;

Αφηρημένο

Ιστορικό

S-προπαργυλο-κυστεΐνη (SPRC), ένα H

2S δότη, είναι ένα δομικό ανάλογο του S-allycysteine ​​(SAC). Ερευνήθηκε για πιθανές αντικαρκινική δράση της στην ΓΓΕ-7901 γαστρικά καρκινικά κύτταρα και τους πιθανούς μηχανισμούς που μπορούν να συμμετέχουν.

Μέθοδοι και Ευρήματα

θεραπεία SPRC μειώθηκε σημαντικά κυτταρικής βιωσιμότητας, καταστέλλεται η πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των SPRC-7901 γαστρικών καρκινικών κυττάρων, ήταν προ-αποπτωτικών καθώς προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G

1 /S. Σε μια

in vivo μελέτη

, ενδο-περιτοναϊκή έγχυση 50 mg /kg και 100 mg /kg του SPRC μείωσε σημαντικά τα βάρη του όγκου και οι όγκοι του όγκου του γαστρικού εμφυτευμάτων καρκίνου σε γυμνά ποντίκια, με ποσοστό αναστολής της ανάπτυξης του όγκου του 40-75%. SPRC επάγεται επίσης ένα προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα σε ιστούς του καρκίνου και αυξημένα τις εκφράσεις της ρ53 και Bax σε όγκους και κύτταρα. θεραπεία SPRC αύξησε επίσης πρωτεΐνη έκφραση του κυσταθειόνης-γ-λυάση (CSE) σε κύτταρα και οι όγκοι, και αυξημένα H

2S επίπεδα σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας, το πλάσμα και καρκινική δράση Πρόσωπα του γαστρικού καρκίνου που προκαλείται από γυμνούς ποντικούς με 2, 2,3 και 1,4 φορές, αντίστοιχα. Οι περισσότερες από τις λειτουργίες κατά του καρκίνου του SPRC στα κύτταρα και οι όγκοι ήταν σημαντικά κατασταλεί από PAG, έναν αναστολέα της δραστηριότητας του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου.

Συμπεράσματα

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα της μελέτης μας παρέχουν γνώσεις σχετικά με ένα μυθιστόρημα αντικαρκινική δράση της H

2S, καθώς και των SPRC σε γαστρικού καρκίνου μέσω της επαγωγής της δραστηριότητας ενός νέου στόχου, του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου

Παράθεση:. ΜΑ K, Liu Υ, Zhu Q, Liu Ch, Duan JL, Tan BK-H, et al. (2011) H

2S Δωρητών, S-προπαργυλ-κυστεΐνη, Αυξάνει ΧΑΚ SGC-7901 και Καρκίνος-Induced Ποντίκια: Τα στοιχεία για μια νέα Αντικαρκινική επίδραση του ενδογενούς H

2S; PLoS ONE 6 (6): e20525. doi: 10.1371 /journal.pone.0020525

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Απριλίου, 2011? Δεκτές: 2, Μαΐου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 27 του Ιούνη 2011

Copyright: © 2011 MA et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αναγνωρίζουμε η οικονομική ενίσχυση που παρέχεται από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Διακεκριμένοι Νέων Επιστημόνων Grant 385 (Νο 30888002) στην Κίνα, το Εθνικό Σχέδιο 973 (2007CB512006 και 2010CB912600) και τη Σαγκάη-Unilever Research & amp? Ταμείο Ανάπτυξης (08.540.750.400).

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

S-προπαργυλο-κυστεΐνη (SPRC) είναι ένα δομικό ανάλογο του S-allycysteine ​​(SAC ) με την ίδια δομή που περιέχουν κυστεΐνη. SAC, μία από τις κύριες ενώσεις σε ηλικιωμένους εκχύλισμα σκόρδου, προέρχεται από την αποδόμηση του

S

-αλκ (εν) υλ σουλφοξείδια κυστεΐνη (σημεία ACS). Αυτή η ένωση έχει κατά του όγκου [1], [2], αντι-βακτηριακή [3], αντι-μυκητιασική [4], αντι-ηπατοτοξικές [5], καρδιοπροστατευτικές ιδιότητες [6] και απόπτωση [7]. Η πακλιταξέλη λιποσωμάτων, ένα σκεύασμα με βάση τα λιπίδια του αντικαρκινικού φαρμάκου, η πακλιταξέλη, έχει γίνει μια πρώτης γραμμής φάρμακο για τη θεραπεία των πυρίμαχων ωοθηκών, του μαστού, του στομάχου και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινικές δράσεις της SPRC και σύγκριση αυτών με εκείνους της SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων.

κυσταθειόνης-γ-λυάση (ΧΑΚ) είναι ένα μέλος της οικογένειας ενζύμων trans-θειάφισμα και είναι υπεύθυνο για την κατάλυση της αντίδρασης απόσπασης φωσφορική πυριδοξάλη εξαρτώμενη β-δισουλφίδιο καταλήγοντας σε αμμώνιο, πυροσταφυλικό και thiocysteine. Thiocysteine ​​μπορεί στη συνέχεια να αντιδράσει με άλλα θειόλες για την παραγωγή H

2S. Ο καταστολέας ρ53 πρωτεΐνη όγκου παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA και άλλες γονιδιωματικές εκτροπές. Η ενεργοποίηση της ρ53 μπορεί να οδηγήσει είτε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και επιδιόρθωσης του DNA ή απόπτωση. Bax είναι ένα βασικό συστατικό στην κυτταρική απόπτωση μέσω της μιτοχονδριακής στρες, ενώ Bcl-2 ασκεί μια λειτουργία επιβίωσης σε απάντηση σε ένα ευρύ φάσμα των αποπτωτικών ερεθισμάτων μέσω αναστολής της απελευθέρωσης του μιτοχονδριακού κυτοχρώματος c. Εδώ, για πρώτη φορά, βρήκαμε ότι οι αντικαρκινικές δράσεις του SPRC εμπλέκεται ένα σουλφίδιο υδρογόνου (Η

