Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος που επηρεάζει 1 στους 6 άνδρες στις ΗΠΑ. Η κατανόηση της μοριακής βάσης της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη μπορεί να χρησιμεύσει ως εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την ασθένεια αυτή. Protein Kinase D1 (ΡϋΚ1) είναι ένα πολυλειτουργικό κινάση που εκφράζεται υψηλά σε φυσιολογικό προστάτη. Η μειωμένη έκφραση του ΡΚϋ1 έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, τα συνθετικά ή φυσικά προϊόντα που ρυθμίζουν αυτή την οδό σηματοδότησης μπορούν να χρησιμεύσουν ως νέα θεραπευτικούς τρόπους για την πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Η κουρκουμίνη, το δραστικό συστατικό του κουρκουμά, έχει δείξει αντικαρκινικές ιδιότητες μέσω της διαφοροποίησης ενός αριθμού διαφορετικών μοριακών οδών. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι η κουρκουμίνη ενεργοποιεί PKD1, με αποτέλεσμα μεταβολές στην σηματοδότηση β-κατενίνης με την αναστολή της δραστικότητας της μεταγραφής πυρηνικής β-κατενίνης και της αύξησης των επιπέδων των μεμβρανών β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Modulation αυτών των κυτταρικών γεγονότων με κουρκουμίνη συσχετίζεται με μειωμένο πολλαπλασιασμό κυττάρων, σχηματισμό αποικιών και κυτταρική κινητικότητα και αυξημένη συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, έχουμε επίσης αποκάλυψαν ότι η αναστολή της κυτταρικής κινητικότητας με κουρκουμίνη διαμεσολαβείται από τη μείωση των επιπέδων των ενεργών κοφιλίνη, μία προς τα κάτω στόχος του PKD1. Οι ισχυρές αντικαρκινικές επιδράσεις της κουρκουμίνης

in vitro

επίσης αντικατοπτρίζεται σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου του προστάτη. Η

in vivo

αναστολή της ανάπτυξης του όγκου συσχετίζεται επίσης με ενισχυμένη εντόπιση μεμβράνη του β-κατενίνης. Συνολικά, τα ευρήματά μας στο παρόν έχουν αποκαλύψει ένα νέο μοριακό μηχανισμό δράσης κουρκουμίνης μέσω της ενεργοποίησης των PKD1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Παράθεση:. Sundram V, Chauhan SC, Ebeling Μ, Jaggi Μ (2012) Η κουρκουμίνη Εξασθενεί β- κατενίνης Σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης D1. PLoS ONE 7 (4): e35368. doi: 10.1371 /journal.pone.0035368

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 4 Οκτωβρίου 2011? Αποδεκτές: 15 Μαρτίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 του Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Sundram et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από COBRE Grant (P20 RR024219) από ΝΙΗ (https://www.ncrr.nih.gov/) και από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο άμυνας (DOD) (https://cdmrp.army.mil/) σε MJ (DOD PC073643) και SCC (DOD PC073887). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου και η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες στις ΗΠΑ [1]. Ο κίνδυνος για καρκίνο του προστάτη αυξάνεται εκθετικά μετά την ηλικία των 50. Ως εκ τούτου, ο καρκίνος του προστάτη είναι τοποθετημένη για να γίνει μια μεγαλύτερη πρόκληση για τα επόμενα χρόνια λόγω της συνολικής αύξησης της μακροζωίας. Ενώ η αιτιολογία του καρκίνου του προστάτη δεν είναι καλά κατανοητή, και οι δύο γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της νόσου. Μια κοινή στρατηγική πρώτης γραμμής για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη περιλαμβάνει τη χειρουργική ή φαρμακολογική ευνουχισμός μέσω θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων. Ενώ θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων είναι αποτελεσματική κατά τη διάρκεια αρχικά στάδια της νόσου, ο καρκίνος εξελίσσεται γρήγορα σε ανδρογόνα ανεξάρτητο στάδιο για τις οποίες δεν είναι γνωστό αποτελεσματική θεραπεία είναι προς το παρόν διαθέσιμα. Ως εκ τούτου, η κατανόηση της μοριακής βάσης της νόσου είναι ιδιαίτερα επιθυμητή για την ανάπτυξη νεότερων στρατηγικές για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Protein Kinase D1 (ΡΚϋ1) είναι μια εξελικτικά συντηρημένη, εκφράζεται παντού κινάση σερίνης-θρεονίνης που παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση μιας ποικιλίας κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένων κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και την εισβολή [2] – [8]. Η

