Αφηρημένο

Μηχανισμοί της ανώμαλης πρωτεΐνης φωσφορυλίωσης που ρυθμίζουν κυτταρική εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε υψηλής απόδοσης συστοιχία φωσφορυλίωση να δοκιμάσει δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (PC-1 κύτταρα με ένα χαμηλό, και PC-1.0 κυττάρων με υψηλό δυναμικό εισβολή και μετάσταση). Σημειώσαμε ότι ένα σύνολο 57 πρωτεϊνών αποκάλυψε μια διαφορετική έκφραση (πάσο αλλαγή ≥ 2.0). Έξι υποψήφιες πρωτεΐνες περαιτέρω επικυρωθεί από κηλίδα western με διαπιστώθηκε ότι είναι σύμφωνα με τον πίνακα αποτελεσμάτων. 57 πρωτεΐνες, 32 ρυθμίζεται προς τα πάνω τις πρωτεΐνες (π.χ. CaMK1-α και P90RSK) ήταν κυρίως εμπλέκονται στην ErbB και νευροτροφινών μονοπάτια σηματοδότησης, όπως προσδιορίζεται με τη χρήση του λογισμικού DAVID, ενώ το 25 κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες (π.χ. BID και BRCA 1) συμμετείχαν ενεργά στην απόπτωση και σηματοδοτικά μονοπάτια p53. Επιπλέον, τέσσερις πρωτεΐνες (ΑΚΤ1, Chk2, ρ53 και p70S6K) με διαφορετικές θέσεις φωσφορυλίωσης βρέθηκαν, όχι μόνο μεταξύ των επάνω ρυθμισμένη, αλλά και μεταξύ των κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτείνες. Είναι σημαντικό, ειδικά θέσεις φωσφορυλίωσης μπορεί να επηρεάσει τις βιολογικές λειτουργίες των κυττάρων. λογισμικό CentiScaPe υπολογίζεται τοπολογικά χαρακτηριστικά κάθε κόμβος στην αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (ΡΡΙ) δικτύου: βρήκαμε ότι ΑΚΤ1 κατέχει τις μέγιστες βαθμούς κόμβου και betweenness στο δίκτυο πρωτεΐνη ΡΡΙ πάνω ρύθμιση (26 κόμβων, το μέσο μήκος διαδρομής: 1.89, βαθμοί κόμβος : 6,62 ± 4,18, betweenness: 22.23 ± 35.72), και p53 στο δίκτυο πρωτεΐνη ΠΠΑ ρύθμιση προς τα κάτω (17 κόμβων, το μέσο μήκος διαδρομής: 2.04, βαθμούς κόμβο: 3,65 ± 2,47, betweenness: 16.59 ± 29.58). Εν κατακλείδι, η αναγνώριση της ανώμαλης πρωτεΐνης φωσφορυλίωσης που σχετίζονται με την εισβολή και τη μετάσταση μπορεί να μας επιτρέψει να εντοπιστούν νέα βιοδεικτών σε μια προσπάθεια για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στόχων φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Tan Χ, Liu P, Huang Υ, Zhou L, Yang Υ, Wang H, et al. (2016) Phosphoproteome Ανάλυση Εισβολή και Μετάσταση παράγοντες που συνδέονται σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 11 (3): e0152280. doi: 10.1371 /journal.pone.0152280

Επιμέλεια: Dong Wang, Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 14, Νοεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 12 του Μάρτη 2016? Δημοσιεύθηκε: 25 Μαρτίου, 2016

Copyright: © 2016 Tan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Liaoning Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 2014021006)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια εξαιρετικά κακοήθης νόσος με πολύ πτωχή πρόγνωση. Παρά τις σημαντικές προόδους σε ακτινολογικές και ενδοσκοπικές τεχνικές υπερήχων, συχνά παρουσιάζεται ως ένα τοπικά προχωρημένη ή μεταστατική νόσο στους περισσότερους ασθενείς, και μόνο περίπου το 10-20% των ασθενών θεωρούνται υποψήφιοι για χειρουργική επέμβαση [1, 2]. Εκτός από τη χειρουργική επέμβαση, άλλες αποτελεσματικές μέθοδοι θεραπείας δεν υπάρχουν, και το ποσοστό επιβίωσης για εκτομή τους ασθενείς είναι επίσης εξαιρετικά χαμηλή. Ο κυριότερος λόγος για την κακή πρόγνωση είναι τοπικές υποτροπές ή /και απομακρυσμένες μετάσταση μετά την χειρουργική επέμβαση. Αυτό υποδηλώνει ότι η κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος είναι σημαντική και απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Ωστόσο, πρωτεΐνη μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, οι οποίες μπορεί να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ρύθμιση των κυτταρικών αποκρίσεων, δεν έχει αποδειχθεί σαφώς ότι. Επομένως, είναι σημαντικό να εντοπιστούν τυχόν συμβάντα φωσφορυλίωσης και να καθορίσουν ολόκληρη προφίλ φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών των καρκινικών κυττάρων. Πρόσφατα, συγκρίνοντας τα phosphoproteomes σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια του καρκίνου του δέρματος σε ποντίκια, ταυτοποιήθηκαν πρωτεΐνες που συνδέονται με πρώιμη και όψιμη κυτταρικές αποκρίσεις, παρέχοντας νέες γνώσεις σχετικά με την εξέλιξη της νόσου [3]. Batchu et al. διαπιστώθηκε ότι η θεραπεία miR-26a μπορεί να αποκαταστήσει λειτουργίες άγριου τύπου μεταλλαγμένης ρ53 μέσω φωσφορυλίωσης στα υπολείμματα του Ser9 και Ser392, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης [4]. Ως εκ τούτου, site-specific φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση κυτταρικές διεργασίες.

