Αφηρημένο

Δυσλειτουργία της Paneth και κύλικα κύτταρα στο έντερο συμβάλλει στη φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD) και κολίτιδα σχετιζόμενη με τον καρκίνο του παχέος εντέρου (CAC). Εδώ, αναφέρουμε έναν ρόλο για το NAD

+ – εξαρτώμενη SIRT1 απακετυλάσης ιστόνης στον έλεγχο των αντι-βακτηριακή άμυνα. Ποντίκια με μια εντερική ειδικές

SIRT1

ανεπάρκεια (

SIRT1

int – /-

) έχουν περισσότερες Paneth και λαγηνοειδή κύτταρα με επακόλουθη αναδιάταξη της μικροχλωρίδας του εντέρου. Από μηχανιστική άποψη, οι συνέπειες για την ωρίμανση εντερικού κυττάρου ποντικού που προκαλείται από SIRT1 που εξαρτώνται από τις αλλαγές στην κατάσταση ακετυλίωση SPDEF, έναν κύριο ρυθμιστή της Paneth και κύλικα κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η στόχευση SIRT1 μπορεί να παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τη διαχείριση της IBD και ο CAC

Παράθεση:. Lo Sasso G, Ryu D, Mouchiroud L, Fernando SC, Άντερσον CL, Katsyuba E, et al. (2014) απώλεια της λειτουργίας SIRT1 βελτιώνει την εντερική αντι-βακτηριακή Άμυνας και προστατεύει από Κολίτιδα-προκληθέντα καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (7): e102495. doi: 10.1371 /journal.pone.0102495

Επιμέλεια: Salvatore Παπά, Ινστιτούτο ηπατολογίας – Birkbeck, Πανεπιστήμιο του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: May 20, 2014? Αποδεκτές: 19 Ιουν 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Lo Sasso et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. GLS υποστηρίζεται από μια εξερχόμενη Σύλλογος ιταλικό για την Έρευνα του Καρκίνου (AIRC) /Marie Curie Fellowship. εργαστήριο JA KS υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από την Ομοσπονδιακή Πολυτεχνική Σχολή της Λωζάννης, το πρόγραμμα Ιδέες ΕΕ (ΑτΕ-231138), το Ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (31003A-140780 και 310030 έως 143748), η Krebsforschung Schweiz (KFS-3082-02- 2013 και KFS-2809-08-2011), και ΝΙΗ (R01AG043930). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Paneth και Κύπελλο κελιά είναι άκρως εξειδικευμένα μικρά εντερικά επιθηλιακά κύτταρα που συνθέτουν και εκκρίνουν αντι-μικροβιακών πεπτιδίων και βλέννα. Οι παράγοντες αυτοί αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας κατά των παθογόνων παραγόντων και είναι απαραίτητο να διατηρηθεί η λεπτή ισορροπία ανάμεσα σε διαφορετικά είδη βακτηρίων που αποικίζουν το έντερο των θηλαστικών [1]. Dysbiotic επιπτώσεις μικροχλωρίδας στην υγεία του ξενιστή και να συμβάλλουν στην παθογένεση διαφόρων εντερικών παθήσεων, όπως η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (IBD) και κολίτιδα σχετιζόμενη με ορθοκολικό καρκίνο (CAC) [2].

Η διαφοροποίηση και ωρίμανση του Paneth και λαγηνοειδών κυττάρων ελέγχεται από τις καταρράκτες σηματοδότησης Wnt και Notch που συνεργάζονται για την προώθηση της προδιαγραφής των διαφορετικών κυτταρικών γραμμών [3]. Επιπλέον, η SAM επισήμανε περιοχή που περιέχει τον παράγοντα μεταγραφής ETS (SPDEF), ένα καθοδικός τελεστής του Wnt δύο οδούς και Notch, είναι γνωστό ότι ενισχύει τη διαφοροποίηση των δύο Paneth και λαγηνοειδή κύτταρα από την κοινή τους προγονικά [4]. SPDEF αρχικά αναγνωρίστηκε ως ρυθμιστής του ειδικού προστατικού αντιγόνου [5], αλλά αργότερα επίσης συνδέεται προς μαστού, του πνεύμονα, και το έντερο επιθήλιο, με πιθανή εμπλοκή σε εξέλιξη του καρκίνου σε αυτούς τους ιστούς [6], [7].

Sirtuin 1 (SIRT1), ένα NAD

+ – εξαρτώμενη αποακετυλάσης [8], εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση, και ανοσολογική απόκριση [9]. Ο ρόλος της SIRT1 στη ρύθμιση της εντερική ομοιοστασία έχει μόλις αρχίσει να διευκρινιστεί. Πρόσφατα μια εμπλοκή των εντερικών SIRT1 στη χολή οξύ και χοληστερίνη μεταβολισμός συστημική έχει προταθεί [10]. Επιπλέον, μελέτες που αναδεικνύουν τον ρόλο της SIRT1 στην παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου με τη χρήση Αρο

min /+ ποντίκια ως πρότυπο, έδειξαν αντικρουόμενα αποτελέσματα που υποστηρίζουν τόσο την προώθηση του όγκου [11] και καταστολής όγκων [12], [13] λειτουργίες.

