Abstract

Cetuximab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που μπλοκάρει τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), επί του παρόντος εγκριθεί για τη θεραπεία διαφόρων τύπων στερεών όγκων. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι το cetuximab μπορεί να αναστείλει υποξία παράγοντα-1 άλφα (HIF-1α) σύνθεση πρωτεΐνης αναστέλλοντας την ενεργοποίηση των οδών κατάντη σηματοδότησης EGFR συμπεριλαμβανομένων Erk, Akt, και mTOR. 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 ΡΑ) είναι μια ένωση anthrapyrazolone γνωστός ως SP600125 που αναστέλλει ειδικά c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK). Εδώ, αναφέρουμε 1, 9 ΡΑ μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α ανεξάρτητα από αναστολή της JNK. Αυτό μειωτικά αποτέλεσμα καταργήθηκε όταν το οξυγόνο που εξαρτώνται από τον τομέα (ODD) του HIF-1α (HIF-1α-ΔODD, η περιοχή που είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση HIF-1α) πειραματικά διαγραφεί ή όταν η δραστικότητα του HIF-1α προλυλ υδροξυλάσης (PHD) ή το σύμπλοκο του πρωτεασώματος 26S αναστάλθηκε, υποδεικνύοντας ότι η 1, 9 ΡΑ ρυθμίζει προς τα κάτω HIF-1α με την προώθηση PHD εξαρτώμενη αποδόμηση HIF-1α. Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός των 1, 9 ΡΑ και cetuximab εργαστεί συνεργικά για να επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα στα οποία cetuximab ή 1, 9 ΡΑ μόνο είχε καμία ή μόνο ασθενή αποπτωτική δραστηριότητα. Αυτή η συνεργιστική επίδραση μειώθηκε ουσιαστικά σε καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με HIF-1α-ΔODD, υποδεικνύοντας ότι μειορρύθμιση του HIF-1α ήταν ο μηχανισμός αυτής της συνεργικής δράσης. Το πιο σημαντικό, 1, 9 ΡΑ μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα που είναι ευαίσθητα στην cetuximab επαγόμενη αναστολή της έκφρασης HIF-1α λόγω υπερέκφραση των ογκογόνων

Ras

(RasG12V). Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι 1, 9 ΡΑ είναι μία ένωση μολύβδου μιας νέας κατηγορίας φαρμάκων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ενισχύσουν την απόκριση των καρκινικών κυττάρων στο cetuximab μέσω συμπληρωματικής επίδραση στην ρύθμιση προς τα κάτω του HIF-1α.

Citation : Lu Υ, Λι Χ, Lu Η, ανεμιστήρα Z (2010) 1, 9-Pyrazoloanthrones ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α και τον καρκίνο ευαισθητοποιήσει κύτταρα στο cetuximab τη μεσολάβηση αντι-EGFR θεραπεία. PLoS ONE 5 (12): e15823. doi: 10.1371 /journal.pone.0015823

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 29 Αυγούστου 2010? Αποδεκτές: 29 Νοεμβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 29, Δεκεμβρίου, 2010

Copyright: © 2010 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας βραβείο 5R01CA129036 (με ZF) και επιχορήγηση από το Κέντρο για Στοχευμένη θεραπεία του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου (με ZF). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) παίζει αρκετούς σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη και πρόοδο πολλών τύπων συμπαγών όγκων [1]. Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών, έχουν νέες θεραπείες του καρκίνου που στοχεύουν EGFR έχουν αναπτυχθεί και μελετηθεί εκτενώς [2], [3]. Πρόσφατες κλινικές μελέτες έχουν δείξει μια αντικειμενική απόκριση σε ασθενείς με διάφορους τύπους καρκίνων αγωγή είτε με αποκλεισμό EGFR με μονοκλωνικά αντισώματα (cetuximab, panitumumab, κ.λπ.) ή με αναστολή του EGFR δραστικότητας κινάσης τυροσίνης με αναστολείς μικρού μορίου (gefitinib, erlotinib, κλπ ) [4] – [9]. Οι μελέτες αυτές οδήγησαν στην ρυθμιστική έγκριση αυτών των παραγόντων EGFR-στόχευσης για τη θεραπεία του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, σε συνδυασμό με τη συμβατική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία? Ωστόσο, παρά τις αντικειμενικές αποκρίσεις, το συνολικό ποσοστό ανταπόκρισης των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με EGFR-στοχευμένες είναι χαμηλή, ιδιαίτερα όταν αυτοί οι παράγοντες EGFR-στόχευσης που χρησιμοποιούνται ως μονοθεραπείες [10] – [12]. Επιπλέον, πολλοί ασθενείς με όγκους που εκφράζουν ή ακόμη και εξαιρετικά εκφράζουν EGFR μπορεί να μην έχει μια βέλτιστη ανταπόκριση στη θεραπεία με τους παράγοντες EGFR-στόχευσης [3]. Για παράδειγμα, σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, μόνο το 20-30% των ασθενών είχαν νόσο ανταποκρίθηκαν με αντισώματα EGFR-αποκλειστές [4]. Μεταξύ των 70-80% των ασθενών με νόσο δεν αποκρίνονται, 30-35% είχαν

K-Ras μεταλλάξεις

, 20% είχαν

Β-Raf

και

ΡΙ3Κ

μεταλλάξεις, και το υπόλοιπο είχε άλλες εκτροπές [13]. Έτσι, αν και EGFR παίζει σημαντικούς ρόλους στην ογκογένεση, τα καρκινικά κύτταρα είναι γενετικά ασταθής και μπορεί να ξεφύγει το αποτέλεσμα της θεραπείας που στοχεύει EGFR σε μερικούς καλά χαρακτηρισμένο και μερικά δεν έχουν ακόμη γνωστούς μηχανισμούς αντίστασης. Μεγάλο μέρος συνεχιζόμενη έρευνα επικεντρώνεται στην ανάπτυξη νέων θεραπειών που στοχεύουν συνδυαστικής EGFR και μορίων σε οδούς κατάντη σηματοδότησης EGFR σε μια προσπάθεια να ξεπεραστούν αυτά μηχανισμούς ανθεκτικότητας.