ΡΚϋ1

γονίδιο εκφράζεται σε πολλά όργανα με την υψηλότερη έκφραση τεκμηριώνεται στον προστάτη και όρχεις γεννητικά κύτταρα [3], [9], [10]. PKD1 παρουσιάζει ένα συνδυασμό των δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών τόσο της οικογένειας PKC (γλυκερίνη διακυλ και φορβολεστέρα δεσμευτική δομικές περιοχές) και την οικογένεια CaMK (δομική ομολογία του τομέα κινάσης και υπόστρωμα και αναστολέας της ειδικότητας). Ως εκ τούτου, είναι μοναδικά τοποθετημένη εντός της μεταγωγής σήματος καταρράκτη για την ενσωμάτωση των πληροφοριών σηματοδοσίας από εξωτερικά ερεθίσματα και τα μετατρέπει σε ενδοκυτταρική απόκριση με διαμόρφωση ποικίλων οδών κατάντη [2]. Έτσι, η απορρύθμιση των PKD1 επηρεάζει πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης, με αποτέλεσμα χρόνιων ασθενειών όπως ο καρκίνος [2]. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας έχει ενοχοποιηθεί ένα κρίσιμο ρόλο για PKD1 στον καρκίνο του προστάτη [11]. Η εργασία μας έχει αποκαλύψει την ικανότητα του ΡΚϋ1 να αναστέλλουν τις λειτουργίες της β-κατενίνης στον καρκίνο του προστάτη [12]. Επιπλέον, ΡΚϋ1 έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με και ρυθμίζουν τις λειτουργίες Ε-καδερίνης, υποδοχέα ανδρογόνων και μονοπάτια σηματοδότησης MAPKinase [13] – [18]. ΡΚϋ1 επίσης αναστέλλει κυτταρική κινητικότητα με άμεση αλληλεπίδραση με και ρυθμίζοντας τις λειτουργίες ενός αριθμού πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της ακτίνης, συμπεριλαμβανομένων βολή σφεντόνα φωσφατάση (SSH1L) και cortactin [19] – [23]. Επιπλέον, ΡΚϋ1 είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην αναστολή της διήθησης, της μετάστασης και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) των καρκινικών κυττάρων με τη ρύθμιση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) [24], [25] και τις λειτουργίες του παράγοντα μεταγραφής σαλιγκάρι [26 ], αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, μόρια που ρυθμίζουν την έκφραση PKD1 ή δραστηριότητα μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην πρόληψη και ή θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Η κουρκουμίνη (Σχήμα 1Α), το δραστικό συστατικό του κουρκούμη, είναι ένα μη-τοξικό, diferuloyl μεθάνιο ένωση η οποία έχει ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική, αντι-φλεγμονώδη και αντι-οξειδωτική ιδιότητες [27], [28]. Και η

in vivo

και

in vitro

μελέτες απέδειξαν την ικανότητα της κουρκουμίνης να αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη του καρκίνου [29] – [31]. Αυτό το ισχυρό ιδιότητα αντικαρκινική της κουρκουμίνης σχετίζεται με την ικανότητά της να διαμορφώνει ταυτόχρονα τις λειτουργίες ενός αριθμού διαφορετικών μοριακών οδών συμπεριλαμβανομένων ΜΑΡΚ, EGFR και μονοπάτια ΝΡκΒ [32]. Επιπλέον, η κουρκουμίνη ρυθμίζει επίσης τη μεταγραφική δραστηριότητα της πυρηνικής β-κατενίνης /παράγοντα Τ κυττάρων (TCF). Ωστόσο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί της κουρκουμίνης μεσολάβηση καταστολή της β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

Α). Χημική δομή της κουρκουμίνης. ΣΙ). Επίδραση της κουρκουμίνης επί του πολλαπλασιασμού των διαφόρων προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές. LNCaP, C4-2, DU145 και κυτταρικές PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη ή φορέα DMSO ελέγχου για 48 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων τοις εκατό υπολογίστηκε με κανονικοποίηση τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε επεξεργασία με κουρκουμίνη πολλαπλασιασμό κυττάρων αγωγή ελέγχου. Εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με κουρκουμίνη. Μέσος όρος ± SE? n = 3? * P & lt?. 0.05

Η

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αποκαλύψει την επίδραση της κουρκουμίνης στην ενεργοποίηση PKD1. Η κουρκουμίνη μεσολαβητική ενεργοποίηση ΡΚϋ1 κατασταλεί δραστικότητα μεταγραφής /TCF πυρηνικής β-κατενίνης και ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη σε κυτταρική γραμμή και ζωικό μοντέλο ξενομοσχεύματος. Η ενεργοποίηση της PKD1 ενίσχυσε επίσης τη συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου και ανέστειλε τις λειτουργίες των κυττάρων κινητικότητα

μέσω

εμπλουτισμό της μεμβράνης της β-κατενίνης και την αναστολή της δραστηριότητας κοφιλίνη. Συνολικά, έχουμε αποκαλύψει ένα νέο μονοπάτι μοριακής σηματοδότησης ρυθμίζεται από κουρκουμίνη να εξασθενεί την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη.

Αποτελέσματα

Η κουρκουμίνη αναστέλλει προστάτη τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Η απορρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να προσδιοριστεί η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα της κουρκουμίνης (Σχήμα 1Α), ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών προστάτη (ευαίσθητες νωρίς πέρασμα των ανδρογόνων LNCaP, ανδρογόνο-ανεξάρτητες C4-2, PC3 και DU145) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης για 48 h και αξιολογούνται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. θεραπεία κουρκουμίνη εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε όλες τις διαφορετικές του καρκίνου του προστάτη κύτταρα (Σχήμα 1Β). Η αντιστοίχιση του προστάτη σύστημα καρκινική κυτταρική σειρά LNCaP (ανδρογόνων ευαίσθητα) και C4-2 κύτταρα (LNCaP προέρχεται, ανδρογόνο-ανεξάρτητες) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω μελέτες.