Ωστόσο, όσο γνωρίζουμε, οι μελέτες έχουν δεν αναλύονται τα προφίλ phosphoproteome των δύο ομοιογενείς κυτταρικές γραμμές (PC-1 με ένα χαμηλή, και PC-1.0 με υψηλό δυναμικό εισβολής και μετάστασης) [5, 6] σε παγκρεατικά έρευνα του καρκίνου. Στόχος μας είναι να συγκρίνουμε τις αλλαγές στις 582 θέσεις φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών 452 μεταξύ του PC-1 και PC-1.0 κύτταρα με τη χρήση της τεχνολογίας Array φωσφο Explorer αντισωμάτων. Επιπλέον, τα μονοπάτια και τα δίκτυα που σχετίζονται με φωσφοπρωτείνες προσδιορίζονται στη μελέτη δείχνουν σημαντικές διαφοροποιήσεις μας στα συστατικά τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Δύο χάμστερ του παγκρέατος κυτταρικές σειρές καρκίνου του χρησιμοποιήθηκαν: ασθενώς επεμβατική και μεταστατικά κύτταρα (PC-1), και ιδιαίτερα επεμβατική και μεταστατικά κύτταρα (PC-1.0). Η κυτταρική σειρά PC-1 ιδρύθηκε από παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα που προκαλείται από BOP σε ένα συριακό χρυσή χάμστερ. Η κυτταρική σειρά PC-1,0 ιδρύθηκε από έναν υποδόριο όγκο που παράγεται μετά τον εμβολιασμό ενός χάμστερ, PC-1 κύτταρα [5,6].

In vitro

, PC-1.0 κύτταρα είναι κυρίως μεμονωμένα κύτταρα, ενώ τα κύτταρα PC-1 αναπτύσσονται ως αποικίες κυττάρων νησί-όπως.

In vivo

, τοπική εισβολή από το PC-1.0 κυττάρων και τοπική επέκταση των κυττάρων PC-1 παρατηρήθηκαν [7].

PC-1.0 και τα κύτταρα PC-1 επωάστηκαν σε RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, ΝΥ, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Bioserum, Canterbury, Βικτώρια, Αυστραλία), 100 U /mL πενικιλλίνη G και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα από 5% CO

2/95% αέρα.

Phospho-πρωτεΐνη προφίλ με Array Phospho Explorer Antibody

λύματα

Κυττάρου που λαμβάνεται από τον υπολογιστή-1 και τα κύτταρα PC-1,0 εφαρμόστηκαν σε ένα Array φωσφο Explorer αντισωμάτων (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Η διάταξη που περιέχεται 1318 αντισώματα. Κάθε ένα από τα αντισώματα έχει δύο επαναλήψεις που εκτυπώνονται επί επικαλυμμένων γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου, μαζί με πολλαπλές θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες. Εν συντομία, κυτταρικά λύματα εκχυλίζονται με συστοιχία αντισωμάτων Assay Kit που περιείχε έναν αναστολέα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης, και διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 25 μg των κυτταρολυμάτων σημάνθηκαν με 3 μΐ βιοτίνης. slides μικροσυστοιχιών Αντίσωμα πρώτα μπλοκαριστεί σε ένα διάλυμα αποκλεισμού για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ξεπλύθηκε με Milli-Q βαθμού νερό, και στέγνωσε με συμπιεσμένο άζωτο. Και στη συνέχεια επωάστηκαν με προϊόντα λύσης κυττάρου με βιοτίνη σημασμένο σε σύζευξη διάλυμα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. slides Array πλύθηκαν τέσσερις φορές με 60 ml διαλύματος πλύσης 1 × και ξεπλύθηκε εκτεταμένα με Milli-Q νερό πριν βαθμού ανίχνευση δεσμευμένων βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας Cy3-συζευγμένη στρεπταβιδίνη. Τα πλακίδια σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή GenePix 4000 και οι εικόνες αναλύθηκαν με GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Μια αλλαγή αναλογία φωσφορυλίωσης υπολογίστηκε με βάση την ακόλουθη εξίσωση όπου η έκφραση του φωσφορυλιωμένου πρωτεΐνες ομαλοποιήθηκε σε αντίστοιχες μη φωσφορυλιωμένη πρωτεϊνική έκφραση σε δύο πειραματικές (PC-1.0) και τα δεδομένα αναφοράς (PC-1). Φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες θεωρήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά όταν μια αύξηση (≥ 2.0) ή μείωση (≤ 0,5) συνέβη σε αναλογία των επιπέδων έκφρασης μεταξύ PC-1.0 και τα κύτταρα PC-1. δεδομένα φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκαν με κηλίδα western.

