Αφηρημένο

Τα microRNAs είναι βασικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης και έχει αποδειχθεί ότι έχουν αλλάξει την έκφραση σε μια ποικιλία του καρκίνου τύπων, συμπεριλαμβανομένων επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. λειτουργία miRNA είναι πιο συχνά επιτυγχάνεται μέσω σύνδεσης προς την 3′-αμετάφραστη περιοχή του κωδικοποίησης πρωτεΐνης γονιδίου στόχου. Μετάλλαξη διαλογή χρησιμοποιώντας μαζικά παράλληλη αλληλουχίας των 712 γονιδίων miRNA σε 86 περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών εντοπίζονται μόνο 5 μεταλλαγμένα γονίδια miRNA, το καθένα σε διαφορετική περίπτωση. Μία μετάλλαξη βρισκόταν στο ώριμο miRNA, και τρεις μεταλλάξεις είχαν προβλεφθεί να μεταβάλλουν την δευτερεύουσα δομή της μεταγραφής miRNA. Προβολή της 3′-αμετάφραστη περιοχή του 18 υποψήφια γονίδια καρκίνου που έχουν αναγνωριστεί μία μετάλλαξη σε καθένα από

ΑΚΤ2

,

EGFR

,

ERRB2

και

CTNNB1

. Το λειτουργικό αποτέλεσμα αυτών των μεταλλάξεων είναι ασαφής, καθώς τα δεδομένα έκφρασης διαθέσιμη για

ΑΚΤ2

και

EGFR

δεν έδειξαν αύξηση στη γονιδιακή μεταγραφή. Μεταλλάξεις στα γονίδια miRNA και 3′-αμετάφραστες περιοχές είναι έτσι ασυνήθιστο στον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Ryland GL, Bearfoot JL, Doyle MA, Boyle SE, Choong DYH, Rowley SM, et al. (2012) Γονίδια microRNA και Target 3′-αμετάφραστες περιοχές τους είναι Σπανίως σωματικώς μεταλλαγμένα σε καρκίνους των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (4): e35805. doi: 10.1371 /journal.pone.0035805

Επιμέλεια: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 22 Μαρ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Ryland et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη βικτοριανή Breast Cancer Research Consortium, την Αυστραλία, και το Αυστραλιανό Εθνικό Σύστημα Υγείας και του Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας (NHMRC). Πράσινη γραμμή υποστηρίζεται από μια αυστραλιανή Βραβείο Μεταπτυχιακών Σπουδών. Η αυστραλιανή Καρκίνος των ωοθηκών Ομάδα Μελέτης υποστηρίχθηκε από τις ΗΠΑ Army Medical Research και Εντολή υλικού υπό DAMD17-01-1-0729, τα καρκινικά Συμβούλιο Τασμανία, το Ίδρυμα Καρκίνου της Δυτικής Αυστραλίας και της NHMRC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs), μια κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA, έχουν σημαντικούς ρυθμιστικούς ρόλους σε διάφορες κυτταρικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης, γήρανση και μεταβολισμός [1]. Αυτή η ρύθμιση επιτυγχάνεται μέσω ημι-συμπληρωματικών βάσεων φλούδι με την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του αγγελιαφόρου RNA στόχου (mRNA) [1] – [3], καθώς και το 5′-αμετάφραστη περιοχή ή κωδικοποίησης περιοχές του mRNA, τα οποία είναι μεταγενέστερα υποβαθμισμένων ή μετα-μεταγραφικά σιγήσει [4] – [6]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν τώρα ότι η έκφραση των miRNAs είναι παρεκκλίνουσα στον καρκίνο [7], που οδηγεί στην υπόθεση ότι οι μεταβολές στις οδούς miRNA μπορεί να είναι ένα σημαντικό βήμα για την έναρξη και την εξέλιξη σε κακοήθεια. Συνεπής με αυτή την υπόθεση είναι η παρατήρηση ότι τα γονίδια miRNA συχνά εντοπίζονται σε περιοχές του γονιδιώματος συνήθως μεταβάλλεται σε καρκίνο, συμπεριλαμβανομένης της ελάχιστης περιοχές της διαγραφής, η απώλεια της ετεροζυγωτίας και ενίσχυσης καθώς και εύθραυστη χώρων [8] – [10]. Μετάλλαξη είναι ένας εναλλακτικός μηχανισμός για miRNA απορρύθμιση στη ρύθμιση του καρκίνου, σύμφωνα με την οποία η μετάλλαξη μπορεί να μεταβάλει τη μεταγραφή miRNA, επεξεργασία ή αλληλεπιδράσεις miRNA-mRNA. Ο μηχανισμός αυτός περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Καλίν

et al.