Η κουρκουμίνη ενεργοποιεί PKD1

PKD1 είναι αναγκαία για την κανονική φυσιολογία των κυττάρων του προστάτη και προς τα κάτω ρύθμιση του σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, μη τοξικά, φυσικές ενώσεις που ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση ή τη δραστηριότητα του ΡΚϋ1 μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη και ή θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Για να προσδιοριστεί εάν η κουρκουμίνη μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση ή τη δραστηριότητα του ΡΚϋ1, μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα C4-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κουρκουμίνη για διάφορες χρονικές στιγμές, και η έκφραση του συνολικού ΡΚϋ1 (Σχήμα 2Α) και ενεργός ΡΚϋ1 (Σχήμα 2Β) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΡΚϋ1 και φωσφο ΡΚϋ1 αντισώματα αντίσωμα. Ενώ καμία αξιοσημείωτη μεταβολή στο συνολικό επίπεδο ΡΚϋ1 ανιχνεύτηκε μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη (Σχήμα 2Α), η θεραπεία κουρκουμίνη ενίσχυσε σημαντικά την έκφραση του ενεργοποιημένου ΡΚϋ1 εντός 1 ώρας της θεραπείας (Σχήμα 2Β και Σχήμα S1 Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης σε κύτταρα που υπερεκφράζουν C4-2 PKD1 (C4-2-ΡΚϋ1) (Σχήμα S1B) και σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα S1c). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία κουρκουμίνη μπορεί να επάγει αποτελεσματικά την ενεργοποίηση του ΡΚϋ1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Α). Επίδραση της κουρκουμίνης σε επίπεδα PKD1. κύτταρα C4-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ κουρκουμίνη. Σε διάφορες χρονικές στιγμές, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF και ανιχνεύθηκαν για το σύνολο PKD1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. Οι εντάσεις μπάντα πυκνομετρικώς αναλύθηκαν, κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνη και γράφημα. θεραπεία κουρκουμίνη δεν προκάλεσε καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση ΡΚϋ1 στις 1, 3 και 6 ώρες. ΣΙ). Επίδραση της κουρκουμίνης στην ενεργοποίηση του PKD1. Για τον προσδιορισμό της έκφρασης του ενεργοποιημένου /φωσφορυλιωμένων ΡΚϋ1, στυπώματα ανιχνεύθηκαν με φωσφο ΡΚϋ1, σύνολο ΡΚϋ1 και β-ακτίνη αντισώματα. Η ένταση της ζώνης pPKD1 ομαλοποιήθηκε με τα συνολικά επίπεδα PKD1 και γράφημα. θεραπεία κουρκουμίνη επαγόμενη ΡΚϋ1 ενεργοποίηση /φωσφορυλίωση από 1 ώρα, ενώ δεν παρατηρήθηκαν εμφανείς αλλαγές στην έκφραση του συνολικού PKD1. Αντιπροσωπευτικά στυπώματα τριών πειραμάτων παρουσιάζονται στο σχήμα. Κές αυθαίρετες μονάδες.

Η

θεραπεία κουρκουμίνη εμπλουτίζει εντοπισμός β-κατενίνης στην κυτταρική μεμβράνη

β-κατενίνης είναι μια σημαντική κυτταρική πρωτεΐνη που φωσφορυλιώνεται από PKD1. ΡΚϋ1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι αυξάνει τα επίπεδα της μεμβράνης β-κατενίνης και την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [12]. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της κουρκουμίνης διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΚϋ1 επί μεμβράνης β-κατενίνης εντοπισμού, αντιμετωπίζεται η κουρκουμίνη κύτταρα C4-2 ανοσοχρωματίστηκαν για β-κατενίνης και υποβάλλονται σε επεξεργασία για συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 3). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η θεραπεία κουρκουμίνη εμπλουτισμένη μεμβράνη β-κατενίνης εντοπισμό σε κύτταρα C4-2 μέσα σε 1 ώρα της θεραπείας σε σύγκριση προς κύτταρα που κατεργάζονται ελέγχου του οχήματος. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε LNCaP κύτταρα (Σχήμα S2).

Κύτταρα

C4-2 καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες για μία νύχτα σε 12 φρεατίων πλάκες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (άνω πάνελ) ή κουρκουμίνη (20 μΜ) (κάτω πίνακας) επί 1 ώρα, πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και ανοσοχρώση για β-κατενίνης (κόκκινο) και αντι-βάφτηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). Υψηλότερες χρώση β-κατενίνης παρατηρήθηκε στην κυτταρική επιφάνεια σε 1 ώρα της θεραπείας κουρκουμίνη, σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου DMSO. Οι αρχικές μεγεθύνσεις 600 ×.

Η

Η κουρκουμίνη που προκαλείται ενίσχυση της μεμβράνης β-κατενίνης αναστέλλεται από PKD1 siRNA