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού που εγείρεται έναντι επιτόπων της ανθρώπινης Abl1, pAbl1-Tyr204 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), ITGB4 , ITGB4-Tyr1510 (Abcam, Cambridge, MA, USA), myc, pmyc Ser62, Fos, PFOS-THR232, IRS-1, Pirs-1-Ser636, Raf1, pRaf1-Tyr341 και β-ακτίνη (Santa Cruz Biotechnology, Ντάλας , TX, USA) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεύοντα αντισώματα. Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα ή ΡΙΤΟ-επισημασμένο φθορίζοντα αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ, USA) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα για western αποτύπωση. FOS και IRS-1 siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). αναστολέας RAF1 (GW5074) αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX).

κηλίδας Western

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε πάγο χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και του αναστολέα φωσφατάσης για 30 λεπτά. Εν συντομία, τα δείγματα ισοδυνάμου ολικής πρωτεΐνης (20 μg) έτρεξαν σε ένα 5% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Bio-Rad, Anaheim, CA, USA). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα, αραιωμένο σε 0.1% Tween-20 /PBS, όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (αραιωμένο 1: 5000) σε 0.1% Tween-20 /PBS. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη αντιδραστήρια ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Santa Cruz Biotechnology).

In vitro

εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασίες

κύτταρα PC-1,0 επιμολύνθηκαν παροδικά με διαφορετικές siRNAs χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Grand Island, Νέα Υόρκη), ή κατεστάλησαν με τη χρήση αναστολέα RAF1. Για εισβολή δοκιμασίες Transwell, τα επιμολυσμένα κύτταρα (5 × 10

4 κύτταρα /mL) σε μέσο χωρίς ορό προστέθηκαν στα άνω θαλάμους, το οποίο αγοράστηκε από την Costar (φίλτρα μεγέθους πόρων 8 μm, New York, ΝΥ) και επικαλυμμένα με Matrigel (dilution1: 4). Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με RPMI-1640 που περιείχε 10% ορό. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που παραμένουν στα άνω θαλάμους απομακρύνθηκαν, και τα επεμβατικές κυττάρων στον κατώτερο θαλάμους σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη (Sigma-Aldrich), χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες σε θερμοκρασία δωματίου, και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. Για δοκιμασία μετανάστευσης επούλωσης πληγών, τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων για 24 ώρες. Μια πληγή 1 χιλιοστό κλίμακα έγινε κατά μήκος της μονοστιβάδας χρησιμοποιώντας την άκρη μιας πιπέτας 200 μί. Στη συνέχεια, οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε 0, 6 και 12 ώρες με τη χρήση μικροσκοπίου. Τα κύτταρα PC-1,0 διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω ως έλεγχος. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις διπλούν και για τρεις φορές. Για την επιβεβαίωση του επιπέδου των τριών πρωτεϊνών στο knockdown κυττάρων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου και ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές και αντισώματα, αντίστοιχα. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση της FOS και IRS-1 παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Γονιδιακή Οντολογία και του Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) οδός αναλύσεις και Αναζήτηση εργαλείο για την ανάκτηση των Αλληλεπίδραση γονιδίων /Πρωτεΐνες

Για την ανίχνευση σημαντικά εμπλουτισμένη Gene Ontology (GO) όρους, χρησιμοποιήθηκε η Cytoscape plugin BINGO [8,9]? εκφράζονται διαφορικά φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών αυτομάτως συναρμολογούνται σε κατηγορίες βιολογικής διαδικασίας, μοριακή λειτουργία ή κυτταρικό συστατικό. GO ομάδες με ένα διορθωμένο

P

-τιμή & lt? 0.01 σημάνθηκαν για διαφορετικά επίπεδα σημαντικότητας. Μονοπάτι αναλύσεις των διαφορικά εκφρασμένων φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών διεξήχθη χρησιμοποιώντας DAVID (της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και Ολοκλήρωσης Discovery) βιοπληροφορική πόρων (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [10] βιοπληροφορική και σημαντικά αλλάξει μονοπάτια σηματοδότησης επιλέχθηκαν με βάση σε ένα

P

-τιμή & lt? 0.01, και FDR (False Discovery Rate) & lt? 10%. Εμπλουτισμός θα μπορούσε επομένως να μετρηθεί ποσοτικά χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ μία τροποποιημένη Fisher. Χρησιμοποιώντας ένα εργαλείο αναζήτησης για την ανάκτηση των Αλληλεπίδραση γονιδίων /Πρωτεΐνες (STRING) (https://www.string-db.org/) βάση δεδομένων, πήραμε μια αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (ΠΠΑ) του δικτύου [11]. Ένα δίκτυο PPI κατασκευάστηκε όταν ένα σκορ εμπιστοσύνη περισσότερων από 0,9 έδειξαν ότι μόνο οι αλληλεπιδράσεις με ένα υψηλό επίπεδο εμπιστοσύνης θεωρήθηκαν ως έγκυρες συνδέσεις στο δίκτυο ΠΠΑ.

