Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

Αύξηση αποδεικτικά στοιχεία έχουν δείξει ότι το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) θα μπορούσαν να προέρχονται από μια ξεχωριστή υποπληθυσμός ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), τα οποία είναι υπεύθυνα για την περιορισμένη αποτελεσματικότητα των συμβατικών θεραπειών. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι κοκκιοκίνης-επιθελίνης πρόδρομο (GEP), ένας αυξητικός παράγοντας πολυδύναμων, υπερεκφράζεται σε HCC, αλλά όχι στο παρακείμενο μη-όγκου, και ότι GEP είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για HCC. Εδώ, θα χαρακτηρίζεται πρότυπο έκφρασης της και ιδιότητες βλαστοκυττάρων στο εμβρυϊκό και καρκινικά το συκώτι.

Μέθοδοι

Πρωτεΐνη έκφραση της GEP σε εμβρυϊκό και ενήλικο συκώτια, εξετάστηκε σε μοντέλα ανθρώπου και ποντικού με ανοσοϊστοχημική χρώση και κυτταρομετρία ροής. καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ήπατος, που απομονώνονται με βάση την GEP τους ή /και εξαρτώμενη από ΑΤΡ κασέτας σύνδεσης (ABC) έκφραση μεταφορέα φάρμακο ABCB5, αξιολογήθηκαν για ηπατική ιδιότητες CSC σε όρους σχηματισμού αποικίας, χημειοαντίσταση και ογκογονικότητα.

Αποτελέσματα

έδειξε ότι ήταν ένα GEP ηπατική ογκοεμβρυϊκά πρωτεΐνη που εκφράζεται στα εμβρυϊκά ήπατα, αλλά όχι στα φυσιολογικά ενήλικα ήπατα. Σημαντικά, GEP + κύτταρα εμβρυϊκού ήπατος συν-εκφράζονται τα μόρια σηματοδότησης εμβρυϊκών βλαστικών (ES) κυττάρων που σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων β-κατενίνης, Oct4, Nanog, Sox2 και DLK1, και επίσης ηπατική CSC-δείκτες CD133, EpCAM και ABCB5. Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός σε HCC κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές αποκάλυψαν ότι GEP + καρκινικά κύτταρα συν-εκφράζεται αυτούς τους δείκτες αρχέγονων κυττάρων παρομοίως ως κύτταρα εμβρυϊκού ήπατος GEP +. Επιπλέον, GEP δείχθηκε να ρυθμίζει την έκφραση του κυττάρου που σχετίζονται με σηματοδότηση μορίων ES β-κατενίνης, Oct4, Nanog, και Sox2. Απομονωμένες GEP

υψηλής καρκινικά κύτταρα έδειξαν αυξημένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών και χημειοαντίσταση σε σύγκριση με τις GEP

χαμηλή ομολόγους. Συν-έκφραση της GEP και ABCB5 καλύτερη καθόρισε τους πληθυσμούς CSC με ενισχυμένη ογκογόνο ικανότητα σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι GEP είναι ένα ηπατική ογκοεμβρυϊκών πρωτεΐνη που ρυθμίζει τα μόρια των κυττάρων που σχετίζονται με σηματοδότηση ES . Συν-έκφραση της GEP και ABCB5 εμπλουτίζει περαιτέρω ένα υποπληθυσμό με βελτιωμένες ιδιότητες CSC. Τα τρέχοντα δεδομένα παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με την θεραπευτική στρατηγική

Παράθεση:. Cheung PFY, Cheng CKC, Wong NCL, Ho JCY, Yip CW, Lui VCH, et al. (2011) Granulin-επιθελίνη προδρόμου είναι ένα ογκοεμβρυϊκά Πρωτεΐνη Καθορισμός του καρκίνου Ηπατική βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (12): e28246. doi: 10.1371 /journal.pone.0028246

Επιμέλεια: Νέοι Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, Δημοκρατίας της Κορέας

Ελήφθη: 2 Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 4 Νοέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 16 Δεκεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Cheung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από τη Sun CY Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών για χοληφόρων και του παγκρέατος Χειρουργική, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας και το Συμβούλιο Κονδυλίων Έρευνας του Χονγκ Κονγκ (N_HKU 709/07, HKU7 /CRG /09), το Πρόγραμμα Σπόρων Χρηματοδότηση και Μικρών Έργων Χρηματοδότηση Προγράμματος του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, είναι μια εξαιρετικά κακοήθης νόσος χωρίς αποτελεσματική θεραπεία σήμερα [1]. Ενώ οι μοριακοί μηχανισμοί της HCC παθογένεση παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, HCC θεωρείται μια ετερογενής νόσος που οφείλεται σε πολλαπλούς μοριακών προφίλ του και ποικίλη κλινική έκβαση [2]. Η ετερογένεια των HCC και η έλλειψη των κατάλληλων βιοδεικτών εμπόδισαν την πρόγνωση και τη θεραπεία των ασθενών.

Για χρόνια, καρκινικών κυττάρων ετερογένεια έχει εξηγηθεί από την κλωνική μοντέλο εξέλιξη [3]. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι όγκοι είναι ιεραρχικά οργανωμένη με ένα ξεχωριστό υποπληθυσμό που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) που βρίσκεται στην κορυφή της ιεραρχίας. Αυτά τα κύτταρα δεν είναι μόνο υπεύθυνος για την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου, αλλά επίσης προικισμένο με ιδιότητες βλαστοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, ικανότητα διαφοροποίησης και χημειοαντίσταση [4]. Παρά το γεγονός ότι οι υπάρχουσες θεραπείες μπορούν να εξαλείψουν αρχικά το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού του όγκου, οι ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων του ΚΕΠ να μπορέσουν να επιβιώσουν και να επανεγκατασταθούν στον όγκο, με αποτέλεσμα την υποτροπή της νόσου [5].