αναφερθεί στο παρελθόν ότι το cetuximab μπορεί αξιοσημείωτα ρυθμίζουν προς τα κάτω τα υψηλά βασικά επίπεδα της υποξίας -inducible παράγοντα-1 άλφα (HIF-1α) αναστέλλοντας την πρωτεϊνική σύνθεση HIF-1α σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές που είναι ευαίσθητοι στην αναστολή του EGFR [14], [15]. Δείξαμε ότι η αναστολή της HIF-1α είναι απαραίτητη, αν και δεν μπορεί να είναι επαρκής, για να μεσολαβούν την απόκριση των καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία που στοχεύει EGFR [14] – [17]. Knockdown του HIF-1α με παρεμβολή RNA (RNAi) αξιοσημείωτα ευαισθητοποιημένα καρκινικά κύτταρα με ογκογόνο

Ras

μεταλλάξεις ή αυτές με

ΡΤΕΝ

αδρανοποίηση ή διαγραφή στο cetuximab θεραπεία [16]. Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα τα οποία ήταν αρχικά ευαίσθητοι στη θεραπεία που παρέχει ουσιαστική αντίσταση σε αντι-EGFR θεραπεία [16]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η άμεση στόχευση HIF-1α μπορεί να παρακάμψει πολλές γνωστούς μηχανισμούς cetuximab-αντίσταση, όπως μεταλλακτική ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και αδρανοποίηση των γονιδίων καταστολής όγκων στα κατάντη οδούς EGFR και /ή εναλλακτικά ενεργοποίηση αυτών των επακόλουθων οδών με άλλους υποδοχείς παράγοντα ανάπτυξης . Novel συνδυασμός προσεγγίσεις για τη στόχευση του EGFR και HIF-1α μπορεί, ως εκ τούτου, έχει ως αποτέλεσμα μία βελτιωμένη θεραπευτική απόκριση σε ασθενείς.

Διάφορες στρατηγικές για τη στόχευση HIF-1α ή ανάντη ρυθμιστές της ή κατάντη γονιδίων στόχων έχουν δοκιμαστεί τα τελευταία χρόνια [18]. Προσεγγίσεις για άμεση στόχευση λειτουργία HIF-1α περιλαμβάνουν αναστολή γονιδιακής έκφρασης HIF-1α χρησιμοποιώντας αντινόημα ή παρεμβολή RNA ή αναστέλλοντας την μεταγραφική δραστικότητα του HIF-1α /β ετεροδιμερές παρεμβαίνοντας με την αλληλεπίδραση του με DNA ή συμπαράγοντες. Οι προσεγγίσεις αυτές έχουν κυρίως δοκιμάζονται πειραματικά, δεδομένου ότι είναι δύσκολο να ελεγχθεί κλινικά με το παρόν διαθέσιμη τεχνολογία. Εναλλακτικά, ο HIF-1α πρωτεΐνη μπορεί να στοχεύει έμμεσα από τη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης του ή τη σταθερότητα χρησιμοποιώντας φαρμακολογικές στρατηγικές που μπορεί να δοκιμαστεί κλινικά [19].

Στην προσπάθεια μας να βρούμε νέες ενώσεις μολύβδου μικρού μορίου που έχουν αντι -HIF-1α δραστικότητα και ότι μπορεί να βελτιστοποιηθεί περαιτέρω για συνδυασμό με cetuximab να ενισχυθεί θεραπευτικά αποτελέσματα σε καρκινικά κύτταρα, ανακαλύψαμε ότι το 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 ΡΑ), το οποίο είναι ένα anthrapyrazolone γνωστός ως SP600125 που αναστέλλει ειδικά γ -Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) [20], [21], μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω έντονα HIF-1α σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, μελετήθηκε η σχέση μεταξύ γνωστή δραστικότητα 1, 9 ΠΑ αναστολής JNK και ανακαλύφθηκε πρόσφατα δραστικότητα της προς τα κάτω ρύθμιση HIF-1α. Έχουμε διερευνηθούν επίσης τους βιοχημικούς μηχανισμούς μέσω των οποίων 1, 9 PA ρυθμίζει προς τα κάτω HIF-1α. Τέλος, εκτελέσαμε πειράματα απόδειξη της απόδειξης για τη δοκιμή υπόθεσή μας ότι η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με ένα συνδυασμό του cetuximab και 1, 9 ΡΑ μπορεί να ενισχύσει την δραστικότητα κατά του όγκου του και ευαισθητοποίηση καρκινικών κυττάρων σε θεραπεία με cetuximab. Τα ευρήματά μας δικαιολογούν την ανάπτυξη νέων παραγώγων της 1, 9 ΡΑ που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με cetuximab για τη θεραπεία του καρκίνου μέσω της συμπληρωματικής προς τα κάτω ρύθμιση του HIF-1α χωρίς ταυτόχρονη αναστολή της JNK.

