Αφηρημένο

Ιστορικό

Periostin, IFN-επαγόμενη διαμεμβρανική πρωτεΐνη 1 (IFITM1) και Απτέρου τύπου MMTV ενσωμάτωση οικογενειακή ιστοσελίδα, 5Β μέλος (Wnt-5β) είχαν προηγουμένως αναγνωριστεί ως η εισβολή προωθείται γονίδια του κεφαλιού και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα τραχήλου (HNSCC) από τη σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ γονέα και ένα εξαιρετικά επεμβατική κλώνο. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι Periostin και IFITM1 προώθησε την εισβολή των κυττάρων HNSCC. Εδώ αποδείξαμε ότι Wnt-5β υπερέκφραση προώθησε την εισβολή των κυττάρων HNSCC. Επιπλέον, στρομελυσίνη-2 (μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας-10? ΜΜΡ-10) αναγνωρίστηκε ως μια κοινή up-ρυθμιζόμενο γονίδιο μεταξύ Periostin, IFITM1 και Wnt-5β κύτταρα που υπερεκφράζουν HNSCC χρησιμοποιώντας σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχίας. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τους ρόλους της MMP-10 κατά την εισβολή των HNSCC.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Εξετάσαμε την έκφραση της MMP-10 σε περιπτώσεις HNSCC με ανοσοϊστοχημεία. Υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 και συχνά παρατηρούμενη συσχετίστηκε σημαντικά με την διεισδυτικότητα και τη μετάσταση σε περιπτώσεις HNSCC. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τους ρόλους της MMP-10 κατά την εισβολή των κυττάρων HNSCC

in vitro

. Έκτοπη υπερέκφραση της ΜΜΡ-10 προώθησε την εισβολή των κυττάρων HNSCC, και knockdown του ΜΜΡ-10 κατέστειλε την εισβολή των κυττάρων HNSCC. Επιπλέον, η ΜΜΡ-10 knockdown κατέστειλε Periostin και Wnt-5β-προωθείται εισβολή. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ΜΜΡ-10 υπερέκφραση προκάλεσε την μειωμένη δραστηριότητα της ρ38 και ΜΜΡ-10 knockdown προκάλεσε την αυξημένη δραστηριότητα της ρ38. Επιπλέον, η θεραπεία με έναν αναστολέα SB203580 ρ38 σε κύτταρα HNSCC ανέστειλε την εισβολή.

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ΜΜΡ-10 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εισβολή και τη μετάσταση των HNSCC, και ότι εισβολή οδηγείται από ΜΜΡ-10 είναι εν μέρει σχετίζεται με την αναστολή ρ38 ΜΑΡΚ. Προτείνουμε ότι η ΜΜΡ-10 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την πρόβλεψη της μετάστασης σε HNSCC

Παράθεση:. Deraz EM, Kudo Υ, Yoshida Μ, Obayashi Μ, Tsunematsu Τ, Tani Η, et al. (2011) MMP-10 /στρομελυσίνη-2 Προωθεί εισβολή του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 6 (10): e25438. doi: 10.1371 /journal.pone.0025438

Επιμέλεια: Torbjorn Ramqvist, Ινστιτούτο Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 24 Γενάρη του 2011? Αποδεκτές: 5 Σεπτέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Οκτ, 2011

Copyright: © 2011 Deraz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Πολιτισμού της Ιαπωνίας επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας (Υ Kudo και Τ Τακάτα) και επιχορήγηση του Ιδρύματος Kurozumi Memorial (Υ Kudo). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κεφαλής και τραχήλου ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (HNSCC) είναι ένας από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο, με ετήσια συχνότητα εμφάνισης πάνω από 500.000 περιπτώσεις παγκοσμίως [1]. Παρά τις προόδους των στρατηγικών θεραπείας, το ποσοστό θνησιμότητας και την αποτυχία των επιλογών θεραπείας σε ασθενείς HNSCC εξακολουθούν να είναι υψηλά. Υψηλή θνησιμότητα και φτωχή πρόγνωση του HNSCC να προβλεφθεί από την εμφάνιση του λεμφαδένα μετάστασης, η οποία είναι ένα κοινό συμβάν σε ασθενείς με καρκίνο [2]. HNSCC αναπτύσσεται μέσω της συσσώρευσης πολλαπλών γενετικών και επιγενετικών μεταβολές σε μια διαδικασία πολλών σταδίων [3]. Οι προσπάθειες για τον εντοπισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στη μετάσταση είναι κομβικής σημασίας για την έγκαιρη πρόβλεψη της συμπεριφοράς HNSCC. Η διαδικασία της μετάστασης αποτελείται από διαδοχικές και επιλεκτικής μέτρα, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διέγερση της αγγειογένεσης, αποκόλληση, κινητικότητα, εισβολή σε κυκλοφορία, η συσσωμάτωση και η επιβίωση στην κυκλοφορία, κύτταρο σύλληψης σε μακρινές τριχοειδείς κλίνες και εξαγγείωση σε παρέγχυμα οργάνων [4], [5] . Η ταυτοποίηση νέων εισβολή και μετάσταση σχετίζονται μόρια στο HNSCC και την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους τα κύτταρα καρκινώματος υφίστανται κατά τα στάδια της εισβολής και της μετάστασης είναι θεμελιώδους σημασίας για καλύτερο σχεδιασμό θεραπευτικών στρατηγικών για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας.