τοπολογική ανάλυση του δικτύου PPI

για την καλύτερη κατανόηση του δικτύου ΠΠΑ, λογισμικό CentiScaPe [12] χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση τοπολογικά χαρακτηριστικά του δικτύου και για τον υπολογισμό της διανομής κόμβο βαθμό, το μέσο μήκος διαδρομής, τοπολογικές συντελεστής και betweenness. Θα μπορούσαμε να αναλύσουμε άμεσα δίκτυα μοριακών αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιώντας ορατό εργαλεία, και απέκτησε ενδιαφέρον βασικές πρωτεΐνες. Επιπλέον, ένας web server GeneMANIA (https://www.genemania.org/) χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη των δικτύων. Ένα τέτοιο εργαλείο web server γίνεται αποτελεσματική προβλέψεις της λειτουργίας των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των συν-έκφραση, φυσικές αλληλεπιδράσεις, μονοπάτια και προέβλεψε δίκτυα, τα οποία βασίζονται σε ήδη αναφερθεί πειραματικά δεδομένα [13]. Στην έκθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε μια επιλέγεται αυτόματα η μέθοδος στάθμισης και χρησιμοποιούνται ανθρώπων ως ένα είδος πηγή για την πρόβλεψη των δικτύων.

Στατιστικά Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση και τα γραφικά έγιναν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Συγκρίσεις των ποσοτικών δεδομένα αναλύθηκαν με Μαθητή

t

τεστ ή ANOVA μεταξύ των δύο ομάδων (δύο-ουρά?

P

-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικά σημαντική).

Αποτελέσματα

διαφορικά εκφράζονται φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών που προσδιορίζονται από PEX100 σε υψηλά (PC-1.0) και ασθενώς (PC-1) επεμβατική και μεταστατικά κύτταρα του παγκρέατος

Για την αναγνώριση διαφορικά εκφρασμένων σηματοδότησης που σχετίζονται με φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες μεταξύ υψηλής (PC-1.0) και ασθενώς (PC-1) επεμβατική και μεταστατικά καρκινικά κύτταρα, συγκρίθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της φωσφο-αντισώματος ειδικές πρωτεΐνες στις δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Από τους 1318 αντισώματα αναλύθηκαν σε πειράματα μικροσυστοιχιών, συνολικά 57 πρωτεΐνες έδειξαν διαφορική έκφραση χρησιμοποιώντας ένα πλάσια αναλογία ≥ 2 ως κριτήριο αποκοπής. Από αυτές τις 57 πρωτεΐνες, τα επίπεδα έκφρασης των 32 πρωτεΐνες σημαντικά αυξημένη σε PC-1.0 σε σύγκριση με το PC-1 κύτταρα (Πίνακας 1 δείχνει τις δέκα πιο αυξητικά πρωτεΐνες). Σε αντίθεση, τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών 25 ήταν σημαντικά μειωμένα σε PC-1.0 σε σύγκριση με το PC-1 κύτταρα (Πίνακας 2 δείχνει τις δέκα πιο ρυθμίζεται προς τα κάτω πρωτεΐνες). Οι αναλογίες που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα έκφρασης σε PC-1.0 κυττάρων σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης σε κύτταρα PC-1. CaMK1-α ήταν υπερ-εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε PC-1.0 κύτταρα ενώ Smad1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω, αποκαλύπτοντας μια χαμηλή ένταση συστοιχίας. Επιπλέον, τέσσερις πρωτεΐνες (ΑΚΤ1, Chk2, ρ53 και p70S6K) με διαφορετικές θέσεις φωσφορυλίωσης βρέθηκαν, όχι μόνο μεταξύ των επάνω ρυθμισμένη, αλλά και μεταξύ των κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτείνες. Οι πραγματικές εικόνες συστοιχία τσιπ φαίνονται στον Πίνακα S2 και η έκφραση όλων των πρωτεϊνών που αναφέρονται στον Πίνακα S3.

Η

Εκκαθάριση των πρωτεϊνών φωσφορυλίωση από κηλίδα western, και διαφορικά πρωτεΐνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην μετανάστευση των κυττάρων, και την εισβολή των PC-1.0 Μεταστατικό

Για να επικυρώσετε τα δεδομένα φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης, τα επίπεδα έκφρασης των έξι τυχαία επιλεγμένων πρωτεϊνών από τις συγκρίσεις των PC-1.0 και PC-1 κύτταρα επανεξεταστεί από western blot (Εικ 1). Western blots απεκάλυψε ότι και οι έξι πρωτεΐνες έδειξαν αυξημένη φωσφορυλίωση σε PC-1.0 κύτταρα συμβατό με δεδομένα array μας, επιβεβαιώνοντας έτσι την αξιοπιστία του τελευταίου. Για να καταλάβουμε λειτουργικές σχέσεις των διαφορικών μεταβολή στη φωσφορυλίωση πρωτεΐνης σε υψηλά μεταστατικά κύτταρα PC-1.0, δοκιμασίες εισβολή και τη μετανάστευση διεξήχθησαν. αναλύσεις κηλίδος Western και σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθησαν για να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα του siRNA ή αναστολέα προς τα κάτω ρύθμιση (όπως φαίνεται στο S3 Πίνακα). Μια ισχυρή αναστολή της μετανάστευσης παρατηρήθηκε για FOS, IRS-1 και RAF1 χρησιμοποιώντας siRNA ή ανασταλτικό αντίσωμα (Σχήμα 2Α), και όσον αφορά την εισβολή, FOS, IRS-1 και RAF1 προκάλεσε επίσης σημαντική μείωση στην ικανότητα εισβολής (Σχήμα 2Β).