2S) μεσολάβηση οδό. SPRC μπορεί να υποστεί β-απομάκρυνση από ΧΑΚ να παράγει ενδογενή H

2S, η οποία μπορεί να ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση του ρ53 και Bax, με αποτέλεσμα την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση. έτσι μελέτη μας έδειξε μία νέα αντικαρκινική επίδραση του ενδογενούς H

2S δότη, SPRC, για τον καρκίνο του γαστρικού μέσω επαγωγής της δραστηριότητας ενός νέου στόχου, CSE. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι SPRC ήταν σε θέση να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση καθώς και την ανάπτυξη του όγκου σε καρκίνο του στομάχου που προκαλείται από το μοντέλο γυμνών ποντικών, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να είναι ένας πιθανός παράγοντας για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου στον άνθρωπο. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι αντικαρκινικές επιδράσεις του SPRC αποδόθηκαν σε καταστολή του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή της απόπτωσης. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι SPRC θα μπορούσε να ρυθμίσει το γονίδιο εκφράσεις του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου, Bax και p53. Βρήκαμε ότι η ΠΣΟ, ένας αναστολέας της δραστηριότητας του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου, θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά τις αντικαρκινικές επιδράσεις του SPRC.

Αποτελέσματα

δοσοεξαρτώμενες, η ανάπτυξη ανασταλτικές και ανίχνευση των κυτταροστατικών αποτελεσμάτων της SPRC στην ΓΓΕ- 7901 κύτταρα

Επιδράσεις της SPRC επί SGC-7901 γαστρικό καρκίνο κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 1Α, 1 μΜ και 10 μΜ SPRC παράγονται 18-25% αναστολή της βιωσιμότητας των SGC-7901 κύτταρα. 20 mM έως 30 mM SPRC προκάλεσε περίπου 50% αναστολή της βιωσιμότητας κυττάρων. Βρήκαμε επίσης ότι SPRC σε χαμηλές συγκεντρώσεις 1 μΜ και 10 μΜ θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας και την ικανότητα μετανάστευσης των SGC-7901? Αυτά τα αποτελέσματα ήταν πιο σημαντική σε σύγκριση με το SAC (Σχήματα 1Β, 1C και 1D). PAG, ένας αναστολέας του ΧΑΚ, μπλοκάρει το ανασταλτικό αποτέλεσμα SPCR στην κυτταρική ανάπτυξη (Σχήματα 1Β και 1Γ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οδός ΧΑΚ είχε εμπλακεί σε SPRC επαγόμενη καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης.

A. μελέτη δόσης-απόκρισης των αποτελεσμάτων της SPRC στην αναστολή της ανάπτυξης του SGC-7901 κύτταρα. B. Επιπτώσεις της SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων για τη βιωσιμότητα της ΓΓΕ-7901 κύτταρα. Γ Επιδράσεις SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων για το σχηματισμό αποικιών σε SGC-7901 κύτταρα. Δ Επιδράσεις SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων στην ικανότητα μετανάστευσης των SGC-7901 κύτταρα. ικανότητα διαφορική μετανάστευση των κυττάρων εξετάσθηκε με τη δοκιμασία πληγή-κλείσιμο. Ε Επιδράσεις SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων σε τραύματος ταχύτητα κλεισίματος. Οι τιμές εκφράζονται ως% του ελέγχου. * Αντιπροσωπεύουν σημαντική διαφορά μεταξύ ελέγχου έναντι SPRC, SAC και ομάδες λιποσωμάτων πακλιταξέλη (ρ & lt? 0,01).

# αντιπροσωπεύουν σημαντική διαφορά (p & lt? 0,01) μεταξύ SPRC vs ομάδα SPRC + PAG (p & lt? 0,01).

Η

μορφολογικές αλλαγές, την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο ανάλυσης

Η απόπτωση [ ,,,0],21] είναι προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος που χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένες δομικές αλλαγές που περιλαμβάνουν συρρίκνωση κυττάρου, πυρηνική συμπύκνωση και κατάτμηση του DNA. χρώση Hoechst χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση των μορφολογικών αλλαγών των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη λιποσωμάτων, SPRC και SAC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε ότι μορφολογικές αλλαγές χαρακτηριστικές απόπτωσης εμφανίστηκαν σε SGC-7901 κυττάρων μετά από επεξεργασία με SPRC ed για 24 ώρες. Τα κύτταρα παρουσίασαν ένα πυκνό πρότυπο χρώσης με κατάτμηση του DNA και την απουσία διακριτές πυρηνικών μεμβρανών. Τα κύτταρα ελέγχου δεν εμφάνισαν παρόμοια μορφολογικές αλλαγές. Η απόπτωση που επάγουν επιδράσεις του SPRC αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 2Β)? 24 ωρη συνεδρία της του SGC-7901 κυττάρων με 10 μΜ SPRC οδήγησε σε σημαντική αύξηση της τάξης του 26% των αποπτωτικών σωμάτων, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Σε σύγκριση, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε πακλιταξέλη λιποσωμάτων και SAC-αγωγή ομάδες ήταν λιγότερο από περίπου 8% και 4%, αντίστοιχα.