ΡΚϋ1 έχει προηγουμένως δειχθεί να επηρεάσει την υποκυτταρική εντόπιση του β-κατενίνης [12] . Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να διερευνηθεί ο ρόλος του ΡΚϋ1 σε μεσολάβηση κουρκουμίνη εμπλουτισμό μεμβράνη β-κατενίνης. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε PKD1 ειδικά siRNA να φιμώσουν PKD1 στα κύτταρα C4-2. PKD1 siRNA αποτελεσματικά σιωπήσει έκφρασης PKD1 (πάνω από 95%) σε κύτταρα C4-2 σύγκριση με ομελέτα (μη στοχευμένα) siRNA (Σχήμα 4Α). Μετά την αναστολή της έκφρασης ΡΚϋ1, τα κύτταρα C4-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για συνεστιακή μικροσκοπία για τον προσδιορισμό β-κατενίνης και της έκφρασης και ο εντοπισμός ΡΚϋ1 (Σχήμα 4Β). Σε κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα, η θεραπεία κουρκουμίνη ενισχυμένη αποτελεσματικά β-κατενίνης εντοπισμού στην κυτταρική μεμβράνη (Σχήμα 4Β, Α2-D2) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4Β, Α1-D1). Ωστόσο, σε κύτταρα επιμολυσμένα με ΡΚϋ1 φίμωση siRNA, κουρκουμίνη αγωγή απέτυχε να εμπλουτίσουν β-κατενίνης επί της μεμβράνης σε κύτταρα C4-2 (Σχήμα 4Β, Α4-D4). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΡΚϋ1 παίζει ρόλο στην μεσολάβηση κουρκουμίνη εμπλουτισμό μεμβράνη β-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Α). Αποσιώπηση των PKD1 από PKD1 συγκεκριμένες siRNA. κύτταρα C4-2 επιμολύνθηκαν για 48 ώρες με 25 ηΜ siRNA ελέγχου ή ΡΚϋ1 siRNA, λύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν για PKD1 και β-ακτίνη χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Η ποσοτικοποίηση των εντάσεων πρωτεϊνική ζώνη διεξήχθη με πυκνομετρική ανάλυση. Τα επίπεδα ΡΚϋ1 κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνη επίπεδα και γράφημα. Κές αυθαίρετες μονάδες. Η ανοσοκηλίδωση δεικνύει πάνω από 95% καταστολή της έκφρασης ΡΚϋ1 για επιμόλυνση με ΡΚϋ1 ειδικό siRNA (λωρίδα 2) σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (λωρίδα 1). ΣΙ). Καταστολή της PKD1 αναστέλλει τον εμπλουτισμό των επιπέδων της β-κατενίνης μεμβράνη. C4-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες για όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα πρώτα επιμολυσμένα είτε με έλεγχο siRNA (Α1-D1? Α2-D2) ή ΡΚϋ1 φίμωση siRNA (Α3-D3? Α4-D4) για 24 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με έλεγχο οχήματος (DMSO) (Α1-D1? Α3 -θ3) ή κουρκουμίνη (20 μΜ) (Α2-D2? Α4-D4) για 1 ώρα. Τα κύτταρα ανοσοχρώθηκαν για β-κατενίνης (κόκκινο) ή ΡΚϋ1 (πράσινο) και ο πυρήνας ήταν μετρητής χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). Υψηλότερες χρώση β-κατενίνης παρατηρήθηκε στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων siRNA ελέγχου σε 1 ώρα της θεραπείας κουρκουμίνη (Α2) σε σύγκριση με τη θεραπεία του οχήματος (Α1). Ωστόσο, siRNA μεσολαβεί σίγηση του ΡΚϋ1 (Β3, Β4) ανέστειλε κουρκουμίνη μεσολάβηση εμπλουτισμό χρώση β-κατενίνης μεμβράνης στην επιφάνεια του κυττάρου (Α4 vs Α3 και Α2). Αρχικό μεγεθύνσεις 600 × 2 × ζουμ.

Η

Η κουρκουμίνη μειώνει τα πυρηνικά της β-κατενίνης σηματοδότησης

PKD1 διαμορφώνει το σηματοδοτικό μονοπάτι της β-κατενίνης με την αλληλεπίδραση, φωσφορυλίωσης και ρυθμίζοντας τη υποκυτταρικό εντοπισμό και την παρεμπόδιση η δραστικότητα μεταγραφής πυρηνικής β-κατενίνης [12]. Παρατηρήσαμε μέγιστη ενεργοποίηση ΡΚϋ1 με κατεργασία κουρκουμίνη εντός 1 h (Σχήμα 2Β). Παροδική ενεργοποίηση ΡΚϋ1 έχει δειχθεί ότι έχουν μακροπρόθεσμες κατάντη κυτταρικές επιδράσεις [12], [17]. Επομένως, προσδιορίσαμε περαιτέρω την επίδραση της κουρκουμίνης σε μεμβράνη β-κατενίνης εντοπισμός μετά από 24 ώρες θεραπείας χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 5Α). Υψηλότερες μεμβράνη β-κατενίνης εντοπισμός μαζί με μειωμένη κυτταροπλασματική β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε κύτταρα μετά από 24 ώρες θεραπείας κουρκουμίνη (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, η θεραπεία κουρκουμίνη 24 ώρες μεταβάλλεται επίσης την υποκυτταρική εντόπιση του ΡΚϋ1 (Σχήμα 5Α). Ενώ σε κύτταρα ελέγχου, ΡΚϋ1 εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα, κύτταρα κατεργασμένα κουρκουμίνη παρουσίασαν ΡΚϋ1 εντόπιση στη μεμβράνη και στον πυρήνα (Σχήμα 5Α).

Α) Επίδραση της θεραπείας κουρκουμίνης στο κυτταρικό εντοπισμό του β- κατενίνης και PKD1. C4-2 κύτταρα κατεργασμένα με κουρκουμίνη (20 μΜ) ή DMSO για 24 ώρες ανοσοχρωματίστηκαν για β-κατενίνης (πράσινο) ή ΡΚϋ1 (κόκκινο) και αντι-βάφτηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). κύτταρα κατεργασμένα κουρκουμίνη έδειξαν χαμηλότερη κυτταροπλασματική μεμβράνη και υψηλότερες χρώση β-κατενίνης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, ενώ ΡΚϋ1 ήταν κυρίως εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα στα κύτταρα ελέγχου, τα κύτταρα έλαβαν κουρκουμίνη εμφάνισαν χρώση κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη και στον πυρήνα (λευκά βέλη), με ελαφρά κυτταροπλασματική χρώση. Αρχικό μεγεθύνσεις 600 × 2 × ζουμ. Β) Επίδραση της κουρκουμίνης στα επίπεδα πυρηνικής β-κατενίνης. Πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από κύτταρα C4-2 αγωγή είτε με κουρκουμίνη (20 μΜ) ή DMSO διαχωρίστηκαν σε μεμβράνη PVDF και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα β-κατενίνης. Ιστόνη Η1 πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζώνης β-κατενίνης, κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα ιστόνη Η1 φαίνεται στο γράφημα. θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της πυρηνικής β-κατενίνης σε σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν φορέα. Κές αυθαίρετες μονάδες. C) Επίδραση της κουρκουμίνης στην μεταγραφική δραστηριότητα της β-κατενίνης σε C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η δραστικότητα μεταγραφής β-κατενίνης μετρήθηκε με παροδικής επιμόλυνσης των κυττάρων με κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης TCF που περιέχουν είτε θέσεις TCF δέσμευσης προαγωγέα (pTOP-FLASH) ή θέσεις δέσμευσης μεταλλαγμένης TCF προαγωγό (pFOP-FLASH) μαζί με το πλασμίδιο εσωτερικού ελέγχου που περιέχει