[8], ο οποίος εντόπισε μια παραλλαγή βλαστικής σειράς στο

HSA-miR-16-1

που συνδέονται με ευαισθησία σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία. Από τότε, έχουν πολυμορφισμούς βλαστικής σειράς σε γονίδια miRNA έχουν συσχετιστεί με προδιάθεση σε άλλους τύπους καρκίνου [11]. Παρά την υπόθεση ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως συμβατικά ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η σωματική μετάλλαξη εντός miRNAs είναι ένα σπάνιο φαινόμενο και εκείνες που έχουν αναφερθεί δείχνουν μικρή επίδραση στην δραστικότητα miRNA [10], [12] – [14] . Ωστόσο, η πλειοψηφία αυτών των μελετών έχουν ευνοήσει μια προσέγγιση υποψήφιων γονιδίων και μέχρι σήμερα, un-προκατειλημμένη εκτίμηση της εμφάνισης των σωματικών αλλαγών στα γονίδια miRNA σε οποιοδήποτε τύπο καρκίνου είναι ανύπαρκτη.

Ανάλογα με μεταλλάξεις που συμβαίνουν στο εσωτερικό miRNA σπόρων περιοχές, οι μεταλλάξεις που συμβαίνουν εντός της αλληλουχίας mRNA στόχου μπορεί να αλλοιώσει πρόσδεση και επακόλουθη miRNA-εξαρτώμενη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ενώ βλαστικής γραμμής μεταβολές στο miRNA θέσεις σύνδεσης σε 3′-UTRs μπορεί να συνεισφέρει στην ευαισθησία του καρκίνου [11], [15] – [17], οι εκθέσεις των σωματικών μεταλλάξεων που συμβαίνουν σε ένα παρόμοιο πλαίσιο περιορίζεται σε μία ενιαία έκθεση περίπτωση [13] και έχει ακόμη είναι να διερευνηθεί σε μεγάλες ομάδες του όγκου. Εάν οι σωματικές μεταλλάξεις συμβαίνουν σε θέσεις δέσμευσης miRNA, θα αποτελούσε προηγουμένως ανεξερεύνητη γενετικό μηχανισμό για την καταστολή ή την ενεργοποίηση ενός mRNA που σχετίζεται με καρκίνο.

δραστικότητα παρεκκλίνουσα miRNA συχνά συνδέεται με την παθογένεση και την πρόοδο του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών , η πιο κοινή μορφή της ωοθηκικής κακοήθειας. Mirna μελέτες προφίλ τηρούν με συνέπεια την παγκόσμια αποσιώπηση της έκφρασης των miRNAs σε όγκους των ωοθηκών, η οποία συνέβαλε στην εν μέρει από γονιδιωματική απώλεια και επιγενετικές μεταβολές [10], [18] – [22]. Παρομοίως, η έκφραση πολλών γνωστών και υποθετικών γονιδίων καρκίνου δυσρυθμισμένη στον καρκίνο των ωοθηκών, για παράδειγμα

BRCA2

, για την οποία μόνο ένα ποσοστό της παρατηρούμενης απώλεια έκφρασης μπορεί να αποδοθεί σε μετάλλαξη, και μεθυλίωση προαγωγός δεν παρατηρήθηκαν [ ,,,0],23]. Προηγουμένως, έχουμε καταδείξει ότι η συχνότητα των σωματικών μεταλλάξεων σε 10 καρκίνο εμπλέκονται miRNAs είναι χαμηλή σε όγκους των ωοθηκών [24]. Στην παρούσα μελέτη, επεκτείνουμε την ανάλυση αυτή με συνολικά χαρακτηρίζουν σωματικές μεταλλάξεις σε 712 γονίδια miRNA χρησιμοποιούν μαζικά παράλληλη στοχευμένη εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας. Επιπλέον, διαλογή των 3′-UTRs 18 υποψήφια γονίδια του καρκίνου με σκοπό τον προσδιορισμό σωματικών μεταλλάξεων που μεταβάλλουν προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης miRNA. Παρά το γεγονός ότι αυτά τα γονίδια είναι συχνά εμπλέκονται στην ογκογόνο διαδικασία, που κωδικοποιεί μεταλλάξεις, μεθυλίωση ή αριθμό αντιγράφων μεταβολές αποτελούν μόνο ένα υποσύνολο των διαφορών έκφρασης παρατηρείται σε όγκους των ωοθηκών.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Σωματικές μεταλλάξεις στόχευση γονιδίων microRNA είναι σπάνια γεγονότα σε όγκους των ωοθηκών