Αποτελέσματα

1, 9 ΡΑ ρυθμίζει προς τα κάτω HIF-1α ανεξάρτητες από την αναστολή της JNK

σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι, εκτός από την αναστολή της φωσφορυλίωσης c-Jun σε μία δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, 1, 9 ΡΑ μείωσε σημαντικά το συνολικό HIF -1α επίπεδο πρωτεΐνης σε Α431 κύτταρα του αιδοίου πλακώδους καρκινώματος νωρίς, σε 15 λεπτά μετά την αγωγή, ενώ 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη αναστολή της JNK ανιχνεύθηκε σε μεταγενέστερο χρονικό σημείο (Σχήμα 1Α). Αυτό υποδηλώνει ότι το 1, μειωτικά επίδραση 9 PA για HIF-1α είναι ανεξάρτητη από την ανασταλτική δράση της επί JNK. Η ένωση επίσης προκάλεσε μια παροδική αύξηση στα επίπεδα της φωσφορυλίωσης ενεργοποίησης ειδικών του Akt τόσο T308 και S473, καθώς και μια παρατεταμένη και σταδιακή αύξηση του επιπέδου της φωσφορυλιωμένης Erk στα κύτταρα, τα οποία συσχετίζονται χρονικά με την αποκατάσταση του HIF -1α επίπεδο ξεκινώντας από περίπου 4 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικόνα 1Α).

(Α) χρονική σειρά και συσχέτιση των 1, 9 PA-επαγόμενη HIF-1α προς τα κάτω ρύθμιση και την αναστολή της JNK, και η θεραπεία που προκαλείται από αντισταθμιστικά ενεργοποίησης της Akt και ERK. Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ 1, 9 PA σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Β) Δόση εξαρτώμενη επιδράσεις των 1, 9 ΡΑ σε προς τα κάτω ρύθμιση HIF-1α, αναστέλλοντας JNK, και ενεργοποιώντας Erk. Α431 κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις των 1, 9 ΡΑ για 16 ώρες σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Γ) ανεξαρτησία των 1, 9 PA-επαγόμενη HIF-1α προς τα κάτω ρύθμιση από την ανασταλτική λειτουργία της JNK. Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 1, 9 ΡΑ ή 1-μεθυλο-1, 9 ΡΑ για 1 ώρα σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Δ) Δεν υπάρχουν αλλαγές σε HIF-1α επίπεδο μετά την ενεργοποίηση ή την αναστολή της JNK. Α431 κύτταρα Wert παροδικά διαμολυσμένα με φορέα ελέγχου ή ένα από τα κατασκευάσματα που περιέχει ένα ιδιοσυστατικά ενεργό μεταλλαγμένο SEK1 S220E /T224D (SEK1-CA), μια κυρίαρχη-αρνητική SEK1 K129R μεταλλαγμένο (SEK1-DN), ή κυρίαρχο-αρνητικό ΜΕΚΚ1 K432M μεταλλαγμένο (ΜΕΚΚ1-DN) όλη τη νύκτα. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Ε) Αντισταθμιστικό ενεργοποίηση του Erk μετά HIF-1α σίγηση σε σύγκριση με τη θεραπεία με 1, 9 ΡΑ ή 1-μεθυλο-1, 9 ΡΑ. Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε knockdown του HIF-1α με ειδικές ή ελέγχου siRNA, ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 10 μΜ 1, 9 ΡΑ ή 1-μεθυλο-1, 9 ΡΑ για 16 ώρες. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (F) ρύθμιση προς τα κάτω του HIF-1α κατά 1, 9 PA σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ενδείκνυται κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε 10 ή 40 μΜ 1, 9 ΡΑ για 1 ώρα σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με δείχνονται τα αντισώματα.

Η

Η θεραπεία που προκαλείται από προς τα κάτω ρύθμιση του HIF-1α και αντισταθμιστική αύξηση σε κυτταρική σηματοδότηση ήταν επίσης 1, 9 PA δοσοεξαρτώμενη (Εικόνα 1Β) . Η ελάχιστη δόση του 1, 9 ΡΑ αναγκαίο να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α ήταν μεταξύ 1,25 και 2,5 μm, το οποίο ήταν ελαφρώς υψηλότερη από την ελάχιστη δόση που απαιτείται για την αποτελεσματική μείωση της φωσφορυλίωσης c-Jun μέσω της αναστολής της JNK (μεταξύ 0,6 και 1,25 μΜ? Σχήμα 1Β ), γεγονός που υποδηλώνει περαιτέρω ότι το πρόσφατα ανακαλύφθηκε μειωτικά επίδραση της 1, 9 PA σε HIF-1α είναι ανεξάρτητη από τις γνωστές ανασταλτική δράση της επί της JNK.

για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση, θα αντιμετωπίζονται τα ίδια κύτταρα με 1-μεθυλο -1, 9 PA, ένα δομικό ανάλογο του 1, 9 ΡΑ που έχει χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός έλεγχος για 1, 9 ΡΑ στη βιβλιογραφία, διότι δεν αναστέλλει JNK. Επιβεβαιώσαμε ότι 1-μεθυλο-1, 9 PA δεν μειώνουν φωσφορυλίωση c-Jun σε κύτταρα Α431 σε σύγκριση με 1, 9 PA? Ωστόσο, ήταν εξίσου αποτελεσματικό στην προς τα κάτω ρύθμιση HIF-1α σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 1 C). Από την άλλη πλευρά, η επιμόλυνση των Α431 κυττάρων είτε με ένα συστατικώς δραστικό SEK1, το οποίο ενεργοποιεί ΙΝΚ, ή με κυρίαρχο-αρνητικό SEK1 ή κυρίαρχο-αρνητικό ΜΕΚΚ1, δύο εκ των οποίων απενεργοποίηση JNK, δεν επηρέασε το επίπεδο της HIF-1α στα κύτταρα (Σχήμα 1 D). Αυτά τα επιπλέον πειράματα ελέγχου που προβλέπονται ισχυρές ενδείξεις ότι η αναστολή της JNK μόνη δεν είχε καμία επίδραση στο επίπεδο του HIF-1α στο μοντέλο των κυττάρων που εξετάστηκαν.