Όπως φαίνεται, η συνολική έκφραση της κάθε πρωτεΐνης ήταν ίση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, ενώ στο επίπεδο φωσφορυλίωσης, η έκφραση των έξι πρωτεϊνών ήταν ισχυρότερη σε κύτταρα PC-1,0 από τα κύτταρα PC-1. Οι μοριακοί δείκτες υποδεικνύονται.

Η

(Α) Επίδραση των τριών πρωτεϊνών για τη μετανάστευση μετά τη χρήση siRNA ή το κλείδωμα σε άκρως μεταστατικά κύτταρα PC-1.0 αντισώματος. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες. Το ποσοστό μετανάστευσης υπολογίστηκε και γράφημα. * Σε σύγκριση με το PC-1.0,

P

-τιμή & lt? 0,01. (N = 3) (Β) Ποσοτικοποίηση των Transwell δοκιμασίας για ομάδα υπό αγωγή και την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε τριπλά φρεάτια και σε τρία πανομοιότυπα πειράματα, * Σε σύγκριση με το PC-1,0,

P

-τιμή & lt? 0,01. (N = 3)

Η

Λειτουργική ταξινόμηση, του δικτύου και της οδού ανάλυση

Για να κατανοήσουμε τις παρόμοιες βιολογικές διαδικασίες που σχετίζονται με την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, ερευνήσαμε αυτά και πάλι με τη χρήση του σε απευθείας σύνδεση λειτουργικό εργαλείο σχολιασμού, DAVID, συμπεριλαμβανομένης KEGG τις οδούς ανάλυση. όρος ανάλυση GO έδειξε ότι οι στόχοι εμπλουτίστηκαν σε πολλές διαδικασίες (Πίνακες 3-5), συμπεριλαμβανομένων των φωσφορυλίωσης αμινοξέων και μετα-μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης. αναλύσεις οδός αποκάλυψε, όπως ρυθμίζεται προς τα πάνω τους στόχους εμπλουτίστηκαν σε 27 οδούς KEGG (Σχήμα 3Α), η οποία ήταν απαραίτητη για τον μεταβολισμό (ινσουλίνη μονοπατιού σηματοδότησης και του κυτταρικού κύκλου), την ασυλία (οδός σηματοδότησης των υποδοχέων των Τ κυττάρων) και ανάπτυξη (ErbB μονοπάτι σηματοδότησης). Πρωτεΐνες αποτελούν ένα δίκτυο ΡΡΙ και εμπλέκονται στη μεταβολή και τον έλεγχο κυτταρική εισβολή σε διαφορετικά βιολογικά συστήματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Β και 3C. Σχήμα 4Α και 4D δείχνουν το δίκτυο αλληλεπίδρασης κατασκευάστηκε το STRING μετά την υποβολή ερωτημάτων το 32 up-ρυθμίζονται και 25 κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες που βρίσκονται στο PC-1.0 κύτταρα. Επιπλέον, όταν το σκορ ήταν εμπιστοσύνη & gt? 0.900, CAMK1-α, PIM-1 και ΜΚΚ7 /MAP2K7 είχαν πλέον συμπεριληφθεί σε ένα up-ρύθμιση του δικτύου, καθώς και ΜΑΡΚΑΡΚ2, κυτοκερατίνη 8, GATA1, GRK1, ACC1, PDGFRA και Smad1 σε ένα δίκτυο κάτω-ρυθμίζονται. Markov (MCL) και K-Means αλγόριθμοι σύμπλεγμα στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να αναλύσει περαιτέρω τα δίκτυα PPI. Συγκριτικά, πήραμε μια κατά προσέγγιση συνέπεια της διασποράς, όπου η αποκοπή MCL ήταν 2 και ο αποκοπής K-Mean ήταν 4 και στις δύο up-ρύθμιση (Σχήμα 4Β και 4Γ) και προς τα κάτω-ρυθμίζονται (Σχήμα 4Ε και 4F) δίκτυα PPI. Πρωτεΐνες με λιγότερες ή καθόλου αλληλεπιδράσεις βρέθηκε περισσότερο προς την περιφέρεια του δικτύου. Περαιτέρω πειραματική διερεύνηση απαιτείται από αυτές τις άσχετες πρωτεΐνες, προκειμένου να κατανοήσουν πραγματική λειτουργία τους σε ένα δίκτυο PPI.

KEGG και BioCarta μονοπάτι λειτουργική σχολιασμούς των διαφορικά εκφρασμένων up-ρύθμιση (A, C) και κάτω-ρυθμίζονται (Β ) πρωτεΐνες (

P

-τιμές & lt? 0,01, Benjamin & lt? 0,05). Οι εμπλουτισμό βαθμολογίες που αντιστοιχούν σε κάθε μονοπάτι που παρέχονται από το εργαλείο σχολιασμού DAVID εμφανίζεται ως -log

P

-τιμές. Down-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες που ήταν BioCarta μονοπάτι λειτουργική επισημειώσεις μόνο εμπλουτίστηκαν σε αποπτωτική σηματοδότηση σε απόκριση σε βλάβη του DNA.