για να διερευνηθεί κατά πόσο μεταλλάξεις στα γονίδια miRNA συμβάλλουν στην μεταβληθεί δραστηριότητα miRNA στον καρκίνο των ωοθηκών, 86 πρωτογενείς όγκους του επιθηλίου των ωοθηκών αξιολογήθηκαν για σωματικές μεταλλάξεις σε περιοχές του γονιδιώματος που αντιστοιχεί στο πρόδρομο ή ώριμο miRNA αλληλουχίες. Τα κλινικά χαρακτηριστικά αυτών των περιπτώσεων συνοψίζονται στον Πίνακα S1. Στοχευμένες αλληλουχίας επόμενη γενιά χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση 712 miRNA γονιδίων σχολιασμένη στη βάση δεδομένων Sanger miRNA (έκδοση 13.0, Μάρτιος 2009). Μετά την ευθυγράμμιση των δεδομένων, το 95% των στοχευμένων βάσεων εντός των 712 γονίδια miRNA είχε μια ελάχιστη κάλυψη 10 φορές αλληλουχία, με αντίστοιχη μέση κάλυψη του 92-φορές. Φιλτράρισμα για την απομάκρυνση βλαστική παραλλαγών που ανιχνεύθηκαν σε συμφωνημένα φυσιολογικό DNA των λεμφοκυττάρων και επικύρωση από τα συμβατικά αλληλουχίας προσδιορίζονται σωματικές μεταλλάξεις στο 5 γονίδια miRNA:

HSA-miR-10a

,

HSA-miR-622

, em

HSA-miR-767-5p

,

HSA-miR-888

και

HSA-miR-1280

(Σχήμα 1). Συνολικά, σωματικές μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 6% (5/86) των όγκων και σε λιγότερο από 1% (5/712) των γονιδίων miRNA αναλύθηκαν, χωρίς γονίδια miRNA περιοδικά στοχεύονται από μετάλλαξη. Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, μεταλλάξεις εντός ώριμη miRNAs ήταν ασυνήθιστο? μόνο μία μετάλλαξη βρισκόταν εντός της ώριμης περιοχής του

HSA-miR-767-5p

(αλλά εξωτερικά της περιοχής σπόρου), ενώ τα υπόλοιπα τέσσερα συνέβη εντός του προδρόμου φουρκέτα. Αυτά τα δεδομένα είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μικρότερης κλίμακας που υποδηλώνει ότι σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια miRNA είναι ένα σπάνιο συμβάν σε δείγματα όγκων [8], [12], [14], [24], [25].

τα καρκινικά συγκεκριμένες μεταλλάξεις χαρακτηρίζονται ως μαύρες γραμμές σε σχέση με το ώριμο microRNA (λευκό κουτί) και πρόδρομο microRNA (γκρι πλαίσιο) ακολουθίες. Οι θέσεις των μεταλλάξεων που αναφέρθηκαν σε σχέση με τις ακόλουθες μεταγραφές microRNA πρόδρομος:

HSA-miR-10a

NR_029608.1?

HSA-miR-622

NR_030754.1?

HSA-miR-767-5p

NR_030409.1?

HSA-miR-888

NR_030592.1?

HSA-miR-1280

NR_031703.1.

Η

Mirna βιογένεση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία που ξεκίνησε από την RNA πολυμεράση ΙΙ με τη μεσολάβηση της μεταγραφής, που ακολουθείται από RNAse III-εξαρτώμενη κόψιμο σε μια φουρκέτα ενδιάμεσο και επακόλουθη διάσπαση σε ένα λειτουργικό ώριμο miRNA [1], [26]. Αυτή η διαδικασία εξαρτάται από μοτίβα αλληλουχίας και RNA στοιχεία δευτεροταγούς δομής εντός των πρωτογενών και των πρόδρομων μορίων miRNA [26]. Ως εκ τούτου, οι μεταλλάξεις που προκύπτουν σε πρόδρομο περιοχές μπορεί να μεταβάλει RNA δευτερεύουσα δομή και έτσι να μπλοκάρουν τη μεταποίηση σε ώριμο miRNA. Για να προσδιοριστεί εάν το RNA δομικές αλλαγές μπορούν να προκύψουν από τις σωματικές μεταλλάξεις miRNA εντοπίζονται, χρησιμοποιήσαμε το πρόγραμμα RNAfold [27] για να προβλέψει την πιο σταθερή δευτερογενή δομή τόσο για το άγριου τύπου και μεταλλαγμένες αλληλουχίες. Διαμορφωτικές αλλαγές είχαν προβλεφθεί για το μεταλλαγμένο

HSA-miR-622

,

HSA-miR-767-5p

και

HSA-miR-1280

(Σχήμα S1). Ωστόσο, διαμορφωτικές αλλαγές προέβλεψε

in silico

σπάνια ισοδυναμεί με φυσιολογική επίδραση [12] και τη λειτουργική επίπτωση των μεταλλάξεων που προσδιορίζονται εδώ απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση με

in vitro

δοκιμασίες.