Σχήμα 1Ε δείχνει ότι η θεραπεία των κυττάρων Α431 με είτε 1, 9 ΡΑ ή 1 μεθυλο-1, 9 ΡΑ, ή knockdown του HIF-1α έκφραση με RNAi οδήγησε σε αντισταθμιστική αύξηση του επιπέδου της φωσφορυλιωμένης Erk σε αυτά τα κύτταρα, υποστηρίζοντας περαιτέρω το συμπέρασμα ότι η αύξηση στη σηματοδότηση των κυττάρων μετά από 1, 9 θεραπεία ΡΑ είναι μια αντισταθμιστική απόκριση που πιθανόν σχετίζεται με την ρύθμιση προς τα κάτω του HIF-1α, αλλά όχι στην αναστολή της JNK.

Εκτός από Α431 κύτταρα αιδοίου πλακώδους καρκινώματος, βρήκαμε ότι 1, 9 ΡΑ θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α σε PC3 κύτταρα καρκίνου προστάτη, καρκίνου του μαστού MDA468 κυττάρων, MCF7 καρκίνου του μαστού κύτταρα επιμολυσμένα με ένα υψηλό επίπεδο HER2, και H3255 και HCC827 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα (Σχήμα 1 F). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν έντονα ότι 1, 9 ΡΑ μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μέσω ενός μηχανισμού (ες) που είναι ανεξάρτητη από τον μηχανισμό (ες) με την οποία αναστέλλει JNK. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν επίσης ότι τα κύτταρα ανταποκρίνονται σε 1, 9 ΡΑ ή 1-μεθυλο-1, 9 ΡΑ-επαγόμενη μειορύθμιση του HIF-1α ή μεσολάβηση RNAi αποσιώπηση HIF-1α, μέσω ενός εξισωτικού απόκριση της ενεργοποίησης της κυτταρικής σηματοδότησης μονοπατιών που είναι γνωστό ότι την αύξηση της έκφρασης του HIF-1α [22] – [26].

1, 9 PA μειώνει το επίπεδο HIF-1α με την προώθηση ουμπικουιτίνωση του HIF-1α

Στη συνέχεια διερευνηθεί ο μηχανισμός (s) με την οποία 1, 9 ΡΑ ρυθμίζει προς τα κάτω HIF-1α. HIF-1α είναι ένα ιδιαίτερα ασταθές πρωτεΐνη υπό ορθοξικές συνθήκες, επειδή κατέχει το οξυγόνο που εξαρτώνται από τον τομέα (ODD), η οποία υπόκειται σε μετα-μεταφραστική ρύθμιση μέσω της πρωτεΐνης ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση [27], [28]. Επειδή 1, 9 ΡΑ μείωσε δραματικά το επίπεδο HIF-1α σε λιγότερο από 15 λεπτά (0.25 h? Σχήμα 1Α), υποθέσαμε ότι 1, 9 ΡΑ δρα μέσω ενός μηχανισμού που ενισχύει HIF-1α αποικοδόμηση πρωτεΐνης. Το Σχήμα 2Α δείχνει ότι, σε σύγκριση με τη θεραπεία ελέγχου του οχήματος κυττάρων Α431 μετά από αποκλεισμό των νέων πρωτεϊνικής σύνθεσης κυκλοεξιμίδιο, κατεργασία των κυττάρων με 1, 9 ΡΑ ταχεία σημαντικά την αποικοδόμηση του HIF-1α? ο χρόνος αποδόμησης μειώθηκε από 60 λεπτά στα κύτταρα ελέγχου σε λιγότερο από 20 λεπτά στα κύτταρα κατεργασμένα με 1, 9 ΡΑ. Επιπλέον, 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη μειορύθμιση του HIF-1α ήταν εντελώς αποκλεισμένη με κατεργασία των κυττάρων Α431 με MG132 (Σχήμα 2Β), η οποία αναστέλλει το σύμπλοκο πρωτεασωμική 26S, υποδεικνύοντας ότι η μείωση του HIF-1α μετά από 1, 9 θεραπεία ΡΑ ήταν επιτυγχάνεται μέσω της αύξησης αποικοδόμησης πρωτεΐνης.

(Α) μειωμένη HIF-1α σταθερότητα της πρωτεΐνης με την παρουσία 1, 9 ΡΑ (1, 9 ΡΑ). Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ κυκλοεξιμίδιο (CHX) συν 10 μΜ 1, 9 ΡΑ ή DMSO έλεγχο οχήματος σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας για έως 60 λεπτά στους 37 ° C. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά την κατεργασία σε κάθε χρονικό σημείο και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Β) Αναστολή της 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη HIF-1α αποικοδόμηση από το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος. Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ 1, 9 PA ± 10 μΜ MG132 για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά την κατεργασία σε κάθε χρονικό σημείο και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με δείχνονται τα αντισώματα.

Η

Ενώ 1, 9 ΡΑ αισθητά μειωτικά HIF-1α υπό νορμοξικές συνθήκες, βρήκαμε ότι η ικανότητα του 1 , 9 PA να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α ήταν σημαντικά μειωμένη όταν το οξυγόνο δεν ήταν διαθέσιμα ή όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεφεροξαμίνη (DFO), ένα μέσο χηλικοποίησης σιδήρου (Σχήμα 3Α)? τόσο O

2 και Fe

Οι 2+ απαιτούνται για HIF-1α προλυλ υδροξυλάσης (PHD) δραστηριότητα για την υδροξυλίωση των HIF-1α για την αναγνώριση από το VHL ουβικιτίνης λιγάση [29], [30]. Το αποτέλεσμα της θεραπείας με DFO ήταν παρόμοια με εκείνη της θεραπείας με MG132: την ουβικουιτινωμένης HIF-1α ανεστάλη από αποικοδόμηση μέσω της οδού πρωτεασώματος (Σχήμα 3Α). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το 1, 9 PA μπορεί να επηρεάσει άμεσα ή έμμεσα την ουμπικουιτίνωση του HIF-1α [29], [30].

