Αφηρημένο

Στόχοι

Η γλουταθειόνη (GSH) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων από την οξειδωτική βλάβη. ABCC1 πρωτεΐνη μεταφέρει GSH. Αν και αυτή η πρωτεΐνη είναι σε μεγάλο βαθμό μελετηθεί σε καρκίνο, λόγω πολυφαρμακευτική αντίσταση φαινότυπο, ο ρόλος του στα σωληνοειδή κύτταρα του νεφρού είναι άγνωστη. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διαπιστώσουν κατά πόσον ABCC1 έχει ένα ρόλο στην προστασία των κυττάρων από το περιφερικό νεφρώνα κατά του στρες που προκαλείται από την υψηλή νωτιαίο ωσμωτικότητα.

Κύρια Μέθοδοι

κύτταρα ΜΑ104 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υψηλές Οι συγκεντρώσεις χλωριούχου νατρίου, ουρία, ή και τα δύο για να αυξήσει το ωσμωτικότητα του μέσου καλλιέργειας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν προσβάσιμες από ΜΤΤ και μπλε τρυπάνης δοκιμασίες. έκφραση ABCC1 και εξώθηση του καρβοξυτερματικό φλουορεσκεΐνης (CF), ένα φθορίζον υπόστρωμα ABCC1, μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Βασικά Ευρήματα

Η επώαση των κυττάρων ΜΑ104 σε μέσο υψηλής συγκέντρωσης νατρίου είχε ως αποτέλεσμα αλλαγές στο κελί διακριτότητας και αλλοιωμένη έκφραση και τη δραστηριότητα των ABCC1. Η ουρία δεν μετέβαλε την έκφραση ABCC1 ή δραστηριότητα, αλλά αντέστρεψε τις παρατηρούμενες επιδράσεις NaCl. Υψηλές συγκεντρώσεις νατρίου είχε επίσης αρνητικό αντίκτυπο στην βιωσιμότητα των κυττάρων και η ουρία και προστατεύονται τα κύτταρα από αυτό το αποτέλεσμα.

Σημασία

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι ABCC1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία των κυττάρων του νεφρού επιθηλιακά κατά το στρες που προκαλείται από το περιβάλλον σημερινό υψηλό νάτριο σε νεφρική μυελό

Παράθεση:. Fonseca LM, Alvarez AB, Rodrigues RC, Σάντος DHF, Lopes AG, Capella ΜΑΜ (2013) ABCC1 σχετίζεται με την προστασία του απώτερου Nephron κατά Υπερωσμωτικότητα και High Περιβάλλοντος νάτριο: Πιθανές Επιπτώσεις για τον καρκίνο χημειοθεραπεία. PLoS ONE 8 (6): e68049. doi: 10.1371 /journal.pone.0068049

Επιμέλεια: Dominique Heymann, Faculté de Ιατρικής de Nantes, Γαλλία

Ελήφθη: 7, Ιανουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 23η Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Fonseca et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa μην Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa de Oncobiologia (FECD /FAF /ογκο ΙΙ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nivel Superior (CAPES) και Programa de Apoio AOS Núcleos de Excelencia (PRONEX). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η πολυανθεκτικότητα (MDR) εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία της αποτυχίας στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Αν και MDR είναι πολυπαραγοντική, είναι κατά κύριο λόγο χαρακτηρίζεται από μία ΑΤΡ-εξαρτώμενη μείωση στην ενδοκυτταρική συσσώρευση του φαρμάκου, λόγω της υπερέκφραση τριών πρωτεϊνών που ανήκουν στις μεταφορείς ABC υπερ-οικογένειας: P-γλυκοπρωτεΐνη (ABCB1), πρωτεΐνη καρκίνο του μαστού (BCRP ή ABCG2) ή πολυφαρμακευτική αντοχή σχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 (MRP1 ή ABCC1). Παρόλο που παρατηρήθηκε αρχικά στα κύτταρα του όγκου, αυτές οι πρωτεΐνες είναι επίσης παρούσα σε φυσιολογικά κύτταρα. Σε νεφρά, τόσο ABCB1 και ABCG2 εκφράζονται στην ακραία μεμβράνη των εγγύς σωληναρίων, υποδεικνύοντας ένα ρόλο στην έκκριση των ναρκωτικών [1], [2].

ABCC1, προηγουμένως γνωστό ως MRP1, είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που αναγνωρίστηκε αρχικά ως ένας μεταφορέας που σχετίζονται με την πολυφαρμακευτική φαινότυπο αντοχής σε μερικά καρκινικά κύτταρα [3] – [6], αλλά μετέπειτα μελέτες έδειξαν ότι αυτή η πρωτεΐνη εκφράζεται παντού σε σχεδόν όλα τα όργανα σε θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων [7], [8]. Ο μεταφορέας αυτός έχει μια μεγάλη σημασία σε φλεγμονώδεις διαδικασίες και οξειδωτική βλάβη, δεδομένου ότι μεταφέρει τόσο ανηγμένη και οξειδωμένη γλουταθειόνη, λευκοτριένιο C4 και προσταγλανδίνες [7], [9]. φυσιολογικός ρόλος του έχει μελετηθεί σε διάφορα όργανα και συστήματα και μία από τις πιο σημαντικές ανακαλύψεις είναι το γεγονός ότι η παρουσία της είναι απαραίτητη για την υπερτασική απόκριση στην αγγειοτενσίνη II [10].