σε αντίθεση με τη συχνή παρατήρηση του όγκου-ειδικά παραλλαγές που συμβάλλουν στην ενεργοποίηση ή καταστολή του κωδικοποίησης γονιδίων στον καρκίνο πρωτεΐνη, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια miRNA είναι ένα σπάνιο συμβάν κατά τη διάρκεια των ωοθηκών παθογένεση και προσθέστε σε συσσώρευση στοιχεία από μια σειρά όγκου τύποι που υποδηλώνει ότι miRNAs σπάνια απορυθμίζεται από το μηχανισμό αυτό. Λόγω του μεγάλου αριθμού των στόχων mRNA που προβλέπεται για ένα μόνο miRNA και τους διαφορετικούς ρόλους αυτών των προβλεπόμενων γονιδίων στόχων, οποιαδήποτε σωματική μετάλλαξη σε ένα γονίδιο που miRNA (και ιδιαίτερα εκείνα που εμφανίζονται μέσα στην αλληλουχία σπόρου) είναι πιθανό να επηρεάσουν πολλές βιολογικές οδούς [2], [3], μερικές από τις οποίες μπορεί να εμπλέκεται στη διατήρηση της ομοιόστασης του κυττάρου. Κατά συνέπεια, ακόμη και αν μια έκφραση μεταβάλλεται mRNA του γονιδίου miRNA σωματικώς μεταλλαγμένα να επηρεάσει θετικά την επιβίωση των όγκων, είναι πιθανό ότι θα υπάρξει ένας μεγαλύτερος αριθμός αλλαγών έκφρασης γονιδίου το οποίο δεν θα ήταν ευνοϊκό για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου. Αντιστρόφως, σε ορισμένες περιπτώσεις, το mRNA μεταγραφική καταστολή μπορεί να προκύψει από τη δράση των πολλαπλών miRNAs [28] και ως εκ τούτου, η αλλαγμένη δραστηριότητα ενός ενιαίου miRNA μπορεί να είναι ανεπαρκής για να οδηγήσει σε ένα βιολογικό αποτέλεσμα. Τέλος, γίνεται ολοένα και πιο αναγνωρισμένο ότι miRNA αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν σε ιστούς του καρκίνου μπορεί να συμβεί δευτεροβάθμιας ελαττωμάτων σε συστατικά των μηχανημάτων επεξεργασίας miRNA, συμπεριλαμβανομένων των μεταγραφικών παραγόντων και των γονιδίων της χρωματίνης αναδιαμόρφωση ρυθμίζουν miRNA μεταγραφής, καθώς και τα στοιχεία των miRNA μετα-μεταγραφική ρύθμιση [29 ], [30]. Σε όγκους των ωοθηκών,

DICER1

και

EIF2C2

έχουν (Argonaute2) αντίγραφο DNA κέρδη αριθμό παρατηρήθηκαν σε 24,5% και 51,5% των όγκων αντίστοιχα [9] και η διάμεση συνολική επιβίωση μειώνεται στις γυναίκες των οποίων οι όγκοι έχουν χαμηλότερα

DICER1

και

DROSHA

έκφραση του mRNA [31]. Περαιτέρω έρευνα χρειάζεται αποδείξει τη σημασία των αλλαγών σε αυτά και άλλα συστατικά της οδού βιογένεσης miRNA στην παθογένεση του καρκίνου των ωοθηκών.

Σωματικές μεταλλάξεις στόχευση 3′-αμετάφραστες περιοχές είναι σπάνια γεγονότα σε όγκους των ωοθηκών

για να διερευνηθεί η πιθανότητα ότι σωματικές μεταλλάξεις που συμβαίνουν εντός των 3′-UTRs γονιδίων του καρκίνου μεταβάλλουν μια υπάρχουσα θέση σύνδεσης miRNA, και έτσι να σημαίνει ένα νέο μηχανισμό για μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση mRNA σε καρκίνο, εμείς αλληλουχία των 3′-UTRs 11 ογκογονιδίων (

ΑΚΤ2

,

BRAF

,

CCNE1

,

CTNNB1

,

EGFR

,

ΕΚΒΒ2

,

FGF1

,

KRAS

,

MYC

,

PIK3CA

και

RAB25

) από στοχευμένες εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας στους όγκους 86 ωοθηκών. Στην περίπτωση ενός ογκογονιδίου, κατάργηση ενός τόπου πρόσδεσης miRNA μπορεί να επιτρέπει ανεξέλεγκτη έκφραση ογκογονιδίου. Επιπλέον, οι 3′-UTRs των γονιδίων καταστολής 7 όγκων (ΕΠΠΕ) (