Η έννοια της ΚΕΠ έχει τεκμηριωθεί σε ποικίλα κακοηθειών συμπεριλαμβανομένου του μαστού [6], του παχέος εντέρου [7] και καρκίνων του ήπατος [8], [9]. Παρά τις πρόσφατες προόδους στην ηπατική ταυτοποίηση CSC, ακριβής προέλευση αυτών των κυττάρων παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Ογκογένεση και τη εμβρυογένεση είναι γνωστό ότι έχουν πολλά κοινά ιδιότητες που περιλαμβάνουν την κυτταρική πλαστικότητα, δυναμική κινητικότητα κυττάρου [10] και της σύγκλισης των οδών σηματοδότησης, υποδηλώνοντας μια πιθανή σύνδεση μεταξύ των εμβρυϊκών και καρκινικών κυττάρων [11]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έννοια της CSC είναι κυρίως παρόμοιος με τη θεωρία «εμβρυονικό ανάπαυσης», η οποία προτάθηκε με βάση τις ιστολογικές ομοιότητες των εμβρυϊκών και καρκινικών ιστών, γεγονός που υποδηλώνει ότι ιστούς ενηλίκων περιέχουν εμβρυϊκά υπολείμματα που κανονικά βρίσκονται αδρανείς, αλλά μπορούν να ενεργοποιηθούν για να γίνει καρκινικό [12]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των βασικών μορίου που κρύβονται κάτω από τον κοινό των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ES) και καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές στρατηγικές για να καταστείλει την κακοήθη εξαλλαγή των φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, ή την εξάλειψη της ΚΕΠ.

Granulin-επιθελίνης πρόδρομος (GEP, που ονομάζεται επίσης progranulin, proepithelin, acrogranin, ή αυξητικού παράγοντα που προέρχεται PC-) είναι ένας αυξητικός παράγοντας πολυδύναμων ρυθμίζουν την ανάπτυξη του εμβρύου [13], την επισκευή των ιστών [14] και την ογκογένεση σε διάφορους καρκίνους [15]. Βρέθηκε να ρυθμίζει αναπτυξιακά συμβάντα συμπεριλαμβανομένων σπηλαίωση σε έμβρυα προεμφύτευσης ποντικού [16] και αρσενικά-ειδική διαφοροποίηση του εγκεφάλου του υποθαλάμου του νεογέννητους αρουραίους [17]. Προηγουμένως, έχουμε δείξει υπερέκφραση GEP στην πλειονότητα των ανθρώπινων δειγμάτων HCC [18], [19] και του ρόλου της στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού HCC, εισβολή και ογκογονικότητα [19]. Επιπλέον, η εξουδετέρωση του GEP μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των καθιερωμένων HCC [20]. Παρά τις σημαντικές ενδιαφέρον για διπλούς ρόλους της στην εμβρυογένεση και ογκογένεση, πληροφορίες για το πρότυπο έκφρασης της και των βιολογικών λειτουργιών στο ήπαρ εξακολουθούν να σπανίζουν.

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι GEP είναι ένα ηπατική ογκοεμβρυϊκών πρωτεΐνη που ρυθμίζει την έκφραση του κυττάρου που σχετίζονται με σηματοδότηση μορίων βλαστικά β-κατενίνης, Oct4, Nanog και Sox2. Λειτουργικές μελέτες επιβεβαίωσαν ότι τα κύτταρα GEP εκφράζουν διέθετε μεγαλύτερη ικανότητα στο σχηματισμό αποικιών και χημειοαντίσταση. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα που συνεκφράζουν GEP και ΑΤΡ εξαρτώμενη κασέτα σύνδεσης (ABC) B5 επέδειξαν ενισχυμένη ογκογόνο ικανότητα σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. Τα ευρήματά μας είναι ζωτικής σημασίας όχι μόνο για την κατανόηση της ανάπτυξης του εμβρύου ήπαρ, αλλά επίσης και για την κατασκευή ειδικών θεραπειών που στοχεύουν GEP και ABCB5 για την εξάλειψη των χημειοθεραπεία ΚΕΠ σε ασθενείς HCC.

Υλικά και Μέθοδοι

προσδιορισμούς κυττάρων

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος, Hep3B και HepG2, αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20]? ενώ Huh7 αγοράστηκε από Health Science Research Τράπεζα Πόρων (Osaka, Japan) και διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen, Carlsbad, CA). έχουν σταθερά προϊόντα μεταμόλυνσης για GEP υπερέκφραση και η καταστολή έχουν περιγραφεί [19]. GEP απόφραξη Hep3B πραγματοποιήθηκε με επώαση των κυττάρων με ή χωρίς 50 μg /ml A23 μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-GEP (σπιτικό, που περιγράφηκε προηγουμένως [20] ή IgG ποντικού αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 24 h.