Χρησιμοποιώντας ποντίκια με μια εντερική ειδικές

SIRT1

διαγραφή (

SIRT1

int – /-

), δείχνουμε εδώ ότι SIRT1 ρυθμίζει την ωρίμανση και την παραγωγή των κυττάρων Paneth και Κύπελλο αντι-βακτηριακές πρωτεΐνες. Οι επιδράσεις αυτές εξαρτώνται από SIRT1 μεσολάβηση αλλαγές στην κατάσταση ακετυλίωση SPDEF. Επιπλέον, εντερική

SIRT1

διαγραφή έχει σημαντικό αντίκτυπο για την microbiome εντέρου και προστατεύει τα ποντίκια από IBD και ο CAC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι επιπτώσεις του

SIRT1

ανεπάρκεια στην παραγωγή αντι-βακτηριακή πρωτεΐνες είναι εξελικτικά συντηρημένες σε

C.elegans

ανάδειξη της αρχαίας φύση αυτής της λειτουργίας της SIRT1. Στο σύνολό τους τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι

Υλικά και Μέθοδοι

Δημιουργία SIRT1

int στόχευση SIRT1 μπορεί να παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τη διαχείριση της IBD και ο CAC -. /- Και SIRT1

int – /- LGR5

EGFP-IRES-CRE-ΕΡΤ2 ποντίκια

Για την παραγωγή του

SIRT1

floxed (

SIRT1

L2 /L2

) ποντίκια, γονιδιωματικό DNA που καλύπτει ο

SIRT1

locus ενισχύθηκε από το στέλεχος 129Sv με υψηλής πιστότητας PCR. Τα προκύπτοντα DNA θραύσματα συναρμολογήθηκαν στο φορέα στόχευσης του Institut Clinique de la Σουρής (Στρασβούργο, Γαλλία). Το κατασκεύασμα στο οποίο εξώνια 5, 6 και 7 περιστοιχίζεται από θέσεις ΙοχΡ στη συνέχεια ηλεκτροδιάτρηση σε κύτταρα 129Sv εμβρυϊκών βλαστικών (ES) (Σχήμα S1B). επιλέχθηκαν και αναλύθηκαν για ομόλογο ανασυνδυασμό με PCR και οι θετικοί κλώνοι επαληθεύτηκαν με υβριδισμό κηλίδος Southern ανθεκτικές στο G418 αποικίες. Σωστά στοχευμένη κυτταρικοί κλώνοι ES εγχύθηκαν σε βλαστοκύτταρα και μεταφέρθηκαν σε ψευδοέγκυα θηλυκά, οδηγώντας σε χιμαιρικά απογόνους που ζευγάρωσαν σε θηλυκούς C57BL /6J ποντικούς που εκφράζουν το recombinase Flp υπό τον έλεγχο του υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού πανταχού [14]. Απόγονοι που διαβίβασε το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και ότι έχασε την διαγονιδίου Flp (

SIRT1

L2 /WT

ποντίκια) έπειτα επιλέγονται και διασταυρώθηκαν με C57BL /6J ποντίκια για δέκα γενιές. Για την ανάλυση του εντέρου microbiota SIRT1

int – /- και SIRT1

L2 /L2 ήταν συστεγάζεται υπό συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα μέσα στο ίδιο δωμάτιο. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ΑΟΜ /DSS στεγάστηκαν ξεχωριστά μετά τον απογαλακτισμό να αποφευχθούν οι διαφορές στην πρόσληψη DSS. Ωστόσο, SIRT1

int – /- και SIRT1

L2 /L2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία υπό συγκεκριμένες συνθήκες χωρίς παθογόνα μέσα στο ίδιο δωμάτιο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, SIRT1

int – /- και SIRT1

L2 /L2 ποντίκια προέρχονται από τους ίδιους τους γονείς. Όλα τα πειράματα σε ζώα έγιναν σύμφωνα με τις θεσμικές και της Ελβετίας κατευθυντήριες γραμμές και εγκριθεί από τις καντονίου αρχές του καντονιού Vaud. Επιπλέον, όλα τα πειράματα σε ζώα ήταν σύμφωνα με τη νομοθεσία της Ελβετίας καλή μεταχείριση των ζώων και επανεξετάζονται από την ηθική Διοικητικό Συμβούλιο της Canton de Vaud (Animal Welfare Act 2005? Έργου Άδειας Αρ 2463-2463.1-2605 άδεια στον καθηγητή Johan Auwerx) μέλος. Τέλος, όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το ανεξάρτητο κράτος του Vaud Κτηνιατρικής γραφείου ηθική του σκάφους, η οποία ενεργεί σύμφωνα με το νόμο Animal Welfare, τις διεθνείς οδηγίες AAALAC, της Ελβετίας και της νομοθεσίας της ΕΕ. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία χρησιμοποιώντας μια σύντομη έκθεση σε CO

2. Η μέθοδος αυτή οδηγεί σε γρήγορη και ανώδυνη ασφυξία σε ποντικούς. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν από τον Οκτώβριο του 2011 έως τον Απρίλιο του 2014.

πλασμίδια

θηλαστικών φορέα έκφρασης Puse-SIRT1 αγοράστηκε από την Upstate. Η αλληλουχία που κωδικοποιεί SPDEF ανήκει στο ποντίκι Transcription Factor Δυναμικού [15]. Είναι ενισχύθηκε και συνδέθηκε με το pCDNA3-FLAG ή ρΟΕΧ-GST. pCruzHA SIRT1G261A (πλασμίδιο 10963) [16] και pGL2Basic-EcadK1 (πλασμίδιο 19290) [17] αγοράστηκαν από Addgene. pGEX-GST-SPDEFK294Q δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση.

C.elegans

δοκιμασίες

C.elegans

στελέχη αναπτύχθηκαν στους 20 ° C σε πλάκες ανάπτυξης των νηματωδών άγαρ μέσα μαζικής ενημέρωσης (NGM) seeded με

Ε. coli

στέλεχος OP50 εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν άγριου τύπου Bristol Ν2, VC199

sir-2.1 (ok434)

IV, SAL129 [

pha-1

(e2123) III?