BRCA1

,

BRCA2

,

CDKN2A

,

PTEN

,

RB1 ​​

,

SPARC

και

TP53

) έχουν επίσης την ακολουθία για να εκτιμηθεί ο επιπολασμός των σωματικών μεταλλάξεων που θα δημιουργήσει ένα

de novo

miRNA και το αποτέλεσμα στην ΕΠΠΕ ρύθμιση προς τα κάτω. Αυτά τα γονίδια αναγνωρίζονται από το Cancer Gene Απογραφή να εμπλέκεται αιτιολογικά στην ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών είτε με σωματική μετάλλαξη, ενίσχυση γονιδίου ή διαγραφή [32].

FGF1

,

RAB25

και

SPARC

επιλέχθηκαν με βάση αποδειχθεί λειτουργικό τους ρόλο στον καρκίνο των ωοθηκών [33] – [37]. 3′-UTRs η αλληλουχία έως 108 φορές σημαίνει κάλυψη και μεγαλύτερη από το 99% των στοχοθετημένων βάσεων μέσα σε αυτές τις περιοχές καλύφθηκαν από 10 ή περισσότερα ακολουθία διαβάζει. Ογκοειδικό μεταλλάξεις σπάνια προσδιορίζονται στις 3′-UTRs δειγμάτων ωοθηκών: 4/86 δείγματα όγκου το καθένα ταυτίζεται με μια μετάλλαξη σε ένα από τα τέσσερα διαφορετικά ογκογονίδια (

ΑΚΤ2

,

CTNNB1

,

EGFR

και

ΕΚΒΒ2

) (Πίνακας 1), χωρίς μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στις 7 ΕΠΠΕ διερευνηθεί.

Στο silico

miRNA αλγορίθμων πρόβλεψης στόχου δείχνουν ότι μεταλλαγμένες θέσεις στο

ΑΚΤ2

,

CTNNB1

και

ΕΚΒΒ2

μπορεί να συμβεί εντός της περιοχής της προβλεπόμενης miRNA δεσμευτική χώρο, με δύο μεταλλάξεις, το γ * 538T & gt?. Α (

CTNNB1

) και γ * 460 g & gt?. C (

ΕΚΒΒ2

) υποκαταστάσεις, προβλέπεται να συμβεί εντός της σειράς σπόρων του

HSA-miR-630

και

HSA-miR-640

δεσμευτική αντίστοιχα. προφίλ έκφρασης RNA ήταν διαθέσιμο για δείγματα με μεταλλάξεις στο

ΑΚΤ2

και

EGFR

και απέδειξαν ότι τα επίπεδα μεταγραφής των γονιδίων αυτών δεν μεταβλήθηκε σε δείγματα με σωματικά 3′-UTR μεταλλάξεις σε σχέση με άλλα καρκινικά δείγματα του ίδιου ωοθηκών υποτύπου (Εικόνα S2).

η

Παρά το γεγονός ότι αναγνωρίζεται ότι miRNAs μπορούν επίσης να προσδώσουν μεταγραφική καταστολή μέσω της δράσης για την 5′-UTR ενός στόχου mRNA, η μελέτη αυτή παρέχει προκαταρκτικές ενδείξεις ότι σωματικές μεταλλάξεις μεταβάλλοντας θέσεις σύνδεσης miRNA εντός της 3′-UTR των κοινών γονιδίων καρκίνου είναι σπάνια σε επιθηλιακούς όγκους των ωοθηκών. Αποτελεσματικές αποσιώπηση μεταγραφική μπορεί να απαιτήσει συνεργιστική δράση των miRNAs σε πολλαπλές θέσεις σε ένα UTR, είτε από μια ενιαία οικογένεια των microRNAs ή με συνδυασμό των μη συνδεδεμένων microRNAs, και έτσι οι ενιαίο σωματικές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν εδώ είναι πιθανόν ανεπαρκή για να φιμώσουν το αντίστοιχο μεταγραφή [28] , [38]. Η σωματική επικράτηση μετάλλαξη στο 3′-UTR περιοχές των γονιδίων υποψήφιων καρκίνο αλληλουχία ήταν 1,43 μεταλλάξεις ανά Mb. Συγκριτικά, ο επιπολασμός μετάλλαξη στην πρωτεΐνη κωδικές περιοχές των γνωστών γονιδίων του καρκίνου στην ομάδα αυτή του όγκου είναι 570,57, 183,60 και 32,63 μεταλλάξεις ανά MB για