Ωστόσο, όσον αφορά του φυσιολογικού ρόλου του ABCC1 στο νεφρό, δεν είναι πιθανό ότι αυτή η πρωτεΐνη παρουσιάζει κανενός είδους εκκριτικής ρόλο, λόγω του γεγονότος ότι περιορίζεται στο σπείραμα και στην βασεοπλευρική μεμβράνη τόσο του παχέως ανιόντος μέλους του βρόγχου Henle και το νωτιαίο αγωγού συλλογής [11 ]. Η διαπίστωση αυτή τελικά αναβληθεί περαιτέρω μελέτες σχετικά με τη σημασία αυτού του μεταφορέα στα νεφρά, αν και κάποιες ενδείξεις υποδηλώνουν έναν ρόλο των ABCC1 σε μηχανισμούς συγκέντρωσης των ούρων. Για παράδειγμα, παχύ άκρο αύξουσα και άπω σωληνάριο είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην εξάντληση της GSH που προωθείται από μηλεϊνικό διαιθυλεστέρα (DEM), το οποίο σχηματίζει σύμπλοκα με GSH, τη μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων της παρούσας τριπεπτιδίου. Τα ζώα υποβλήθηκαν στη θεραπεία με DEM έδειξε σοβαρή ουροποιητικού ελλείψεις συγκέντρωσης [12], [13]. Επιπλέον, δείχθηκε ότι επάγεται ετοποσίδη πολυουρία σε abcc1 (- /-) ποντικούς, υποδηλώνοντας ότι αυτή η πρωτεΐνη είναι κατά κάποιο τρόπο συνδέεται με επαναπορρόφηση του νερού [14]

Πολλά αντικαρκινικά φάρμακα είναι γνωστό ότι προκαλούν νεφροτοξικότητα.. Για παράδειγμα, η νεφροτοξικότητα που προκαλείται από τη σισπλατίνη, ένα κοινά χρησιμοποιούμενο φάρμακο στην αντικαρκινική θεραπεία, περιορίζει τη χρήση της στη θεραπεία του καρκίνου, και αρκετές ερευνητικές εκτελούνται να μειωθεί αυτό το δυσμενές αποτέλεσμα [15] – [17]. Επίσης, δείχθηκε πρόσφατα ότι νεφροτοξικότητα που σχετίζεται με δοξορουβικίνη, ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται εξαιρετικά στη χημειοθεραπεία του καρκίνου του μαστού και άλλων μορφών καρκίνου, οφείλεται σε μιτοχονδριακό διαταραχές και κυτταρικό θάνατο που ρυθμίζουν γονίδια [18].

Από νεφροτοξικότητα είναι σχετίζεται με αρκετές αντικαρκινικά φάρμακα [19], [20], και δεδομένου ότι ο ρόλος των ABCC1 στο νεφρό παραμένει άλυτο, η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να αναγνωρίσει ένα πιθανό ρόλο αυτής της πρωτεΐνης σε νεφρικά κύτταρα. Παρατηρήσαμε ενδείξεις ότι ABCC1 σχετίζεται με την προστασία του άπω νεφρώνα κατά Υπερωσμωτικότητα οφείλεται σε ένα περιβάλλον υψηλής νάτριο και ότι η GSH είναι σημαντικό να διατηρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων άπω νεφρώνα.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλες οι διαδικασίες ζώων είχαν προηγουμένως ελεγχθεί και εγκριθεί από την επιτροπή των ζώων Θέμα του Centro de Ciencias da Saúde – UFRJ με αριθμό πρωτοκόλλου IBCCF 082/2009

Cell Culture

Πίθηκος εμβρύου κυτταρική γραμμή ΜΑ104. , νεφρό χοίρου επιθηλιακά κύτταρα LLC-ΡΚ1 και νεφρού σκύλου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή MDCK ελήφθησαν όλα από Rio de Janeiro Τράπεζας κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (Gibco, USA) με πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco, USA) και συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, USA) και L-γλουταμίνη (Gibco, USA).

η θεραπεία με οσμολυτών

για να αυξήσετε ωσμωτικότητα του μέσου καλλιέργειας, 100 mM NaCl, 200 mM ουρία, 200 mM μαννιτόλη, ή 50 mM NaCl 100 mM ουρία (τελικές συγκεντρώσεις) προστέθηκαν σε το μέσο, ​​αυξάνοντας ωσμωτικότητα του σε περίπου 450 mOsm /Kg H

2O. Τα διαλύματα προστέθηκαν είτε βαθμιαία, σε χρονικό διάστημα 72 ωρών, ή σε ένα μόνο Επιπλέον, όπως περιγράφεται στο λεζάντες των μορφών.

ΜΤΤ Δοκιμασία

ΜΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία [21] χρησιμοποιήθηκε να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα της κυτταρικής γραμμής ΜΑ104 επωάστηκαν σε υπεροσμωτικό μέσο. Περίπου 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 96 πλάκες φρεατίων. Την επόμενη μέρα NaCl, ουρία, μαννιτόλη ή NaCl + ουρία προστέθηκαν στο μέσο, ​​όπως περιγράφηκε παραπάνω. Σε μερικά πειράματα μπουθειονίνης-σουλφοξιμίνη, ένας αναστολέας της σύνθεσης GSH (BSO-Fluka, USA), και MK571, ένας αναστολέας ABCC1, προστέθηκαν επίσης. Μετά περιόδους επώασης των 24, 48 ή 72 ώρες, 20 μΐ 10 mg /mL Θειαζοϋλίου blue tetrazolium βρωμίδιο (Sigma, USA) προστέθηκαν στην καλλιέργεια και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 3 ώρες στους 37 ° C. Στο τέλος του χρόνου επώασης το υπερκείμενο απορρίφθηκε και προστέθηκαν 100 μι διμεθυλοσουλφοξειδίου ανά φρεάτιο για να διαλυθεί το πρόσφατα σχηματισμένο άλας φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας ELISA (Benchmark, BioRad). Οι μέσες τιμές υπολογίστηκαν από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

μπλε χρώση trypan

Μια άλλη μέθοδος που χρησιμοποιείται για την πρόσβαση βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν κυττάρων μετρώντας με μπλε χρώση Trypan. Σε αυτή την περίπτωση, 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 24 φρεατίων και μετά την επώαση με τα οσμολυτών όπως περιγράφηκε ανωτέρω, τα κύτταρα μετρήθηκαν σε αιματοκυτταρόμετρο.