Lys-1

: : GFP +

pha-1

(+)], και SAL105 [

pha-1

(e2123) III?

Lys-7 Ιστοσελίδα :: GFP +

ΡΗΑ 1

(+)]. Στελέχη που παρέχονται από το

Caenorhabditis

Genetics Center (University of Minnesota). Βακτηριακές σίτιση πειράματα RNAi διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [18]. Η

sir-2.1

(R11A8.4) κλώνος αγοράστηκε από GeneService και αλληλουχία.

Η ποσοτικοποίηση της GFP

έκφρασης διεξήχθη σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφονται [19]. Για την απόκτηση εικόνα του

Lys-7 Ιστοσελίδα :: GFP έκφρασης, τα ζώα τοποθετήθηκαν σε μαξιλάρια αγαρόζης 2% σε 10 mM τετραμισόλη (Sigma) και εξετάζονται με τη βοήθεια Zeiss Αχίορίαπ-2 μικροσκόπιο (Carl Zeiss).

εκχύλιση mRNA και RT-qPCR ανάλυση

RNA απομονώθηκε από τους ιστούς με χρήση του αντιδραστηρίου TriPure (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA παράχθηκε από 1 μ§ ολικού RNA χρησιμοποιώντας Αντίστροφη QuantiTect Transcription Kit (Qiagen). qRT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας LightCycler 480 SYBR Green Ι Κύριο Μείγμα (Roche) και αναλύθηκαν μέσω υπολογισμού ΔΔCT. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με την κυκλοφιλίνη έκφρασης. Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1 στο S1 File.

δοκιμασία Λουσιφεράσης

PC3 κύτταρα (ATCC) σε 96 πλάκες /φρεάτια συν-επιμολύνθηκαν με ένα ρεπόρτερ που περιέχει το στοιχείο απόκρισης SPDEF της ανθρώπινης Ε -cadherin υποκινητή, pGL2Basic-EcadK1 και pcDNA3, pCDA3-FLAG-SPDEF ή pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q με ή χωρίς Puse-SIRT1 φορείς έκφρασης (jetPEI επιμόλυνση? Polyplus). Τα μέσα απομακρύνθηκαν μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, και λουσιφεράσης Υπόστρωμα (Bright-Glo Luciferase Assay System, Promega) προστέθηκε πριν από τη μέτρηση λουσιφεράσης από το Victor × 3. β-γαλακτοσιδάσης χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση.

In vitro ακετυλίωση και η αποακετυλίωση δοκιμασίες

Ιη vitro δοκιμασίες ακετυλίωση και η αποακετυλίωση διεξήχθησαν όπως περιγράφεται αρχικά [20]. Εν συντομία, 1 μg ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SPDEF, που λαμβάνεται από το στέλεχος BL21, επωάστηκαν με 500 ng ανασυνδυασμένου Ρ300 σε ρυθμιστικό ακετυλίωση (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8, 100 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 μg /ml bepstatin, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη, 1 mM βουτυρικό νάτριο και 150 μΜ ακετυλ-CoA) για 1 ώρα στους 30 ° C. Μετά την επώαση, τα δείγματα αναλύθηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με Western Blot ή να χρησιμοποιηθούν για δοκιμασίες αποακετυλίωση in vitro. Για τις δοκιμασίες αποακετυλίωση, 1 μg ακετυλιωμένου SPDEF επωάστηκε με 500 ng ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη SIRT1 σε ρυθμιστικό αποακετυλίωσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 9, 4 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 1 μg /ml bepstatin, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη και 1 mM NAD

+) για 30 λεπτά με συνεχή ανάδευση. Τα δείγματα επωάζονται διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με western blot ή να χρησιμοποιηθούν για τη χαρτογράφηση ενός ακετυλιωμένου κατάλοιπο με νανο-LC-MS /MS. Ανασυνδυασμένη p300, SIRT1, SIRT6, και οι πρωτεΐνες SIRT7 έγιναν από τον Dr. Michael O. Hottiger (Πανεπιστήμιο της Ζυρίχης). Κυττάρων με βάση αποακετυλίωση αναλύθηκε σε κύτταρα Hek293T επιμολυσμένα με pCDA3-FLAG-SPDEF ή pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q με ή χωρίς Puse-SIRT1 ή φορείς έκφρασης pCruzHA-SIRT1G261A από κιτ jetPEI επιμόλυνσης (Polyplus). 22 ώρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο (Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle με 4,5 g /l γλυκόζη, 10% ορό εμβρύου μόσχου, 0,1 mM ΝΕΑΑ, 50 μg /ml γενταμυκίνη και 1 mM βουτυρικό νάτριο). Μετά από 2 ώρες, ολόκληρων κυττάρων-προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό IP λύσης (50 mM Tris HCl, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton Χ-100, 10 mM βουτυρικού νατρίου και 10 mM νικοτιναμιδίου) συμπληρωμένο με Complete δισκία κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). 0,5 mg έως 1 mg του ολικού κυττάρου-προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ). IP διεξήχθη με FLAG-Αγαρόζης Affinity Gel όπως περιγράφεται από τον προμηθευτή (A2220, Sigma-Aldrich). Μετά IP, δείγματα εφαρμόστηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

κυτταρικής καλλιέργειας, επιμόλυνση, και αντισώματα

ΗΕΚ293 και PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco συμπεριλαμβανομένων 4,5 g /l γλυκόζη, 10% ορό εμβρύου μόσχου, 0,1 mM ΝΕΑΑ και 50 μg /ml γενταμυκίνη στους 37 ° C υπό 5% CO

2 ατμόσφαιρα. ΗΕΚ293Τ και PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο JetPei (