Renilla

γονίδιο της λουσιφεράσης (pRL-ΤΚ). Μετά από 3 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κουρκουμίνη (20 μΜ) ή DMSO για 24 ώρες. Η μεταγραφική δραστηριότητα της β-κατενίνης ήταν η πρώτη κανονικοποιημένη να

Renilla

δραστηριότητα λουσιφεράσης, και εκφράζεται ως ποσοστό της δραστηριότητας /pFOP-FLASH pTOP-FLASH. Η δραστηριότητα των κυττάρων που έλαβαν κουρκουμίνη ομαλοποιήθηκε με τη δραστηριότητα των κυττάρων που έλαβαν φορέα (θεωρείται 100%). θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά δραστικότητα μεταγραφής β-κατενίνης σε κύτταρα C4-2 σύγκριση με κύτταρα που έλαβαν φορέα. Η μέση ± SE, η = 3, * ρ & lt? 0,01. ΡΕ). Επίδραση της κουρκουμίνης στη μεταγραφή της κυκλίνης D1. Η μεταγραφή της κυκλίνης D1 αναλύθηκε από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με κουρκουμίνη ή όχημα ελέγχου για 24 ώρες. Μετά την αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε cDNA, PCR ενίσχυση της κυκλίνης D1 ή GAPDH εσωτερικού ελέγχου διεξήχθη χρησιμοποιώντας ειδικό γονίδιο εκκινητές. Τα ενισχυμένα προϊόντα διαχωρίστηκαν επί πηκτής αγαρόζης 1%. Η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζώνης κυκλίνης D1 κανονικοποιούνται σε επίπεδα GAPDH φαίνεται στο γράφημα. θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε την έκφραση της κυκλίνης D1. Κές αυθαίρετες μονάδες. ΜΙ). αναλύσεις ανοσοστυπώματος. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκε από κουρκουμίνη (20 μΜ) ή DMSO αγωγή C4-2 κύτταρα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. θεραπεία κουρκουμίνη μειώθηκε αισθητά έκφραση D1 κυκλίνης, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στην έκφραση του συνολικού β-κατενίνης, Ε-καδερίνης ή Wnt 3α. Αντιπροσωπευτικά ανοσοαποτυπώματα από τρία πειράματα που δείχνονται.

Η

β-κατενίνης είναι ένα κρίσιμο συστατικό του καταρράκτη σηματοδότησης Wnt. λειτουργίες Πυρηνική β-κατενίνης ως παράγοντας συν-μεταγραφή με σχηματισμό ενός συμπλόκου με TCF και ενισχύει την έκφραση ενός αριθμού μορίων με προ-ογκογόνο ρόλους, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνη D1, c-myc και c-jun. Από ΡΚϋ1 ρυθμίζει τη υποκυτταρική εντόπιση της β-κατενίνης και δεδομένου ότι μεσολαβεί η κουρκουμίνη ενεργοποίηση ΡΚϋ1 ενισχυμένη τον εντοπισμό μεμβράνης της β-κατενίνης, αναλύσαμε την επίδραση αυτής της ενεργοποίησης για την έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης χρησιμοποιώντας ανοσοκηλιδώσεως και στην δραστικότητα της μεταγραφής β-κατενίνης χρησιμοποιώντας λουσιφεράση σύστημα αναφοράς σε C4-2 καρκίνου του προστάτη κύτταρα (Σχήματα 5Β και 5Γ). θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά την πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης σε σύγκριση με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) κατεργασμένων κυττάρων (Σχήμα 5Β). Η μείωση των επιπέδων πυρηνικής β-κατενίνης συσχετίζεται με την εξασθένηση της δραστηριότητας της μεταγραφής β-κατενίνη σε C4-2 (Σχήμα 5C). Προκειμένου να προσδιοριστούν τα κατάντη αποτελέσματα της καταστέλλεται δραστικότητα β-κατενίνης, η έκφραση της κυκλίνης D1 αναλύθηκε σε κατεργασία κουρκουμίνη κύτταρα C4-2. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια σημαντική μείωση στην έκφραση της κυκλίνης D1 στο mRNA (Σχήμα 5D) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 5Ε) παρατηρήθηκε σε κατεργασία κουρκουμίνη κύτταρα C4-2. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, καμία εμφανής μεταβολή παρατηρήθηκε στην έκφραση του Wnt 3α, β-κατενίνης και της Ε-καδερίνης (Εικόνα 5Ε).