(Α) Απαίτηση O

2 και Fe

2+ στο 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη μειορύθμιση του HIF-1α. Α431 κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ 1, 9 ΡΑ σε 0,5% μέσου FBS καλλιέργειας υπό νορμοξικές συνθήκες υπό την απουσία ή παρουσία της DFO (100 μΜ) ή MG132 (10 μΜ), και υπό συνθήκες υποξίας για 16 ώρες στους 37 ° ΝΤΟ. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Β) Ο ρόλος της ODD του HIF-1α σε 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη μειορύθμιση του HIF-1α. κύτταρα Α431 διαμολύνθηκαν παροδικά με τον HIF-1α-ΔODD κατασκεύασμα ή φορέα ελέγχου για 48 ώρες και στη συνέχεια είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις 1, 9 ΡΑ για 1 ώρα στους 37 ° C. Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Γ) Αντίσταση του Α431 /κυττάρων HIF-1α-ΔODD στο 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη μειορύθμιση του HIF-1α. Α431 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά το κατασκεύασμα HIF-1α-ΔODD υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α). Κυτταρολύματα κατόπιν παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με δείχνονται τα αντισώματα.

Η

Για να δοκιμαστεί περαιτέρω αυτή η υπόθεση, εξετάσαμε την ικανότητα των 1, 9 ΡΑ να ρυθμίσει ένα HIF-1α μεταλλαγμένο στο οποίο η PHD /VHL αλληλεπιδρούν τομέα σε HIF-1α, δηλαδή, ODD, διεγράφη (HIF-1α-ΔODD). Όπως αναμενόταν, ενώ 1, 9 ΡΑ μειώθηκε το επίπεδο της άγριου τύπου HIF-1α, αυτό δεν επηρέασε το επίπεδο της HIF-1α-ΔODD σε κύτταρα Α431 παροδικά επιμολυσμένα με τον HIF-1α-ΔODD κατασκεύασμα (Σχήμα 3Β). Στη συνέχεια καθορίζονται ομαδοποιήθηκαν Α431 κύτταρα που σταθερώς εξέφρασαν HIF-1α-ΔODD και επιβεβαίωσε περαιτέρω τα ευρήματα που ελήφθησαν στα γονικά κύτταρα Α431 με αγωγή των κυττάρων Α431 που εκφράζουν ΗΙΡ-1α-ΔODD κατά τον ίδιο τρόπο (Εικόνα 3C). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν σθεναρά το συμπέρασμα ότι το 1, 9 PA ρυθμίζει προς τα κάτω HIF-1α, μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση μεταξύ PHD /VHL και το περίεργο του HIF-1α. Όταν τα βασικά στοιχεία (O

2, Fe

2+, και 26S πρωτεασώματος) που απαιτούνται για τη δραστηριότητα PHD για την υδροξυλίωση των HIF-1α και για την επακόλουθη VHL μεσολάβηση ουμπικουιτίνωση και η υποβάθμιση του λείπουν ή να ανασταλεί, ή όταν το ODD του HIF-1α, η οποία είναι η στοχευμένη περιοχή από το σύμπλοκο λιγάσης ουβικιτίνη VHL, είναι απούσα, 1, 9 PA χάνει την ικανότητά του να ρυθμίζουν προς τα κάτω HIF-1α.

για να ληφθεί άμεση απόδειξη ότι το 1, 9 PA προωθεί η ουβικιτινίωση του HIF-1α, υποβάλλαμε τον HIF-1α ανοσοκαταβυθίστηκαν από τα προϊόντα λύσεως των 1, 9 ΡΑ-επεξεργασμένα κύτταρα Α431 να κηλίδωση Western με ένα αντι-ubiquitin αντισωμάτων. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της polyubiquitinated HIF-1α αυξήθηκε σαφώς μέσα σε 10 λεπτά μετά από 1, 9 θεραπεία ΡΑ (Σχήμα 4Α). Παρουσία του αναστολέα πρωτεασώματος MG132 κατά τη διάρκεια της 1, 9 θεραπεία ΡΑ ανέστειλε ουβικουιτινωμένης HIF-1α από το να αποικοδομούνται (Εικόνα 4Β).

(Α). Κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ 1, 9 ΡΑ για υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για HIF-1α ανοσοκαταβύθιση, ακολουθούμενα από στύπωση Western των ανοσοκαταβύθισης με αντισώματα που κατευθύνονται έναντι της ουβικιτίνης (επάνω), ο HIF-1α και β-ακτίνης. (Β) κύτταρα Α431 ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ 1, 9 ΡΑ υπό την παρουσία 10 μΜ MG132 για 1 ώρα σε 0.5% FBS μέσου. HIF-1α ανοσοκαταβυθίστηκε ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western με αντι-HIF-1α αντίσωμα.

Η

Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας προβλέπουν ισχυρές ενδείξεις ότι το 1, 9 ΡΑ μειώνει HIF-1α μέσω ενός μηχανισμού που θα ενισχύει η αλληλεπίδραση μεταξύ των περίεργη του HIF-1α και του συμπλόκου PHD /VHL /ουβικιτινίωση, και ως εκ τούτου οδηγεί σε αυξημένη αποδόμηση του HIF-1α μέσω της οδού πρωτεασώματος.