TP53

,

KRAS

και

PIK3CA

αντίστοιχα, ενώ ο εκτιμώμενος επιπολασμός μετάλλαξη στην κωδικοποίηση exome είναι 2,4 μεταλλάξεις ανά MB σε όγκους των ωοθηκών [23]. Έτσι, είναι πιθανό ότι το χαμηλό ποσοστό μετάλλαξης σε 3’UTRs σύγκριση με εξώνια υποδεικνύει ότι η πλειονότητα των μεταλλάξεων στο 3′-ρυθμιστικές περιοχές που προσδιορίζονται εδώ εμφανίζονται ως γεγονότα παριστάμενος στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Εν περιλήψει, σωματικές μεταλλάξεις σε γονίδια miRNA ήταν σπάνια παρατηρήθηκε σε όγκους των ωοθηκών και επομένως είναι απίθανο να ευθύνονται για αλλαγμένη δραστικότητα miRNA παρατηρείται σε αυτόν τον τύπο όγκου. Επιπλέον, παρέχουμε προκαταρκτική απόδειξη ότι η επιλογή για σωματικές μεταλλάξεις εντός των 3′-UTRs των γονιδίων του καρκίνου υποψηφίου, που θα υποτεθεί να παρεμβαίνει με ρύθμιση γονιδίου που εξαρτάται από miRNA, είναι απίθανο να αντιπροσωπεύει έναν κοινό μηχανισμό για την έκφραση αλλαγμένης mRNA σε όγκους των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

σε δεδουλευμένη βάση και τη χρήση του υλικού ασθενών για τη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από τις ακόλουθες επιτροπές Ερευνών Δεοντολογίας του Ανθρώπου: Σαουθάμπτον Νοσοκομείο Ανθρωπίνων Έρευνας Επιτροπή Δεοντολογίας, Peter MacCallum Κέντρο Καρκίνου Επιτροπή Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής, Queensland Institute of Medical Research Επιτροπής Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου της Μελβούρνης Επιτροπής Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής, Westmead Νοσοκομείο Ανθρωπίνων Έρευνας Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας. Όλα τα άτομα που έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των ιστών τους στην έρευνα. Το σχέδιο αυτό εγκρίθηκε από το Cancer Centre Επιτροπή Peter MacCallum Ανθρωπίνων Έρευνας Ηθικής (Έγκριση # 9.29).

ωοθηκών ομάδα όγκου

86 πρωτογενή επιθηλιακά δείγματα ιστού ωοθήκης όγκου ελήφθησαν μέσω του Peter MacCallum Cancer Centre Tissue Bank, Αυστραλία ωοθηκών μελέτη για τον καρκίνο ή από ασθενείς που παρουσιάζουν σε νοσοκομεία στο νότο της Αγγλίας [39]. Όλα τα δείγματα του DNA του όγκου μικροτομή να εξασφαλιστεί μεγαλύτερη από 80% συστατικό επιθηλιακών κυττάρων. Αυτή η ομάδα των όγκων περιελάμβανε ένα μίγμα (n = 6) υποτύπους ορώδης (n = 45), ενδομητριοειδές (n = 28), βλεννώδες (n = 7) και σαφής κυττάρων. Αντιστοίχιση δείγματα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν επίσης από όλους τους ασθενείς κατά τη στιγμή της συλλογής του όγκου και να χρησιμοποιηθεί ως πηγή βλαστικής σειράς DNA.

ταυτοποίησης περιοχή υποψήφια για στοχευμένη επόμενης γενιάς αλληλούχιση

3′-UTRs 18 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη επιλέχθηκαν για σωματική διαλογή μετάλλαξη. Γονιδίωμα συντονίζει για επιλεγμένες 3′-UTRs προσδιορίστηκαν με βάση εκείνα που σημειώνονται στη βάση δεδομένων Ensembl (απελευθέρωση 54) για τις ακόλουθες μεταγραφές:

ΑΚΤ2

(ENST00000392038),

BRAF

(ENST00000288602) ,

CCNE1

(ENST00000262643),

CTNNB1

(ENST00000349496),

EGFR

(ENST00000275493 και ENST00000344576),

ΕΚΒΒ2

(ENST00000269571),

FGF1

(ENST00000359370),

KRAS

(ENST00000256078),

MYC

(ENST00000259523 και ENST00000377970),

PIK3CA

(ENST00000263967),

RAB25

(ENST00000361084),

BRCA1

(ENST00000309486),

BRCA2

(ENST00000380152),

CDKN2A

(ENST00000304494),

PTEN

(ENST00000371953),

RB1 ​​

(ENST00000267163),

SPARC

(ENST00000231061) και

TP53

(ENST00000269305). Οι γονιδιωματικές συντεταγμένες για ανθρώπινη πρόδρομη miRNAs ελήφθησαν από την Sanger Institute miRBase (απελευθερώσει 13.0, Μάρτιος 2009) [40], [41], συμπεριλαμβανομένων 548 μεμονωμένα γονίδια miRNA καθώς και 164 miRNAs εντός 62 συμπλέγματα miRNA. Όλες οι κωδικοποίησης εξώνια του

TP53

,

KRAS

και

PIK3CA

συμπεριλήφθηκαν για ανάλυση της αλληλουχίας.