οι μικροσυστοιχίες γονιδιακή έκφραση έχουν προκύψει και την ευρεία χρήση τους έχει οδηγήσει στην ταυτοποίηση των πιθανών υποψήφιων γονιδίων. Περαιτέρω έρευνα των βιολογικών συμπεριφορών και σημαντική κλινική έκβαση αυτών των γονιδίων ιδιαίτερα σε HNSCC έχει μεγάλο ενδιαφέρον. Έχουμε ήδη δημιουργήσει μια κυτταρική γραμμή HNSCC, MSCC-1, από μετάσταση στους λεμφαδένες [6]. Επιπλέον, απομονώσαμε ένα ιδιαίτερα επεμβατική κλώνο MSCC-INV1 από MSCC-1 κύτταρα με τη χρήση ενός

in vitro

συσκευή δοκιμασίας εισβολή [7]. Στη συνέχεια, συγκρίναμε την μεταγραφικό προφίλ των μητρικών κυττάρων (MSCC-1) και ένα εξαιρετικά επεμβατική κλώνος (MSCC-INV1) με ανάλυση μικροσυστοιχιών για τον εντοπισμό γονιδίων τα οποία διαφέρουν στην έκφραση τους [8]. Αρκετά γονίδια επιλεκτικά υπερεκφράζεται σε εξαιρετικά επεμβατική κλώνο. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, Periostin (οστεοβλαστών-ειδικό παράγοντα 2 (φασικλίνη Ι αρέσει)) ήταν το πιο υψηλά εκφραζόμενο γονίδιο και το δεύτερο ήταν IFITM1 (ΙΡΝ-επαγόμενη διαμεμβρανική πρωτεΐνη 1). Στην πραγματικότητα, έχουμε αποδείξει ότι Periostin και IFITM1 προωθείται εισβολή και

in vitro

και

in vivo

[8], [9]. Εντοπίσαμε επίσης Απτέρου τύπου MMTV οικογενειακή ιστοσελίδα ολοκλήρωσης, μέλος 5Β (Wnt-5β) ως το τρίτο υψηλής έκφρασης γονιδίων σε MSCC-INV1. Εδώ, επιβεβαιώσαμε την ικανότητα του Wnt-5β να προωθήσει την εισβολή των κυττάρων HNSCC

in vitro.

Επιπλέον, προσδιορίσαμε μεταλλοπρωτεϊνάσης-10 (ΜΜΡ-10) ως κοινή απορυθμίζεται γονίδιο από μόρια προωθώντας εισβολή συμπεριλαμβανομένων Periostin , IFITM1 και Wnt-5β. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) αντιπροσωπεύουν μια οικογένεια εξαρτώμενων από ψευδάργυρο πρωτεϊνάσες οι οποίες είναι σε θέση να αποδομούν τα συστατικά ECM όπως κολλαγόνα και πρωτεογλυκάνες και έχουν ένα ρόλο στην κανονική ανάπτυξη και βλάβης ιστού σε διάφορες παθοφυσιολογικές καταστάσεις που περιλαμβάνουν την αρθρίτιδα, την επούλωση πληγών και την ανάπτυξη του όγκου [10 ]. MMPs μπορούν να ταξινομηθούν σε υποομάδες, συμπεριλαμβανομένων? κολλαγενάσες, στρομελυσίνες, ζελατινάσες, και ΜΜΡ τύπου μεμβράνης [11]. Ορισμένα μέλη της ΜΜΡ εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετάσταση σε HNSCC όπως ΜΜΡ-2, μεμβράνη τύπου-1 ΜΜΡ (ΜΤ1-ΜΜΡ), και ΜΜΡ-9 [12], [13]. Η υπερέκφραση αυτών των MMPs έχει συσχετιστεί με την εισβολή, μετάσταση, και φτωχή πρόγνωση. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τους ρόλους της MMP-10 κατά την εισβολή των HNSCC.

Αποτελέσματα

Wnt-5β προωθεί την εισβολή των HNSCC

Wnt-5β είναι ένα μέλος της οικογένειας γονιδίων Wnt, μια ομάδα που εκκρίνεται γλυκοπρωτεϊνών που παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και σε αρκετές αναπτυξιακές διεργασίες και ενεργοποιεί ενδοκυτταρικές αποκρίσεις μέσω διαφόρων οδών σηματοδότησης. Με τη σύγκριση του μεταγραφικού προφίλ των μητρικών κυττάρων και την ιδιαίτερα επεμβατική κλώνου με ανάλυση μικροσυστοιχιών, Wnt-5β ήταν η τρίτη εντόνως εκφρασμένο γονίδιο στο εξαιρετικά επεμβατική κλώνο μετά Periostin και IFITM1. Εξετάσαμε πρώτα εάν Wnt-5β συμμετείχε στην εισβολή των HNSCC. Η υψηλότερη έκφραση Wnt-5β στην ιδιαίτερα επεμβατική κλώνο σε σύγκριση με τα πατρικά κύτταρα επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (Σχήμα 1Α). Εξετάσαμε την έκφραση του mRNA Wnt-5β σε έξι HNSCC κυτταρικές σειρές. mRNA έκφραση Wnt-5β σημειώθηκε σε όλα σχεδόν τα HNSCC κυτταρικές σειρές εκτός HSC4 κυττάρων (Εικόνα 1Α). Να διευκρινιστεί ο ρόλος του Wnt-5β στην εισβολής των HNSCC, δημιουργήσαμε το Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν με επιμόλυνση του Wnt-5β σε κύτταρα HSC4 χωρίς έκφραση Wnt-5β. Μετά από να πάρει το σταθερό κλώνο του Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν (Εικόνα 1Β), είχαν χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της εισβολής από