1, 9 ΡΑ συνεργεί με cetuximab για να επάγει απόπτωση μέσω συν-προς τα κάτω ρύθμιση HIF-1α

προηγουμένως έδειξαν ότι το cetuximab ρυθμίζει προς τα κάτω HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα σε αντι-EGFR θεραπεία μέσω αναστολής της πρωτεϊνικής σύνθεσης HIF-1α, η οποία εμποδίζεται από την έκφραση ενός μυριστοϋλιωμένης Akt ότι είναι ουσιαστικά δραστική [16]. Το Σχήμα 5Α δείχνει την τρέχουσα ευρήματά μας, οι οποίες είναι παρόμοιες με αυτές που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν? Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με τα προηγούμενα ευρήματα μας, η έκφραση του ιδιοσυστατικά ενεργό Akt δεν επηρέασε 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη μειορύθμιση του HIF-1α (Σχήμα 5Β), εμπλέκοντας ότι ο ρόλος των 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη αύξηση στην Akt δραστηριότητας (βλέπε Εικόνα 1Α) δεν ήταν για την εξουδετέρωση 1, 9 ΡΑ επαγόμενη αποδόμηση πρωτεΐνης HIF-1α, αλλά μάλλον για να αντισταθμίσει 1, 9 ΡΑ-επαγόμενη HIF-1α αποικοδόμηση πρωτεΐνης διεγείροντας σύνθεση νέας πρωτεΐνης HIF-1α.

Α431 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα φορέα ελέγχου ή ένα μυριστοϋλιωμένες Akt (Myr-Akt) για 24 ώρες σε 0.5% FBS μέσο. Η οργανισμούς φορείς ή Myr-Akt-επιμολυσμένα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 20 ηΜ cetuximab ή PBS όλη τη νύκτα (Α), ή με 10 μΜ 1, 9 ΡΑ ή DMSO ελέγχου του οχήματος για 1 h (Β). Μετά τη θεραπεία, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western με δείχνονται τα αντισώματα.

Η

έτσι Υποθέσαμε ότι ο συνδυασμός των 1, 9 ΡΑ και cetuximab, τα οποία μπορούν να αναστείλουν τις οδούς Akt και ERK και με τον τρόπο αυτό μπλοκάρει την αντισταθμιστικών μηχανισμών, θα έχει ένα πρόσθετο ή ακόμη και συνεργική επίδραση στην ρύθμιση προς τα κάτω του HIF-1α. Ελέγξαμε την υπόθεση αυτή σε 3 κυτταρικές γραμμές καρκίνου που είναι ευαίσθητα σε θεραπεία cetuximab: Α431, ΗΝ5 (καρκίνου κεφαλής και τραχήλου) και DiFi (ορθοκολικό καρκίνο). Επειδή τα κύτταρα DiFi είναι εξαιρετικά ευαίσθητα στο cetuximab, που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2 nM cetuximab? Α431 και ΗΝ5 κύτταρα, τα οποία δεν είναι τόσο ευαίσθητα στο cetuximab ως κύτταρα DiFi, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ cetuximab. Το Σχήμα 6Α δείχνει ότι, όταν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές γραμμές 3 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με είτε 10 είτε 40 μΜ 1, 9 ΡΑ ή cetuximab μόνο, HIF-1α ήταν μειωτικά. Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τόσο με 1, 9 ΡΑ και cetuximab, HIF-1α περαιτέρω ρυθμίζεται προς τα κάτω. Κατεργασία των κυττάρων με cetuximab ή 1, 9 PA μόνος που προκαλείται ελάχιστη μόνο ή καμία διάσπαση της PARP, ενός δείκτη της απόπτωσης? Ωστόσο, ο συνδυασμός του cetuximab και 1, 9 ΡΑ ενισχύεται σημαντικά την επαγωγή της διάσπασης της ΡΑΚΡ σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3.

(Α) Επαγωγή της διάσπασης PARP από το συνδυασμό των 1, 9 ΡΑ και cetuximab. Α431, κύτταρα ΗΝ5, και DiFi ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με cetuximab (10 ηΜ για Α431 και ΗΝ5 κύτταρα και 2 ηΜ για τα κύτταρα DiFi για 16 ώρες), 1, 9 ΡΑ (10 μΜ ή 40 μΜ προστίθενται την τελευταία ώρα πριν από τη λύση των κυττάρων) ή και τα δύο σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Β) Αυξημένη διέγερση απόπτωσης με το συνδυασμό του 1, 9 ΡΑ και cetuximab. κύτταρα Α431 σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο (Α). Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με την απόπτωση ELISA. Οι σχετικές τιμές απορρόφησης απεικονίζονται. Η

σ

αξία ήταν & lt? 0,01 κατά τη σύγκριση του επιπέδου απόπτωσης κατά 1, 9 PA μόνο του (10 ή 40 μΜ) ή το cetuximab μόνο με εκείνη της απόπτωσης από συνδυασμό των δύο παραγόντων (σημείωση: μόνο το

ρ

τιμές συγκρίνοντας 10 μΜ 1, 9 ΡΑ μόνο και σε συνδυασμό με cetuximab φαίνονται). (Γ) Εξάρτηση της επαγωγή απόπτωσης με το συνδυασμό του 1, 9 ΡΑ και cetuximab σε HIF-1α προς τα κάτω ρύθμιση. A431neo και Α431 /HIF-1α-ΔODD κύτταρα επεξεργάστηκαν όπως υποδεικνύεται, και τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο (Α).