Κλινικά δείγματα

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ /Νοσοκομείο Αρχής του Χονγκ Κονγκ West Cluster (HKU /ΗΑ HKW IRB). Έξι ασθενείς υποβλήθηκαν θεραπευτική μερική ηπατεκτομή ή μεταμόσχευση ήπατος για HCC στο Queen Mary Hospital, το Χονγκ Κονγκ, είχαν προσληφθεί με γραπτή συγκατάθεση για τη μελέτη. Οι ασθενείς είχαν διαγνωστεί με πρωτοπαθή HCC και επιβεβαιώθηκε από παθολογική εξέταση. Η ηλικία των ασθενών κυμαινόταν 42 έως 67 ετών, με μέση ηλικία 60 ετών. Υπήρχαν 4 άνδρες και 2 γυναίκες, και όλοι ήταν ηπατίτιδας φορείς του ιού Β. Το μέγεθος των όγκων κυμαίνονταν από 3,5 να 19,5 cm, με μέσο μέγεθος 8,3 εκ. Συγκεκριμένα, κάθε δείγμα έχει περιορισμένο αριθμό κυττάρων (μικρό δείγμα της έρευνας να διασφαλιστεί ότι δεν παρεμβολών σε παθολογική εξέταση) και συνεπώς δεν επαρκεί για την πλήρη πίνακα ανάλυσης έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων. Τα δεδομένα έκφρασης του κάθε δείκτη παρουσιάζονται οι μέσες δεδομένα από τουλάχιστον τέσσερα δείγματα. Οι φυσιολογικό ήπαρ δείγμα ελήφθη από τον δότη οργάνων κατά τη διάρκεια της λειτουργίας μεταμόσχευσης, και ο δότης δεν είχε καμία υποκείμενη ηπατική νόσο και ήταν αρνητικά στη δοκιμή ορολογικές της ηπατίτιδας Β. Το δείγμα εμβρυϊκό ήπαρ λήφθηκε από την ανάκτηση των αρχειοθετούνται τομές παραφίνης μπλοκ ιστού φορμόλη σταθερό λαμβάνονται κατά τη διάρκεια της ρουτίνας παθολογική εξέταση του abortus μετά από αυθόρμητη αποβολή σε 10 εβδομάδες 6 ημέρες. έγκριση Δεοντολογίας για τη χρήση των αρχειοθετημένων εμβρυϊκών ιστών προσδιορίζονται από ηλεκτρονική βάση δεδομένων έχει ληφθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ /Νοσοκομείο Αρχής του Χονγκ Κονγκ West Cluster (HKU /ΗΑ HKW IRB).

Ποντίκι δείγματα

τα συκώτια από ενήλικα, νεογνών και του εμβρύου ποντίκια ICR συλλέχθηκαν και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή για την χρήση ζωντανών ζώων στη διδασκαλία και την έρευνα στο Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ (Έγκριση Αναφορά Νο CULATR 1968 -09). Για την απομόνωση των ηπατοκυττάρων ποντικού, ήπατα κιμά και πέψη με κολλαγενάση τύπου IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Μετά από διήθηση και λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, τα κύτταρα μετρήθηκαν για χρώση ανοσοφθορισμού και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACSCalibur, Βϋ Biosciences, San Jose, CA). Κύτταρα που απομονώθηκαν από εμβρυονικά ήπατα χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΑΡΡ (R &? Συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ) και αντίσωμα κατά λευκωματίνης (R &? Συστήματα Δ) να διακρίνει ηπατοκύτταρα για μετέπειτα χαρακτηρισμό GEP-κυττάρων που εκφράζουν

η ανοσοϊστοχημεία

η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε φορμόλη σταθερό παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα με Dako Οραματιστείτε Plus System (Dako, Carpinteria, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή με τις τροποποιήσεις, όπως περιγράφεται [18], [19].

χρώση ανοσοφθορισμού και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την έκφραση της GEP, ABCB5, β-κατενίνης, Oct4, Sox2, Nanog και DLK1, τα κύτταρα διαπερατά με παγωμένο 0,1% σαπωνίνη και στη συνέχεια επωάστηκαν με FITC- συζευγμένο αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου GEP (που περιγράφηκε προηγουμένως [20]), μη συζευγμένο γίδινο αντι-ανθρώπινο ABCB5 (Everest Biotech Ltd, Oxfordshire, UK), Alexa Fluor 647-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο β-κατενίνης, PerCP-Cy5.5-συζευγμένο ποντικού αντι-ανθρώπου Oct4, Alexa Fluor 647-συζευγμένο αντι-Sox2, ΡΕ-συζευγμένο ποντικίσια αντι-ανθρώπινη Nanog (BD Biosciences), μη συζευγμένο αρουραίου αντι-DLK-1 (MBL International, Woburn, ΜΑ), ή ίση ποσότητα που αντιστοιχεί αντισώματα ελέγχου ισοτύπου. Για ABCB5 και DLK1, τα κύτταρα επωάστηκαν με NorthernLights (NL) αντι-αίγας IgG δευτερεύον αντίσωμα 557-συζευγμένο γαϊδάρου ή αντι-αρουραίου IgG δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με NL637 κατσίκα, αντίστοιχα, πριν από τη χρώση με αντι-GEP αντίσωμα. Για CD133 και έκφραση επιφανείας EpCAM, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΑΡΟ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία), ΑΡΟ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο EpCAM (BD Biosciences) ή ίση ποσότητα που αντιστοιχεί αντισώματα ελέγχου ισοτύπου, πριν από την διαπερατότητας και χρώση με αντι GEP-αντισώματος.