γλουταθειόνη

Ένα εμπορικό κιτ χρησιμοποιώντας monochlorobimane ως υπόστρωμα (Millipore, USA) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθούν τα επίπεδα της γλουταθειόνης (GSH). Για την ανίχνευση αυτή, 1 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας, επεξεργασμένο όπως παραπάνω, και συλλέχθηκαν με θρυψίνη. δοκιμασία GSH πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. επίπεδα φθορισμού διαβάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη πλάκας με ένα σετ φίλτρων 380/460 nm.

ABCC1 Δραστηριότητα

Τα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με οσμολυτών όπως περιγράφεται παραπάνω. Καρβοξυ-φλουορεσκεΐνη διοξεικό (CFDA – Molecular Probes, USA) είναι ένας μη φθορίζον μόριο που μετατρέπεται σε φθορίζουσα μία, καρβοξυ-φλουορεσκεΐνη (CF) από ενδοκυτταρικές εστεράσες. Αυτό το μόριο είναι ένα υπόστρωμα για ABCC1. Ως εκ τούτου, για να προσδιοριστεί δραστικότητα ABCC1, τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με 2 μΜ CFDA (για να επιτραπεί η πρόσληψη χρωστικής, δράση εστεράσης, και τη συσσώρευση των CF), ξεπλύθηκε με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), για να ξεπλύνει τη χρωστική και επωάστηκε για άλλα 30 λεπτά σε CFDA-ελεύθερο DMEM για την εξώθηση CF. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με τρυψίνη, πλύθηκαν και ressuspended σε φυσιολογικό ορό. Η ενδοκυτταρική φθορισμός μετρήθηκε σε μια ροή Beckton-Dickinson κυτταρόμετρο (FACSCalibur). Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό Summit (Dako Inc, USA).

Επισήμανση με αντι-ABCC1 Αντίσωμα

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 πηγαδιών πλάκες και η δοκιμασία επισήμανση διεξήχθη όπως περιγράφεται στο α προηγούμενες εργασίες από την ομάδα μας [22]. Η Α23 αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό (Alexis Biochemicals, USA) και Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA) χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα ως πρωτογενή και δευτερογενή φθορίζοντα αντισώματα.

Ανάλυση Western Blotting για Tamms-Horsfall Πρωτεΐνη (ΤΗΡ ή ουρομοδουλίνη) και ακουαπορίνη 2 (AQP2)

η έκφραση του ΤΗΡ και AQP2 εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων σε 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C. Μετά από 48 ώρες επώασης, το μέσο καλλιέργειας αναρροφήθηκε? τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS (ρΗ 7.4) σε θερμοκρασία δωματίου, ξύνεται, και φυγοκεντρήθηκε σε 14.000

g

για 60 δευτερόλεπτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος (βάση Trisma 0,76% m /v? Γλυκερόλη 12,56% m /v και νάτριο δωδεκυλοθειικό 2,3% m /v? ΡΗ 6,8). Μετά την ομογενοποίηση, ένα μικρό δείγμα χρησιμοποιήθηκε για την μέτρηση της πρωτεΐνης. Το ρυθμιστικό στη συνέχεια συμπληρώθηκε με 0,6% διθειο-L-θρεϊτόλη (DTT), 0,5% β-μερκαπτοαιθανόλη, κυανούν βρωμοφαινόλης και (1 mg /mL). Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού Western Breeze (Invitrogen, USA) και επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα έναντι ΤΗΡ ή AQP2. Η αλκαλική φωσφατάση Western Kit Breeze (Invitrogen, USA), χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τις ζώνες στις μεμβράνες. Το C7 υποκλώνος από την κυτταρική σειρά MDCK χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για AQP2, δεδομένου ότι αποτελείται από κύρια κύτταρα από τον αγωγό συλλογής [23]. Άλλοι μάρτυρες ήταν αποσπάσματα από το νεφρό αρουραίου μυελό και το φλοιό. Για το σκοπό αυτό, Whistar αρουραίοι είχαν νεφρά τους αφαιρέθηκαν, αποσυντίθενται και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για επεξεργασία. Τα όργανα κατόπιν ομογενοποιήθηκε σε ένα διάλυμα που αποτελείται από PMSF (1 mM), σακχαρόζη (250 mM), ΕϋΤΑ (1 mM) και ιμιδαζόλιο (20 mM) μέχρι να ληφθεί ένα ομογενοποίημα.

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε πείραμα επαναλαμβάνεται από τρεις έως πέντε φορές. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο ± τυπική απόκλιση της μέσης και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test ή μονόδρομη ANOVA με Dunnet ή Bonferroni υστέρων δοκιμές για τη σύγκριση των διαφορών. Οι τιμές των Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός ΜΑ104 κύτταρα

Δεδομένου ότι δεν υπάρχει ανθρώπινη κυτταρική γραμμή από άπω ​​νεφρώνα που διατίθενται στο εμπόριο, προσπαθήσαμε να ελέγξετε εάν η νεφρική κυτταρική γραμμή πιθήκου ΜΑ104 προήλθε από την άπω νεφρώνα. Πρώτον, συγκρίναμε την ευαισθησία των τριών κυτταρικών γραμμών θηλαστικού νεφρική να ουρία: MDCK, ένα νεφρού σκύλου κυτταρικής γραμμής με χαρακτηριστικά άπω νεφρώνα [24] – [26]? LLCPK1, ένα χοίρο νεφρική κυτταρική γραμμή με τα χαρακτηριστικά των εγγύς σωληναρίων [27] και ΜΑ104, που δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις ουρίας και του αριθμού των κυττάρων και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με βαφή κυανούν τρυπανίου. Όπως μπορεί να φανεί στο Σχ. 1, τα κύτταρα ΜΑ104 είναι ως ανθεκτικές στην ουρία ως κύτταρα MDCK, ενώ τα κύτταρα LLC-ΡΚ1 είναι πιο ευαίσθητα.