Η

(Α) Ένα δίκτυο ΠΠΑ, όπως φαίνεται στην διαδραστική άποψη, που παράγεται από μια βάση δεδομένων STRING να αποκαλύψει λειτουργικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ up-ρυθμιζόμενες πρωτείνες. Κάθε κόμβος αντιπροσωπεύει μια πρωτεΐνη, και το καθένα αντιπροσωπεύει μια άκρη αλληλεπίδραση (

P

-τιμές = 6.06E-12)? (Β) αλγόριθμοι συμπλέγματος MCL Up-ρύθμιση των πρωτεϊνών »προέρχεται χρήση STRING. MCL = 2? (C) αλγόριθμοι συμπλέγματος K-Means Up-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες ». K-Means = 4? κατά προσέγγιση ίδιες συνέπειες με δύο συστάδες? (D) Ένα δίκτυο ΠΠΑ αποκαλύπτει λειτουργικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ ρυθμισμένα προς τα κάτω πρωτεϊνών (

P

-τιμή = 1.47E-6)? (Ε) Down-ρυθμίζονται οι αλγόριθμοι συμπλέγματος proteins’MCL. MCL = 2? (F) Κ-Means αλγόριθμοι συμπλέγματος Down ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες ». K-Means = 4.

Η

Η

Επιπλέον, CentiScaPe λογισμικού, το οποίο υπολογίζει τοπολογικά χαρακτηριστικά του κάθε κόμβου, χρησιμοποιήθηκαν για να αποκτήσουν μια σε βάθος κατανόηση των βιολογικών χαρακτηριστικών του δικτύου ΠΠΑ, αλλά μη συμπεριλαμβανομένων των μη συνδεδεμένων πρωτεϊνών. Το δίκτυο ΡΡΙ πάνω ρύθμιση αποτελούνταν από 26 κόμβους με μέσο μήκος διαδρομής 1,89. βαθμός κόμβου ήταν 6,62 ± 4,18, και betweenness ήταν 22.23 ± 35.72 (Πίνακας 6). Με την ίδια μέθοδο, κάτω ρύθμιση δίκτυο ΠΠΑ μας εμφανίζονται 17 κόμβοι με μέσο μήκος διαδρομής 2,04. βαθμός κόμβου ήταν 3,65 ± 2,47, και betweenness ήταν 16,59 ± 29,58 (Πίνακας 7). Οι πρωτεΐνες με υψηλή αξία ήταν πιο σημαντικό στο δίκτυο και αυτό πρότεινε ένα κεντρικό ρόλο στη διατήρηση λειτουργικότητα και τη συνοχή των μηχανισμών σηματοδότησης. Σε up-ρύθμιση του δικτύου ΠΠΑ μας, πρωτεΐνες hub με υψηλό βαθμό κόμβου και betweenness (& gt? Μέσα) ήταν ΑΚΤ1, CTNNB1, FOS, NFkB-p65, SYK, TP53 και MYC. Από την άλλη πλευρά, το δίκτυο κάτω ρυθμισμένα περιλαμβάνονται BRCA1, LCK, ΑΚΤ1, και ΤΡ53 (Σχήμα 5). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ΑΚΤ1 και TP53 εμφανίζεται την υψηλότερη βαθμολογία για όλους τους υπολογίζεται centralities, προτείνοντας κεντρικό ρυθμιστικό ρόλο της στην επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες και σε ένα δίκτυο κάτω-ρυθμίζονται.

Όλοι οι κόμβοι που έχουν μια τιμή κεντρικότητα μεγαλύτερη ή ίση με το κατώφλι επισημαίνονται με ένα ανοιχτό γκρι χρώμα στην προβολή του δικτύου. (Α) επάνω ρυθμισμένο πρωτεΐνες? (Β) προς τα κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες.

Η

Η

Στη συνέχεια, διαφορικά εκφρασμένων φωσφοπρωτείνες ανέβηκαν πάνω σε ένα εργαλείο GeneMANIA να προβλέψει ένα δίκτυο συν-έκφραση. Ως αποτέλεσμα, 20 γονίδια προστέθηκαν στο δίκτυο (Σχήμα 6, Πίνακας 8). Ένα τέτοιο δίκτυο συν-έκφραση εξηγεί διακριτές διεργασίες βρίσκονται σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Σε γενικές γραμμές, όπως τοπολογικές ιδιότητες του δικτύου μπορεί να βελτιώσει την κατανόηση των βασικών γονιδίων που σχετίζονται με την εισβολή.

Ένα δίκτυο των διαφορικών γονιδίων δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας GeneMANIA. Το αριστερό δίκτυο αντιπροσωπεύει up-ρυθμιζόμενα γονίδια και το δικαίωμα του δικτύου αντιπροσωπεύει κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια. Επιπλέον, υπάρχουν πέντε γονίδια και στα δύο πάνω και κάτω-ρυθμίζονται δίκτυα (TP53, CHEK2, ΑΚΤ1, RPS6KB1, RAF1). Τα γονίδια ερώτημα υποδεικνύεται από τα μαύρα στίγματα και συν-έκφραση υποδεικνύεται με ροζ γραμμές. Γκρι κόμβων δείχνουν προβλέψει γονίδια.