Polyplus Επιμολύνσεις

, Illkirch, France) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντισώματα: λυσοζύμη (Abcam, Ab36362), CHRA (Santa Cruz, SC-13090), ακετυλιωμένη λυσίνη (κυτταρική σηματοδότηση, 9441L), SIRT1 (Abcam, ab12193), β-κατενίνης (Sigma, A5441), L-FABP (Santa Cruz , SC-50380), PCNA (Santa Cruz, sc-56), HSP90 (BD Transduction Laboratories, 610.418), αντι-FLAG (Sigma, F1804), τουμπουλίνης (Santa Cruz, sc-5286), SPDEF για Western blot (Sigma , AV32533), SPDEF για IHC παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή J. Whitsett.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

κυτταρόπλασμα και νουκλεόπλασμα κλάσματα που λαμβάνονται από το

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /-

απομονωθεί κρύπτη. Κρύπτες απομονώθηκαν μετά από μια δημοσιευμένο πρωτόκολλο [21]. Μεμονωμένα κύτταρα κρύπτης προερχόμενα τελικά πλύθηκαν με παγωμένο PBS και επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT10 mM, 10 HEPES-ΚΟΗ, ρΗ 7.4) που περιλαμβάνει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης (Roche) για 5 min. Μετά από 50 κτυπήματα σε ομογενοποιητή dounce, κυτόπλασμα κλάσμα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση (1,4 k χ g για 5 λεπτά, 4 ° C). Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό Α Πυρήνες επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Β (150 mM NaCl, 0,1% ΝΡ-40, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης για 30 λεπτά επί πάγου. Πυρηνόπλασμα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση (2 k χ g για 5 λεπτά, 4 ° C). Πρωτεΐνες ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Lowry και υποβάλλονται σε επεξεργασία για προσδιορισμό κηλίδας western.

GFP

+ κύτταρα ανάλυση

Κρύπτες από

SIRT1

L2 /L2-

και

SIRT1

int – /- LGR5

EGFP-IRES-CRE-ΕΡΤ2

έντερα απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (δείτε το

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

παράγραφο) [22]. Ενιαία κύτταρα αναλύθηκαν με FACS για την ανίχνευση της GFP

+ κύτταρα.

Η κλασματοποίηση των κυττάρων κατά μήκος των κρύπτης-λάχνης άξονα

Η διαδοχική απομόνωση του ποντικιού μικρών εντερικών επιθηλιακών κυττάρων κατά μήκος του crypt- άξονα των λαχνών διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] με λίγες τροποποιήσεις. Εν συντομία, το σύνολο του λεπτού εντέρου (δωδεκαδάκτυλο έως τελικό ειλεό) απομακρύνθηκε, ξεπλύθηκε, και κόψτε σε μικρά κομμάτια (2-5 mm) και επωάζεται στους 37 ° C για 15 λεπτά σε 15 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α (96 mM NaCl, 1,5 mM KCl, 27 mM κιτρικό νάτριο, 8 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, και 5.6 mM Να

2HPO

4, ρΗ 7.3). Στη συνέχεια επωάστηκε για 10 λεπτά σε 15 ml ρυθμιστικού διαλύματος Β (PBS συν 1.5 mM EDTA, 0.5 mM διθειοθρεϊτόλη και 1 mg /ml αλβουμίνη βόειου ορού) σε ένα ανακινούμενο επωαστή 37 ° C. Κατά την ολοκλήρωση της επώασης 15 λεπτών, ανεξάρτητο εντεροκύτταρα συλλέχθηκαν (κλάσμα 1) και 15 ml φρέσκου ρυθμιστικού διαλύματος Β προστίθενται στον ιστό. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε τέσσερις ακόμα φορές, τα βήματα διάρκειας 25, 25, 25 και 30 λεπτά, αντίστοιχα (κλάσματα 2, 3, 4 και 5), για ένα σύνολο 120 λεπτών του χρόνου επώασης. Κατά την ολοκλήρωση της τελικής περιόδου επώασης, τα κύτταρα συλλέγονται από κάθε ένα από τα 5 κλάσματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1500 rpm στους 4 ° C για 5 λεπτά. Τα κυτταρικά ιζήματα πλύθηκαν δύο φορές και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό RIPA. Η δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης προσδιορίστηκε με κιτ δοκιμασίας αλκαλικής φωσφατάσης (BioVision).

Η φασματομετρία μάζας ανάλυση

λωρίδες πηκτής κόπηκαν σε κομμάτια και υποβλήθηκε σε πέψη σε γέλη με ενδοπρωτεϊνάση Glu-C ή θρυψίνη. Peptide πέψης επαναιωρήθηκαν και αναλύθηκαν με νανο-LC-MS /MS χρησιμοποιώντας ένα Orbitrap Elite φασματογράφο μάζας (Thermo Fischer Scientific) συζευγμένο με ένα σύστημα ultraperformance LC (UPLC) (Thermo Fischer Scientific Ultimate 3000 RSLC). Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με Proteome Discoverer (ν. 1.3) και αναζητήσεις διεξήχθησαν με Mascot και Sequest έναντι μιας βάσης δεδομένων ποντικού (UniProt απελευθερώσει 2013_01). Τα δεδομένα περαιτέρω επεξεργασία, επιθεωρούνται και να απεικονιστεί χρησιμοποιώντας ικριωμάτων 3 λογισμικό.