Καθορίσαμε επίσης την επίδραση της κουρκουμίνης στη δραστικότητα μεταγραφής β-κατενίνης σε κύτταρα LNCaP. Παρόμοια με τα κύτταρα C4-2, δραστηριότητα κουρκουμίνη ανέστειλαν μεταγραφής β-κατενίνης (Σχήμα S3A) και αξιοσημείωτα μείωσε τη έκφραση της κυκλίνης D1 (Σχήμα S3b) σε κύτταρα LNCaP.

θεραπεία κουρκουμίνη καταστέλλει ογκογόνο φαινότυπο σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Ενισχυμένη κλωνογόνο δυναμικό και μειωμένη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου είναι δύο σημαντικά χαρακτηριστικά της ανάπτυξης του καρκίνου και μετάσταση. Η κλωνογονική χαρακτηριστική αύξηση είναι απαραίτητη για τα καρκινικά κύτταρα για τη δημιουργία ενός πρωτογενούς όγκου και τελικά μεταστάσεις. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την ικανότητα της κουρκουμίνης να αναστέλλει αγκυροβόλιο εξαρτώμενα και αγκυροβόλιο ανεξάρτητο σχηματισμό αποικίας. θεραπεία κουρκουμίνη ανέστειλαν αγκυροβόλιο εξαρτώμενα και αγκυροβόλιο σχηματισμός ανεξάρτητων αποικιών με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 6Α, Β). Σε αγκυροβόλιο ανεξάρτητες δοκιμασίες, θεραπεία κουρκουμίνη μείωσε όχι μόνο τον αριθμό των αποικιών, αλλά μειώθηκε επίσης το μέγεθος των αποικιών (Σχήμα 6Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε LNCaP κύτταρα (Σχήμα S3C, D).

Α). Anchorage δοκιμασία σχηματισμού αποικίας εξαρτάται. C4-2 κύτταρα (2000) επιστρώθηκαν όλη τη νύκτα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης για 14 ημέρες και εξετάστηκαν για την ικανότητά τους σχηματισμού αποικιών. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες φαίνονται. Η κουρκουμίνη έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή στην αγκύρωση δοκιμασία σχηματισμού αποικίας εξαρτάται. Μέσος όρος ± SE? n = 3? *

σ

& lt? 0,05. ΣΙ). Anchorage δοκιμασία ανεξάρτητη σχηματισμού αποικίας. C4-2 κύτταρα σπάρθηκαν σε 0.3% αγαρόζη και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης για 9 ημέρες. Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκαν και απεικονίζονται. θεραπεία κουρκουμίνη ανέστειλαν αγκυροβόλιο ανεξάρτητο σχηματισμό αποικιών κυττάρων C4-2. Μέσος όρος ± SE? n = 3?

* ρ

& lt? 0,01. Γ) προσδιορισμό συσσωμάτωσης κυττάρου-κυττάρου. κύτταρα C4-2 κατεργασία με κουρκουμίνη (15 μΜ) ή DMSO για 1 ώρα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν για συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου με επώαση υπό ήπιες συνθήκες ανακίνηση στους 37 ° C υπό την παρουσία 5 mM ΟαΟ

2. Μετά από 6 ώρες επώαση, ένα κλάσμα του μίγματος αντίδρασης αναλύθηκε και φωτογραφήθηκε για συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Μεγαλύτερες συσσωματώματα κυττάρου-κυττάρου παρατηρήθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα κουρκουμίνη, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου DMSO. Αρχικό μεγεθύνσεις 100 ×.

Η

Η προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου διευκολύνεται από μεσοκυττάρια αλληλεπίδραση καντερίνη-cadherin. Η αυξημένη εντοπισμός μεμβράνη του β-κατενίνης ενισχύει τις αλληλεπιδράσεις καντερίνη-κατενίνης και έτσι ενισχύει τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου [12]. Προκειμένου να προσδιοριστεί η επίδραση της ενισχυμένης εντοπισμού μεμβράνης β-κατενίνης, η κουρκουμίνη αντιμετωπίζονται C4-2 και ΡΚϋ1 κύτταρα που υπερεκφράζουν C4-2 (C4-2-ΡΚϋ1) αξιολογήθηκαν για συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου. αντιμετωπίζονται κουρκουμίνη κύτταρα C4-2 σχηματίζονται μεγαλύτερα συσσωματώματα κυττάρου-κυττάρου σε σύγκριση με τα κύτταρα κατεργασμένα ελέγχου (Σχήμα 6C). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ C4-2-ΡΚϋ1 σχηματίζονται συσσωματώματα μεγάλων κυττάρων, πολύ μεγαλύτερα συσσωματώματα κυττάρου-κυττάρου παρατηρήθηκαν κατά την αγωγή κουρκουμίνη αυτών των κυττάρων (Σχήμα S4). Αυτά τα δεδομένα εμπλέκουν ένα ρόλο μεσολάβηση κουρκουμίνη ενεργοποίηση του PKD1 σε συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου.

Η κουρκουμίνη αναστέλλει κυτταρική κινητικότητα μέσω ΡΚϋ1 μεσολάβηση φωσφορυλίωσης κοφιλίνη

Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως εμφανίζουν αυξημένη κυτταρική κινητικότητα για τη διευκόλυνση της μετάστασης. Ως εκ τούτου, η ικανότητα ενός χημειοπροληπτική ή χημειοθεραπευτικό παράγοντα να αναστέλλει την κυτταρική κινητικότητα θα βοηθήσει στην πρόληψη της μετάστασης του καρκίνου. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την επίδραση της κουρκουμίνης στην κυτταρική κινητικότητα χρησιμοποιώντας ένα «επούλωση πληγών» και δοκιμασίες θαλάμου Boyden του. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, θεραπεία κουρκουμίνη ανέστειλε την κυτταρική κινητικότητα του C4-2 κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε αμφότερες τις δοκιμασίες (Σχήμα 7Α, Β). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα επί της κυτταρικής κινητικότητας παρατηρήθηκε επίσης σε LNCaP κύτταρα (Σχήμα S3E).