A. θεραπεία με SPRC, SAC, PAG, PAG + SPRC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων (10 μΜ) σε 24 ώρες για τον προσδιορισμό των αποπτωτικών αλλαγές αναλύονται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. B. Ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. Γ κατανομή κυτταρικού κύκλου. Μαρκαδόροι για φωτογραφίες δείχνουν: 1, Ελέγχου. 2, SPRC 10 μΜ. 3. SAC 10 μΜ. 4. PAG 10 μΜ. 5. SPRC + PAG, κάθε 10 μΜ. 6. Η πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 μΜ.

Η

Η επίδραση της SPRC σχετικά με τη δραστηριότητα του κυτταρικού κύκλου της ΓΓΕ-7901 κυττάρων αναλύθηκε με την εκτέλεση χρώση ιωδιούχου προπιδίου που ακολουθείται από ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής. Συνεπής με την επίδρασή της στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων, που προκαλείται από SPRC διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε SGC-7901 κύτταρα σε G φάση

1 /S (Σχήμα 2C). 10 υΜ SPRC οδήγησε επίσης σε αυξημένη συσσώρευση 24% των κυττάρων στο G

1 φάση και μειωμένη κατά 20% των κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτό υποδηλώνει ότι υπάρχει μια απόφραξη της G

1 /μετάβασης φάσης S, η οποία μπορεί να προκαλέσει καταστολή ανάπτυξης κυττάρου ή απόπτωση. Η προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα SPRC, καθώς και η επίδρασή της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου σε G

1 φάσης /S ανεστάλη επίσης σε μεγάλο βαθμό από την ΠΣΟ.

Επιδράσεις της SPRC στην έκφραση της πρωτεΐνης του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου και της δραστηριότητας και H

επίπεδα 2S

Οι εκφράσεις της πρωτεΐνης του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου στις ΓΓΕ-7901 κύτταρα (Σχήματα 3Α, Β και Γ) και όγκους σε άτριχα ποντίκια (σχήματα 3 D, Ε και ΣΤ) αυξήθηκαν σημαντικά κατά τη θεραπεία SPRC. SPRC σε δόσεις των 50 mg /kg και 100 mg /kg αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου κατά περίπου 1,4 φορές (Σχήμα 3G). δραστηριότητα ΧΑΚ σε όγκους του SPRC αγωγή γυμνά ποντίκια ήταν υψηλότερη από ότι σε ιστούς της ομάδος SAC-θεραπεία. H

επίπεδα 2S σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 3Η), μετρήθηκαν στο πλάσμα άτριχων ποντικών (Σχήμα 3θ). Η H

επίπεδο 2S στα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας των 10 κυττάρων μΜ SPRC επεξεργασία και την H πλάσμα

2S των 50 mg /kg και 100 mg /kg SPRC αγωγή γυμνά ποντίκια ήταν επίσης σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (P & lt? 0,05). Σε σύγκριση με το SAC-θεραπεία ομάδα ποντικών, η ομάδα SPRC ασθενείς είχαν σημαντικά υψηλότερο H

επίπεδο 2S (P & lt? 0,05). Τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου, η δραστηριότητα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου και H

2S στην ομάδα SPRC αγωγή ήταν όλα σε μεγάλο βαθμό μειώνονται με επεξεργασία ΠΣΟ. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έτσι πρότεινε ότι η αντικαρκινική δράση της SPRC ήταν προκαλείται από την ενεργοποίηση του /H

2S οδού ΧΑΚ

Για την Α, Λωρίδα 1, ομάδα ελέγχου.? Διαδρομή 2, η πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 μΜ? Λωρίδα 3, SPRC 1 υΜ? Λωρίδα 4, SPRC 10 μΜ? Λωρίδα 5, SAC 10 υΜ? Λωρίδα 6, ομάδα ελέγχου? Διαδρομή 7, SPRC 10 μΜ? Διαδρομή 8, PAG 10 μΜ? Λωρίδα 9, PAG + SPRC 10 μΜ. Για D: Λωρίδα 1, ελέγχου? Λωρίδα 2, πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 mg /kg? Λωρίδα 3, SPRC 50 mg /kg? Λωρίδα 4, SPRC 100 mg /kg? Λωρίδα 5, SAC 100 mg /kg? Λωρίδα 6, ελέγχου? Διαδρομή 7, SPRC 100 mg /kg? Διαδρομή 8, PAG 100 mg /kg? Διαδρομή 9, PAG + SPRC 100 mg /kg. Η σχετική ένταση υπολογίζεται με σύγκριση με την ένταση του GAPDH χρησιμοποιώντας πυκνομετρία (φαίνεται στα γραφήματα στα δεξιά). * Αντιπροσωπεύουν σημαντική διαφορά μεταξύ ελέγχου έναντι SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων αντιμετωπίζονται ομάδες (p & lt? 0,05).

# αντιπροσωπεύει σημαντική διαφορά μεταξύ SPRC 10 μΜ έναντι της ομάδας SPRC + PAG. Σχήμα G δείχνει τη δραστηριότητα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου (μmol /g) στο γαστρικό καρκίνο όλων των ομάδων. Το Σχήμα Η δείχνει H

επίπεδα 2S (μΜ) σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας. Σχήμα Ι δείχνουν πλάσμα H

2S επίπεδα σε γαστρικών όγκων γυμνών ποντικών των διαφορετικών ομάδων.

Η

Επιδράσεις της SPRC και SAC στο γονίδιο εκφράσεις του Βαχ, ρ53 και Bcl-2

Το αποτέλεσμα της ανάπτυξης καταστολή των SPRC στην SGC-7901 κυττάρων αξιολογήθηκε για την ανάλυση των επιπτώσεων στη δραστηριότητα του κυτταρικού κύκλου και τις εκφράσεις των γονιδίων ρυθμιστή της απόπτωσης – Bax, p53 και Bcl-2. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Α και 4Β, βρήκαμε ότι η θεραπεία 24 ώρες SPRC αύξησε σημαντικά το επίπεδο mRNA (περίπου 1,5 φορές) και το επίπεδο πρωτεΐνης ρ53 και Bax του SGC-7901 κύτταρα.