In situ υβριδισμού

Το

in situ

ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αντιστοιχούν σε εκφρασμένων ετικετών αλληλουχίας ή πλήρως αλληλουχία cDNAs που λαμβάνονται από Open Biosystems. Οι αριθμοί για την προσχώρηση αυτών των ανιχνευτών είναι οι εξής: ποντίκι

Olfm4

BC141127 (9.055.739), το ποντίκι

Defa4

BC134360 (40134597). Για να εξασφαλιστεί η ειδικότητα των ανιχνευτών, δημιουργήσαμε και τα δύο με νόημα και αντινόημα διερευνητές από

in vitro

μεταγραφής χρησιμοποιώντας DIG μίγμα επισήμανσης RNA (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και με δημοσιευμένες μεθόδους [24]. ISH έγινε χρησιμοποιώντας τον πλήρως αυτοματοποιημένο όργανο Ventana XT (Roche). Χημικές ουσίες που ήταν από τη Roche Diagnostics. Εν συντομία, σταθεροποιημένα με φορμαλίνη τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη από-παραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν και προκατεργάστηκαν με ενζυματική πέψη (protease1, 4 λεπτά στους 37 ° C). Η υβριδοποίηση εκτελέστηκε προσθέτοντας σε κάθε διαφάνεια 50 ή 100 ng του ανιχνευτή αραιωμένα σε Ribohybe στους 65 ° C για 6 ώρες.

Βακτηριοκτόνος δοκιμασία

Βακτηριοκτόνος δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [25] με μερικές τροποποιήσεις. Εν συντομία, το λεπτό έντερο των ποντικών ενηλίκων ξεπλύθηκε με παγωμένο PBS και τα τμήματα επωάστηκαν σε 30 mM EDTA για την έκλουση επιθηλιακά κύτταρα. Σύνολο πρωτεΐνες από τα επιθηλιακά κύτταρα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό ΝΡ40 λύσεως (20 mM Tris ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 2.5 mM ΚΟΙ, 5 mM EDTA, 5% [όγκο /όγκο] γλυκερόλη, 1% [όγκο /όγκο] ΝΡ40) συμπληρωμένο με πλήρη αναστολέα πρωτεάσης. 100 μα πρωτεϊνών επωάστηκαν για 60 λεπτά στους 37 ° C σε 10 mM ρυθμιστικό iPIPES περιέχει εκθετικά αυξανόμενη

E.coli Κ12

(ATCC, 10

6 CFU /mL). 20 μL δείγματος αραιώθηκε και απλώθηκε σε LB άγαρ στερεό μέσο. Επιβίωση βακτηρίδια ποσοτικά ως CFU επί πλακών μετά από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C. Τα βακτήρια επωάστηκαν σε iPIPES χωρίς προσθήκη πρωτεΐνες θεωρήθηκαν ως μάρτυρες.

Κολίτιδα και Κολίτιδα σχετιζόμενη μοντέλα καρκίνου του παχέος

DSS επαγόμενη κολίτιδα προκλήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. αξιολογήθηκαν ημερήσιες μεταβολές στο σωματικό βάρος. Αιμορραγία από το ορθό βαθμολογήθηκε σε μία κλίμακα από 0 έως 5, που δείχνει κανένα (0) ή πολύ σοβαρή (5) αιμορραγία από το ορθό. Ηλείας και παχύ έντερο καταψύχθηκαν ή σταθερό με 4% Forma-Fixx (Thermo Scientific) και ενσωματωμένα σε παραφίνη.

In vivo

εντερική διαπερατότητα εξετάστηκε σε ποντικούς όπως περιγράφεται [27]. Κολίτιδα επαγόμενη από καρκίνο του παχέως εντέρου (ΑΟΜ /DSS μοντέλο) προκλήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Μετά τη θυσία, κόλον ποντικού ανοίχθηκαν κατά μήκος και μετά από 2 ώρες σταθεροποίηση σε 4% Τυπική-Fixx, εν συντομία χρωματίστηκαν με Coomassie Blue για να απεικονίσει όγκους. Οι όγκοι μετρήθηκαν με τυφλό τρόπο από έναν παθολόγο. μέγεθος όγκων δοκιμάστηκε με μετρητή. Μικρά κομμάτια του τερματικού Ηλείας και εγγύς παχύ έντερο καταψύχθηκαν και τα υπόλοιπα σταθερά με 4% Forma-Fixx (Thermo Scientific) και ενσωματωμένα σε παραφίνη.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα ελέγχθηκαν με το τεστ Shapiro-Wilk για κανονικότητα στο R πριν από τη διενέργεια δοκιμών σημασία. Μεταβλητές με μια τιμή W ≥0.80 θεωρήθηκαν ως περίπου κανονική κατανομή. Δύο μεταβλητή συγκρίσεις υπολογίστηκαν με τη χρήση του Welch δίπλευρη

t-test

. Για πολλαπλές συγκρίσεις, δοκιμή Bartlett του έγινε για να ελέγξετε για ίση διακύμανση (p & gt? 0.10) και, στη συνέχεια, μονόδρομη ANOVA πραγματοποιήθηκε με το τεστ post-hoc Bonferroni. Μεταβλητές με μια τιμή Shapiro-Wilk W & lt? 0,80 θεωρήθηκαν ως μη κανονική και οι συγκρίσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το signed-rank test Wilcoxon. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση επιβίωσης σε σκουλήκια. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM, και για όλες τις συγκρίσεις σημασία,

σ

τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές.

* p & lt? 0,05?

** p & lt? 0,01?

*** p & lt? 0.001. Η μελέτη αυτή είχε διερευνητικό χαρακτήρα και δεν υπήρχε προκαθορισμένο μέγεθος της επίδρασης. Το μέγεθος του δείγματος επιλέχθηκε με βάση τη μελέτη σκοπιμότητας και τις δυνατότητες στατιστική ισχύς. Τα μεγέθη των δειγμάτων είναι συνεπείς με αυτές που αναφέρθηκαν σε παρόμοιες μελέτες. Στατιστική ανάλυση για την ανάλυση του εντέρου microbiota αναφέρεται στις συμπληρωματικές πληροφορίες.