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν πάνω σε 24-πηγαδιών πλάκες και ουρία προστέθηκε 24 ώρες αργότερα σε διάφορες συγκεντρώσεις. Μετά από 48 ώρες επώασης, ο αριθμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα μετρήθηκαν με βαφή κυανούν τρυπανίου (n = 4). α – διαφορετική από 37.5 mM (p & lt? 0,01)? β – διαφορετική από 75 mM (p & lt? 0.001).

Η

MDCK είναι ένα σκυλί κυτταρική γραμμή νεφρού και υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ σκύλου και ανθρώπου. Επιπλέον, πολλά αντισώματα που αναπτύχθηκαν για τον άνθρωπο δεν επισημαίνουν τις πρωτεΐνες σκύλου. Από την άλλη πλευρά, ΜΑ104 είναι μια κυτταρική γραμμή νεφρού πιθήκου, και αυτό είναι αποδεκτό ότι τα μη ανθρώπινα πρωτεύοντα μοιράζονται πολλά κοινά χαρακτηριστικά με τον άνθρωπο. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι αντισώματα κατά της ανθρώπινης ABCB1 και ABCC1 επισημαίνονται επίσης αυτή η κυτταρική σειρά [28], [29]. Δεδομένου ότι ABCC1 εκφράζεται μόνο στα πλαγιοβασική μεμβράνες του άπω σωληναρίου και ευθεία συλλογής επιθήλια αγωγού [11], και λαμβάνοντας υπόψη την αντίσταση των κυττάρων ΜΑ104 σε ουρία, φαίνεται πιθανό ότι αυτά τα κύτταρα προήλθαν από άπω ​​νεφρώνα. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε ορισμένα χαρακτηριστικά του άπω νεφρώνα τμημάτων σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ΜΑ104 κύτταρα δεν παρουσιάζουν σημαντική επισήμανση με ΡΝΑ, ένα δείκτη για παρεμβαλλόμενες κύτταρα και δεν εξέφρασαν ουρομοδουλίνη, μια πρωτεΐνη που εκφράζεται μόνο στο άπω ευθεία σωληναρίου, αλλά εκφράζουν AQP2, ένα χαρακτηριστικό πρωτεΐνη των κύριων κυττάρων του συλλογής αγωγού (Εικ. 2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα ΜΑ104 προέρχονταν από αγωγού συλλογής, που τους καθιστά ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη του πιθανού ρόλου του ABCC1 στην αντίσταση των κυττάρων των νεφρών να Υπερωσμωτικότητα.

A. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΤΗΡ σε νεφρό αρουραίου φλοιώδη (λωρίδα 1) και meldullary (διαδρομή 2) και τα εκχυλίσματα ΜΑ104 (λωρίδα 3) στην άνω μεμβράνη και β-ακτίνη στην κάτω μεμβράνη? B. Έκφραση Aquaporin 2 σε MDCK-C7 (λωρίδα 1) και ΜΑ 104 (λωρίδα 2)? Γ και Δ επισήμανση PNA (100 μΜ) του MDCK-C11 (C) και ΜΑ 104 (D).

Η

Ευαισθησία του ΜΑ104 κύτταρα σε διάφορους οσμολυτών

Το επόμενο βήμα ήταν να καθοριστεί η επίδραση των διαφορετικών οσμολυτών στην επιβίωση των κυττάρων ΜΑ104. Μέσο οσμωτικότητα αυξήθηκε με χλωριούχο νάτριο, ουρία ή μαννιτόλη σε μία μόνο προσθήκη (ένα οσμωτικό σοκ) και η βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Η συγκέντρωση του NaCl που χρησιμοποιήθηκε ήταν προηγουμένως προσδιορίστηκε ως η ελάχιστη συγκέντρωση NaCl να επιτευχθεί η μέγιστη επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σύκο. 3 δείχνει ότι η προσθήκη του χλωριούχου νατρίου μειώνεται σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων, ενώ η ουρία και η μαννιτόλη είχε μόνο μια μικρή επίδραση. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε επεξεργασία με NaCl δεν οφείλεται στην ίδια Υπερωσμωτικότητα, αφού η μαννιτόλη δεν παράγουν το ίδιο αποτέλεσμα.

Μετά από μία αρχική επώαση 24 ωρών στους 37 ° C, οσμολυτών προστέθηκαν σε το μέσο καλλιέργειας και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (η = 3). α – διαφορετικό από τον έλεγχο (ρ & lt? 0,05)? β – διαφορετική από NaCl (p & lt? 0,01)

Η

Από NaCl μπορεί να επηρεάσει πολλές λειτουργίες, όπως τα κανάλια νατρίου, κανάλια χλωριούχο, νάτριο-κάλιο ΑΤΡάσης κλπ, και δεδομένου ότι δεν υπάρχουν δεδομένα στην επιστημονική. βιβλιογραφία που υποδηλώνει αν Na

+ ή Cl

– είναι η κύρια αιτία της μείωσης της βιωσιμότητας των κυττάρων, αποφασίσαμε να μελετήσουμε αυτό το σημείο. Για λόγους σύγκρισης, χρησιμοποιήσαμε χλωριούχο χολίνη, η οποία διατηρεί την ίδια ιοντική ισχύ του μέσου whithout παρουσία Na

+. Στο Σχ. 4 φαίνεται ότι NaCl και χλωριούχο χολίνη μείωσε ισόποσα κυτταρική βιωσιμότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ιόν χλωριδίου φέρει την ευθύνη για το σκοπό αυτό.