vitro δοκιμασία εισβολής στην

. Wnt-5β υπερέκφραση ενισχύεται σημαντικά η εισβολή των κυττάρων HNSCC

in vitro

(Σχήμα 1Β). Για να επιβεβαιωθεί η Wnt-5β-προωθείται εισβολή των κυττάρων HNSCC, εξετάσαμε την knockdown του Wnt-5b χρησιμοποιώντας siRNA σε κύτταρα HSC2 με υψηλή έκφραση του Wnt-5β. Θεραπεία της Wnt-5β siRNA μείωσε την έκφραση του mRNA Wnt-5β και ανέστειλε σημαντικά την εισβολή (Σχήμα 1Β). Αν και Wnt-5β δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχήμα 1C), προώθησε σημαντικά την κυτταρική κινητικότητα των κυττάρων HNSCC όπως καταδεικνύεται με προσδιορισμό επούλωσης πληγών (Εικόνα 1D). Είναι ενδιαφέρον ότι, Wnt-5β siRNA ανέστειλαν σημαντικά την κυτταρική κινητικότητα των κυττάρων HNSCC (Εικόνα 1D). Επιπλέον, σε σύγκριση με το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ ελέγχου και Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4 με ανάλυση μικροσυστοιχιών (Data S1). S100A8, SERPINB4, οστεοποντίνη και SERPINB3 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και TGF-β2, CDH11 και θρομβοσπονδίνη 1 ήταν προς τα κάτω σε Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν (Πίνακας S1).

Α,

Έκφραση Wnt- 5β στα ιδιαίτερα επεμβατική κλώνο και κυτταρικές HNSCC γραμμές. Η έκφραση του mRNA Wnt-5β MSCC-1, MSCC-INV1 καθώς και κυτταρικές σειρές έξι HNSCC? HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ηο-1-Ν-1, και ΗΟ-1-U-1 εξετάστηκε με RT-PCR. Έκφραση του mRNA Wnt-5a εξετάστηκε επίσης σε κυτταρικές σειρές 6 HNSCC. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Β,

Wnt-5β προώθησε την εισβολή των κυττάρων HNSCC. Για την παραγωγή του Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν, φορέας έκφρασης Wnt-5β επιμολύνθηκε σε κύτταρα HSC4 χωρίς έκφραση Wnt-5β. Έχουμε λάβει το σταθερός κλώνος και η έκφραση Wnt-5β εξετάστηκε με στύπωση Western με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-Wnt-5β (αριστερό άνω πάνελ). Χρησιμοποιήσαμε άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (άδειο) ως μάρτυρα. έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η εισβολής του Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν (δεξιά επάνω πάνελ) εξετάστηκε με

in vitro

δοκιμασία εισβολής. 1,5 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν στο επάνω διαμέρισμα του ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας. Μετά από 12 ώρες επώασης, τα κύτταρα διείσδυσαν πάνω στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. κύτταρα HSC2 με την έκφραση Wnt-5β ήταν επιμολυσμένα με Wnt-5β siRNA (siWnt-5β) ή τον έλεγχο siRNA (siControl). Μια κωδικοποιημένα αλληλουχία η οποία δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία προς αρουραίου, ποντικού ή αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδίου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η επίδραση της knockdown αξιολογήθηκε με RT-PCR (αριστερά κάτω πίνακας). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η εισβολής των κυττάρων Wnt-5β-νοκ-κάτω εξετάστηκε από

in vitro

δοκιμασία εισβολή (κάτω δεξιά πλευρά). Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα διείσδυσαν πάνω στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετικό από κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ή στον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε

P

& lt? 0,01.

C,

κυτταρικό πολλαπλασιασμό των Wnt-5β-υπερεκφράζουν κύτταρα και κύτταρα Wnt-5β-νοκ-κάτω. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και επεξεργασία με θρυψίνη κύτταρα μετρήθηκαν με μετρητή κυττάρων σε 0, 2, 4 και 6 την ημέρα. Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

D,

Μετανάστευσης της Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν και Wnt-5β-νοκ-κάτω κυττάρων. Η μετανάστευση των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία τραύματος επούλωση. Στις 24 ώρες μετά το ξύσιμο των κυττάρων, εικόνες αντίθεσης φάσης (10 χ πεδίο) της διαδικασίας επούλωσης του τραύματος φωτογραφήθηκαν ψηφιακά με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Η απόσταση από τις περιοχές τραύματος μετρήθηκαν στις εικόνες, ορίζεται σε 100% για 0 ​​ώρες, και το μέσο ποσοστό των συνολικών αποστάσεις των περιοχών του τραύματος υπολογίστηκε. Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική από κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ή τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε

P

& lt?. 0.01

Η

MMP-10 έχει χαρακτηριστεί ως ένα κοινό γονίδιο στόχο για Periostin, IFITM1 και Wnt 5β υπερέκφραση