Αποτελέσματα

SIRT1

διαγραφή αυξάνει αντι-μικροβιακή απόκριση σε θηλαστικά και νηματώδεις

έχουμε καθορίζεται πρώτα τον εντοπισμό της SIRT1 πρωτεΐνης κατά μήκος του άξονα των λαχνών /κρύπτη. Από SIRT1, είναι πολύ εμπλουτισμένο σε μικρές κρύπτες έντερο (Σχήμα S1A), μπορούμε εκτρέφονται βιλλίνης-Cre διαγονιδιακών ποντικών με ποντίκια στα οποία εξόνια 5-7 του

SIRT1

γονίδιο που πλευρίζεται από θέσεις ΙοχΡ (

SIRT1

L2 /L2

) για τη δημιουργία του εντέρου, ειδικά

SIRT1

knockout ποντικών (

SIRT1

int – /-

) (Σχήμα S1B-C). Σε αντίθεση με μια προηγουμένως αναφερθεί διαγραφή του

SIRT1

εξόνιο 4 [29], δεν περικόπτεται και δυνητικά ενεργά θραύσματα SIRT1 ανιχνεύθηκαν σε

SIRT1

int – /-

ποντίκια (Σχήμα S1c).

SIRT1

int – /-

έντερα έδειξαν μια σημαντική αύξηση του αριθμού των Paneth (λυσοζύμη

+ και Defa4

+) και Κύπελλο (PAS

+), αλλά όχι εντεροενδοκρινές (CHRA

+) κύτταρα (Σχήμα 1Α, Σχήμα S1D). Συνεπώς, τα επίπεδα mRNA του Paneth (

Lys, Crypt1, Crypt4, ΔΕΦΑ-Rs

) και λαγηνοειδών (

Klf4, MUC2

) δείκτες κυττάρων, όπως επίσης και πρωτεΐνη λυσοζύμη αφθονία και

Defa4

mRNA ανιχνεύεται μέσω

in situ υβριδισμού

, προκλήθηκαν στο εγγύς και άπω έντερο του

SIRT1

int – /- ποντίκια

(Σχήματα 1Β-C, Σχήμα S1D-Ε ).

Α, Εκπρόσωπος εικόνες της Paneth (λυσοζύμη

+ κύτταρα), Κύπελλο (περιοδικές οξύ-shiff

+ κύτταρα), και εντεροενδοκρινή (χρώση των κυττάρων χρωμογρανίνης A

+ κύτταρα). (Ν = 3 ποντίκια? 5-10 τομέα ανά ποντίκι, 50-100 κρύπτη /λαχνών ανά πεδίο). Bar = 50 μm. Β-Ο, τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης του Paneth (

Lys, ΜΜΡ7, Crypt1, Crypt4, ΔΕΦΑ-Rs

) και λαγηνοειδών (

Klf4, MUC2

) δείκτες αυξάνονται στο εγγύς και άπω λεπτό έντερο του

SIRT1

int – /- ποντίκια

(Ν = 6-8). Για την ανάλυση RTqPCR,

rps12

χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στο στύπωμα Western. D, αυξημένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην άμυνα του παθογόνου στο

sir-2.1

(

ok434

)

C. elegans

μετάλλαγμα (Ν = 6? κάθε Ν σημαίνει ένα μόνο πληθυσμό -500 σκώληκες).

Act1

και

Υ45

χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά. E,

sir-2.1

επάγει siRNA

Lys-1

και

Lys-7

οδηγείται GFP έκφραση στο

Lys-1 :: GFP

και

Lys-7 :: GFP

σκουλήκια δημοσιογράφος. Στο ίδιο σχήμα μια αντιπροσωπευτική εικόνα του

Lys-7 :: GFP

πριν και μετά το

(DIC, αντίθεση παρέμβαση διαφορικό) sir-2.1

siRNA φαίνεται. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

επόμενο αξιολογηθεί κατά πόσο

SIRT1

συσχετίζεται με τα γονίδια που εμπλέκονται στην αντι-βακτηριακή άμυνας χρησιμοποιώντας το γενετικό πληθυσμό αναφοράς BXD ποντίκι (www.genenetwork. org) [30]. Καθώς δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα εντερική γονιδιακή έκφραση, αναλύσαμε αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία είναι μέρος του οπλοστασίου των κυττάρων που προστατεύουν έναντι των παθογόνων. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας,

SIRT1

έκφραση συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση αρκετών Defensin που σχετίζονται με γονίδια (Σχήμα S1F).

Για να ελέγξετε αν η σύνδεση μεταξύ

SIRT1

και η αντι-βακτηριακή άμυνα ήταν εξελικτικά συντηρημένη, χρησιμοποιήσαμε

C. elegans

. Είναι αξιοσημείωτο ότι η έκφραση ενός ευρέος φάσματος των γονιδίων που εμπλέκονται στην αντιμικροβιακή άμυνα (

lyz-1, lyz-7, lyz-8

) [31], καθώς και εκείνη των γονιδίων που προκαλείται από συγκεκριμένα παθογόνα ( F01D5.5, F56D6.2, C17H12.8, C29F3.7, K08D8.5) [32] ενισχύθηκε σε ποσοστό

sir-2.1

[33] μεταλλαγμένα σκουλήκια (Σχήμα 1D). Επιπλέον, στο

Lys-1 :: GFP

και

:: GFP

στελέχη Lys-7 ρεπόρτερ [31], s

ir-2.1

siRNA που προκαλούνται σημαντικά τόσο

Lys-1

– και

Lys-7

εξαρτώμενη έκφραση GFP (Σχήμα 1Ε). Τα δεδομένα αυτά ως εκ τούτου υποδεικνύουν ότι η επίδραση του

SIRT1

στην αντι-μικροβιακή απάντηση είναι εξελικτικά συντηρημένη από θηλαστικά σε σκουλήκια.

