικέτα-free προσέγγιση. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε LTQ-Orbitrap XL αφού υποβληθεί σε υγρή χρωματογραφία. Επειδή είναι γνωστό ότι διαφορετικές τεχνικές απομονώσουν διακριτά και επικαλυπτόμενα τμήματα του phosphoproteome [17], συμπεριλαμβανομένων Fe (III) και Ga (III) IMAC [18], αναμίξαμε το Fe (III) και Ga (III) κλάσματα IMAC από κάθε δείγματος και τους αναλύεται παράλληλα.

Αξιολογήσαμε τον αριθμό των μοναδικών πεπτιδίων και των αντίστοιχων πρωτεϊνών τους, καθώς και φωσφοπεπτίδια και τα αντίστοιχα φωσφοπρωτείνες τους, τα οποία προσδιορίζονται σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (AC), καρκίνωμα πνεύμονα πλακώδους κυττάρου (SC) και φυσιολογική πνεύμονα (NL) δείγματα εφαρμόζοντας ένα δόλωμα αναζήτηση δεδομένων σε ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη & lt? 0,05. Η εκτεταμένη ανάλυση που πραγματοποιήθηκε σε δείγματα NSCLC και NL χρησιμοποιώντας LC-MS /MS μας επέτρεψε να προσδιορίσει ένα μέσο όρο των 381 μοναδικά πεπτίδια ανά δείγμα, των οποίων η μέση του 56 ήταν φωσφοπεπτίδια. Αυτά τα πεπτίδια αντιστοιχούν σε μια μέση τιμή 138 μοναδικές πρωτεΐνες προσδιορίζονται ανά δείγμα, από τα οποία φωσφορυλιούται ένα μέσο 39. Το κλάσμα του φωσφοπεπτιδίων ταυτοποιηθεί (αριθμός των φωσφορυλιωμένων πεπτιδίων * 100 /αριθμό συγκεκριμένων πεπτιδίων) ήταν 19,9%.

αναλύσεις οντολογία Gene διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας όλες τις προσδιοριζόμενες πρωτεΐνες. Ο κατάλογος πρωτεΐνη όγκου σε σύγκριση με την κανονική λίστα πρωτεΐνη πνεύμονα για κάθε μοριακή λειτουργία (Σχήμα S1), βιολογική διεργασία (Σχήμα S2), ή οδού (Σχήμα 1) χρησιμοποιώντας όρους PANTHER. Αυτή η προσέγγιση έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κανονικών δειγμάτων πνεύμονα και των όγκων (οι πλήρεις αναλύσεις παρέχονται στον Πίνακα S1). Οι διαφορές στο μοριακό λειτουργίες που σχετίζονται κυρίως με την αλληλεπίδραση με τα νουκλεϊκά οξέα και την ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης και τη δραστηριότητα. Διεργασιών που ελέγχουν εξωκυπάρωσης, ανοσολογική απάντηση, απάντηση σε ερέθισμα, αντίδραση στο στρες και τις μεταφορές ήταν σημαντικά υποεκπροσωπούνται σε όγκους, ενώ οι υπερεκπροσωπούνται κατηγορίες που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση-μήτρα ή απάντηση σε τοξίνη. Από την άλλη πλευρά, οι κατηγορίες ομοιόσταση ήταν υπό-εκπροσωπούνται, ενώ οι κατηγορίες που σχετίζονται με την παραγωγή ενέργειας και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν υπερεκπροσωπούνται σε όγκους. Αξιοσημείωτες διαφορές στην ανάλυση μονοπάτι εμφανίστηκε σε κατηγορίες που σχετίζονται με τον έλεγχο μεταγωγής σήματος. Ενώ κυτταροσκελετού ρύθμιση από Rho ΟΤΡάσης, φλεγμονή που προκαλείται από χημειοκινών και κυτοκινών μονοπατιού σηματοδότησης, ιντεγκρίνης μονοπάτι σηματοδότησης και Wnt μονοπάτι σηματοδότησης ήταν υπο-εκπροσωπούνται σε δείγματα όγκων, EGF υποδοχέα μονοπατιού σηματοδότησης, γλυκόλυση, p53 μονοπάτι και PI3 κινάσης ήταν υπερεκπροσωπούνται.