διαλογή κυττάρων

Απομόνωση GEP- ή /και κυττάρων ABCB5 εκφράζουν διεξήχθη με μαγνητικά ενεργοποιούμενο κυτταρικό διαχωρισμό (Miltenyi Biotec) σύμφωνα με κατασκευαστή οδηγίες. Εν συντομία, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με FITC-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο GEP (που περιγράφηκε προηγουμένως [20]) ή βιοτίνη-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο ABCB5 (Rockland, Gilbertsville, ΡΑ) αντίσωμα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ΡΙΤΟ ή αντι-βιοτίνη μαγνητικά μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec), που ακολουθείται από μαγνητικό διαχωρισμό. Σημειώστε ότι τα κύτταρα ταξινομήθηκαν με βάση την επιφανειακή έκφραση του GEP και ABCB5, αλλά όχι για την ενδοκυτταρική έκφραση τους, επειδή διαπερατοποίηση δεν ήταν εφικτό να κρατήσει τα κύτταρα βιώσιμα για μετέπειτα λειτουργικές δοκιμασίες. Μετά την απομόνωση των κυττάρων, 2 εκατομμύρια από κάθε ταξινομημένο πληθυσμού συλλέχθηκαν για να αξιολογηθεί η κυτταρική βιωσιμότητα με βαφή κυανούν τρυπανίου και καθαρότητα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ποντικού αντι-ανθρώπου GEP (R &? Συστήματα D) ή κατσίκας αντι-ανθρώπινης ABCB5 (Everest Biotech) αντίσωμα που αναγνωρίζει επιτόπια διαφορετικά από τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για κυτταρική διαλογή. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού κουνελιού ή NL557-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κατσίκας δευτερογενές αντίσωμα IgG για GEP ή ABCB5, αντίστοιχα. Για την αξιολόγηση της καθαρότητας των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, ταξινομημένα κύτταρα διαπερατά πριν από τη χρώση, έτσι ώστε θα μπορούσε να καθοριστεί η συνολική GEP και ABCB5 έκφραση των ταξινομημένων πληθυσμών. Μετα-ανάλυση διαλογής τυπικά έδειξε καθαρότητες & gt? 80% με ελάχιστη κυτταρικό θάνατο (& lt? 10%).

συσσώρευση δοξορουβικίνη και την απόπτωση

Τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς 0,5 μg /ml δοξορουβικίνη για 24 ώρες. Η ενδοκυτταρική συσσώρευση δοξορουβικίνη αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε φάσμα FL2? ενώ κυτταρική απόπτωση προσδιορίστηκε με Annexin V-FITC (FL1) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (FL2) χρώση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Colony

δοκιμασία σχηματισμού

Προσφάτως απομονωθέντα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πυκνότητα 1000 κύτταρα /φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες. σχηματισμός αποικιών εκτιμήθηκε με μία χρωματομετρική ανάλυση με χρήση κρυσταλλικό ιώδες (Sigma Aldrich).

In vivo πειράματα

ογκογονικότητα

χρησιμοποιήθηκαν BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια από ηλικίας 5 εβδομάδων για να δοκιμαστεί η

in vivo

ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή για την χρήση ζωντανών ζώων στη διδασκαλία και την έρευνα στο Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Διάφοροι αριθμοί κυττάρων εμβολιάσθηκαν υποδορίως στη ραχιαία περιοχή του κορμού του κάθε ζώου. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν μεταξύ 8 και 16 εβδομάδες μετά την ένεση, στην οποία οι όγκοι συλλέχθηκαν για περαιτέρω εξέταση. Οι εν λόγω ποντίκια ένεση με κύτταρα HCC, αλλά χωρίς το σημάδι του φορτίου του όγκου ήταν γενικά τερματίζεται 5 μήνες μετά την έγχυση των κυττάρων.

στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν με t δοκιμασία του Student. Μια πιθανότητα (ρ) & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντικά διαφορετικές. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του στατιστικού λογισμικού GraphPad Prism για Windows, έκδοση 3.00 (GraphPad Software, CA, USA).

Αποτελέσματα

GEP είναι ένα ηπατική ογκοεμβρυϊκών πρωτεΐνη

Προηγουμένως , GEP mRNA αναφέρθηκε στην εμβρυϊκή ήπαρ ποντικού [13], αλλά αν GEP μεταφράζεται σε πρωτεΐνη και την ώρα της ενεργοποίησης /-off κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ήπατος παραμένει άγνωστη. Από το εμβρυϊκό ήπαρ έχει την αφθονία των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων εκτός από την εμβρυϊκή ηπατοκύτταρα, θα πρέπει να προσδιορίσει το είδος (s) των κυττάρων που εκφράζουν GEP. Εδώ, περιγράφεται για πρώτη φορά το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης του GEP στο ανθρώπινο και ποντικού ήπατα. Με ανοσοϊστοχημική χρώση, GEP πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε ποντικού και ανθρώπου εμβρυϊκού ήπατα, ενώ ενήλικος ήπατα στερούνται GEP εκφράζουν ηπατοκύτταρα (Σχήμα 1Α).

(Α) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση δείχνει GEP πρωτεΐνης σε εμβρυϊκό ήπαρ ποντικού ( εμβρυϊκή ημέρα 17.5) και της ανθρώπινης (10 εβδομάδων 6 ημέρες), αλλά όχι σε ενήλικες ήπατα (μεγέθυνση χ 400). (Β) Οι αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής που αποδεικνύουν την έκφραση της GEP και ηπατικής βλαστοκυττάρων δείκτες σε εμβρυϊκά ηπατοκύτταρα ποντικού. Η συν-έκφραση της GEP και δεικτών ηπατικής βλαστικών κυττάρων CD133, EpCAM, DLK1 και β-κατενίνης διεξήχθησαν με τετραπλού χρώμα κυτταρομετρία ροής, μέσω πύλης στο AFP + και /ή λευκωματίνη + ηπατοκύτταρα εμβρυϊκών ήπατα. Κύτταρα συν-εκφράζουν τα αντίστοιχα δείκτες παρουσιάστηκαν στην άνω δεξιά τεταρτημόριο διαγράμματα στιγμών. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ποσοστό + κυττάρων SD.