Εντερική

SIRT1

διαγραφή επιπτώσεις στο έντερο μικροχλωρίδας

Λαμβάνοντας υπόψη τον θεμελιώδη ρόλο που διαδραματίζουν Paneth και λαγηνοειδή κύτταρα στην προστασία του έντερο των θηλαστικών από την παρεκκλίνουσα βακτηριακό αποικισμό, είμαστε δίπλα ανέλυσε τις επιπτώσεις της

SIRT1

διαγραφή στο έντερο μικροχλωρίδας.

SIRT1

int – /-

έντερα δεν έχουν μόνο ένα μεγαλύτερο τυφλό έντερο (Σχήμα 2Α), ενδεικτικό ενός τροποποιημένου microbiome [34], είχαν επίσης υψηλότερο βακτηριοκτόνο ικανότητα (Εικόνα 2Β). Χρησιμοποιώντας ϋΝΑ που εξάγεται είτε από το ενδοαυλική περιεχόμενο τυφλού εντέρου ή του ιστού του παχέος εντέρου, εμείς ενίσχυσε την περιοχή V3 του γονιδίου βακτηριακής 16S rRNA. Μετά την αφαίρεση της χαμηλής ποιότητας διαβάζει και όλοι οι μονήρεις Επιχειρησιακού Ταξινομική Μονάδες (Otus) (Πίνακας S2 στο αρχείο S1), το 98% των διαβάζει έπεσε στον πυρήνα Μετρήσιμα microbiome (CMM-βλέπε μεθόδους). Η μικροβιακή κοινότητα κυριαρχείται από 4 φύλα,

Firmicutes, Bacteroidetes, Πρωτεοβακτηρίων και Verrucomicrobia

(Σχήμα 2C) [35]. Για τη χαρτογράφηση της κοινότητας σύνθεση της μικροβιακής και τη δομή σε όλη την

SIRT1

μετάλλαξη χρησιμοποιήσαμε μια μέθοδο ΕΞΩ-based. Στις αναλύσεις που βασίζεται σε δίκτυο, το τυφλό έντερο μικροβιακές κοινότητες του

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /- ποντίκια

υπογράμμισε κοινότητα διαφορές μεταξύ των γονότυπων (Σχήμα 2D), μια παρατήρηση υποστηρίζεται περαιτέρω από Κύριες Συντεταγμένες Analysis (PCA? Σχήμα 2Ε). είδος-δείκτη μικροβιακής που συμβάλλουν στην κοινότητα διαφορές μεταξύ των

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /- ποντίκια

εντοπίστηκαν και Otus εμφανίζεται στο Σχήμα 2F και στον πίνακα S3 στην S1 αρχείο. Είναι ενδιαφέρον ότι, η πλειοψηφία των εμπλουτισμένο Otus στο

SIRT1

int – /-

ποντίκια ήταν του γένους

Barnesiella

,

Bacteroides

, και

Prevotella

(φύλο

Bacteroidetes

), που βρίσκονται στο φυσιολογικό ανθρώπινο και ποντικού έντερο, οι οποίες κυρίως μειώθηκε σε IBD [36], [37]. Σε αντίθεση, το γένος

Clostridium

(συνομοταξία

Firmicutes

) επεκτάθηκε σε

SIRT1

L2 /L2

ποντίκια (Σχήμα 2F και στον Πίνακα S3 στο S1 αρχείου). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εντερική

SIRT1

διαγραφή και οι συνακόλουθες αλλαγές στην Paneth και λαγηνοειδή κύτταρα τροποποιήσετε το microbiome έντερο.

Α, Εκπρόσωπος εικόνα που δείχνει μια σημαντική αύξηση του μεγέθους τυφλό στο

SIRT1

int – /-

ποντίκια. Β βακτηριοκτόνο ικανότητα του λεπτού εντέρου (δωδεκαδάκτυλο) στο

SIRT1

int – /-

και

SIRT1

L2 /L2

ποντίκια αναλύθηκε με τη δοκιμασία μονάδα σχηματισμού αποικιών. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως% του ελέγχου (χωρίς πρωτεΐνες) (Ν = 7). C, Κατανομή των μικροβιακών Φύλα στον ιστό του παχέος εντέρου και το περιεχόμενο του τυφλού εντέρου

της SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /-

ποντίκια. D, δίκτυο που βασίζεται σε αναλύσεις του τυφλού εντέρου βακτηριακές κοινότητες στο

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /-

ποντίκια. Κάθε μεγάλος κύκλος αντιπροσωπεύει ένα ζώο και κάθε μικρότερη κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα OTU?

SIRT1

L2 /L2

(Μπλε) και

SIRT1

int – /-

(κόκκινο). Ε, κύριος συντεταγμένων Analysis (PCA) (PERMANOVA p = 0.012, και ANOSIM p = 0,007) δείχνει σημαντική διαχωρισμό των μικροβιακών κοινοτήτων μεταξύ

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /- ποντίκια

. F, Heatmap δείχνει το top 20 διαφορετικές Otus μεταξύ

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /-

ποντίκια. Οι τιμές αφθονίας ήταν μετασχηματισμένα λογαριθμικά και τυποποιημένη και απεικονίζονται στο matlab. * Υποδηλώνει

Barnesiella

,

Bacteroides

, και

Prevotella

? ° δεικνύει

ΚΛΩΣΤΡΊΔΙΟ

γένους (βλέπε επίσης Πίνακα S3 στο S1 αρχείου). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

Εντερική

SIRT1

διαγραφή προστατεύει από κολίτιδα και κολίτιδα που προκαλείται από καρκίνο του παχέος εντέρου

Με δεδομένες αυτές τις τελευταίες παρατηρήσεις, μελετήθηκε η επίδραση της

SIRT1

σχετικά με την παθογένεση τόσο της κολίτιδας και CAC.