για την αναγνώριση των γονιδίων κοινό στόχο για Periostin, IFITM1 και Wnt-5β υπερέκφραση, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των κυττάρων ελέγχου HSC2 και Periostin-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC2, τον έλεγχο Ca9-22 κύτταρα και IFITM1- κύτταρα που υπερεκφράζουν Ca9-22 και κύτταρα HSC4 ελέγχου και Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4 (Σχήμα 2Α). Ως αποτέλεσμα, αρκετές ομάδες γονιδίων με μεταβλητές βιολογικές λειτουργίες στην κανονική ανάπτυξη και κατά τη διαδικασία της κακοήθειας βρέθηκαν να είναι κοινή σε Periostin, IFITM1 και κύτταρα Wnt-5β-υπερεκφράζουν (Σχήμα 2Β). Εντοπίστηκαν μια σειρά κοινών γονιδίων-στόχων με μεταβλητή βιολογικές συμπεριφορές συμπεριλαμβανομένων προσκόλλησης κυττάρου, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, κυτταρικό κύκλο και άλλα. ανάλυση Gene οντολογία έγινε με τη χρήση του λογισμικού Gene Spring GX να προσδιορίσει τις βιολογικές λειτουργίες αυτών των μορίων (Σχήμα 2Β). Οι κοινές up-ρυθμιζόμενα γονίδια μεταξύ Periostin- και IFITM1-υπερέκφραση, Periostin- και Wnt-5β-υπερέκφραση και IFITM1- και Wnt-5β-υπερέκφραση παρατίθενται στον Πίνακα S2, S3 και S4, αντίστοιχα. Αρκετά γονίδια του εξαιρετικά ρυθμίζεται προς τα πάνω μεταξύ Periostin-, IFITM1- και Wnt-5β-υπερεκφράζουν HNSCC κύτταρα (Πίνακας S5). Μεταξύ αυτών, στρομελυσίνη-2 (ΜΜΡ-10) είχε συμπεριληφθεί. MMPs είναι γνωστά ως οικογένεια εξαρτώμενη από ψευδάργυρο πρωτεϊνάσες οι οποίες είναι σε θέση να αποδομούν τα συστατικά ECM και έχουν ένα ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [10]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη συμμετοχή των ΜΜΡ-10 κατά την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στην MMP-10 ως κοινή απορυθμίζεται μόριο που προκαλείται από σχετικές εισβολή παράγοντες HNSCC και εξέτασε το ρόλο της στην εισβολή των HNSCC.

Α,

Schema παρουσιάζει τη στρατηγική για τον εντοπισμό ο κοινός στόχος των μορίων που σχετίζονται με την εισβολή. Periostin, IFITM1, και Wnt-5β ταυτοποιούνται ως τα μόρια που συνδέονται με εισβολή με σύγκριση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ της μητρικής (κύτταρα MSCC-1) και ένα εξαιρετικά επεμβατική κλώνου (κύτταρα MSCC-INV1). Για τον προσδιορισμό των κοινών στόχων των μορίων που σχετίζονται με την εισβολή, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του ελέγχου έναντι Periostin-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC2, ελέγχου έναντι IFITM1-κύτταρα που υπερεκφράζουν Ca9-22, και τον έλεγχο έναντι Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4. Η έκτοπη επίπεδο έκφρασης του Periostin, IFITM1 και Wnt-5β σε κάθε κύτταρα δείχνονται με RT-PCR. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Β,

Αρκετές ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια βρέθηκαν μεταξύ Periostin και IFITM1, Periostin και Wnt-5β, και Wnt-5β και IFITM1. Με τη χρήση του λογισμικού Gene Ontology, εντοπίσαμε τις βιολογικές λειτουργίες αυτών των γονιδίων. Ο πίνακας δείχνει τα κοινά αυτά ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια που περιλαμβάνουν διαφορετικές οικογένειες με μεταβλητή βιολογικές λειτουργίες.

Η

Υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 συσχετίζεται καλά με τα πρότυπα εισβολή και τη μετάσταση σε HNSCC

Θα εξεταστεί πρώτα η έκφραση της ΜΜΡ-10 σε 30 κανονικά από το στόμα βλεννογόνους ιστούς και 116 περιπτώσεις HNSCC με ανοσοϊστοχημεία. Κλινικές πληροφορίες των 116 ασθενών, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, την τοποθεσία, το μέγεθος του όγκου, πρότυπο εισβολή, μετάσταση, το στάδιο του όγκου, την ταξινόμηση ΤΝΜ, θεραπεία, επιβίωση και MMP-10 έκφρασης παρουσιάζεται στο Data S2. Για να αποδειχθεί η ειδικότητα των αντισωμάτων του ανοσοϊστοχημική χρώση της ΜΜΡ-10, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση χωρίς δευτερογενή αντίσωμα ή χωρίς πρωτογενές αντίσωμα ως αρνητικός έλεγχος (Σχήμα S1). Υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 παρατηρήθηκε σε 89 από 116 (76,7%) περιπτώσεις HNSCC, ενώ μη νεοπλασματικά επιθήλιο δεν έδειξε ΜΜΡ-10 έκφρασης (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, συγκρίναμε την ΜΜΡ-10 έκφρασης με μοτίβο εισβολή, στάδιο ομαδοποίηση και λεμφαδένα μετάσταση (Πίνακας 1). Χρησιμοποιήσαμε την κατάταξη του Jacobsson του (Patterns Ι-IV) για την αξιολόγηση του σχεδίου εισβολής (Εικόνα S2) [14]. Από 116 περιπτώσεις HNSCC, 9, 12, 62, και 33 περιπτώσεις έδειξε το πρότυπο I, II, III, και IV, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον ότι η συχνότητα εμφάνισης της ΜΜΡ-10 θετικές περιπτώσεις στο μοτίβο III και IV ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στο πρότυπο Ι και II (Σχήμα 3Β). Είναι γνωστό ότι τα πρότυπα III και IV που αντιστοιχούν στην κακή διαφοροποίηση και υψηλού μεταστατικού ποσοστό [14]. Η συσχέτιση μεταξύ ΜΜΡ-10 έκφρασης και πρότυπο εισβολή ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0.001) (Πίνακας 1). Έχουμε, επίσης, σε σύγκριση με την έκφραση της ΜΜΡ-10 με την ομάδα στάσης. Σαράντα-εννέα περιπτώσεις HNSCC ήταν διαθέσιμα για το στάδιο ομαδοποίησης (Ι-IV) σύμφωνα με τα κριτήρια της Ιαπωνικής Εταιρείας για καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [15]. Οι περισσότερες περιπτώσεις (97,1%) έδειξε υψηλή έκφραση του ΜΜΡ-10 σε προχωρημένο στάδιο ομάδα (III και IV), ενώ το 46,7% των περιπτώσεων έδειξαν υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 στην ομάδα πρώιμο στάδιο (Ι και II). Η συσχέτιση μεταξύ ΜΜΡ-10 έκφρασης και το στάδιο ομαδοποίηση ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ & lt? 0.001) (Πίνακας 1). Επιπλέον, η ΜΜΡ-10 έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με λεμφαδένα μετάσταση (Ρ & lt? 0.001) (Πίνακας 1 και Σχήμα 3Β). Είκοσι εννέα από 89 περιπτώσεις HNSCC με υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 είχαν λέμφου μετάσταση στους λεμφαδένες, ενώ 5 από 27 περιπτώσεις HNSCC με χαμηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 είχαν λεμφαδένα μετάσταση (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ΜΜΡ-10 και της επιβίωσης σε περιπτώσεις HNSCC. Σαράντα δύο περιπτώσεις HNSCC ήταν διαθέσιμα για ανάλυση επιβίωσης. Είναι ενδιαφέρον, αν και δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική (

P

= 0.21), οι ασθενείς με υψηλή έκφραση των MMP-10 έτειναν να παρουσιάζουν κακή πρόγνωση (Σχήμα 3C).

Α,

Ανοσοϊστοχημική έκφραση του ΜΜΡ-10 σε 116 περιπτώσεις HNSCC και 30 κανονικές επιθήλια. Κανονική επιθήλιο είναι εντελώς αρνητικό για ΜΜΡ-10 σε σύγκριση με τις περιπτώσεις στις οποίες HNSCC πλέον καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν εξαιρετικά έκφραση της ΜΜΡ-10. Αντιπροσωπευτικά περίπτωση χαμηλής ΜΜΡ-10 έκφραση σε κανονικά από το στόμα επιθήλιο και περίπτωση HNSCC (Jacobsson του κατάταξη Pattern Ι), και αντιπροσωπευτικές περιπτώσεις υψηλή έκφραση του ΜΜΡ-10 (χαμηλή και υψηλή μεγέθυνση) στις περιπτώσεις HNSCC (Jacobsson του κατάταξη Pattern IV) δείχνονται. μπαρ κλίμακα εμφανίζεται σε κάθε εικόνα.

Β,

Συσχέτιση μεταξύ ΜΜΡ-10 έκφρασης και την εισβολή και τη μετάσταση σε περιπτώσεις HNSCC. Αριστερό γράφημα δείχνει τη σχέση μεταξύ ΜΜΡ-10 έκφρασης και μοτίβο της εισβολής. ταξινόμηση του Jacobsson του (Patterns I-IV) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του σχεδίου εισβολής (Σχήμα S1) [14]. * Σημαντικά διαφορετική από μοτίβο Ι ή ΙΙ σε

P

& lt? 0,01. Δεξιό γράφημα παρουσιάζει την σχέση μεταξύ ΜΜΡ-10 έκφρασης και μετάσταση. * Σημαντικά διαφορετική από χαμηλή έκφραση της MMP-10 στο

P

& lt? 0,01.

C,

MMP-10 έκφρασης και κακή έκβαση. Σαράντα δύο ιταλικές περιπτώσεις HNSCC ήταν διαθέσιμα για ανάλυση επιβίωσης. Καμπύλες Kaplan-Meier δείχνουν επιβίωση των ασθενών με HNSCC υψηλή έκφραση του ΜΜΡ-10 (•, Ν = 34) ή χαμηλή έκφραση του ΜΜΡ-10 (▴, Ν = 8).

Η

MMP-10 προάγει την εισβολή του HNSCC

στη συνέχεια εξετάσαμε ΜΜΡ-10 mRNA και πρωτεΐνης σε 6 κυτταρικές γραμμές HNSCC με RT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. Υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 mRNA και η πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε Ca9-22, Ho-1-U-1 και ΗΟ-1-Ν-1 κύτταρα (Σχήμα 4Α). Σε κύτταρα HSC2, HSC3 και HSC4, ΜΜΡ-10 έκφραση ήταν χαμηλή (Σχήμα 4Α). έκφραση της πρωτεΐνης ΜΜΡ-10 αντιστοιχούσε στο επίπεδο έκφρασης του mRNA. Για να διερευνηθεί αν η ΜΜΡ-10 προάγει την εισβολή του HNSCC