Μετά από μία αρχική επώαση 24 ωρών στους 37 ° C, οσμολυτών προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες? Α Κύτταρα κατεργασμένα με NaCl ή NaCl + ουρία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (η = 3). α – διαφορετικό από τον έλεγχο (ρ & lt? 0,05)? b – διαφορετικό από NaCl 175 mM (ρ & lt? 0.001) και Β κύτταρα κατεργασμένα χλωριούχου χολίνης (φαίνεται ως χολίνη) ή χλωριούχο χολίνη + ουρία (n = 3). α – διαφορετικό από τον έλεγχο (ρ & lt? 0.001)? β – διαφορετική από χολίνη 175 mm (p & lt? 0.001)

Η

Επίδραση της ουρίας στην ευαισθησία των ΜΑ104 κύτταρα σε NaCl και χλωριούχου χολίνης

Μερικοί συγγραφείς παρατηρηθεί ότι προστατεύονται ουρίας κύτταρα κατά. βλάβη που προκαλείται από το χλωριούχο νάτριο [30]. Όπως μυελώδη Υπερωσμωτικότητα στο νεφρό οφείλεται κυρίως στην ουρία και NaCl, το επόμενο βήμα μας ήταν να διερευνηθεί μία πιθανή προστατευτική επίδραση της ουρίας στη βιωσιμότητα των κυττάρων κάτω από υψηλή συγκέντρωση NaCl. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβάλλονται σε οσμωτικό σοκ με NaCl παρουσία ή απουσία ουρίας. Προκειμένου να διατηρηθεί το ίδιο ωσμωτικότητα του μέσου, διαφορετικές ποσότητες NaCl και ουρίας χρησιμοποιήθηκαν (το τελικό ωσμωτικότητα του μέσου με 50 mM ουρίας 150 mM NaCl ήταν παρόμοια με εκείνη του μέσου προστίθενται μόνο με 175 mM NaCl, περίπου 561 mOsm /Kg H

2O, όπως μετράται με ένα οσμώμετρο). Για σύγκριση, χρησιμοποιήσαμε επίσης χλωριούχο χολίνη. Μπορεί να φανεί στο Σχ. 4 ότι οι προστατευόμενες ουρία κύτταρα υποβάλλονται σε υψηλές NaCl, αλλά η επίδραση της ουρίας σε κύτταρα επεξεργασμένα με χλωριούχο χολίνη ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη που παρατηρείται για το NaCl. Αυτό υποδηλώνει ότι και τα δύο ιόντα (Na

+ και Cl

-) συμμετέχουν σε κυτταρικό θάνατο, αλλά η επίδραση της ουρίας είναι πιο έντονη κάτω από ένα περιβάλλον NaCl, το οποίο είναι σύμφωνο με το νεφρικό μυελική περιβάλλον. Από χλωριούχο χολίνη δεν είναι ένα ωσμολύτη στη νεφρική μυελός, εμείς δεν χρησιμοποιούν την ουσία αυτή στα ακόλουθα πειράματα.

Η ενδοκυτταρική GSH επίπεδα στο ΜΑ104 κύτταρα επεξεργασμένα με οσμολυτών

Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι NaCl μολύβδου με οξειδωτική βλάβη [31], [32]. Δεδομένου GSH είναι ένα από τα πιο σημαντικά ενδοκυτταρικά μόρια που συνδέονται με την προστασία κατά του οξειδωτικού στρες [33], τα επίπεδα ενδοκυτταρικής GSH αξιολογήθηκαν σε ΜΑ104 κύτταρα μετά από θεραπεία με τις οσμολυτών. Για την ανίχνευση αυτή, οι οσμολυτών προστέθηκαν σε ένα σταδιακό τρόπο, κατά τη διάρκεια των 72 ώρες και το περιεχόμενο της GSH μετρήθηκε. Στο Σχ. 5 φαίνεται ότι η θεραπεία των κυττάρων με NaCl προκάλεσε σημαντική αύξηση (περίπου 50%) στα ενδοκυτταρικά επίπεδα της μειωμένης GSH σε κύτταρα ΜΑ104. Η ουρία μόνη της δεν μετέβαλαν την ενδοκυτταρική περιεκτικότητα της GSH, αλλά αντέστρεψε την αύξηση GSH που παρατηρείται σε κύτταρα κατεργασμένα με NaCl. Για να ελεγχθεί αν αυτή η αύξηση στα επίπεδα GSH μπορούσαν να σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση, χρησιμοποιήσαμε BSO, έναν αναστολέα της γλουταθειόνης συνθάσης, η οποία θα επηρεάσει αυτή την αύξηση στα επίπεδα GSH. Τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με BSO, πριν τις θεραπείες με NaCl ή ουρία. Όπως αναμενόταν, η αναστολή της σύνθεσης GSH με BSO μειώνεται κατά 50% την επιβίωση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με NaCl, αλλά δεν μετέβαλε εκείνη των κυττάρων σε επεξεργασία με ουρία ή ουρία + NaCl (σχ. 6), υποδηλώνοντας ότι ο θάνατος κυττάρου σε παρουσία ουρίας + NaCl λαμβάνει χώρα με τρόπο διαφορετικό από εκείνον με NaCl μόνο και δεν εξαρτάται από την GSH.

κύτταρα επωάστηκαν όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4 και τα ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο υλικά και μέθοδοι. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (η = 8)? ρ & lt? 0.05 (α – διαφορετικός τόσο από τον έλεγχο και την ουρία)

Η

Μετά από μία αρχική επώαση 24 ωρών στους 37 ° C, BSO (1 mM) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας και μετά από 24 ώρες. επώασης οσμολυτών προστέθηκαν στην καλλιέργεια και τα κύτταρα επωάστηκαν για περαιτέρω 48 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (η = 3)? p & lt? 0,05. (Α – διαφορετική από NaCl).