Η

επιλεγμένα κύτταρα Α431 για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το αποτέλεσμα αυτό με τη χρησιμοποίηση μια ανεξάρτητη απόπτωση ELISA που μετρά ποσοτικά το επίπεδο της ιστόνης που σχετίζονται DNA κατακερματισμού στο κυτταρόπλασμα μετά την απόπτωση (Σχήμα 6Β). 1, 9 ΡΑ μόνη της σε συγκεντρώσεις των 10 και 40 μΜ δεν αισθητά την αύξηση του επιπέδου της απόπτωσης? cetuximab αυξημένη μόνος μετρίως το επίπεδο της ιστόνης που σχετίζονται με το DNA του κατακερματισμού στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η θεραπεία συνδυασμού αύξησε σημαντικά το επίπεδο της απόπτωσης (

ρ

& lt? 0,01). Για την περαιτέρω επιβεβαιώσει εάν η επαγωγή της απόπτωσης παρατηρείται με τη θεραπεία συνδυασμού με τη μεσολάβηση των συμπληρωματικών επιδράσεις στην ρύθμιση προς τα κάτω του HIF-1α από αυτούς τους 2 παράγοντες, επαναλάβαμε τα πειράματα σε κύτταρα Α431 κύτταρα που εκφράζουν ΗΙΡ-1α-ΔODD. Το Σχήμα 6C δείχνει ότι, σε σύγκριση με το αποτέλεσμά του τον έλεγχο των φορέων-επιμολυσμένα κύτταρα A431neo, η θεραπεία συνδυασμού είχαν μια σημαντικά χαμηλότερη επίδραση στην διάσπαση PARP σε Α431 κύτταρα /HIF-1α-ΔODD. Η επίδραση της 1, 9 ΡΑ για την ρύθμιση προς τα κάτω της ενδογενούς HIF-1α ήταν επίσης μειωμένη σε Α431 κύτταρα /HIF-1α-ΔODD σύγκριση με A431neo κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση του HIF-1α ήταν ο μηχανισμός για την συνεργική δράση του συνδυασμού των 1, 9 ΡΑ και cetuximab.

1, 9 PA υπερνικά ογκογόνο Ras επαγόμενη αντίσταση cetuximab

ογκογονικής μεταλλάξεως του

Ras

έχει δειχθεί ότι είναι ένας κύριος μηχανισμός του cetuximab ανθεκτικότητας σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [10]. Εμείς προηγουμένως έδειξαν ως απόδειξη της έννοιας που knockdown του HIF-1α μέσω RNAi αποκαθιστά ουσιαστικά την ευαισθησία των κυττάρων Α431 επιμολύνονται με ένα ογκογόνο

H-Ras

(G12V) μετάλλαξη στο cetuximab θεραπεία [16]. Για να αποδείξει την περαιτέρω αυτό το μυθιστόρημα έννοια, εξετάσαμε την επίδραση της 1, 9 PA μόνη της και σε συνδυασμό με cetuximab σε κύτταρα Α431 επιμολυσμένα με

Ras-G12V

(Α431 /RasG12V). Το Σχήμα 7Α δείχνει ότι, σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα-επιμολυσμένα A431neo κύτταρα, κύτταρα Α431 /RasG12V είχε υψηλότερο βασικό επίπεδο φωσφορυλίωσης Akt και ήταν ανθεκτικά σε cetuximab επαγόμενη αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt, ρύθμιση προς τα κάτω του HIF-1α, και διάσπαση της PARP. Επιπλέον, 1, 9 PA μόνος ανέστειλε τόσο το βασικό και το Ras-επαγόμενη προς τα πάνω ρύθμιση της φωσφορυλίωσης Akt και μειωτικά HIF-1α τόσο A431neo και Α431 κύτταρα /RasG12V, αλλά δεν είχε καμία ανιχνεύσιμη επίδραση στην επαγωγή της διάσπασης της ΡΑΚΡ σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά . Ο συνδυασμός των 1, 9 ΡΑ και cetuximab, ωστόσο, σημαντικά αυξημένη διάσπαση της ΡΑΚΡ σε αμφότερα τα κύτταρα A431neo και Α431 /RasG12V. Η διάσπαση της ΡΑΚΡ σε Α431 κύτταρα /RasG12V είναι ιδιαίτερα σημαντική, διότι το cetuximab μόνο δεν ήταν σε θέση να διεγείρει διάσπαση PARP σε αυτά τα κύτταρα, λόγω της έκφρασης των ογκογόνων

Ras

? λαμβάνοντας υπόψη ότι η θεραπεία συνδυασμού στην Α431 /κυττάρων RasG12V οδήγησε σε ένα επίπεδο διάσπασης PARP η οποία ήταν παρόμοια με το επίπεδο της διάσπασης PARP σε A431neo κύτταρα, υποδεικνύοντας μία συνέργεια μεταξύ 1, 9 ΡΑ και cetuximab στην επαγωγή της απόπτωσης σε cetuximab ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) Επίδραση της 1, 9 ΡΑ και cetuximab, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, με το επίπεδο HIF-1α και επαγωγή απόπτωσης. A431neo και Α431 κύτταρα /RasG12V ήταν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με cetuximab (10 ηΜ για 16 ώρες), 10 μΜ 1, 9 ΡΑ (προστέθηκε η τελευταία ώρα πριν από τη λύση των κυττάρων), ή και τα δύο σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (Β) 1, 9 PA μεσολάβηση ευαισθητοποίηση στο cetuximab επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. A431neo και κύτταρα Α431 /RasG12V υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του cetuximab ± 5 μΜ 1, 9 PA σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας για 5 ημέρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μία δοκιμασία ΜΤΤ. Οι τιμές οπτικής πυκνότητας των κατεργασμένων ομάδων κανονικοποιήθηκαν με τις τιμές των ομάδων ελέγχου (με ή χωρίς 1, 9 θεραπεία ΡΑ) και εκφράζεται ως ποσοστό του αντίστοιχου ελέγχου. Το ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν απεικονίστηκε γραφικά ως συνάρτηση της θεραπείας με αυξανόμενες συγκεντρώσεις cetuximab. Οι διαφορές στην επιβίωση των κυττάρων μεταξύ των δύο ομάδων ήταν στατιστικά σημαντικές (