Η

Στο μοντέλο ποντικού, για να διακρίνει έκφραση GEP ειδικά στα ηπατοκύτταρα, η ανάλυση του επιπέδου GEP διεξήχθη με τριπλή χρώμα κυτταρομετρία ροής, μέσω πύλης στο AFP + ή /και η λευκωματίνη + για ηπατοκύτταρα σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Ένταξη της AFP + ή /και αλβουμίνη + κυττάρων σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια θα αντικατοπτρίζει καλύτερα τον πληθυσμό ηπατοκυττάρων στο ήπαρ, διότι το ποσοστό των + κυττάρων AFP και την αλβουμίνη + κυττάρων ήταν διαφορετική στην εμβρυϊκή, νεογνική και ενηλίκων συκώτια (Σχήμα S1). έκφραση GEP αυξάνεται σταδιακά από εμβρυϊκή ημέρα Ε11.5 (14,8% + 6,9%) σε Ε17.5 (30,8 + 9,2%). Αμέσως μετά την γέννηση, το επίπεδο μειώθηκε απότομα GEP από την ημέρα 1 (4,4 + 1,5%) για να Ημέρα 7 (1,2 + 0,4%), και έγινε σχεδόν μη ανιχνεύσιμη σε ενήλικες ήπατα του ποντικού (0,9 + 0,4%) (Σχήμα S1). Μαζί με τα προηγούμενα ευρήματα μας ότι GEP εκφράζεται στην πλειοψηφία των δειγμάτων HCC, αλλά όχι στα γειτονικά ήπαρ μη-όγκου ιστούς [18], [19], επιβεβαιώσαμε ότι ήταν ένα GEP ηπατικής ογκοεμβρυϊκό πρωτεΐνη.

Για χαρακτηρίζουν την βλαστικών κυττάρων υπογραφή του GEP + εμβρύου ηπατοκύτταρα, εξετάσαμε την συν-έκφραση του GEP και πολλών ηπατικών βλαστικών κυττάρων ή βλαστικών δείκτες κυττάρου που σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων CD133, EpCAM, DLK1 και β-κατενίνης [21], [22], [23] [24], στα εμβρυϊκά ήπατα (Σχήμα 1Β). Hepatoblasts θα έχουν αύξοντα αλλαγές μαζί αναπτυξιακά στάδια και να οδηγήσει σε ηπατοκύτταρα και χοληφόρα. Στο εμβρυϊκή ημέρα 11.5 (Ε11.5), εκφράσεις του CD133, EpCAM, DLK1 και β-κατενίνης ήταν υψηλή στις hepatoblasts και η πλειοψηφία των GEP-θετικών κυττάρων συν-εκφράζεται όλα αυτά ηπατική δείκτες αρχέγονων κυττάρων. Στο Ε13.5, εκφράσεις του CD133 και EpCAM άρχισαν να μειώνονται και τα περισσότερα από τα CD133 + ή EpCAM + κυττάρων παρατηρήθηκε να συν-express GEP. Για DLK1 και β-κατενίνης, τα επίπεδα έκφρασης τους παρέμεινε υψηλή σε Ε13.5 και η πλειοψηφία των GEP-κυττάρων που εκφράζουν ήταν επίσης θετικά για τους δύο δείκτες. Στο Ε17.5, οι εκφράσεις του CD133, EpCAM, DLK1 και β-κατενίνης μειώθηκε σε χαμηλά επίπεδα, ενώ η έκφραση GEP φτάσει στην κορυφή σε αυτό το στάδιο. Η διαφορά των τάσεων έκφρασης μεταξύ GEP και αυτών των δεικτών των βλαστικών κυττάρων θα μπορούσε να αποδοθεί στις ιδιότητες του αυξητικού παράγοντα του GEP. Ενώ περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός που υπογραμμίζει την πρότυπο έκφρασης του GEP, συν-έκφραση του GEP με αυτά ηπατική βλαστοκυττάρων ή βλαστικού κυττάρου δείκτες που σχετίζονται προτείνει ένα βλαστοκύτταρο φαινότυπο του GEP-εκφράζοντα κύτταρα.

η έκφραση GEP στα ηπατοκύτταρα ποντικού ερευνήθηκε από σπιτικά A23 μας αντίσωμα αντι-GEP. Η εξειδίκευση της Α23 εξετάστηκε με κηλίδα western (Σχήμα S2 και το αποτέλεσμα έδειξε ότι θα μπορούσε να αναγνωρίσει το GEP ποντίκι ως ενιαίο συγκρότημα από το εκχύλισμα πρωτεΐνης ήπατος εμβρυϊκών ποντικού. Επιπλέον, το πρότυπο έκφρασης GEP, όπως φαίνεται στην κηλίδα western ήταν σύμφωνο με τη ροή κυτταρομετρία δεδομένα σε αυτό το επίπεδο της πρωτεΐνης GEP αυξήθηκε από Ε11.5 και Ε13.5 να Ε17.5, παρέχοντας συνεπή δεδομένα να αντικατοπτρίζουν την έκφραση GEP στα εμβρυϊκά ήπατα.

χαρακτηρισμός φαινοτυπική GEP-κυττάρων που εκφράζουν σε HCC

Για να χαρακτηριστεί καλύτερα αν οι GEP-εκφράζοντα κύτταρα είχαν τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων σε HCC, εξετάσαμε την συν-έκφραση της GEP και ένα πάνελ των δεικτών βλαστικών κυττάρων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCC Hep3B και Huh7. Markers εξετάστηκαν περιλαμβάνουν αιμοποιητικά πρόδρομα δείκτες κυτταρικής επιφάνειας CD31, CD34, CD117, ηπατική πρόδρομο δείκτη κυτταρικής επιφάνειας CD123, βλαστικά δείκτες κυτταρικής επιφάνειας μόρια σηματοδότησης CD24, CD29, δείκτες της ηπατικής CSC επιφάνεια CD44, CD90, CD133, EpCAM, ES κυττάρων που σχετίζονται με β-κατενίνης, Oct4, Nanog και Sox2, ABC μεταφορείς ναρκωτικών ABCC1 και ABCB5. Σημειώστε ότι οι μεταφορείς ABC φάρμακο συμπεριλήφθηκαν επίσης, διότι τόσο φυσιολογικά και καρκινικά βλαστικά κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερο επίπεδο των μεταφορέων φαρμάκου ABC, συμβάλλοντας στην μεγαλύτερη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες από διαφοροποιημένα κύτταρα [4], [21]. Μεταξύ των δεικτών που ερευνώνται, κύτταρα GEP + δείχθηκαν να προτίμηση συν-express με β-κατενίνης, Oct4, Nanog, Sox2, CD133 και EpCAM σε σύγκριση με GEP- κύτταρα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές HCC Hep3B (Σχήμα S3) και Huh7 (Σχήμα S4 ). Ως εκ τούτου, τα ευρήματα μας πρότεινε ένα χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων του GEP-κυττάρων που εκφράζουν στα κύτταρα τόσο εμβρυϊκά και καρκινικών ήπαρ.