A. Διαδρομή 1, η πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 μΜ? Λωρίδα 2, τον έλεγχο? Λωρίδα 3, 10 μΜ SPRC? Λωρίδα 4, SPRC 1 υΜ? Λωρίδα 5, SAC 10 υΜ? Λωρίδα 6, SAC 1 μΜ. Η σχετική ένταση υπολογίζεται με σύγκριση με την ένταση της β-ακτίνης χρησιμοποιώντας πυκνομετρία (φαίνεται στα γραφήματα στα δεξιά). B. Η ποσοτικοποίηση της Βαχ, ρ53 και mRNA έκφραση Bcl-2. * Αντιπροσωπεύουν σημαντική σημασία μεταξύ ελέγχου vs SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων σε ρ & lt? 0.05 επίπεδο

Η

καταστολή της ανάπτυξης [22] και η επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης σε όγκους από SPRC

Η ανάπτυξη. του γαστρικού καρκίνου αξιολογείται από τον όγκο του όγκου μειώθηκε σημαντικά με κατεργασία SPRC των 50 mg /kg και 100 mg /kg βάρους σώματος κάθε δεύτερη ημέρα, τρεις φορές την εβδομάδα με ένα IR του 40-75% (Σχήμα 5Α και 5Β). Το βάρος του όγκου μειώθηκε επίσης σημαντικά σε ομάδες SPRC αγωγή (Σχήματα 5C), ενώ θεραπεία PAG μείωσε σημαντικά τη λειτουργία καταστολή της ανάπτυξης των SPRC. Οι αντιπροσωπευτικοί όγκοι σε διαφορετικές ομάδες έδειξαν προφανή αλλαγή μεγέθους του όγκου (Εικόνες 5D και 5Ε).

Α. Αλλαγή στο μέσο όρο του όγκου των όγκων (mm

3). Β ρυθμός αναστολής (IR) στην αύξηση του όγκου σε διαφορετικές ημέρες. Γ Μεταβολή του βάρους του όγκου. Δ Αλλαγή στο μέγεθος του όγκου. Ε

In vivo

απεικόνιση του όγκου των άτριχων ποντικών μετά τη θεραπεία για 24 ημέρες. * Αντιπροσωπεύουν σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) μεταξύ ελέγχου εναντίον SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων ομάδων.

#represents σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) μεταξύ SPRC 100 mg /kg έναντι SPRC + PAG και PAG ομάδων. ΣΤ Η.Ε. χρώση με ενίσχυση των 4 × 10 και μεγαλύτερο ενισχυμένο εικόνων (100 × 10) στη δεξιά γωνία. Γ χρώση σήραγγας (100 × 10) αποπτωτικών σωμάτων των γαστρικών όγκων. δείκτες αριθμό στις φωτογραφίες δείχνουν: 1, ομάδα ελέγχου? 2, η πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 mg /kg ομάδα? 3, SPRC 50 mg /kg ομάδα? 4, SPRC 100 mg /kg ομάδα? 5, SAC 100 mg /kg ομάδα.

Η

Θα εξεταστεί επίσης κατά πόσον η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από το SPRC αντανακλάται στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Η &? Ε χρώση αποκάλυψε (Σχήμα 5F) επιπλέον αποπτωτικών καρκινικών κυττάρων σε πακλιταξέλη λιποσωμάτων και SPRC αγωγή ομάδες. χρώση TUNEL έδειξε ότι οι όγκοι από ποντικούς SPRC ασθενείς είχαν μία αξιοσημείωτα υψηλότερη αρίθμηση των αποπτωτικών σωμάτων σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου (Σχήμα 5G). Η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης της απόπτωσης στους όγκους ήταν σύμφωνη με την επίδραση της αναστολής της ανάπτυξης όγκου από SPRC, υποδηλώνοντας ότι SPRC εξασκείται αναστολή ανάπτυξης όγκου εν μέρει με αύξηση της απόπτωσης στους όγκους.

Επιδράσεις της SPRC και SAC για την πρωτεΐνης και mRNA εκφράσεις [23] του Βαχ, ρ53 και Bcl-2

Η επίδραση καταστολής της SPRC επί γαστρικού καρκίνου αξιολογήθηκε περαιτέρω με Βαχ, ρ53 και Bcl-2. Αυτή η επίδραση του SPRC επιβεβαιώθηκε επίσης σε καρκίνο του στομάχου που προκαλείται από γυμνούς ποντικούς όπως φαίνεται στα σχήματα 6Α και 6Β. Η πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του Βαχ και p53 σε όγκους SPRC αγωγή ήταν σημαντικά αυξημένα, ενώ εκείνα του Bcl-2 μειώθηκαν, σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου. Ο εντοπισμός και η ποσότητα αυτών των τριών πρωτεϊνών σε ιστούς όγκων ταυτοποιήθηκαν επίσης με ανοσοχρώση. Όπως φαίνεται στα σχήματα 6C και 6D, καμία προφανής ανοσοχρώση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Βαχ και ρ53, παρατηρήθηκε στην ομάδα ελέγχου, ενώ ένα ισχυρό σήμα ανοσοαντιδραστικότητας παρατηρήθηκε στις ομάδες λιποσώματα αγωγή SPRC- και πακλιταξέλη. Μια πολύ ασθενώς θετική χρώση για την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bcl-2, ανιχνεύθηκε σε SPRC-, πακλιταξέλη liposome- και ομάδες SAC επεξεργασμένο στο σχήμα 6Ε. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι SPRC είναι σε θέση να ρυθμίζει τις γονίδιο εκφράσεις του Βαχ, ρ53 και Bcl-2 προς κυτταρικής απόπτωσης.