in vitro

, δημιουργήσαμε ΜΜΡ-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν με τη χρήση κυττάρων HSC2 και HSC3 με χαμηλή έκφραση της ΜΜΡ-10 (Σχήμα 4Β). Επιβεβαιώσαμε την υψηλότερη δραστικότητα του ΜΜΡ-10 σε ρυθμισμένα μέσα από ΜΜΡ-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν με στρομελυσίνη ζυμογραφία (Σχήμα 4Β). Αν και ΜΜΡ-10 υπερέκφραση δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ενίσχυσε δραματικά την επεμβατική δραστηριότητα και στα δύο κύτταρα HSC2 και HSC3 (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 4C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ΜΜΡ-10-διαμεσολαβούμενη εισβολή των κυττάρων HNSCC, εξετάσαμε την knockdown του ΜΜΡ-10 με τη χρήση siRNA σε Ca-9-22 και ΗΟ-1-Ν-1 κύτταρα με υψηλή έκφραση της ΜΜΡ-10. Για ΜΜΡ-10 knockdown, χρησιμοποιήσαμε 3 διαφορετικά siRNAs (# 1, # 2 και # 3). Όλα τα siRNAs συμπεριλαμβανομένων κοκτέιλ από 3 siRNAs μειώνεται ΜΜΡ-10 έκφρασης (Σχήμα S3). Χρησιμοποιήσαμε κοκτέιλ από 3 siRNAs στα ακόλουθα μελέτες. MMP-10 knockdown ανέστειλε την έκφραση της ΜΜΡ-10 mRNA και πρωτεΐνης σε Ca9-22 και Ho-1-Ν-1 κύτταρα (Σχήμα 4D). MMP-10 knockdown κατέστειλε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων HNSCC (Σχήμα 4Ε). Λαμβανόμενα όλα μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ΜΜΡ-10 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εισβολή των κυττάρων HNSCC.

Α,

Έκφραση ΜΜΡ-10 mRNA και πρωτεΐνης σε έξι κυτταρικές γραμμές HNSCC. Η έκφραση του ΜΜΡ-10 mRNA σε HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ηο-1-Ν-1, και ΗΟ-1-U-1 εξετάστηκε με RT-PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ΜΜΡ-10 αξιολογήθηκε σε έξι HNSCC κυτταρικές σειρές με ανάλυση στυπώματος Western. Οι εικόνες των βραχείας και μακράς έκθεσης της πρωτεϊνικής έκφρασης ΜΜΡ-10 φαίνεται στην εικόνα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Β,

γενιά των MMP-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν. Έχουμε λάβει αρκετοί κλώνοι με επιμόλυνση με pBICEP-FLAG-tagged ΜΜΡ-10 σε κύτταρα HSC2 και HSC3. Η έκτοπη έκφραση της ΜΜΡ-10 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ (αριστερό πάνελ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ενζυματική δραστικότητα της ΜΜΡ-10 ανιχνεύθηκε με ζυμογραφία στρομελυσίνη (δεξί πάνελ). Δραστική μορφή της ΜΜΡ-10 (κεφαλή βέλους) ανιχνεύθηκε σε ρυθμισμένα μέσα από ΜΜΡ-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν.

C,

Επεμβατική δραστηριότητα των MMP-10-υπερεκφράζουν HSC2 (αριστερό πάνελ) και HSC3 (δεξιά πλευρά) κύτταρα σε σύγκριση με άδειο φορέα επιμολυσμένα HSC2 και HSC3 κύτταρα (άδειο) από

in vitro

δοκιμασία εισβολής. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν μετά από επώαση 12 h ή 20 h σε κύτταρα ή κύτταρα HSC2 HSC3, αντίστοιχα. Το σχήμα δείχνει την χρώση κάτω πλευρά της μεμβράνης όπου τα κύτταρα διείσδυσαν (άνω πάνελ). Τα γραφήματα δείχνουν τον αριθμό των κυττάρων σε εισέβαλαν ΜΜΡ-10 που υπερεκφράζουν και κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (κάτω πίνακας). Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική από κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα σε

P

& lt? 0,01.

D,

MMP-10 siRNA κατέστειλε την εισβολή των κυττάρων HNSCC. Κοκτέιλ 3 διαφορετικών ΜΜΡ-10 siRNAs διαμολύνθηκε παροδικά σε Ca-9-22 και ΗΟ-1-Ν-1 κύτταρα με ΜΜΡ-10 έκφρασης. Μια κωδικοποιημένα αλληλουχία η οποία δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία προς αρουραίου, ποντικού ή αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδίου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από 48 h επιμόλυνσης, η έκφραση της ΜΜΡ-10 mRNA και η πρωτεΐνη εξετάστηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western (WB), αντίστοιχα. GAPDH mRNA και β-ακτίνης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Διεξήχθη πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης ΜΜΡ-10. MMP-10 /αναλογία GAPDH εμφανίζεται.

E,

καταστολή της εισβολής ΜΜΡ-10 knockdown σε Ca9-22 και Ho-1-Ν-1 κύτταρα. Η εισβολής της MMP-10 κύτταρα νοκ-κάτω εξετάστηκε από

vitro δοκιμασία εισβολής στην

σε σύγκριση με siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. Μια κωδικοποιημένα αλληλουχία η οποία δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία προς αρουραίου, ποντικού ή αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδίου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετρήθηκε. Το σχήμα δείχνει την χρώση κάτω πλευρά της μεμβράνης όπου τα κύτταρα διείσδυσαν (αριστερό πλαίσιο). Το γράφημα δείχνει τον αριθμό των εισέβαλε κύτταρα (δεξιά πλευρά). Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική από siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα σε

P

& lt?. 0.01

Η

MMP10 νοκ ντάουν καταστέλλει την Periostin και Wnt-5β-προωθείται εισβολή των κυττάρων HNSCC