Η σύγκριση με τον αριθμό των πρωτεϊνών που έχουν ανατεθεί σε κάθε GO κατηγορία οδού. Οι κανονικές κατηγορίες δείγμα ιστού εκπροσωπήθηκαν ως πολλαπλή μεταβολή σε σχέση με αυτή την κατηγορία. Η στατιστική σημαντικότητα δοκιμάζεται χρησιμοποιώντας το διωνυμικό τεστ. Μόνο σημαντικές κατηγορίες (p & lt? 0,05) εμφανίζονται

Η

ανάλυση διαφορική έκφραση μεταξύ NSCLC εναντίον φυσιολογικού πνεύμονα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κοσκίνου 1.2 του λογισμικού.. Ένα σύνολο 296 διαφορικά εκφρασμένων κορυφές m /z βρέθηκαν, 115 εκ των οποίων είχε στη διάθεσή φάσματα MS2, που οδηγεί στην ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ φυσιολογικού πνεύμονα και των δειγμάτων NSCLC (Πίνακας 1). Όλα τα δεδομένα που προκύπτουν από τις αναλύσεις κόσκινο συμπεριλαμβανομένων των σχετικών αξιών της έκφρασης, που προβλέπεται στον πίνακα S2.

Η

PTRF /Cavin-1 και ΜΙΡ outstand μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων βιοδείκτες μεταξύ NSCLC και φυσιολογικά δείγματα πνεύμονα σε ετικέτα χωρίς αναλύσεις ως η πιο κάτω ρυθμιζόμενα και πάνω ρυθμισμένα αντίστοιχα (Σχήμα 2). PTRF /Cavin-1 έδειξε απώλεια της έκφρασης τόσο αδενοκαρκίνωμα και τα δείγματα πλακώδες καρκίνωμα. Από την άλλη πλευρά, MIF έδειξαν αυξημένη έκφραση σε αυτά τα δείγματα. Προκειμένου να αποφευχθούν εσφαλμένες θετικές αναγνωρίσεις, περισσότερα από είκοσι φάσματα MS2 για κάθε MIF και PTRF /Cavin-1 πεπτίδια αξιολογήθηκαν με το χέρι (Σχήματα S3 και S4 και Πίνακας S3). Αλλαγές στο PTRF /Cavin-1 και την έκφραση του MIF στα δείγματα NSCLC επικυρώθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC) και western blot αναλύσεις. Τα ίδια δείγματα που χρησιμοποιούνται για MS /MS αναλύσεις και εννέα επιπλέον δείγματα αδενοκαρκινώματος, καρκινώματος πλακώδους κυττάρου και φυσιολογικού πνεύμονα αξιολογήθηκαν για MIF και PTRF χρησιμοποιώντας στύπωμα western. Πέντε επιπλέον δείγματα αδενοκαρκινώματος, καρκινώματος πλακώδους κυττάρου και φυσιολογικού πνεύμονα αξιολογήθηκαν για MIF και PTRF χρησιμοποιώντας IHC. Όλες οι όγκοι εμφανίζουν θετική χρώση για ΠΔΠ και αρνητική χρώση για PTRF, ενώ όλοι οι κανονικοί ιστοί ήταν αρνητικοί για ΠΔΠ και θετική για χρώση PTRF. MIF υπερέκφραση σε ιστούς όγκων επιβεβαιώθηκε τόσο από την IHC και κηλίδα western (Σχήματα 3 και 4). Από την άλλη πλευρά, τα δείγματα όγκων επιβεβαίωσε απώλεια PTRF έκφρασης /Cavin-1 σε σύγκριση με φυσιολογικό πνεύμονα (Σχήματα 3 και 4) και με τις δύο τεχνικές. συσχέτισης του Pearson μεταξύ των τιμών της έκφρασης Κόσκινο χωρίς σήμανση και ποσοτικοποίηση κηλίδας western ήταν r = 0,723 και r = 0,754 (p & lt? 0.005) για ΠΔΠ και PTRF /Cavin-1 αντίστοιχα

Boxplots αντιπροσωπεύουν μέση και 25ης-75ο εκατοστημόριο. ? μουστάκια αντιπροσωπεύουν minimun και Μέγιστο. Οι μετρήσεις ελήφθησαν από πέντε διαφορετικά δείγματα για κάθε κατάσταση. Οι τιμές p δοκιμή Kruskall-Wallis δείξει. AC: αδενοκαρκίνωμα? SC: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? NL:. Φυσιολογικού πνεύμονα