A. έκφραση πρωτεϊνών, Λωρίδα 1 ελέγχου? Λωρίδα 2 πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 mg /kg? Διαδρομή 3 SPRC 50 mg /kg? Λωρίδα 4, SPRC 100 mg /kg? Λωρίδα 5, SAC 100 mg /kg. Η σχετική ένταση υπολογίστηκε με σύγκριση με την ένταση της β-ακτίνης χρησιμοποιώντας πυκνομετρία. έκφραση Β mRNA. * Αντιπροσωπεύουν στατιστική σημαντικότητα μεταξύ ελέγχου vs SPRC, SAC και πακλιταξέλη liposome- αντιμετωπίζονται ομάδες (p & lt? 0,05). C. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Βαχ. D. Η ανοσοϊστοχημική χρώση του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, ρ53. Ε Η ανοσοϊστοχημική χρώση του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bcl-2. δείκτες αριθμό στις φωτογραφίες στο Σχήμα 6 Γ, Δ και Ε αναφέρει: 1, ομάδα ελέγχου? 2, η πακλιταξέλη λιποσωμάτων 10 mg /kg? 3, SPRC 50 mg /kg? 4, SPRC 100 mg /kg? 5, SAC 100 mg /kg.

Η

H

2S απέδειξε την απόπτωση και αντι- αποτέλεσμα του πολλαπλασιασμού επί SGC-7901 κύτταρα και γαστρικό καρκίνο μοντέλο άτριχων ποντικών

διαπίστωσε ότι SPRC αυξημένη δραστηριότητα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου και η οποία έχει ως αποτέλεσμα αυξημένα H

2S επίπεδα, η οποία με τη σειρά της ρυθμίζει γονιδιακή έκφραση του Bax, p53 και Bcl2. Bax άμεσα επάγεται μιτοχόνδρια καθοδηγείται απόπτωση μέσω αυξημένης έκφρασης Mt και μειωμένη έκφραση Bcl-2. Ο καταστολέας ρ53 πρωτεΐνη όγκου παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA και άλλες γονιδιωματικές εκτροπές. Η ενεργοποίηση της ρ53 οδηγεί είτε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βλάβης του DNA ή απόπτωση μέσω Bax πρωτεΐνη στο Σχήμα 7. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ένα νέο μηχανισμό για τις αντικαρκινικές επιδράσεις του SPRC μέσω Πρόσωπα /H

2S-επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης μέσω η p53 /Bax οδού.

Τα επίπεδα αύξησης του H2S έχουν μετατραπεί διαμορφώνει Bax, p53 και πρωτεΐνες Bcl2 και την έκφραση του mRNA. Bax έχει απόπτωση που επάγεται μέσω Mt και την έκφραση Bcl-2. p53 οδηγεί είτε την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βλάβης του DNA ή απόπτωση μέσω Bax πρωτεΐνη.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, το έχουμε αποδείξει μια νέα αντικαρκινική δράση των SPRC για τον καρκίνο του στομάχου και του παρέχονται επίσης στοιχεία που να υποδηλώνουν πιθανό μηχανισμό του. Αρκετά νέα σημεία που δημιουργούνται από τη μελέτη μας. Πρώτον, έχουμε αποδείξει ότι SPRC ήταν σε θέση να μειώσει την ικανότητα της κυτταρικής ανάπτυξης σημαντικά, αλλά και την καταστολή της μετανάστευσης των SGC-7901 κύτταρα. Δεύτερον, βρήκαμε ότι SPRC ήταν σε θέση να αυξήσει την απόπτωση που σχετίζονται με μορφολογικές αλλαγές και προκάλεσε μεγάλη αύξηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων ταυτόχρονα με προφανή διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G

1 /S φάσης. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δύο ευρήματα υποστηρίζουν στοιχεία για μια ανασταλτική επίδραση του SPRC επί SGC-7901 κύτταρα. Τρίτον, αποδείξαμε επίσης ότι ενδο-περιτοναϊκή χορήγηση SPRC σε δόσεις των 50 και 100 mg /kg βάρους σώματος κάθε άλλη τρεις φορές την ημέρα την εβδομάδα ήταν αποτελεσματικό στην αναστολή της ανάπτυξης των γαστρικών όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Τέταρτον, βρήκαμε ότι SPRC θα μπορούσε να αυξήσει τη δραστηριότητα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου, αλλά και την έκφραση της πρωτεΐνης του με αποτέλεσμα την αυξημένη H

επίπεδα 2S στα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και το πλάσμα άτριχων ποντικών. Πέμπτον, βρήκαμε ότι PAG, ένας αναστολέας του ΧΑΚ, θα μπορούσε να καταστείλει σε μεγάλο βαθμό τις παραπάνω λειτουργίες του SPRC. Έκτον, βρήκαμε ότι η θεραπεία SPRC προκαλούνται προφανείς ανύψωση του mRNA και της πρωτεΐνης εκφράσεις Βαχ και ρ53.