GEP ρυθμίζει την έκφραση των δεικτών βλαστικών κυττάρων

διαμορφωμένα τα επίπεδα έκφρασης GEP σε κύτταρα Hep3B με προσέγγιση επιμόλυνση και διερευνάται αν θα τροποποιήσει τις περιεκτικότητες σε πρωτεΐνες των δεικτών των βλαστικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα άνω ρύθμιση του επιπέδου GEP ενισχυμένη, ενώ η καταστολή της επίπεδο GEP μείωσε την έκφραση της β-κατενίνης, Oct4, Nanog, Sox2 και ABCB5 (Πίνακας 1). Διαφοροποίηση στα επίπεδα GEP δεν άλλαξε την έκφραση των ηπατικών βλαστικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας CD133 και EpCAM. Ο λόγος μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η πλειοψηφία των κυττάρων Hep3B ήταν θετικά για CD133 και EpCAM (μεγαλύτερη από 95%), έτσι η αλλαγή του ενός μορίου (π.χ. GEP) μπορεί να μην είναι σε θέση να μετατοπίσει τον πληθυσμό. Ενώ GEP έχει αναφερθεί προηγουμένως από την ομάδα μας για τη ρύθμιση ABCB5 να μεσολαβήσει χημειοαντίσταση σε κύτταρα HCC [25], η θετική συσχέτιση μεταξύ GEP και β-κατενίνης, Oct4, Sox2 και Nanog πρότεινε ότι GEP μπορούσε ρυθμίζουν την έκφραση αυτών των ES κυττάρων-συναφείς μόρια σηματοδότησης για να διατηρηθεί η πλειοδυναμία των βλαστικών κυττάρων.

η

για την περαιτέρω επικύρωση του ρυθμιστικού ρόλου του GEP στην έκφραση αυτών των μορίων σηματοδότησης, GEP απόφραξη από αντι-GEP A23 μονοκλωνικό αντίσωμα πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα Hep3B ( Πίνακας 2). A23 βρέθηκε να μειώσει σημαντικά τα επίπεδα της ενδογενούς GEP σε κύτταρα Hep3B. GEP απόφραξη επίσης κατέστειλε σημαντικά την έκφραση του β-κατενίνης, Oct4, Nanog και Sox2, επιβεβαιώνοντας έτσι το ρυθμιστικό ρόλο της GEP στην έκφραση αυτών των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με μόρια σηματοδότησης.

Η

κύτταρα GEP εκφράζουν έχουν ιδιότητες CSC

in vitro

Η

Για την καλύτερη χαρακτηρίζουν τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων του GEP-κυττάρων που εκφράζουν, GEP

υψηλή και GEP

χαμηλή υποπληθυσμών απομονώθηκαν από καρκίνο κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ήπατος Hep3B, HepG2 και Huh7, και εξετάστηκαν για την έκφρασή τους των δεικτών βλαστικών κυττάρων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα ταξινομήθηκαν με βάση την επιφανειακή έκφραση του GEP, αλλά όχι σε ενδοκυτταρική έκφραση του, επειδή διαπερατοποίηση δεν ήταν εφικτό να κρατήσει τα κύτταρα βιώσιμα για μετέπειτα λειτουργικές δοκιμασίες. Μετά την απομόνωση των κυττάρων, 2 εκατομμύρια από κάθε ταξινομημένο πληθυσμός συλλέχθηκε για να αξιολογηθεί η κυτταρική βιωσιμότητα με βαφή κυανούν τρυπανίου και καθαρότητα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό αντι-GEP αντίσωμα που αναγνωρίζονται διακριτά επιτόπια από αυτά τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για κυτταρική διαλογή. Η καθαρότητα των GEP

υψηλή και GEP

χαμηλή υποπληθυσμών ήταν περίπου 80% έως 90%, αντίστοιχα, όπως αποκαλύπτεται από μετα-ανάλυση διαλογής (Εικόνα 2Α). GEP

υψηλής κύτταρα βρέθηκαν να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα των ES κυττάρων που σχετίζονται με μόρια σηματοδότησης β-κατενίνης, Oct4, Nanog, Sox2 και ABC μεταφορέα ναρκωτικών ABCB5 από GEP

χαμηλή ομολόγους στις τρεις κυτταρικές σειρές HCC (Εικόνα 2Β) . Για ηπατική CSC CD133 δείκτη επιφανείας, υψηλότερη έκφραση επιφάνεια GEP

υψηλής κύτταρα από GEP

χαμηλή ομόλογό βρέθηκε σε HepG2 και Huh7, αλλά όχι Hep3B, η οποία ήταν κατά πάσα πιθανότητα οφείλεται στο εξαιρετικά υψηλό επίπεδο του CD133 (& gt? 95 %) εκφράζουν συντακτικά στα κύτταρα Hep3B (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για EpCAM, υψηλότερη επιφανειακή έκφραση παρατηρήθηκε σε GEP

υψηλή από GEP

χαμηλών πληθυσμών σε Huh7, αλλά όχι Hep3B και HepG2, όπου πλειοψηφία των κυττάρων? Βρέθηκαν να εκφράζουν EpCAM (& gt 95%). Τα δεδομένα είναι επομένως σύμφωνη με τις προηγούμενες διαπιστώσεις που GEP-κυττάρων που εκφράζουν σχετίζονται με εκφράσεις δείκτη βλαστικών κυττάρων σε σύγκριση με τα αρνητικά κύτταρα GEP.