Η

α) Western στύπωμα της συνολικής πρωτεΐνης που εξάγεται από υποδεικνύεται δείγματα, χρησιμοποιώντας αντι-ΜΙΡ και /Cavin-1 πρωτογενή αντισώματα αντι-PTRF. β) Η πυκνομετρική αναλύσεις western blot. ImageJ λογισμικό 1.38e χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ένταση των ζωνών. Όλες οι τιμές σε αυθαίρετες μονάδες. γ) Η ανοσοϊστοχημεία των υποδεικνύεται δειγμάτων, χρησιμοποιώντας αντι-ΜΙΡ και /Cavin-1 πρωτογενή αντισώματα αντι-PTRF. AC: αδενοκαρκίνωμα? SC: καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? NL:. Κανονική πνεύμονα

Η

γραφήματα Box-Plot δείχνει ποσοτικοποίηση western blot PTRF και MIF χρησιμοποιώντας το λογισμικό 1.38e ImageJ. Όλες οι τιμές σε αυθαίρετες μονάδες. Κάθε κουτί περιλαμβάνει τιμές από εννέα διαφορετικά δείγματα. Διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων ήταν p & lt?. 0.005 και στις δύο περιπτώσεις (δοκιμή Kruskall-Wallis)

Η

Ψάξαμε στη βάση δεδομένων STRING για interactomic συνδέσεις του MIF και PTRF. Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί το ποσοστό των εσφαλμένων θετικών, εμείς εξαλειφθεί συνεργάτες χρησιμοποιώντας αυστηρά κριτήρια, και μόνο πειραματική αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και οδοί από επιμελημένες βάσεις δεδομένων ελήφθησαν υπόψη. PTRF περιλαμβάνεται στην οδό μεταγραφή RNA, και φυσικά αλληλεπιδρά με TTF1. Άλλες αλληλεπιδράσεις PTRF περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της μεταγραφής και EGFR (Εικόνα 5). MIF έχει σχέση με την οδό μεταβολισμό της φαινυλαλανίνης, και αλληλεπιδρά με ρ53 και πρωτεΐνες του συμπλόκου σηματοσώματος COP9, ένα συγκρότημα που εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές και αναπτυξιακές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης ρ53 φωσφορυλίωση με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [19]. Άλλες αλληλεπιδράσεις περιλαμβάνουν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου και της φλεγμονώδους διαδικασίας (Σχήμα 6).

Ένα γράφημα του δικτύου PTRF κατασκευάστηκε με τη χρήση STRING v9.0 εμφανίζεται. Διαφορετικά χρώματα γραμμή αντιπροσωπεύουν τους τύπους των αποδεικτικών στοιχείων για την ένωση:. Ροζ για πειράματα και μπλε για τις βάσεις δεδομένων

Η

Ένα γράφημα του δικτύου MIF κατασκευάστηκε με τη χρήση STRING v9.0 εμφανίζεται. Διαφορετικά χρώματα γραμμή αντιπροσωπεύουν τους τύπους των αποδεικτικών στοιχείων για την ένωση:. Ροζ για πειράματα και μπλε για τις βάσεις δεδομένων

Η

Συζήτηση

Πρωτεομική γενικά και phosphoproteomics κυρίως γίνονται οι προτιμώμενες μεθόδους της πρωτεΐνης αναλύσεις ανακάλυψη που βασίζεται. Η χρήση της ετικέτας-free, ανακάλυψη που βασίζεται σε προσεγγίσεις που μπορούν να βοηθήσουν να ανακαλύψουν απροσδόκητο βιολογική συνδέσεις λόγω της απουσίας των προηγούμενων προκατάληψη γνώσης. εργαλεία βιοπληροφορικής, όπως η γονιδιακή οντολογίας και interactome αναλύσεων, εφαρμόζεται σε κλινικά δείγματα έχουν μεγάλες δυνατότητες για τον εντοπισμό οδών και μορίων με επιπτώσεις στο θεραπευτικό επίπεδο και μπορεί να προσφέρει ενδείξεις για την γένεση των ασθενειών και των υποκείμενων μοριακών μεταβολών τους. Ωστόσο, τόσο η ίδια η τεχνολογία και τα εργαλεία ανάλυσης δεδομένων θα πρέπει να βελτιωθεί περαιτέρω, πριν την είσοδό τους στην κλινική.