ευρήματα της μελέτης μας έδειξαν ότι η ΜΜΡ-10 είναι ένα κοινό απορυθμίζεται γονίδιο μεταξύ Periostin, IFITM1 και Wnt-5β υπερέκφραση. Συγκρίναμε την έκφραση της ΜΜΡ-10 σε Periostin, IFITM1, και Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν με ότι στα κύτταρα ελέγχου. ΜΜΡ-10 βρέθηκε να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένη με Periostin ή Wnt-5β (Σχήμα 5Α), αλλά όχι από IFITM1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην ανάλυση μικροσυστοιχιών μας, παρατηρήθηκε 17,4 φορές αύξηση της ΜΜΡ-10 έκφραση σε Periostin-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC2 και 5,8 φορές αύξηση της ΜΜΡ-10 έκφραση παρατηρήθηκε σε Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4. Επομένως, εξετάσαμε τον πιθανό ρόλο των ΜΜΡ-10 στην Periostin και Wnt-5β-προωθείται εισβολή σε HNSCC. Εξετάσαμε την επίδραση της ΜΜΡ-10 knockdown για την εισβολή σε Periostin υπερεκφράζουν Ca9-22 κύτταρα και σε Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4. Η έκφραση του ΜΜΡ-10 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά ΜΜΡ-10 knockdown σε Periostin- και Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν (Σχήμα 5Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ΜΜΡ-10 knockdown κατέστειλε σημαντικά την Periostin- και Wnt-5β-προωθείται εισβολή (Σχήμα 5C), δεικνύοντας ότι η ΜΜΡ-10 μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ικανότητα εισβολής οδηγείται από Periostin- και Wnt-5β-υπερέκφραση σε HNSCC. Εξετάσαμε, επίσης, MMP-10 νοκ ντάουν στον Periostin-overxpressiong κύτταρα HSC2 (Σχήμα S4). Σε παρόμοιο με Periostin-overxpressiong κύτταρα Ca9-22, MMP-10 siRNA κατέστειλε τις επεμβατικές ικανοτήτων Periostin-overxpressiong κύτταρα HSC2. Επιπλέον, MMP-10 νοκ ντάουν ανέστειλε σημαντικά την εισβολή στον έλεγχο Ca9-22 κύτταρα, ενώ η MMP-10 νοκ ντάουν ανέστειλε ελαφρώς την εισβολή στο HSC2 ελέγχου και κύτταρα HSC4 (Σχήμα 5C και Σχήμα S4). Σε κύτταρα Ca9-22, παρατηρήθηκε υψηλό επίπεδο ΜΜΡ-10 έκφραση, αλλά όχι σε κύτταρα HSC2 και HSC4 (Σχήμα 4Α). Καθώς τα κύτταρα Ca9-22 έδειξαν ενδογενή έκφραση της ΜΜΡ-10 σε υψηλότερα επίπεδα, σκεφτήκαμε ότι η ΜΜΡ-10 siRNA κατέστειλε επεμβατική ικανότητες μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της ενδογενούς έκφρασης ΜΜΡ-10 στα κύτταρα Ca9-22. Το επίπεδο της καταστολής, από ΜΜΡ-10 knockdown ήταν πιθανότατα εξαρτάται από το επίπεδο έκφρασης της ΜΜΡ-10.

Α,

Η έκφραση του mRNA MMP10 εξετάστηκε με RT-PCR σε CA9 έλεγχο -22 κύτταρα, Periostin-κύτταρα που υπερεκφράζουν Ca9-22, τα κύτταρα HSC4 ελέγχου και Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Β,

κύτταρα Wnt-5β-υπερεκφράζουν MMP-10 νοκ ντάουν σε Periostin- και. Κοκτέιλ 3 διαφορετικών ΜΜΡ-10 siRNAs διαμολύνθηκε παροδικά σε Periostin υπερεκφράζουν Ca-9-22 κύτταρα και Wnt-5β-κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC4. Μια κωδικοποιημένα αλληλουχία η οποία δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία προς αρουραίου, ποντικού ή αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδίου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από 48 h επιμόλυνσης, επίπεδο πρωτεΐνης ΜΜΡ-10 εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western με αντι-ΜΜΡ-10 αντίσωμα σε ΜΜΡ-10 siRNA επιμολυσμένα Periostin-κύτταρα που υπερεκφράζουν. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

C,

The εισβολής των MMP-10 siRNA επιμολυσμένα Periostin-υπερεκφράζουν Ca-9-22 κυττάρων (αριστερό πάνελ) και-5β-υπερεκφράζουν Wnt κύτταρα HSC4 (δεξί πάνελ) εξετάστηκε με

in vitro

δοκιμασία εισβολής. Μετά από 18 ώρες επώαση κυττάρων HSC4 και 24 h επώαση των κυττάρων Ca9-22, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετρήθηκε. Το σχήμα δείχνει την χρώση κάτω πλευρά της μεμβράνης όπου τα κύτταρα διείσδυσαν (άνω πάνελ). Διαγράμματα δείχνουν τον αριθμό των κυττάρων σε εισέβαλαν knockdown και κύτταρα ελέγχου (κάτω πίνακας). Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική από έλεγχο σε