(Α) έκφραση GEP σε μη ταξινομημένα κύτταρα Hep3B, HepG2 και Huh7, και η πρόσφατα απομονωμένες GEP

υψηλή, και GEP

χαμηλή υποπληθυσμών μετά από διαλογή κυττάρων. Τα κύτταρα ταξινομούνται με βάση την επιφανειακή έκφραση του GEP, αλλά όχι σε ενδοκυτταρική έκφραση του, προκειμένου να κρατήσει τα κύτταρα βιώσιμα για μετέπειτα λειτουργικές δοκιμασίες. Μετά την απομόνωση των κυττάρων, 2 εκατομμύρια από κάθε ταξινομημένο πληθυσμός συλλέχθηκε για να αξιολογηθεί η κυτταρική βιωσιμότητα με βαφή κυανούν τρυπανίου και η καθαρότητα των ταξινομημένο υποπληθυσμών με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό αντίσωμα αντι-GEP (αναγνωρίζοντας διακριτών επιτόπων σε σύγκριση με τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για κυτταρική διαλογή ). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ποσοστό + κυττάρων GEP ± SD. επίπεδα (Β) Η έκφραση πρωτεΐνης των δεικτών των βλαστικών κυττάρων β-κατενίνης, Oct4, Nanog, Sox2 και ABCB5 στις ταξινομημένο υποπληθυσμούς μετρήθηκαν με ενδοκυτταρική χρώση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ποσοστό των θετικών κυττάρων ± SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001, σε σύγκριση με GEP

χαμηλή κύτταρα. (C) Αποικία αποδόσεις σχηματισμό GEP

υψηλή υποπληθυσμών ήταν υψηλότερες από τις αντίστοιχες GEP

χαμηλή και μη ταξινομημένα κύτταρα τους Hep3B και HepG2. (D, Ε) Μετά από έκθεση σε δοξορουβικίνη (0,5 μg /ml για 24 ώρες), GEP

υψηλή υποπληθυσμών διατήρησε σημαντικά λιγότερο δοξορουβικίνη και λιγότερες απόπτωση των κυττάρων από GEP

χαμηλή και μη ταξινομημένα κύτταρα Hep3B και HepG2. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001, σε σύγκριση με τα άλλα μικτά ελέγχους

Η

για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα GEP εκφράζουν εμπλουτίστηκαν για ΚΕΠ, συγκρίναμε την ογκογόνο δυναμικό και ιδιότητες βλαστοκυττάρων του GEP

υψηλής κύτταρα με τους ομολόγους τους

in vitro

σε Hep3B και HepG2 κύτταρα, τα οποία αντιπροσωπεύουν υψηλής και χαμηλής GEP-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν, αντίστοιχα. Κλωνογονικότητας των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. GEP

υψηλής Hep3B κύτταρα ήταν σε θέση να σχηματίσει σημαντικά περισσότερες αποικίες σε σύγκριση με το GEP

χαμηλή κυττάρων και την άνευ διαλογής ελέγχου. Παρόμοια παρατήρηση φάνηκε με ανεξάρτητο καρκίνο του ήπατος κυττάρων HepG2 (Σχήμα 2C).

Για να εξετασθεί ο ρόλος της GEP σε χημειοαντίσταση, τα κύτταρα επωάστηκαν με δοξορουβικίνη και αξιολογήθηκαν για ενδοκυτταρική συσσώρευση του φαρμάκου και την κυτταρική απόπτωση. GEP

υψηλή υποπληθυσμών, σε δύο κύτταρα Hep3B και HepG2, έδειξαν σημαντικά χαμηλότερη πρόσληψη δοξορουβικίνη (Σχήμα 2D) και την κυτταρική απόπτωση (Σχήμα 2Ε), σε σύγκριση με τα άλλα μικτά ελέγχου? ενώ GEP

χαμηλή υποπληθυσμών έδειξαν αυξημένη πρόσληψη δοξορουβικίνη και την κυτταρική απόπτωση, σε σύγκριση με αδιαχώριστα πληθυσμούς.

GEP

highABCB5 + κύτταρα επιδεικνύουν υψηλότερη ικανότητα σχηματισμού αποικιών και χημειοαντίσταση

Σύμφωνα με την CSC υπόθεση, ΚΕΠ αντιπροσωπεύουν μόνο ένα σπάνιο πληθυσμό του όγκου [4]. Αυτό σημαίνει ότι GEP

υψηλή υποπληθυσμό εξακολουθεί να είναι ανομοιογενής, και, ενδεχομένως, αποτελείται από υποσύνολα με διαφορική ογκογόνο δυναμικό. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε την περαιτέρω τεμαχίσει το GEP

υψηλή πληθυσμιακή με πρόσθετα συν-έκφραση δείκτη.

Στα κύτταρα Hep3B, η πλειοψηφία των ABCB5 + κυττάρων εξέφρασαν GEP, αλλά μόνο ένα υποσύνολο των GEP + κυττάρων ήταν ABCB5 + (Σχήμα 3Α, αριστερός πίνακας). Επιπλέον, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι ABCB5 ρυθμιζόμενη ηπατική δείκτες καρκίνου βλαστικών κυττάρων CD133 και EpCAM [21]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι GEP σε συνδυασμό με ABCB5 μπορεί να προσδιοριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια η ηπατική πληθυσμού CSC.