Η

(βάρος ≥ 0,04).

Η

Συζήτηση

Τα τελευταία χρόνια, πολλοί ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει την ενδοσκοπική υπερηχογραφικό πρόστιμο βελόνα αναρρόφησης (EUS-FNA) ως προεγχειρητική διαγνωστική μέθοδος για τη μείωση των περιττών χειρουργικών επεμβάσεων, σε μια προσπάθεια να επιτύχουν υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης [14,15]? Ωστόσο, τα αποτελέσματα υπήρξαν ικανοποιητικά. Πώς να μειώσει εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος παραμένει μια έντονη τομέα της έρευνας και συνεχιζόμενο πρόβλημα. Η φωσφορυλίωση είναι το πιο σημαντικό και εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες (π.χ. πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, τη μεταγωγή σήματος, το μεταβολισμό, την απόπτωση, την κυτταρική σηματοδότηση, μεταγραφικά και μεταφραστικά ρύθμιση) [16-23].

Όπως περιγράφεται στην μας προηγούμενη μελέτη, έχουμε δημιουργήσει δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές από ένα πειραματικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος [5,6]. Μη διαχωρισμένα κύτταρα (PC-1) και διαχωρισμένα κύτταρα (PC-1.0) δείχνουν υψηλή ιστολογική ομοιότητες αλλά διαφέρουν σε επεμβατικές και μεταστατικές ικανότητές τους. Εμείς ορθολογικά ότι η χρήση αυτών των κυτταρικών σειρών θα ελαχιστοποιείται η επίδραση της χρησιμοποιώντας κύτταρα από διαφορετικές προελεύσεις ιστού. Ως εκ τούτου, η ανάλυση των διαφορικά εκφραζόμενων phosphoproteomes σε δύο κυτταρικές σειρές (PC-1.0 και PC-1) είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη μελέτη των μηχανισμών του παγκρέατος καρκίνο εισβολή και τη μετάσταση.

Για την περαιτέρω κατανόηση διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες που παράγονται με διαφορετικές τροποποιήσεις φωσφορυλίωση της ίδιας πρωτεΐνης στις δύο κυτταρικές σειρές (PC-1.0 και PC-1), μια τεχνική array φωσφορυλίωση υψηλής απόδοσης χρησιμοποιήθηκε σε αναλύσεις μας. Η συστοιχία ανιχνεύεται επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών επί συγκεκριμένων υπολειμμάτων αμινοξέος (π.χ. Ser, Thr, Tyr), και υπό την προϋπόθεση ακριβή και αποτελεσματική phosphoproteome προφίλ του κάθε παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή. Μετά την εξόρυξη δεδομένων, έχουμε παρατηρήσει ότι από τις πρωτεΐνες διαφορικής έκφρασης 57 υπογραφή, έξι γονίδια που κωδικοποιούνται 12 πρωτεΐνες, με φωσφορυλίωση που συμβαίνουν σε διαφορετικά σημεία (δηλαδή NFkB-p65, p70S6K, Smad2, Chk2, ρ53 και ΑΚΤ1). Η τοπο-ειδική φωσφορυλίωση πρωτεϊνών κανονικά οδηγεί σε διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες [24]. Αλλά οι ρόλοι των πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης σε ένα μόνο μόριο πρωτεΐνης δεν έχουν σαφώς διαλευκανθεί. Ως εκ τούτου, Guo et al. μεταχειρισμένα nanofluidic πρωτεομική ανοσολογική δοκιμή (NIA) να αναλύσει και να χαρακτηρίσει φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης πολλαπλών διαφορετικών τόπων [25]. Σε σύγκριση με το Guo et al. μελέτη, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση σε Thr72-και Ser124 της ΑΚΤ1 έχουν ένα πιο σημαντικό ρόλο και μπορεί να σχετίζεται στενά με παγκρεατικό εισβολή καρκίνου και μετάσταση.

Σε γενικές γραμμές, οι χημειοκίνες είναι μικρές πρωτεΐνες που παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της η μετανάστευση των διαφορετικών κυττάρων [26]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το 10 πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως χημειοκινών (δηλαδή ITGB4, PLCG2, IRS-1, FOS, CTNNB1, PLCG1, CD227, PKD1, Ρ53 και ACTC1), σύμφωνα με https://www.phosphosite.org [27]. Άλλες εισβολή που σχετίζονται με τους τύπους πρωτεΐνης ήταν μεταγραφικών παραγόντων (MYC, Rb, FOS, CTNNB1, NFkB-p65, Ρ53, BRCA1, GATA1, Smad1 και Smad2) και των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού (λαμίνη Α, κυτοκερατίνης 8 και ACTC1).