Έχει αναφερθεί ότι H

2S [24], [25], [26] μπορεί να παραχθεί σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα από το πυριδοξαλ-5-φωσφορική-εξαρτώμενο ένζυμο ΧΑΚ, για τις οποίες L-κυστεΐνη είναι το υπόστρωμα. Πρόσωπα [27] θα μπορούσε καταλύουν φωσφορική πυριδοξάλη εξαρτώμενη β-δισουλφίδιο και αντίδραση απομάκρυνσης, με αποτέλεσμα το σχηματισμό του αμμωνίου, πυροσταφυλικού και thiocysteine. Thiocysteine ​​συνέχεια αντιδρά με άλλες θειόλες για το σχηματισμό H

2S. PAG έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες μελέτες για να ελεγχθεί η βιολογική δράση της αναστολής της ενδογενούς H

2S παραγωγή [28] SPRC, ένα ανάλογο της SAC έχει την δομή που περιέχει κυστεΐνη η οποία μπορεί να υποβληθεί σε β-απομάκρυνση και να χρησιμεύσει ως ένα υπόστρωμα του ΧΑΚ. Η βασική ομάδα προπαργυλίου στο SPRC μπορεί να συνδυάζονται με τις περιοχές δραστηριότητας του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου για την αύξηση της δραστηριότητας του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου. Στη μελέτη μας, προφανής αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης ΧΑΚ στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και όγκοι του γυμνούς ποντικούς παρατηρήθηκε στην ομάδα SPRC επεξεργασμένο? Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί ως «αντισταθμιστικό αποτέλεσμα» για την παραγωγή H

2S να αντιμετωπίσει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα αντιμετωπίζονται από το H

2S δότη, NaHS, εμφανίζεται μια αύξηση στην βλάβη του DNA, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και τη σταθεροποίηση της ρ53, σε συνδυασμό με επαγωγή της κατάντη πρωτεϊνών όπως ρ21, Βαχ και κυτόχρωμα c [29]. Έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία των παγκρεατικά κυψελοειδή κύτταρα με H

2S έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση, που προκύπτουν από την ενεργοποίηση της κασπάσης 3, μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης Bcl-2 και την ενεργοποίηση της έκφρασης Βαχ. H

2S μπορούσε επίσης να επάγει απόπτωση των β-κυττάρων που εκκρίνουν ινσουλίνη ενισχύοντας ER στρες μέσω της ενεργοποίησης p38 ΜΑΡΚ [30]. Έχει αναφερθεί ότι η ρ53 προκαλεί απόπτωση είτε αυξάνοντας μεταγραφική δραστικότητα του προ-αποπτωτικών γονιδίων όπως Βαχ ή να καταστέλλουν την δραστικότητα του αντι-αποπτωτικό γονίδιο Bcl-2 οικογένειας [31], [32]. Bax είναι επίσης γνωστό ότι επάγει μιτοχόνδρια με γνώμονα την απόπτωση. Εδώ βρήκαμε επίσης ότι η ενεργοποίηση του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου και της αυξημένης H

επίπεδα 2S με επεξεργασία SPRC συνδέθηκαν με αυξημένη p53 και εκφράσεις Bax στα γαστρικά κύτταρα και όγκους. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ένα νέο μηχανισμό για τις αντικαρκινικές επιδράσεις του SPRC μέσω του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου /H

2S που προκαλείται από την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση μέσω του p53 /Bax οδού.

Εν κατακλείδι, μας

in vitro

και

in vivo

πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι ο δότης υδρόθειο, SPRC, είχε προφανή ανασταλτική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα επί γαστρικού καρκίνου. SPRC θα μπορούσε να αυξήσει τη δραστηριότητα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου, με αποτέλεσμα την αύξηση του επιπέδου της H

2S, η οποία με τη σειρά της ρυθμίζει γονιδιακή έκφραση του Bax, p53 και Bcl2.

Μέθοδοι

Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα των ζώων τηρούνται οι κανόνες των ζώων διαχείριση των τοπικών αρχών και «Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου» της Πειραματικής Κέντρο ζώων του Πανεπιστημίου Fudan, Σαγκάη, ΛΔΚ.

Λεπτομέρειες από την έγκριση της μελέτης από την επιτροπή δεοντολογίας

ζώο Αξιολόγηση Πιστοποιητικό αριθ .: SCXK hu (Σαγκάη) 2009-0019

έγκρισης Μελέτη No .: Πανεπιστήμιο Πειραματικό Τμήμα Ζωικής Παραγωγής Research Fudan, έγκριση αρ SYXK hu (Shanghai) 2009-0082

Ονομάστηκε συμβούλιο επιθεώρησης: Πρόεδρος: Καθ Yi-Zhun ZHU Dean, Τμήμα Φαρμακευτικής Fudan Πανεπιστήμιο. Αντιπρόεδρος: Καθ Weiyue Lu, καθηγητής Wei Wu, Καθηγητής Xun Sun, καθηγητής Wenjiang Zhou

Μέλη: Καθ Zhang Yun yi, ο καθηγητής Λι Cong, καθηγ. Jiang Chen, καθηγητή Γιν Geng Li, καθηγητής Χονγκ mei ji, καθηγητής Li Xu yang

Γραμματέας:. Tao Lin Lin

Χημικά

SPRC συντέθηκε από την αντίδραση L-κυστεΐνη με προπαργυλοβρωμίδιο. Το προϊόν καθαρίζεται με ανα-κρυστάλλωση από αιθανόλη-νερό. Το τελικό προϊόν επαληθεύθηκε με φασματοσκοπία 1Η πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. SAC αγοράστηκε από Tokyo Kasei (Tokyo, Japan). Η πακλιταξέλη λιποσωμάτων ήταν ένα δώρο από Luye Pharma Group Ltd., Σιγκαπούρη. Βι (ΠΣΟ) αγοράστηκε από Γιντζένγκ Chemical CO., LTD (Σαγκάη, Κίνα). ΜΤΤ (διμεθυλο θειαζολυλο τετραζολίου) αγοράστηκε από Amresco Inc. ΗΠΑ. Hoechst χρώση, κυτταρικού κύκλου και κιτ ανάλυσης απόπτωσης αγοράστηκαν από Beyotime, την Κίνα. RPMI 1640 αγοράστηκαν από την GIBCO ™ Invitrogen, USA. Κουνέλι πολύκλωνα αντισώματα για να Bax, Ρ53 και Bcl2 αγοράστηκαν από την κυτταρική σηματοδότηση, τις ΗΠΑ και πολύκλωνο αντίσωμα κατσίκας στο ΧΑΚ από την Santa Cruz, USA. SuperScript II kit RT και SYBR Green ΡΟΚ Master Mix αγοράστηκαν από την Takara, Ιαπωνία. κιτ χρώσης τούνελ αγοράστηκε από την Calbiochem, Γερμανία.