P

& lt?. 0.01

Η

MMP-10-προωθείται εισβολή σχετίζεται με την αναστολή της p38

Για να γνωρίζουμε το μηχανισμό της MMP-10 προωθείται εισβολή, παρατηρήσαμε τη δραστηριότητα του κυττάρου σηματοδότησης μορίων όπως η ρ38, ΡΑΚ, RSK, Akt, Src, ERK και με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα φωσφορυλίωσης στον έλεγχο και ΜΜΡ-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν. Από αυτά τα μόρια, ρ38 αδρανοποιήθηκε με ΜΜΡ-10 υπερέκφραση (Σχήμα 6Α). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η εμπλοκή της αναστολής ρ38 σε ΜΜΡ-10-προωθείται εισβολή, την επεμβατική ικανότητα ελέγχου και ΜΜΡ-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν μετά τη θεραπεία με αναστολέα της ρ38, εξετάσθηκε SB203580. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία SB203580 προώθησε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων ελέγχου με δραστικότητα ρ38 (Σχήμα 6Β). Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία SB203580 δεν προωθούν την εισβολή σε ΜΜΡ-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν χωρίς δράση της ρ38. Επιπλέον, εξετάσαμε αν ένας αναστολέας ρ38 διασωθεί το μπλοκ της εισβολής που προκαλείται από MMP10 knockdown στο ΜΜΡ-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC2 και HSC3. MMP-10 νοκ ντάουν στην MMP-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν προώθησε την επεμβατική ικανότητα μετά τη θεραπεία με αναστολέα της p38 (Σχήμα S5). Ωστόσο, ο αναστολέας ρ38 δεν διασώθηκε πλήρως την επεμβατική ικανότητα καταστέλλεται από ΜΜΡ-10 siRNA (Σχήμα S5). Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι η προσθήκη ρυθμισμένα μέσα από ΜΜΡ-10-κύτταρα που υπερεκφράζουν ανέστειλε δραστικότητα ρ38 σε HSC2 και HSC3 κύτταρα (Σχήμα 6C). Εξετάσαμε επίσης την ενεργότητα ρ38 και την εισβολή από ΜΜΡ-10 knockdown σε κύτταρα MSCC-INV1. Στα κύτταρα MSCC-INV1, MMP-10 νοκ ντάουν ελαφρώς προς τα πάνω ρυθμισμένη δραστηριότητα p38 (Σχήμα 6D) και ανέστειλε την επεμβατική δραστηριότητα (Σχήμα 6Ε).

A, η αναστολή

ρ38 σημειώνεται στην MMP-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν. Τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένες μορφές των p38, ΡΑΚ, RSK, Akt, Src, ERK και στον έλεγχο και MMP-10 overexpresing κύτταρα με western αποτύπωση.

Β,

εισβολή του ελέγχου και MMP-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν μετά τη θεραπεία με αναστολέα της p38. Η εισβολής του εξετάστηκε από το

in vitro

δοκιμασία εισβολή στο άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα και MMP-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν με τη θεραπεία SB203580. Κενός φορέας επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος. Μετά από 12 ώρες επώασης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετρήθηκε. Το σχήμα δείχνει την χρώση κάτω πλευρά της μεμβράνης όπου τα κύτταρα διείσδυσαν (άνω πάνελ). Γραφήματα δείχνουν τον αριθμό των εισέβαλε κύτταρα (κάτω πίνακας). Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική από κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα χωρίς θεραπεία SB203580 σε

P

& lt? 0,01.

C,

p38 δραστηριότητα μετά τη θεραπεία με ρυθμισμένα μέσα από MMP-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν. Προσαρμοσμένα μέσα από ΜΜΡ-10 κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC2 και HSC3 συλλέχθηκε μετά από 48 ώρες της επιμετάλλωσης. Μετά την προσθήκη ρυθμισμένα μέσα για 0, 6, 12 και 24 ώρες, ή HSC2 HSC3 κύτταρα συλλέχθηκαν. Η έκφραση του φωσφο-ρ38 και ρ38 εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

D,

MMP-10 siRNA ρυθμίζει προς τα πάνω δραστηριότητας ρ38 στα κύτταρα HNSCC. Κοκτέιλ 3 διαφορετικών ΜΜΡ-10 siRNAs διαμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα MSCC-INV1. Μια κωδικοποιημένα αλληλουχία η οποία δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία προς αρουραίου, ποντικού ή αλληλουχίες ανθρώπινου γονιδίου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από 48 h επιμόλυνσης, η έκφραση της ΜΜΡ-10 πρωτεΐνη εξετάστηκε με κηλίδωση Western. Τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένες μορφές της ρ38 εξετάστηκαν επίσης με κηλίδωση Western. έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Ε,

καταστολή της εισβολής από ΜΜΡ-10 νοκ ντάουν στα κύτταρα MSCC-INV1. Η εισβολής εξετάστηκε από

in vitro δοκιμασία εισβολής

. Μετά από 6 ώρες επώασης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετρήθηκε. Το σχήμα δείχνει την χρώση κάτω πλευρά της μεμβράνης όπου τα κύτταρα διείσδυσαν (άνω πάνελ). Το γράφημα δείχνει τον αριθμό των εισέβαλε κύτταρα (κάτω πίνακας). Οι μπάρες δείχνουν τις μέσες τιμές και SDS τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική από έλεγχο σε

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

εισβολή και τη μετάσταση είναι το μεγαλύτερο πρόβλημα και το μεγαλύτερο εμπόδιο για την αντιμετώπιση της HNSCC. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να ταυτοποιηθούν πρωτότυπα μόρια που εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετάσταση των HNSCC. Ταυτοποιήσαμε αρκετά γονίδια που σχετίζονται με εισβολή από τη σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ μητρικών κυττάρων και μια ιδιαίτερα επεμβατική κλώνου [8]. Periostin και IFITM1 ταυτοποιήθηκαν ως τα υψηλότερα γονίδια σε μια ιδιαίτερα επεμβατική κλώνο και τη συμμετοχή τους στην εισβολή επιβεβαιώθηκαν από

in vitro

και

in vivo

μελέτες [8], [9].