Μέσω αναλύσεων KEGG οδού, βρήκαμε ότι οι πρωτεΐνες αυτές διαφορική έκφραση υπήρχε σε δύο κύριες οδούς σηματοδότησης (ErbB και νευροτροφίνης μονοπατιών σηματοδότησης, όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α). Μεταξύ των αλλαγμένη οδού, βρήκαμε PI3K και ΜΑΡΚ ως βασικοί παράγοντες στη διαδικασία της κυτταρικής κινητικότητας. Σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του EGFR μεσολάβηση MEK /ERK σηματοδότηση που επάγεται μονοπάτι κυττάρου εισβολή στα PC-1 κύτταρα, αντίθετα, αναστολέα EGFR AG1478 θα μπορούσε να αναστείλει παραπάνω οδό και τη μείωση των κυττάρων εισβολής στα κύτταρα PC-1.0 [28] . Σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύσαμε υπερφωσφορυλίωση της ErbB3, ErbB4, Raf1, P90RSK, MSK1, MYC και FOS στα κύτταρα PC-1.0 σε σύγκριση με το PC-1 κύτταρα, αλλά δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην Grb2, ΜΕΚ, ERK και ΕΙκ1. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε Raf1 αναστολέα και FOS siRNA να μελετήσει τη σχέση μεταξύ της πρωτεΐνης και την εισβολή. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ο knockdown του FOS ή Raf1 ανέστειλε σημαντικά την μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων PC-1.0. Τα αποτελέσματά μας, δεν παρατηρήθηκαν Grb2 /MEK σηματοδότηση /ERK, ίσως να προκύψουν από μεθοδολογικά περιορισμούς. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι P90RSK ήταν υπερφωσφορυλιωμένη, ωστόσο, Kang et al. ανέφεραν ότι P90RSK2 προωθείται εισβολή και τη μετάσταση των ανθρώπινων κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) [29]. P90RSK μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της παγκρεατικής εισβολή καρκινικών κυττάρων και της μετάστασης.

Η άλλη οδός σηματοδότησης (ΡΙ3Κ /ΑΚΤ) περιλαμβάνει συνήθως στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου [30]. Στα δεδομένα μας, δοκιμάσαμε αρκετά ανάντη ρυθμιστές της PI3K /AKT, όπως VEGFR1 /2/3, ErbB2 /4.3, PDGFRα, ΚΟΑ, EGFR, FLT3, KIT, και IGF-1R. Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών, ErbB3 και ErbB4 είναι ιδιαίτερα φωσφορυλιωμένη, σε αντίθεση, PDGFRα και κιτ είναι μειώθηκαν σημαντικά. Εν τω μεταξύ, παρατηρήσαμε ότι η IRS-1 φωσφορυλίωση στη Ser 636 ήταν σημαντικά αυξημένη, αλλά IGF-1 R δεν άλλαξε. Αξιοσημείωτα, IRS-1 φωσφορυλίωσης μπορεί να ρυθμίζεται αρνητικά από την ενεργοποίηση του p70S6K στο μονοπάτι σηματοδότησης της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTOR [31]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε μια αύξηση στη φωσφορυλίωση p70S6K σε Ser371 και Thr 421, και μείωση κατά Ser 418 φωσφορυλίωση. Ως εκ τούτου, οι μελέτες μας πρότεινε ότι PDGFRα και KIT προς τα κάτω ρύθμιση για τον καρκίνο του παγκρέατος οδηγεί σε μειωμένη φωσφορυλίωση p70S6K σε Ser 418, και αυξημένη φωσφορυλίωση IRS-1 σε Ser 636 μέσω της αυξημένης PI3K /AKT mTOR /p70S6K σηματοδότησης. Υπερφωσφορυλίωση της IRS-1, στη συνέχεια με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης του μονοπατιού PI3K /AKT. Το εύρημα θα μπορούσε να δείξει το μηχανισμό αντίστασης στον καρκίνο του παγκρέατος, ως εκ τούτου, θα πρέπει να θεωρείται κλινικές δοκιμές συνδυασμό με καρκίνο του παγκρέατος.

Εν ολίγοις, προσδιορίζοντας διαφορικά εκφρασμένων phosphoproteomes, όπως αποκάλυψε στη μελέτη μας, θα επισημαίνουν την μηχανισμοί που διέπουν την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος. Στο μέλλον, θα πρέπει να δώσει μεγαλύτερη προσοχή στον εντοπισμό του ενεργοποιημένου phosphoproteome, ιδιαίτερα συγκεκριμένων καταλοίπων αμινοξέων. Στο σύνολό τους, ο εντοπισμός των μη φυσιολογικών πρωτεϊνών φωσφορυλίωση, η οποία σχετίζεται με την εισβολή και μετάσταση, μπορεί να μας επιτρέψει να εντοπιστούν νέα βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Primer αλληλουχίες και του αναστολέα που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία.

Πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη για ανάλυση του επιπέδου της FOS ή IRS-1 mRNA στα knockdown κυτταρικές σειρές. Το επίπεδο των Raf1 νοκ ντάουν επιβεβαιώθηκε με τη χρήση Western blot

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152280.s001

(DOCX)

S2 πίνακα. Η Array φωσφο Explorer αντισωμάτων σαρώθηκε σε ένα σαρωτή GenePix 4000

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152280.s002

(DOCX)

S3 πίνακα. Η έκφραση όλων των πρωτεϊνών του Array Phospho Explorer αντισωμάτων παρουσιάστηκαν

οι συντεταγμένες και οι πρωτεΐνες που αναφέρονται στον πίνακα

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0152280.s003

(XLSX)