φωσφοπεπτιδίου εμπλουτισμός των δειγμάτων πριν από την ανάλυση MS χρησιμοποιώντας PIMAC λειτούργησε αρκετά καλά, καθώς το 20% των μετρούμενων πεπτιδίων ήταν φωσφορυλιωμένη. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει εμπλουτισμό των φωσφοπεπτιδίων από περίπου 50% χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο IMAC παρόμοια με τη δική μας επί τρυπτικής πέψης ενός μίγματος αρκετών πρωτεϊνών αναφοράς [20]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα δείγματα μας ήταν πολύ περίπλοκη και ότι δεν χρησιμοποίησε κανένα βήμα κλασματοποίησης, εμπλουτισμός φωσφοπεπτιδίου ήταν επιτυχής και συγκρίσιμη με αυτή που λαμβάνεται σε προηγούμενες εργασίες [21], [22]. Ωστόσο, τα περισσότερα από τα φάσματα που δείχνει μια απώλεια φωσφορικού παρουσίασε μια φτωχή κατακερματισμού, και η ταυτοποίηση του πεπτιδίου δημιουργήθηκε. Η χρήση των νέων τεχνικών κατακερματισμού, καθώς οι υψηλότερες ενεργειακές συγκρούονταν διαχωρισμό, τη βελτίωση της ποιότητας των φασμάτων κατακερματισμό [23], που επιτρέπει να εκτελέσετε ανάλυση phosphoproteome μεγάλης κλίμακας.

Γονιδιακή οντολογία αναλύσεις της βιολογικής διαδικασίας και πορείες παρουσίασαν αύξηση σε κατηγορίες που σχετίζονται με την παραγωγή ενέργειας στα κύτταρα, όπως γλυκόλυση και την παραγωγή προδρόμων μεταβολιτών και της ενέργειας. Αυτές οι διαφορές στο μεταβολισμό της ενέργειας μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων είναι γνωστά ως Warburg αποτέλεσμα [24]. Από τα μονοπάτια σηματοδότησης υποεκπροσωπούνται σε ιστούς NSCLC, chemokine- και την μεσολάβηση κυτοκινών φλεγμονής έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι υπο-εκπροσωπούνται σε NSCLC [25]. Είναι αξιοσημείωτο το υπερ-εκπροσώπηση των πρωτεϊνών που ανήκουν στην οδό σηματοδότησης EGFR, σε ένα πλαίσιο όπου η κλινική χρήση των αναστολέων EGFR έχει γίνει το πρότυπο της εξατομικευμένης θεραπείας για NSCLC [26], [27], [28].

Περισσότερα από το 10% των διαπιστωμένων πεπτιδίων έδειξε μια διαφορική έκφραση μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων. Το ποσοστό των διαφορικών πεπτιδίων ήταν μικρότερη από 2% κατά τη σύγκριση των δειγμάτων καρκινώματος αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και πλακώδες επιθήλιο, αλλά ακόμα υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο αυτών ιστολογικών υποτύπων NSCLC, όπως έχουμε αποδείξει προηγουμένως [11].