Η

Η έκφραση της ABCC1 στο ΜΑ104 κύτταρα επεξεργασμένα με οσμολυτών

Καθώς η διατήρηση των επιπέδων ενδοκυτταρικής GSH είναι στενά συνδεδεμένη με ABCC1 μεταφορών [34], [ ,,,0],35] και δεδομένου ότι ΜΑ104 και συλλέγοντας τα κύτταρα αγωγού εκφράζουν ABCC1 [14], [22], στα επόμενα πειράματα προσπαθήσαμε να μελετήσουμε έναν πιθανό ρόλο της ABCC1 στην απόκριση των κυττάρων ΜΑ104 σε NaCl και ουρίας. Ωστόσο, κατά την εκτέλεση της κυτταρομετρίας ροής, παρατηρήσαμε ότι οδηγούν NaCl σε μεταβολές στο κελί κοκκοποίηση (ορατό από μεταβολές στην πλευρά σκέδαση-SSC), χωρίς μεταβολές του όγκου των κυττάρων (όπως φαίνεται από μεταβολές στην προς τα εμπρός σκέδαση-FSC) όπως μπορεί να φανεί στην Εικ . 7Α. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε πρώτα τις τροποποιήσεις αυτές. Για να γίνει αυτό, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε δύο περιοχές: την περιοχή R1, που περιέχει τα κύτταρα με φυσιολογική SSC και περιοχή R2 περιέχει τα κύτταρα με υψηλό SSC (Εικόνα 8Α).

Τα κύτταρα επωάστηκαν κατά τη διάρκεια 96 ωρών σε 37. ° C με τις οσμολυτών. Α – τελεία οικόπεδα που δείχνει τη διαφορά μεταξύ εμπρός σκέδαση (FSC) και πλευρική σκέδαση (SSC), που αντιπροσωπεύουν αντίστοιχα τον όγκο των κυττάρων και διακριτότητα. Β – Ποσοστό κυττάρων που παρουσιάζουν κανονική granularity για κάθε ομάδα θεραπείας. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (η = 4)? (Α – διαφορετικό από τον έλεγχο? Ρ & lt? 0.001 και Β- διαφορετικό από NaCl? Ρ & lt? 0,01).

Η

Τα κύτταρα επωάστηκαν με τις οσμολυτών κατά τη διάρκεια 96 ωρών σε 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια σημάνθηκαν με αντίσωμα αντι-ABCC1 και η έκφραση αυτής της πρωτεΐνης αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Κάθε ομάδα θεραπείας χωρίστηκε σε δύο υποομάδες ανάλογα με SSC αξίες. Α – Τα ιστογράμματα δείχνουν τα δύο υποπληθυσμών (κανονική και υψηλή ΕΣΕ) για κάθε συνθήκη και Β – Ποσοστό ABCC1-θετικών κυττάρων τόσο από την κανονική και υψηλή SSC υποπληθυσμών. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE (η = 5). α – διαφορετικό από τον έλεγχο (ρ & lt? 0,01) και Β-διαφορετικό από NaCl? p & lt?. 0.01)

Η

Στο Σχ. 7Β δεικνύεται ότι το 90% των κυττάρων ελέγχου έχουν φυσιολογική SSC και ότι η θεραπεία για 72 ώρες με ουρία μόνη δεν μετέβαλλε κύτταρο διακριτότητα. Ωστόσο, NaCl αυξηθεί σε μεγάλο βαθμό αυτήν την παράμετρο, με σχεδόν το ήμισυ του πληθυσμού έχει μεγαλύτερη SSC. Επιπλέον, η ουρία αντιστραφεί αυτή αλλοίωση, δεδομένου ότι το 76% των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε NaCl + ουρία ήταν στην περιοχή με φυσιολογική SSC και αυτό δεν ήταν στατιστικά διαφορετικά από τα κύτταρα ελέγχου. Παρά το γεγονός ότι αυτή η αύξηση του κυττάρου διακριτότητας θα μπορούσε να οφείλεται σε ένα μειωμένο όγκο των κυττάρων, λόγω της πτώση της περιεκτικότητας σε νερό των κυττάρων, δεν θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε αυτό. Η FSC των κυττάρων που υποβάλλονται σε όλες τις αγωγές ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι δεν μεταβολή του όγκου των κυττάρων μετά από παρατεταμένη θεραπεία με NaCl, ουρία ή NaCl + Ουρία (Εικ. 7Α).

Λόγω της παρατηρούμενης επιδράσεις της θεραπείας NaCl σε SSC, για τη μελέτη της έκφρασης και της δραστηριότητας ABCC1 χωρίσαμε τα κύτταρα σε δύο περιοχές, μία που σχετίζονται με κύτταρα με φυσιολογική SSC και το άλλο σχετίζεται με τα κύτταρα με υψηλό SSC. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο Σχ. 8 έδειξε ότι, για κύτταρα με φυσιολογική SSC, περίπου το 85% των κυττάρων ελέγχου εκφράζουν ABCC1. Το ποσοστό αυτό μειώνεται στο 50% περίπου σε κύτταρα επεξεργασμένα με NaCl, και ουρία δεν ανέστρεψε ‘αυτό. Για τα κύτταρα με υψηλό SSC, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν ABCC1 είναι περίπου 50% σε κύτταρα ελέγχου. NaCl αυξήθηκε αυτό σε περίπου 92%, και ουρία μεταβληθεί αυτό, επιστρέφοντας τις τιμές κοντά στα κύτταρα ελέγχου (54%).