γραμμή κυττάρων και του πολιτισμού

Ανθρώπινο καρκίνωμα γαστρικά κύτταρα (SGC-7901) ελήφθησαν από την Cell Τράπεζα της Σαγκάης Ινστιτούτο Βιολογικών Επιστημών, την Κίνα και καλλιεργείται σε RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη σε φιάλες καλλιέργειας στους 37 ° C σε υγροποιημένο 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα τρέφονται μέχρι συρροή και επεκτάθηκε με αγωγή με θρυψίνη και υπο-καλλιεργήθηκαν σε μικρότερους αριθμούς σε νέες φιάλες καλλιέργειας.

ΜΤΤ δοκιμασία

ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο) δοκιμασία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μεθόδου του Arumugam et al. [8] με ελαφρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, κύτταρα σε εναιώρημα που περιέχει περίπου 8.000 έως 10.000 κύτταρα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας καλλιέργειας 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων διαλύθηκαν σε μέσο καλλιέργειας και προστέθηκαν στα κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων. 10 τελικές συγκεντρώσεις SPRC (1 υΜ, 10 υΜ, 100 υΜ, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM και 30 mM), SAC (1 υΜ και 10 μΜ) και Paclitaxel λιποσώματος (10 υΜ) προστέθηκαν στα κύτταρα για να μελετήσει τις επιπτώσεις τους στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Η επίδραση της συνδυασμένης επεξεργασίας 10 μΜ SPRC και 10 μΜ PAG μελετήθηκε επίσης. Μετά από 24 ώρες, 100 μL του 1 mg /ml διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και εκ νέου επώαση ακολουθήθηκε για 4 ώρες. 100 μL DMSO προστέθηκε στη συνέχεια μετά την απομάκρυνση του διαλύματος ΜΤΤ και οι πλάκες ανακινήθηκαν για 10 λεπτά. Η οπτική πυκνότητα των πλακών καλλιέργειας 96 φρεατίων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ενζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA). Οι οπτικές πυκνότητες από τα φρεάτια υπέστησαν αγωγή μετατρέπεται σε ένα ποσοστό των ζωντανών κυττάρων ( «ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων») κατά τον έλεγχο με τον ακόλουθο τύπο: πείραμα

που σχηματίζουν αποικίες

δοκιμασία

σχηματισμού αποικίας ήταν πραγματοποιείται σύμφωνα με τη μέθοδο των Wang et al. (1998, 2003) [9], [10]. Το εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων παρήχθη και καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων σε πυκνότητα 150 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες φύτευσης, προστέθηκαν 2 συγκεντρώσεις SPRC (10 μΜ, 1 μΜ) και SAC (10 μΜ, 1 μΜ). Ένα πείραμα με συνδυασμένη θεραπεία των 10 μΜ SPRC και 10 μΜ ΠΣΟ μελετήθηκε επίσης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 1% Giemsa μπλε. Οι αποικίες που αποτελούνταν από & gt? 50 κύτταρα βαθμολογήθηκαν και σε σύγκριση με την κανονική ομάδα ελέγχου. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Hoechst δοκιμασία χρώσης

Η απόπτωση [11], [12] προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Hoechst Χρώση Kit (Beyotime). SGC-7901 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SPRC (10 μΜ), SAC (10 Um), Paclitaxel λιποσώματος (10 μΜ) και συνενώθηκαν SPRC και PAG (έκαστο 10 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές σε PBS και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά στους 4 ° C και στη συνέχεια χρωματίζονται με πυρηνόφιλες χρωστική, την Hoechst 33258, για 5 λεπτά. Μετά από μία τελική έκπλυση σε PBS, τα κύτταρα τοποθετούνται σε moiwol, έναν παράγοντα κατά του ξεθωριάσματος, και οπτικοποιήθηκε υπό υπεριώδες φως με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Επειδή αυτή η βαφή λεκέδες τόσο αποπτωτικά και μη αποπτωτικά κύτταρα, τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως εκείνοι που εμφανίζουν συμπύκνωση χρωματίνης και πυρηνική κατάτμηση.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κατανομής φάσεων του κυτταρικού κύκλου και την ανίχνευση της απόπτωσης

Όλα κύτταρα πρώτα εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 2,5 χ 10

πλάκες 5 κύτταρα /φρεάτιο σε 6-φρεατίων. Μετά την επώαση με SPRC, SAC, πακλιταξέλη λιποσωμάτων και συνδυασμένων SPRC και PAG θεραπεία για 24 ώρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και συλλέχθηκαν σε κυτταρομετρία ροής σωλήνες και φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 5 λεπτά για να ληφθεί ένα κυτταρικό ίζημα.