Δεν ήταν είναι σε θέση να επικυρώσει NSCLC πιθανούς βιοδείκτες που προσδιορίζονται στην πρωτεομική κυνηγετικό όπλο αναλύσεις χρησιμοποιώντας IHC και προσεγγίσεις κηλίδας western. MIF (παράγοντας αναστολής μετανάστευσης μακροφάγων) διάκριση μεταξύ φυσιολογικού πνεύμονα και δείγματα NSCLC. Αυτό το γνωστό παράγοντας είναι ένας προφλεγμονώδης κυτοκίνη ικανή να δρα ως διαλυτός παράγοντας ανάπτυξης, που εκφράζεται και εκκρίνεται σε απόκριση προς μιτογόνα και τα σήματα διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη. MIF πρωτεΐνη εμπλέκεται σε πολλές κακοήθειες, δεδομένου ότι προωθεί τον κυτταρικό μετασχηματισμό, αναστέλλει κυτταρολυτική ανοσολογική απόκριση εναντίον των καρκινικών κυττάρων και προωθεί νεοαγγείωση [29]. αναλύσεις Interactome αποκάλυψε μια στενή σχέση μεταξύ της ρύθμισης του κυτταρικού θανάτου και MIF, και δεν είναι περίεργο ότι MIF υπερέκφραση περιγράφηκε σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού, μαστού, προστάτη, του δέρματος και του καρκίνου του πνεύμονα [30], [31], που έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων στο κεντρικό νευρικό σύστημα [32]. Οι όγκοι που συνεκφράζουν MIF και του υποδοχέα μεμβράνης (πρωτεΐνη CD74) της αυξήθηκαν αγγείωση [33]. Αν και υπάρχουν πολλά μόρια τα οποία αναστέλλουν την ενζυματική δραστικότητα του MIF, η υψηλή IC50 του έχει περιορίσει την κλινική χρήση του μέχρι σήμερα [34], αλλά τα νέα μόρια είναι υπό ρεύμα ανάπτυξης [35]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια αυξημένη έκφραση του MIF στα δείγματα NSCLC από την ετικέτα χωρίς πρωτεομική, επιβεβαιώνεται τόσο από κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία.

PTRF (Polimerase Ι και Απομαγνητοφώνηση Factor Release), επίσης γνωστή ως Cavin-1, είναι ένα πρωτεΐνη απαραίτητη για RNA μεταγραφή [36] και μικροσπηλαίων σχηματισμός [37]. Αυτές οι εγκολπώσεις της κυτταρικής επιφάνειας που σχετίζονται με τις διαδικασίες της φυσαλιδώδους μεταφοράς, ομοιόσταση της χοληστερόλης, μεταγωγή σήματος [38] και του ελέγχου της λιπόλυσης [39]. Ως εκ τούτου, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι οι PTRF /Cavin-1 μεταλλάξεις που σχετίζονται με συγγενή γενικευμένη λιποδυστροφία, τύπου 4 στον άνθρωπο [40]. PTRF /Cavin-1 συνεντοπίζεται με caveolin 1 (CAV1) εντός μικροσπηλαίων [41], και θετικά ρυθμίζει την έκφραση του [42]. Interactome αναλύσεις δείχνουν ότι PTRF λιμάνια άγνωστες λειτουργίες πέρα ​​από κάποια περιγράφηκε πρόσφατα [43], [44], [45]. Απώλεια PTRF /Cavin-1 σε καρκίνο του προστάτη έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη [46], και έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση του μειώνει την μετανάστευση του PTRF /Cavin-1 ελλειμματικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη [47]. Η απώλεια της έκφρασης PTRF /Cavin-1 σε ογκογόνα κύτταρα ΗΒΕ σε σύγκριση με φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα έχει αποδειχθεί πρόσφατα [48]. Bai και συνεργάτες ανέφεραν πρόσφατα ότι PTRF πρωτεΐνη κάτω-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και ιστού του όγκου του μαστού, και ότι προς τα κάτω ρύθμιση PTRF σε καρκινικά κύτταρα του μαστού συνδέθηκε με την μεθυλίωση προαγωγού [49]. Οι PTRF /Cavin-1 φωσφορυλιωμένα είδη έχουν περιγραφεί σε κύτταρα που υπερεκφράζουν EGFR, γεγονός που υποδηλώνει μια λειτουργία σε αυτό το μονοπάτι σηματοδότησης [50]. ετικέτα χωρίς πρωτεομική μας αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση PTRF χάνεται σε δείγματα NSCLC. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας τόσο κηλίδος Western και ανοσοϊστοχημική χρώση. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει PTRF /Cavin-1 απώλεια της έκφρασης σε καρκινικό ιστό NSCLC στο επίπεδο πρωτεΐνης. Αυτή η απώλεια της έκφρασης, μαζί με PTRF-EGFR αλληλεπίδρασης και EGFR μονοπάτι απορρύθμιση σε δείγματα NSCLC, προτείνει ένα ρόλο PTRF στην ανάπτυξη NSCLC.