Το επόμενο βήμα ήταν να μελετηθεί η δραστηριότητα ABCC1 με κυτταρομετρία ροής. Όταν το κάνετε αυτό, παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα ελέγχου συσσωρεύονται πολύ πιο CF (ένα κοινό χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα για ABCC1) από ό, τι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με οσμολυτών, πιθανώς επειδή το Υπερωσμωτικότητα των μέσων μαζικής ενημέρωσης με NaCl, ουρία και NaCl + ουρία εμπόδισε την κυτταρική πρόσληψη των βαφών ( Εικ. 9). Αν και αυτή η εξασθενημένη τη σύγκριση των κυττάρων που ωσμολύτη αγωγή με κύτταρα ελέγχου, θα μπορούσαμε ακόμη συγκρίνουμε κυττάρων με φυσιολογική ή υψηλή SSC μέσα στο ίδιο θεραπεία. Ως εκ τούτου, στο Σχ. 10 φαίνεται η συσσώρευση και την εκροή του NaCl κατεργασμένων κυττάρων με φυσιολογική (Σχ. 10Α και 10Β) και υψηλή (Εικ. 10C και 10D) SSC. Μπορεί να φανεί ότι η κυτταρική πρόσληψη του CFDA ήταν παρόμοια ανεξάρτητα από την κανονική ή υψηλή SSC (σχ. 10Α και 10C). Ωστόσο, η εκροή της φθορίζουσας χρωστικής από τα κύτταρα με υψηλό SSC είχε σχεδόν ολοκληρωθεί (Εικ. 10D), ενώ σε κύτταρα με φυσιολογική SSC% περίπου των 50 κύτταρα δεν εκρέει τη χρωστική (Σχ. 10Β). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα σε επεξεργασία με Ν & + ουρία ήταν εξίσου σε θέση να εκρέει της χρωστικής, ανεξάρτητα φυσιολογική ή υψηλή SSC (σχ. 11β και 11δ).

Συνολικός πληθυσμός κυττάρων επωάστηκε κατά την διάρκεια 96 ωρών σε 37 ° C με τις οσμολυτών και το κυτταρικό φθορισμό, που δείχνει την συσσώρευση της CF μετά από 30 λεπτά επώασης μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Το πάνελ Α δείχνει τη συσσώρευση CF στα κύτταρα ελέγχου, όπως αποδεικνύεται από την υψηλή φθορισμού. Πάνελ Β, C και D δείχνουν τη συσσώρευση ΚΙ σε κύτταρα κατεργασμένα αντίστοιχα με NaCl, ουρία ή NaCl + ουρία. Ιστογράμματα αντιπροσωπευτικά 3 διαφορετικών πειραμάτων.

Η

Τα κύτταρα επωάστηκαν με NaCl κατά τη διάρκεια 96 ωρών σε 37 ° C και η δραστικότητα του ABCC1 μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Κατά την ανάλυση, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε δύο υποομάδες σύμφωνα με τις τιμές πλευρικής σκέδασης. Αριστερά πλαίσια: συσσώρευση CF από κύτταρα με φυσιολογική (Α) και υψηλή (C) SSC? Δεξιά πλαίσια: CF εκροή από κύτταρα με φυσιολογική (Β) και υψηλή (D) SSC. Ιστογράμματα εκπρόσωπος του 3 διαφορετικά πειράματα. Οι τιμές σε κάθε πίνακα αναφέρονται στο ποσοστό των κυττάρων με φθορισμό, που σημαίνει κύτταρα τα οποία συσσωρεύονται CF (σε πίνακες Α και C) και τα κύτταρα που δεν ήταν σε θέση να εκρέει της χρωστικής μετά από 30 λεπτά σε βαφή μέσο ελεύθερο (σε πάνελ Β και D).

η

τα κύτταρα επωάστηκαν με NaCl + ουρία κατά την διάρκεια 96 ωρών σε 37 ° C και η δραστικότητα του ABCC1 μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Κατά την ανάλυση, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε δύο υποομάδες σύμφωνα με τις τιμές πλευρικής σκέδασης. Αριστερά πλαίσια: συσσώρευση CF από κύτταρα με φυσιολογική (Α) και υψηλή (C) SSC? Δεξιά πλαίσια: CF εκροή από κύτταρα με φυσιολογική (Β) και υψηλή (D) SSC. Ιστογράμματα εκπρόσωπος του 3 διαφορετικά πειράματα.

Η

Συζήτηση

ΜΑ 104 είναι μια κυτταρική γραμμή που προέρχεται από τα νεφρά της Αφρικής έμβρυα πιθήκων [36]. Εκφράζει διάφορα χαρακτηριστικά του πολωμένου επιθηλιακά κύτταρα, όπως ο σχηματισμός «θόλων», η δημιουργία ενός ηλεκτρικής αντίστασης transmonolayer και πολωμένο ωρίμανση ιός με φάκελο [37]. Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι αυτή η κυτταρική γραμμή εκφράζει τουλάχιστον δύο πρωτεΐνες που σχετίζονται με την πολυφαρμακευτική αντίσταση, ABCB1 και ABCC1 [28], [29], [38]. Στην παρούσα μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται περαιτέρω αυτά τα κύτταρα, και φαίνεται πολύ πιθανό ότι ΜΑ104 προέρχεται από τη συλλογή του αγωγού, κατά πάσα πιθανότητα κύρια κύτταρα. Αυτός ο χαρακτηρισμός είναι σημαντικό να καθιερωθεί αυτή την κυτταρική γραμμή ως μοντέλο για τη μελέτη του ABCC1 στο νεφρό.