Α). δοκιμασία μηδέν. C4-2 κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής, σε πλάκες που περιέχουν ένθετα IBIDI. Τα ενθέματα απομακρύνθηκαν από τις πλάκες για να δημιουργήσει κενά (στερεό λευκό γραμμές δείχνουν το πλάτος του διακένου? Διακεκομμένες γραμμές συνορεύουν το κενό) και τις εικόνες αντίθεσης φάσης της ίδιας περιοχής των κενών ελήφθησαν σε διάφορα χρονικά διαστήματα υπό την παρουσία ή απουσία 20 μΜ κουρκουμίνη. θεραπεία κουρκουμίνη ανέστειλε κινητικότητα του C4-2 κυττάρων καρκίνου του προστάτη. ΣΙ). δοκιμασία θαλάμου Boyden του. Ίσοι αριθμοί κυττάρων C4-2 σπάρθηκαν σε θαλάμους του Boyden και επωάζονται DMSO παρουσία ή η κουρκουμίνη (20 μΜ) για 24 ώρες. Μετανάστευσαν κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν, υπολογίζονται και γράφημα. Η κουρκουμίνη ανέστειλαν την κινητικότητα των κυττάρων C4-2. Μέσος όρος ± SE? n = 3? *

σ

& lt? 0,05. ΝΤΟ). Επίδραση της κουρκουμίνης στην έκφραση ακτίνης αναδιαμόρφωσης πρωτεϊνών. Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάζονται από κουρκουμίνη (20 μΜ) ή DMSO αγωγή C4-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Η πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των ζωνών πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη επίπεδο φαίνεται στο γράφημα. θεραπεία κουρκουμίνη προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση στην έκφραση του ανενεργού φωσφο-κοφιλίνη συγκριτικά με DMSO επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Ήσσονος σημασίας μεταβολή παρατηρήθηκε επίσης στην έκφραση της Arp3. Κές αυθαίρετες μονάδες.

Η

Η εξαιρετικά συντονισμένη διαδικασία της αναδιαμόρφωσης της ακτίνης κρύβεται πίσω από τη διαδικασία της κυτταρικής κινητικότητας. Αυτό αναδιαμόρφωση την αυξανόμενη εμπρός απαιτεί την ενορχηστρωμένη δράση ενός αριθμού μορίων που εμπλέκονται στην F-ακτίνης αναδιοργάνωσης. Οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με την ακτίνη (ARP) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην διακλάδωση του νήματος ακτίνης. Η κοφιλίνη πρωτεΐνη είναι ένα μόριο ακτίνης παραγωγής μονομερούς που εμπλέκεται στην αναδιαμόρφωση ακτίνης. Κοφιλίνη ενεργοποιείται από σφεντόνας (SSH) μεσολάβηση φωσφατάση αντίδραση αποφωσφορυλίωσης και απενεργοποιείται από LIM κινάση (ΙΙΜΚ) μεσολάβηση αντιδράσεις φωσφορυλίωσης [2], [21]. ΡΚϋ1 είναι περίπλοκα εμπλέκονται στην αναστολή της κυτταρική κινητικότητα αλληλεπιδρώντας, φωσφορυλίωση και την αναστολή των λειτουργιών των πολλών που συνδέονται με την κινητικότητα του πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένου ενός σφεντόνας 1 σαν (SSH1L) φωσφατάσης [21]. Δεδομένου ότι η κουρκουμίνη ενεργοποιημένα ΡΚϋ1, επιδιώξαμε να διερευνηθεί η επίδραση της κουρκουμίνης στη δραστικότητα και τα επίπεδα της πρωτεΐνης κοφιλίνη και Arp3 με ανοσοστύπωμα. θεραπεία κουρκουμίνη αύξησε τα επίπεδα του ανενεργού φωσφο-κοφιλίνη σε C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη με μικρή ή καθόλου επίδραση στην έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης (Σχήμα 7C). θεραπεία κουρκουμίνη προκάλεσε επίσης μία μικρή μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης Arp3. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ένα πιθανό ρόλο των PKD1 στη μεσολάβηση κουρκουμίνη αναστολή της κινητικότητας των κυττάρων

μέσω

κοφιλίνη φωσφορυλίωσης.

In vivo

επιπτώσεις της κουρκουμίνης στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη

Ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η

in vivo

επίδραση της κουρκουμίνης στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη και β-κατενίνης υποκυτταρικό εντοπισμό. Nude ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως με κύτταρα C4-2 ανεξάρτητου από ανδρογόνο. Μετά την ανάπτυξη του όγκου, οι ποντικοί χορηγήθηκαν ενδονεοπλαστική ενέσεις κουρκουμίνη ή ελέγχου του οχήματος. Την ημέρα 7, οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν και το ποσοστό της αύξησης όγκου μετά από αγωγή κουρκουμίνη προσδιορίστηκε. Η κουρκουμίνη αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου κατά περισσότερο από δύο πτυχές σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου που έλαβαν (*

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 8Α). Επιπλέον, παρατηρήσαμε μεταβολή της β-κατενίνης υποκυτταρική εντόπιση σε ιστούς αγωγή κουρκουμίνη όγκου (Σχήμα 8Β), παρόμοια με

in vitro

παρατηρήσεις (Σχήμα 3 και 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η κουρκουμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη διαμορφώνοντας τις λειτουργίες της β-κατενίνης.