ρ

& lt? 0,01) όταν οι συγκεντρώσεις του cetuximab ήταν μεγαλύτερες από 0.625 ηΜ σε A431neo κύτταρα και 1.25 ηΜ σε Α431 κύτταρα /RasG12V. (Γ) 1, 9 PA μεσολάβηση ευαισθητοποίηση στο cetuximab επαγόμενη αναστολή της παραγωγής VEGF. A431neo και Α431 κύτταρα /RasG12V ήταν χωρίς θεραπεία ή επεξεργασία με 10 ηΜ cetuximab, 10 μΜ 1, 9 ΡΑ, ή και τα δύο σε 0.5% μέσο καλλιέργειας FBS για 16 ώρες. Το VEGF εκκρίνονται στο ρυθμισμένο μέσο από τα κύτταρα μετρήθηκε με ELISA. Η

σ

-τιμές για υποδεικνύεται συγκρίσεις έδειξαν. (D) Σύγκριση των Α431 και κυττάρων GEO σε θεραπεία με 1, 9 ΡΑ και cetuximab, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Α431 και GEO κύτταρα κατεργάστηκαν όπως περιγράφεται στο (Α). Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με τα αντισώματα που φαίνεται. (ΜΙ). 1, 9 PA μεσολάβηση κυττάρων ευαισθητοποίηση GEO στο cetuximab επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. κύτταρα GEO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του cetuximab ± 5 μΜ 1, 9 PA σε 0.5% FBS μέσο καλλιέργειας για 5 ημέρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μία δοκιμασία ΜΤΤ. επεξεργάστηκαν τα στοιχεία που περιγράφονται στο (Β). Οι διαφορές στην επιβίωση των κυττάρων μεταξύ των δύο ομάδων ήταν στατιστικά σημαντική (

σ

& lt? 0.01). Σε όλες τις συγκεντρώσεις του cetuximab δοκιμαστεί

Η

Για να αποκτήσετε περαιτέρω αποδείξεις σε κυτταρικό επίπεδο για την υποστήριξη το προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα της θεραπείας συνδυασμού, πραγματοποιήσαμε μία συμβατική δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης σύγκριση της cetuximab δοσο-εξαρτώμενη επίδραση με και χωρίς 1, 9 ΡΑ σε A431neo και Α431 κύτταρα /RasG12V. Βρήκαμε ότι το 1, 9 PA ευαισθητοποιημένα κύτταρα και τα δύο A431neo και Α431 /RasG12V να cetuximab (Σχήμα 7Β). Η προσθήκη του 1, 9 PA με το cetuximab μετατόπισε το IC

50 του cetuximab 3 έως 10 nM σε λιγότερο από 1 nM σε A431neo κύτταρα, και το πιο σημαντικό, πέτυχε ένα IC

50 3 ηΜ για cetuximab σε κύτταρα Α431 /RasG12V? Σε αντίθεση, το IC

50 του cetuximab μόνο δεν επετεύχθη (Σχήμα 7Β), ακόμη και σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 10 ηΜ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Βρήκαμε ότι η κατεργασία A431neo κυττάρων με 1, 9 PA μόνο του δεν ανέστειλε σημαντικά την παραγωγή VEGF σε σύγκριση με την αγωγή αυτών των κυττάρων μόνο με cetuximab? προσθέτοντας 1, 9 PA δεν ελάττωσε περαιτέρω το επίπεδο παραγωγής του VEGF που ανεστάλη από cetuximab (Σχήμα 7C). Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, όταν τα κύτταρα Α431 έγινε αντίσταση σε cetuximab επαγόμενη αναστολή της παραγωγής VEGF λόγω έκφραση του ογκογόνου RasG12V, την προσθήκη 1, 9 ΡΑ μείωσε σημαντικά το επίπεδο της παραγωγής VEGF (

ρ

& lt? 0,01 ).

Τέλος, για να διαπιστωθεί αν 1, 9 PA μπορεί επίσης να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα με φυσιολογικά

Ras

μεταλλάξεις, εξετάσαμε την επίδραση του συνδυασμού 1, 9 PA και cetuximab σε GEO καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, τα οποία είναι γνωστό ότι έχουν μεταλλαχθεί

Ras

[31]. Ωστόσο, παρά φέρει ένα μεταλλαγμένο

Ras

επί εξονίου 2, τα κύτταρα GEO ανταποκρίθηκε σε 1, 9 ΡΑ και cetuximab με παρόμοιο τρόπο όπως τα κύτταρα Α431 έκανε. 1, 9 ΡΑ οδήγησε σε αντισταθμιστική αύξηση του επιπέδου της φωσφορυλιωμένης Erk μετά από ολονύκτια επεξεργασία (16 ώρες) και στα δύο Α431 και GEO κύτταρα, τα οποία ήταν μειωμένη με την παρουσία του cetuximab. Ο συνδυασμός αυτών των παραγόντων 2 ενισχυμένης διάσπασης PARP και στους δύο τύπους κυττάρων (Σχήμα 7D) και ευαισθητοποιημένα κύτταρα GEO στο cetuximab επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης (Σχήμα 7Ε).

Εν περιλήψει, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι 1, 9 PA μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα στο cetuximab μεσολάβηση αντι-EGFR θεραπείας με ρύθμιση προς τα κάτω HIF-1α και μπορεί να ενισχύσει την κυτταρική απόκριση σε θεραπεία με cetuximab σε καρκινικά κύτταρα που φέρουν ογκογόνο

Ras

μεταλλάξεις.

Συζήτηση

Εδώ, αναφέρουμε 2 σημαντικά ευρήματα, τα οποία, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχουν αναφερθεί στο παρελθόν.