(Α) GEP και της έκφρασης ABCB5 σε μη ταξινομημένα κύτταρα Hep3B, και η πρόσφατα απομονωθεί GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- και GEP

lowABCB5- υποπληθυσμών. Τα κύτταρα ταξινομούνται με βάση την επιφανειακή έκφραση του GEP και ABCB5. Μετά την απομόνωση των κυττάρων, 2 εκατομμύρια από κάθε ταξινομημένο υποπληθυσμό συλλέχθηκε για να αξιολογηθεί η καθαρότητα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντι-GEP και αντι-ABCB5 αντισώματα που αναγνωρίζουν επίτοπα διαφορετικές από εκείνες των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται για κυτταρική διαλογή. Σημειώστε ότι τα περισσότερα ABCB5 + κύτταρα ήταν επίσης GEP +, έτσι δεν υπήρχε GEP

lowABCB5 + κύτταρα (αριστερό πάνελ). Η μέση εκατοστιαία αναλογία των κυττάρων ± SD παρουσιάζεται σε κάθε τεταρτημόριο. (Β) Αποικία αποδόσεις σχηματισμό GEP

highABCB5 + υποπληθυσμό ήταν υψηλότερες από ό, τι GEP

highABCB5-, GEP

lowABCB5- και μικτές κύτταρα. (C, D) Μετά από έκθεση σε δοξορουβικίνη (0,5 μg /ml για 24 ώρες), GEP

highABCB5 + κύτταρα διατηρούνται σημαντικά λιγότερο δοξορουβικίνη και λιγότερες απόπτωση των κυττάρων από τις άλλες υποπληθυσμών. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τα άλλα μικτά ελέγχους? #

P

& lt? 0,05, # #

P

& lt? 0,01, # # #

P

& lt?. 0.001 μεταξύ των ομάδων που συμβολίζεται με οριζόντιες γραμμές

απομονωθεί GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- και GEP

lowABCB5- κύτταρα από Hep3B. Τα κύτταρα ταξινομήθηκαν με βάση την επιφανειακή έκφραση του GEP και ABCB5, αλλά όχι για την ενδοκυτταρική έκφραση τους, επειδή διαπερατοποίηση δεν ήταν εφικτό να κρατήσει τα κύτταρα βιώσιμα για μετέπειτα λειτουργικές δοκιμασίες. Μετά την απομόνωση των κυττάρων, ταξινομημένο υποπληθυσμών αξιολογήθηκαν για βιωσιμότητα κυττάρου με βαφή κυανούν τρυπανίου και καθαρότητα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντι-GEP ή αντι-ABCB5 αντισώματα που αναγνωρίζονται διακριτά επιτόπια από αυτά τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για κυτταρική διαλογή. Τουλάχιστον το 80% καθαρότητας ελήφθη σε κάθε υποπληθυσμό (Εικόνα 3Α) και ογκογόνο δυναμικό τους εξετάστηκαν τόσο

in vitro

και

in vivo

.

GEP

highABCB5 + κύτταρα κατέδειξαν επαγωγή του μεγαλύτερου αριθμού των αποικιών, ενώ ο GEP

highABCB5- κύτταρα έδειξαν ενδιάμεση ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες αλλά εξακολουθεί να είναι σημαντικά υψηλότερο από το αδιαχώριστα ελέγχου. Σημαντικά, GEP

lowABCB5- υποπληθυσμός ήταν σχεδόν σε θέση να σχηματίσουν αποικίες (Εικόνα 3Β).

Κατά την έκθεση σε δοξορουβικίνη, GEP

highABCB5 + κύτταρα έδειξαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα πρόσληψης ντοξορουμπικίνης και κυτταρικής απόπτωσης σε σύγκριση με GEP

highABCB5- κύτταρα, και μικτές ελέγχου. Αντιθέτως, GEP

lowABCB5- κύτταρα ήταν πολύ ευαίσθητα σε δοξορουβικίνη την άποψη της συσσώρευσης του φαρμάκου και την κυτταρική απόπτωση (Σχήμα 3C και D)

GEP

highABCB5 + κύτταρα είναι πιο ογκογόνα

in vivo

Η

πειράματα ανάπτυξης όγκου χρησιμοποιώντας GEP

highABCB5 + και GEP

lowABCB5- υποπληθυσμών που απομονώνεται από κύτταρα Hep3B πραγματοποιήθηκαν σε ανοσοκατεσταλμένους γυμνούς ποντικούς. Όλα τα ποντίκια ενέθηκαν με GEP

highABCB5 + κύτταρα ανέπτυξαν όγκους. Ποντικοί που ενέθηκαν με 1 χ 10

6 διπλών θετικών κυττάρων που σχηματίζονται όγκους εντός 2 έως 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. Αντίθετα, μόνο 2/10 ποντίκια που ενέθηκαν με GEP

lowABCB5- κύτταρα που δημιουργούνται σχετικώς μικρούς όγκους και απαιτείται πλέον λανθάνουσα κατάσταση (12 εβδομάδες) (Σχήμα 4Α και Β).

(Α) Γυμνοί ποντικοί ενέθηκαν υποδορίως με GEP

highABCB5 + και GEP

lowABCB5- κύτταρα μετά από 8 εβδομάδες. Το δεξί πλαίσιο εμφανίζει τα υποδόριων όγκων που προέρχονται από 2,5 × 10

5 GEP

highABCB5 + και 1 × 10

6 GEP

lowABCB5- κύτταρα κατά την εβδομάδα 16. (Β) Ογκογονικότητα GEP

highABCB5 + και GEP

lowABCB5- κύτταρα.