Η εργασία μας δείχνει ότι είναι δυνατό για τον εντοπισμό πιθανών βιοδεικτών χρησιμοποιώντας μια ετικέτα-free διαφορικό στρατηγική πρωτεομική σε πραγματικά κλινικά δείγματα. Εντοπίσαμε αρκετές διαφορικό δείκτες, δύο εκ των οποίων επικυρώθηκαν από εναλλακτικές κλασική πρωτεομική μεθόδους. Επιπλέον, δείχνουμε ότι το γονίδιο οντολογία και η αλληλεπίδραση αναλύει μπορεί να προσδιορίσει τις οδούς και τις διαδικασίες μεταβληθεί σε ιστό όγκου, η οποία μπορεί να παρέχει ενδείξεις για τη γένεση της νόσου και υποκείμενη μοριακές αλλαγές του, και θα μπορούσε να είναι επιρρεπή σε θεραπευτική παρέμβαση. Με αυτή την έννοια, το έργο αυτό δείχνει ότι ο ρόλος PTRF στον NSCLC και η σχέση της με την οδό του EGFR αξίζει περαιτέρω διερεύνηση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ανάλυση των διαφορών GO Μοριακής Λειτουργία μεταξύ NSCLC και φυσιολογικό πνεύμονα. Σύγκριση του αριθμού των πρωτεϊνών εκχωρηθεί σε κάθε GO μονοπάτι κατηγορία. Οι κανονικές κατηγορίες δείγμα ιστού εκπροσωπήθηκαν ως πολλαπλή μεταβολή σε σχέση με αυτή την κατηγορία. Η στατιστική σημαντικότητα δοκιμάζεται χρησιμοποιώντας το διωνυμικό τεστ. Μόνο σημαντικές κατηγορίες (p & lt? 0,05) εμφανίζονται

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2..

Ανάλυση των διαφορών στις GO Biological Process μεταξύ NSCLC και φυσιολογικό πνεύμονα. Σύγκριση του αριθμού των πρωτεϊνών εκχωρηθεί σε κάθε GO μονοπάτι κατηγορία. Οι κανονικές κατηγορίες δείγμα ιστού εκπροσωπήθηκαν ως πολλαπλή μεταβολή σε σχέση με αυτή την κατηγορία. Η στατιστική σημαντικότητα δοκιμάζεται χρησιμοποιώντας το διωνυμικό τεστ. Μόνο σημαντικές κατηγορίες (p & lt? 0,05) εμφανίζονται

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3..

κατακερματισμός φάσματα από PTRF SLKESEALPEK τρυπτικό πεπτίδιο. Διάγραμμα δείχνει θραύσμα ιόντων που αντιστοιχεί στην κύρια σειρά κατακερματισμού (β-αμινο και y-καρβοξυ). * Υποδηλώνει απώλεια νερού? 2+, διπλά φορτισμένο κομμάτι. Γονικός ιόντων σημειώνεται με ένα βέλος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

κατακερματισμός φάσματα από το ΠΔΠ PMFIVNTNVPR τρυπτικό πεπτίδιο. Διάγραμμα δείχνει θραύσμα ιόντων που αντιστοιχεί στην κύρια σειρά κατακερματισμού (β-αμινο και y-καρβοξυ). * Υποδηλώνει απώλεια νερού. Γονικός ιόντων σημειώνεται με ένα βέλος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s004

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. αναλύσεις

Γονιδιακή Οντολογία εκτελείται με πάνθηρα. Κανονική λίστα πρωτεΐνη πνεύμονα χρησιμοποιήθηκε ως λίστα αναφοράς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s005

(PDF)

Πίνακας S2.

ΚΟΣΚΙΝΟ ετικέτα χωρίς ποσοτικό προσδιορισμό. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από ΚΟΣΚΙΝΟ αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των σχετικών αξιών έκφραση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033752.s006

(PDF)

Πίνακα S3.

PTRF και φάσματα MIF MS2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s007

(PDF)

Πίνακας S4.

Peptide Mass δακτυλικών αποτυπωμάτων και τις ρυθμίσεις Ταυτοποίηση πρωτεϊνών.

doi: 10.1371 /journal.pone.0033752.s008

(DOC)

Ευχαριστίες

Θέλουμε να αναγνωρίσουμε ιδιαίτερα των ασθενών σε αυτή τη μελέτη για τη συμμετοχή τους και την IdiPAZ Βιοτράπεζας ενσωματωθεί στην ισπανική Νοσοκομείο Δίκτυο βιολογικής τράπεζας (RetBioH? www.redbiobancos.es), για τις γενναιόδωρες δωρεές των κλινικών δειγμάτων που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έργο

.