Απόπτωση δοκιμασία

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Beyotime) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κυτταρικό σφαιρίδιο πλύθηκε δύο φορές με PBS. ρυθμιστικού 1 × Δεσμευτική προστέθηκε σε 1 × 10

6 κύτταρα /ml, και ΡΙ στη συνέχεια προστέθηκε στο σκοτάδι. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στο σκοτάδι, τα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας Cyan κυτταρόμετρο ροής (FACSCalibur BD) και το λογισμικό ModFit.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε με τη μέθοδο του Herman-Antosiewicz et al [13]. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας μόνο και μέσα καλλιέργειας που περιέχουν SPRC, SAC και πακλιταξέλη λιποσωμάτων (10 μΜ) στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη, και αποθηκεύθηκαν στους 4 ° C για μεταγενέστερη ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS μία φορά, στη συνέχεια εκ νέου σε εναιώρηση εντός 1 mL ΡΙ αντιδραστηρίου χρώσης (ιωδιούχο προπίδιο 50 mg /ml και 1 mg /ml RNAse σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου, ρΗ 7.4). Τα δείγματα επωάζονται στο σκοτάδι για 30 λεπτά πριν από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Η κατανομή των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο μετρήθηκε με ροή Cyan κυτταρόμετρο συστήματος (BD FACSCalibur) ανάλυση και ποσοτικοποίηση της κατανομής κύκλου κυττάρου διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό Multi-κύκλου (λογισμικό ModFit). Το ποσοστό των κυττάρων στην G1, G2 και S φάσεις υπολογιστεί.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 6 φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε 90% συρροή. Παρόμοιου μεγέθους τραύματα εισήχθησαν μονοστοιβάδας κύτταρα χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα ρύγχη πιπετών. Πληγωμένος κύτταρα μονοστιβάδας πλύθηκαν 3 φορές με PBS για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων? SPRC και SAC στη συνέχεια προστέθηκαν σε δύο συγκεντρώσεις (1 υΜ, 10 υΜ) και πακλιταξέλη λιποσωμάτων (10 μΜ). Η ταχύτητα του κλεισίματος τραύματος παρακολουθήθηκε και φωτογραφήθηκε μετά από 12 και 24 ώρες. Η συγκριτική ταχύτητα κλεισίματος των κατεργασμένων κυττάρων έναντι του ελέγχου του τραύματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: (το πλάτος πληγή των κατεργασμένων κυττάρων στις 0 ώρες – το πλάτος της πληγής στις 24 ώρες) /(το πλάτος τραύμα των κυττάρων ελέγχου ώρα 0 – το πλάτος τραύμα στις 24 ώρες) × 100.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας κιτ SuperScript II RT (Takara, Japan) πριμοδοτήθηκαν με oligo (dT). Εκφράσεις του Bcl2, Bax και mRNA Ρ53 εξετάστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου με το Βήμα ένα σύστημα PCR (Applied Biosystems). 2 υΐ μεταγράφηκε ανάστροφα προϊόν cDNA προστέθηκε σε ένα μίγμα αντίδρασης 20 υΙ που περιέχει 10 ul SYBR Πρόμιγμα ΕΧ Taq (2 χ), 0.4 υΙ ROX Dye αναφοράς (50 ×), 0,4 μΜ προς τα εμπρός εκκινητή και 0,4 μΜ ανταμοιβή εκκινητή. Οι συνθήκες των κύκλων είχαν ως εξής: προ-επώαση στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 s, ανόπτηση και επέκταση στους 60 ° C για 31 s. Με την ολοκλήρωση της ποδηλασίας, ανάλυση καμπύλης τήξης διεξήχθη για να καθοριστεί η εξειδίκευση του προϊόντος PCR. Η σχετική ποσοτική τιμή αυτή εκφράστηκε από τον ΔΔC

μέθοδο Τ. Έλεγχος χρησιμοποιήθηκε ως το δείγμα αναφοράς και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως το ενδογενές ελέγχου. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις διπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι αλληλουχίες εκκινητών και αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος ήταν ως εξής: Ανθρώπινη β-ακτίνης: προς τα εμπρός, 5′-CGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘και αντίστροφος, 5′-TGGAAGGTGGACAGCGA-3′ (201 bp)? ανθρώπινο Βαχ: προς τα εμπρός, 5’-ATGCGTCCACCAAGAAGC-3 ‘και αντίστροφος, 5′-GTCCACGGCGGCAATCA-3′ (95 bp)? ανθρώπινο BCL2: προς τα εμπρός, 5’-AACTGGGGGAGGATTGTG-3 ‘και αντίστροφος, 5′-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3′ (128 bp)? ανθρώπινο ρ53:. προς τα εμπρός, 5’-ACCACCATCCACTACAACTA-3 ‘και αντίστροφος, 5′-AAACACGCACCTCAAAGC-3’ (136 bp)

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε δίσκους και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SPRC (1 υΜ, 10 υΜ), SAC (1 υΜ, 10 υΜ) και Paclitaxel λιποσώματος (10 μΜ) για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS. Τα κύτταρα από κάθε δείγμα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl (ρΗ 8,0), 150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 0,1% SDS, 10 mM δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM φαινυλμεθυλ-σουλφονυλφθορίδιο) και διατηρήθηκε σε πάγο για 30 λεπτά. Κύτταρα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 g στους 4 ° C για 10 λεπτά και τα υπερκείμενα αποθηκεύθηκαν στους -70 ° C μέχρι τον προσδιορισμό. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη μέθοδο Bradford. 25

μl

πρωτεΐνης για κάθε ομάδα αναμίχθηκε με 5

μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης

διαχωρίστηκαν με 10% γέλη SDS-πολυακρυλαμίνης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο [14]. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 2 ώρες σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη σε Τπδ-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.05% Tween 20 (TBST) σε θερμοκρασία δωματίου. Τα προκύπτοντα στυπώματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικό CHT (γ-λυάση κυσταθειονίνης) /Πρόσωπα Ab (1:500, Santa Cruz, USA), πολυκλωνικά Bcl-2 Ab (1: 1000, Cell Signaling, USA), πολυκλωνικά Βαχ Ab (1