Βιβλιοθήκη προετοιμασία και στόχο τον εμπλουτισμό

200 ng του όγκου ή συμφωνημένα κανονικό DNA των λεμφοκυττάρων ήταν τυχαία αποσπασματικές σε περίπου 200 bp (Covaris, Woburn, ΜΑ) και τέλος επισκευή και Α-ουράς διεξάγεται σύμφωνα με την Illumina γονιδιωματική βιβλιοθήκη DNA πρωτόκολλο παρασκευής (Illumina, San Diego, CA). Μετά από αυτό, το DNA συνδέθηκε με ένα από τα 7 έθιμο πολυπλεξίας προσαρμογείς συμβατή με Illumina ενιαίο τέλος αλληλουχίας. Αναπροσαρμόζονται τα δείγματα DNA που συγκεντρώθηκαν εξίσου πριν τον εμπλουτισμό PCR. Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή της βιβλιοθήκης λήφθηκαν από New England Biolabs (ΝΕΒ, Ίπσουιτς, ΜΑ). Μια σύλληψη boutique εξόνιο (SureSelect, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) χρησιμοποιήθηκε για τον εμπλουτισμό ειδικά για επιλεγμένες 3′-UTRs, miRNAs και κωδικοποιητικά εξώνια των γονιδίων του καρκίνου από βιβλιοθήκες γενωμικού ΟΝΑ πριν την αλληλούχιση επόμενης γενιάς. ανιχνευτές σύλληψης σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες παραμέτρους, με την υποβολή γονιδιωματικής συντεταγμένες για να eArray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). υβριδοποίηση Solution, πλύση, έκλουση και ενίσχυση εκτελέστηκαν σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο.

Σωματικά ανάλυση μετάλλαξης με προσδιορισμό της αλληλουχίας και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση Illumina GAIIx

Target εμπλουτισμένα βιβλιοθήκες DNA υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας σε ένα Illumina GAIIx, δημιουργώντας 75 bp ενιαίο τέλος ακολουθία διαβάζει. ανάλυση εικόνας και της βάσης κλήση έγινε με το v1.6 Γονιδιώματος αναλυτή Pipeline. Ακολουθία διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς (συναρμολόγηση /hg19 GRCh37) χρησιμοποιώντας BWA και τα υπόλοιπα unmapped διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με Novoalign λογισμικού [42]. Αυτό ακολουθήθηκε από την τοπική επανευθυγράμμιση με GATK [43]. σημειακές μεταλλάξεις και προσθήκες /διαγραφές (indels) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GATK και Dindel [44], αντίστοιχα, και σχολιασμένο με πληροφορίες από Ensembl απελευθέρωση 56. Μόνο οι μεταλλάξεις στο miRNA μεταγραφές σχολιασμένο miRBase θεωρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

σημειακές μεταλλάξεις και indels ταυτοποιήθηκαν ως σωματικές αλλαγές μόνο όταν (

i

) η παραλλαγή δεν κλήθηκε στην συμφωνημένα κανονικό δείγμα ή αναγνωρίζονται ως βλαστική αλλαγή σε άλλο όγκου /φυσιολογικό ζευγάρι (

ii

) η παραλλαγή δεν παρατηρήθηκε σε & gt? 2% του διαβάζει στο συμφωνημένα κανονικό δείγμα ακόλουθες οδηγίες ελέγχου της ακολουθίας διαβάζει τη χρήση του Ολοκληρωμένου Γονιδιωματική Viewer [45] (

iii

) η παραλλαγή εντοπίστηκε σε τουλάχιστον τέσσερις μοναδική ακολουθία διαβάζει με τουλάχιστον δύο χαρτογράφηση στον εμπρός και δύο χαρτογράφηση στον αντίστροφο προσανατολισμό.