Α) Επίδραση της κουρκουμίνης στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. C4-2 καρκίνου του προστάτη κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν ξενομοσχεύματα σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς. Μετά την ανάπτυξη του όγκου, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδο-ογκικά με κουρκουμίνη (n = 4) ή DMSO (n = 3). Ο ρυθμός ανάπτυξης του όγκου μετρήθηκε μετά 7 ημέρας και η ανάπτυξη τοις εκατό του όγκου μετά από αγωγή έγινε γραφική παράσταση. Η κουρκουμίνη αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Β) Επίδραση της κουρκουμίνης σε β-κατενίνης εντοπισμού. ιστούς όγκων από κουρκουμίνη ή ποντικούς που υπέστησαν αγωγή ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση IHC χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-β-κατενίνης. Ενισχυμένη χρώση μεμβρανώδη β-κατενίνης παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή κουρκουμίνη σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου. Αρχικό μεγεθύνσεις 400 ×.

Η

Συζήτηση

Η απορύθμιση της PKD1, μια κινάση σερίνης-θρεονίνης, έχει συνδεθεί με την εξέλιξη του καρκίνου [2], [4], [6]. ΡΚϋ1 εκφράζεται στο υψηλότερο επίπεδο στον αδένα του προστάτη και διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κανονική φυσιολογία του προστάτη [9], [10]. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας έχει αποκαλύψει την σύνδεση των ΡΚϋ1 αρνητική ρύθμιση με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [3], [11]. προηγούμενη εργασία μας έχει φωτίζεται επίσης το ρόλο των ΡΚϋ1 στη φωσφορυλίωση E-cadherin, η ρύθμιση της κυτταρικής κινητικότητας και συσσωμάτωση κυττάρου-κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [13]. Επιπλέον, έχουμε δείξει ΡΚϋ1 να αλληλεπιδρούν με, φωσφορυλιώνει και ρυθμίζει τη λειτουργία του β-κατενίνης [12]. Η φυσική μακρολακτόνη Βρυοστατίνη 1 ενεργοποιεί PKD1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [12]. Το ενεργοποιημένο ΡΚϋ1 φωσφορυλιώνει και μετατοπίζεται πυρηνικής β-κατενίνης από τον πυρήνα με αποτέλεσμα την αναστολή της β-κατενίνης /TCF μεταγραφική δραστηριότητα [12]. Έτσι φυσικές ενώσεις που ρυθμίζουν την ενεργοποίηση PKD1 μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Η κουρκουμίνη είναι μια φυσική ένωση που είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές για την πρόληψη και θεραπεία διαφόρων καρκίνων [33] – [35]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η κουρκουμίνη ενεργοποιεί ΡΚϋ1, εξασθενεί β-κατενίνης /TCF μεταγραφική δραστηριότητα και εμπλουτίζει μεμβράνη β-κατενίνης με αποτέλεσμα την καταστολή της ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη.

β-κατενίνη είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην οντογένεση και ογκογένεση. Σε συνδυασμό με TCF και ρ300, λειτουργεί ως παράγοντας μεταγραφής στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt [36]. Επιπλέον, β-κατενίνης, μαζί με λειτουργίες Ε-καδερίνης στην κυτταρική μεμβράνη ως ένα κρίσιμο συστατικό της συνδέσεως προσφύσεως για την ενίσχυση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου [37]. Έτσι, η κακή ρύθμιση της β-κατενίνης έχει συσχετισθεί με την ανάπτυξη πολλών τύπων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [36], [38], [39]. Δείξαμε προηγουμένως ένα νέο μηχανισμό ρύθμισης β-κατενίνης μέσω της δράσης των ΡΚϋ1 [12]. Στο παρόν, έχουμε αποκαλύψει ότι η κουρκουμίνη ενεργοποιεί ΡΚϋ1 μέσα σε 1 ώρα της αγωγής (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή, έχουμε καταδείξει ότι η δραστικότητα β-κατενίνης αναστέλλεται από κουρκουμίνη, μετά την ενεργοποίηση ΡΚϋ1 (Σχήμα 5C).

Από β-κατενίνης είναι ένα σημαντικό μόριο σηματοδότησης, οι λειτουργίες του ρυθμίζονται με πολλαπλές οδούς [40]. Ενώ η κουρκουμίνη έχει δειχθεί ότι αναστέλλει δραστικότητα β-κατενίνης /TCF μεταγραφή [41], ακριβής μοριακοί μηχανισμοί της δεν είναι πλήρως γνωστές. Εδώ, μπορούμε για πρώτη φορά έδειξαν ότι η κουρκουμίνη εξασθενεί δραστικότητα β-κατενίνης /TCF μεταγραφή

μέσω

ενεργοποίησης PKD1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μελέτες έχουν επίσης αναφερθεί η αναστολή της β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα κατά την αγωγή κουρκουμίνη σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα μέσω της κασπάσης-3 με τη μεσολάβηση αποικοδόμηση του β-κατενίνης [42]. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στα συνολικά επίπεδα έκφρασης β-κατενίνης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή παραλλαγή τύπου κυττάρου σε κουρκουμίνη μεσολαβεί αναστολή της δράσης της μεταγραφής β-κατενίνης. * P & lt? 0,05.