Μόλις η οποία χαρακτηρίζεται, δείξαμε την άνοδο στην ωσμωτικότητα οφείλεται σε NaCl ή χλωριούχο χολίνη (αλλά όχι ουρία) προκάλεσε μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη. Επιπλέον, η ουρία προστατεύονται τα κύτταρα από την αναστολή της ανάπτυξης ή τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από NaCl, αλλά όχι χλωριούχο χολίνη (Εικ. 3-4). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με άλλους συγγραφείς οι οποίοι έδειξαν ότι η ουρία μπορεί να αντιστρέψει την επιβλαβή επίδραση αποδίδεται σε NaCl [30]. Έχει επίσης δειχθεί ότι, αν και η ουρία μπορεί να προκαλέσει οξειδωτική βλάβη, είναι επίσης ικανή να ενεργοποιεί μηχανισμούς προστασίας έναντι τέτοιων οξειδωτικές βλάβες, και ότι NaCl ενεργοποιείται επίσης μηχανισμούς προστασίας, αλλά μόνο όταν προστέθηκε βαθμιαία στο μέσο [39], [ ,,,0],40]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους συμβαίνουν τέτοια αποτελέσματα δεν έχουν ακόμα κατανοηθεί. Η ακριβής διαδικασία μέσω της οποίας NaCl προκαλεί μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων είναι ακόμη άγνωστη. Μερικοί συγγραφείς φαίνεται να συμφωνούν ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις NaCl προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Τόσο Michea και Kultz ισχυρισμό ότι mIMCD υποφέρουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G2 μετά από επώαση με συγκεντρώσεις χλωριούχου νατρίου υψηλή, οδηγώντας σε μειωμένη πολλαπλασιασμό [41], [42]. Dimitrieva προσθέτει στην εν λόγω αίτηση, που δείχνουν ότι τα επίπεδα p53 αυξάνονται ταχύτατα στα κύτταρα mIMCD3 μετά από επώαση με χλωριούχο νάτριο, μειώνοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε πρώτη στιγμή [43]. Μια μεταγενέστερη μελέτη και πάλι δείχνει ότι NaCl προκαλεί μείωση στον πολλαπλασιασμό, τώρα λόγω της αύξησης στην EGR-1, η οποία θα χρησιμεύσει ως κίνητρο για τη διαφοροποίηση [44]. Kultz [45] περαιτέρω αξιώσεις που NaCl σε υψηλές συγκεντρώσεις οδηγεί σε διπλή διαλείμματα σκέλος του DNA, το οποίο θα μπορούσε να προκληθεί από τις ελεύθερες ρίζες. Επιπλέον, Zhou και Zhang συμφωνούν ότι η υψηλή NaCl προκαλεί αύξηση του ROS και, κατά συνέπεια, την οξειδωτική βλάβη [46], [47]. Όπως έχουν τα πράγματα, τα στοιχεία φαίνεται να δείχνουν ότι η μείωση της βιωσιμότητας τείνει να στρέφεται προς το οξειδωτικό στρες ως σημείο εκκίνησης.

Η προστασία που προσφέρεται από την ουρία είναι τόσο αμφιλεγόμενη, όπως είναι NaCl που προκαλείται ζημιά. Μια μελέτη προτείνει ότι η ίδια η ουρία οδηγεί σε αύξηση των ROS, αλλά επίσης είναι ικανή να επάγει την έκφραση της αίμης οξυγενάσης-1 (ΗΟ-1) σε νεφρικά κύτταρα, τα οποία θα μπορούσε να περιλαμβάνει μέρος του προσαρμοστικού ή συστήματος προστασίας υπεροσμωτικότητα [40]. Zhang et al, δείχνει ότι η προσθήκη ουρίας σε NaCl επεξεργασμένα κύτταρα οδηγεί σε αναστολή της δράσης της κασπάσης-3 [30]. Επίσης, Santos έδειξε ότι η εσωτερική νεφρικά κύτταρα μυελού αγωγή τόσο με NaCl και ουρία έδειξαν αύξηση στη HSP70 που συσχετίζεται με την αύξηση της οσμωτικότητας. Οι συγγραφείς προτείνουν ότι η διαπίστωση αυτή, που σχετίζονται με τη μείωση του πολλαπλασιασμού φαίνεται στα επεξεργασμένα κύτταρα θα μπορούσαν να είναι μέρος του μηχανισμού προστασίας που επιτρέπει στα κύτταρα να επιβιώσουν στο νεφρό μυελό [48]. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα δείχνουν ότι ενώ NaCl (και σε ορισμένα μοντέλα, ουρία) οδηγεί σε αύξηση της ROS και επακόλουθη βλάβη του DNA, μια ταυτόχρονη θεραπεία με ουρία οδηγεί στην ενεργοποίηση των μηχανισμών απόκρισης όπως έκφραση συνοδός που οδηγεί σε προστασία του DNA. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η προστασία της ουρίας είναι από ζημία που προκαλείται κατά κύριο λόγο από Na

+ ιόν και όχι απαραίτητα NaCl. Αυτό υποδηλώνει ότι οι νέες έρευνες που απαιτούνται προκειμένου να κατανοήσουμε τόσο την θανατηφόρο επίδραση του NaCl και η ουρία και την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο συστατικών σε νεφρική μυελό.

Δεδομένου ότι GSH είναι η κύρια μη-ενζυματική αντιοξειδωτικό μόριο, μελετήσαμε τα ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH των κυττάρων σε επεξεργασία με NaCl και /ή ουρία. Παρατηρήθηκε ότι NaCl, αλλά όχι ουρία, αύξησε τα ενδοκυτταρικά επίπεδα GSH και ότι η ουρία αντιστραφεί η αύξηση στα επίπεδα GSH σε NaCl-επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 5). Η αύξηση της περιεκτικότητας σε GSH σε NaCl κατεργασμένα κύτταρα μπορεί να οφείλεται σε αναστολή της δράσης της ABCC1 ή έκφραση, αλλά θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε μια αύξηση οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, BSO μειώνεται κατά 50% την επιβίωση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με NaCl, αλλά δεν μετέβαλε την επιβίωση των κυττάρων σε επεξεργασία με ουρία ή ουρία + NaCl (Εικ. 6).