Όλοι οι μεταλλάξεις οι οποίες πληρούνται τα παραπάνω κριτήρια υποβλήθηκαν σε επικύρωση από τα συμβατικά ενίσχυση PCR και αμφίδρομη τριχοειδή ηλεκτροφόρηση στο ABI3130 Γενετική αναλυτή χρησιμοποιώντας BigDye Terminator v3 0.1 χημεία αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Αναγνώριση των θέσεων miRNA-δεσμευτική

Η TargetScan (αφήστε 5.2) [46], Στόχοι μικρόκοσμο (έκδοση 5) [40 ], DIANA-μΤ (έκδοση 3.0) [47], [48] και η Μιράντα (δελτίο Αύγουστος 2010) [49] πρόβλεψης αλγόριθμοι χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν οι σωματικές μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε mRNA 3’UTRs συνέβησαν εντός θέσεις πρόσδεσης miRNA. Ένα mirSVR κατώφλι βαθμολογία μικρότερη από -0,1 και ελάχιστο όριο αναδίπλωσης ενέργεια βαθμολογία μικρότερη από ή ίση με -16 kcal /mol χρησιμοποιήθηκαν για τον αλγόριθμο Miranda. Default παράμετροι που χρησιμοποιούνται για όλους τους άλλους αλγόριθμους.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

προβλεπόμενη δευτερεύουσα δομή αλλαγές ως αποτέλεσμα των σωματικών μεταλλάξεων σε miRNA μεταγραφές. Οι ώριμες αλληλουχίες σκιάζονται και το μεταλλαγμένο βάση που υποδεικνύεται από το βέλος στο (α)

HSA-miR-622

, (β)

HSA-miR-1280

και (γ)

HSA -miR-767-5p

. Η αλληλουχία πρόδρομος miRNA συν 50 bp που πλευρίζουν τον πρόδρομο στα 5 ‘και 3’ άκρα χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής με τη χαμηλότερη ελεύθερη ενέργεια από το πρόγραμμα RNAfold [29] χρησιμοποιώντας προεπιλεγμένες παραμέτρους

doi:. 10.1371 /περιοδικό. pone.0035805.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

ΑΚΤ2

και

EGFR

έκφραση mRNA δεν μεταβάλλεται με την παρουσία του 3′-αμετάφραστη περιοχή σωματικές μεταλλάξεις σε σχέση με άλλες ωοθηκών δείγματα του ίδιου υποτύπου. (Α)

ΑΚΤ2

έκφρασης σε ενδομητριοειδές όγκους, συμπεριλαμβανομένων P1768 δείγματος με ένα

ΑΚΤ2

γ * 892C & gt?. Τ σωματική μετάλλαξη (υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα). έκφραση του mRNA προφίλ δεδομένα λήφθηκαν από Tothill

et al.

[50].

ΑΚΤ2

καθετήρα έκφρασης θέτει 225471_s_at και 226156_at φαίνονται. (Β)

EGFR

έκφρασης σε ενδομητριοειδές όγκους, συμπεριλαμβανομένων του δείγματος IC151 με ένα

EGFR

γ * 101C & gt?. G σωματική μετάλλαξη (υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα). έκφραση του mRNA προφίλ δεδομένα λήφθηκαν από Ραμακρίσνα

et al.

[51]. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι αντιπροσωπευτικά του μέσου όρου ± SD

doi:. 10.1371 /journal.pone.0035805.s002

(PDF)

Πίνακα S1.

Κλινικά χαρακτηριστικά των όγκων των ωοθηκών αλληλουχία για σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια microRNA και υποψήφιες 3′-αμετάφραστες περιοχές.

doi: 10.1371 /journal.pone.0035805.s003

(XLS)

Ευχαριστίες

Με ιδιαίτερη χαρά ανακοινώνουμε τη συνεργασία των θεσμικών οργάνων στην Αυστραλία που συμμετέχουν στην αυστραλιανή ωοθηκών Μελέτης του Καρκίνου (AOCS). Πρέπει επίσης να αναγνωρίσουμε τη συμβολή των νοσηλευτών μελέτης AOCS, βοηθοί έρευνας και όλων των κλινικών και επιστημονικών συνεργατών και θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους από τις γυναίκες που συμμετείχαν στην AOCS. Τα μέλη της Ομάδας Μελέτης του Καρκίνου της Αυστραλίας ωοθηκών, συνεργάτες και τα νοσοκομεία που συμμετέχουν στην AOCS μπορεί να βρεθεί σε https://www.aocstudy.org

Αυστραλός καρκίνου των ωοθηκών Ομάδα Μελέτης:. David Bowtell (Peter MacCallum Cancer Centre, Ανατολή Μελβούρνη, Βικτώρια, Αυστραλία), Γεωργία Chenevix-Trench (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Adele Πράσινο (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Penny Webb (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Άννα deFazio (Westmead Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου, Westmead Ινστιτούτο της Χιλιετίας, Westmead, Νέα Νότια Ουαλία, Αυστραλία), Ντορότα Gertig (Victorian τραχήλου της Κυτταρολογίας Μητρώο, Carlton South, Βικτώρια, Αυστραλία).