SIRT1

int – /-

ποντίκια, που εκτίθενται σε δεξτράνη θειικού νατρίου (DSS), έδειξε μια ηπιότερη κολίτιδα χαρακτηρίζεται από μικρότερη απώλεια σωματικού βάρους, αιμορραγία σκορ, μια τάση προς μειωμένη εντερική διαπερατότητα, και μειωμένη έκφραση φλεγμονωδών γονιδίων (Σχήμα S2A-D). Αυτά τα αποτελέσματα μας υποκίνησε να μελετήσει πώς

SIRT1

int – /- ποντίκια

αντιδρούν στην CAC. Οι ποντικοί ως εκ τούτου ένεση με το καρκινογόνο ΑΟΜ (αζοξυμεθάνιο) πριν από μια μεταγενέστερη έκθεση σε τρεις κύκλους του DSS (Σχήμα 3Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο αριθμός και το μέγεθος των όγκων σε

SIRT1

int – /-

έντερα ήταν μικρότερες (Εικόνες 3Α-Β). Η καλύτερη κατάσταση της υγείας του

SIRT1

int – /-

ποντικών υπογραμμίζεται περαιτέρω από το μεγαλύτερο μήκος του παχέος εντέρου και ταχύτερη ανάρρωση του σωματικού βάρους μετά τον τελευταίο κύκλο DSS (Εικόνες 3C-D)

Α-Β, Σχηματική αναπαράσταση του /πρωτόκολλο ΑΟΜ DSS (επάνω αριστερό πάνελ) και αντιπροσωπευτική εικόνα των άνω και κάτω τελείες από το

SIRT1

int – /-

και τον έλεγχο ποντίκια μετά από επαγωγή CAC (Bar = 200 μm) (κάτω αριστερά πάνελ).

SIRT1

int – /-

ποντίκια δείχνουν σημαντικά μικρότερη όγκοι (δεξιά πλευρά). Β, αντιπροσωπευτική εικόνα ενός τμήματος του παχέος εντέρου από ένα

SIRT1

int – /-

και τον έλεγχο του ποντικιού μετά την επαγωγή CAC (αριστερά πάνελ). Το μέγεθος του όγκου (δεξιά πλευρά). C, μήκος Colon κατά το χρόνο της θυσίας (ΑΟΜ /DSS). D, Ποσοστό μεταβολής του σωματικού βάρους. Για το πείραμα /DSS ΑΟΜ χρησιμοποιήθηκαν 8 ποντίκια για κάθε γονότυπο. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001. E-F, κύριος συντεταγμένων Analysis (PCA) των βακτηριακών ακολουθιών από τον ιστό του παχέος εντέρου πραγματοποιείται με τη χρήση μη σταθμισμένο πίνακα αποστάσεων UniFrac. E,

SIRT1

int – /-

του παχέος εντέρου ιστού πριν και μετά τη θεραπεία ΑΟΜ (PERMANOVA p = 0,003, ANOSIM p = 0,016). F,

SIRT1

L2 /L2

του παχέος εντέρου ιστού με και χωρίς θεραπεία ΑΟΜ (PERMANOVA p = 0,067, ANOSIM p = 0,038). G-Η, Οι περισσότεροι στατιστικά σημαντική Otus πριν και μετά ΑΟΜ τόσο

SIRT1

L2 /L2

(G), και

SIRT1

int – /-

(H), ιστούς του παχέος εντέρου? * Δηλώνει

Helicobacter

και

Desulfovibrio

(βλέπε επίσης Πίνακα S4 στο S1 αρχείου). Εγώ, PCA των βακτηριακών ακολουθιών από τον ιστό του παχέος εντέρου μετά από ΑΟΜ (PERMANOVA p = 0,767, ANOSIM p = 0,167).

Η

Ανάλυση της μικροβιακής κοινότητας μετά την έκθεση DSS /ΑΟΜ αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στο

SIRT1

int – /-

ποντίκια (Σχήμα 3Ε), ενώ η αλλαγή ήταν μικρότερη σε

SIRT1

L2 /L2

ποντίκια (Σχήμα 3F). Δείκτης μικροβιακά είδη, πριν και μετά DSS /ΑΟΜ, προσδιορίστηκαν (Εικόνες 3G-Η και Πίνακας S4 στο S1 File). Αξίζει να σημειωθεί ότι, Otus που ανήκουν στο γένος

Helicobacter

και

Desulfovibrio

αυξήθηκαν μόνο μετά DSS /ΑΟΜ στο

SIRT1

L2 /L2

ποντίκια (Σχήμα 3G και Πίνακας S4 στο S1 αρχείου). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και ο ρόλος του

Helicobacter

σε καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει αμφιλεγόμενη [38],

Desulfovibrio

θεωρείται ότι λαμβάνει μέρος στην παθογένεση της ελκώδους κολίτιδας και της νόσου του Crohn [39]. Μικροβιακές κοινότητες στο

SIRT1

L2 /L2

και

SIRT1

int – /- ποντίκια

μετά τη θεραπεία DSS /ΑΟΜ δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές (Σχήμα 3θ). Συνολικά, υποθέτουμε ότι οι αλλαγές στη γενική μικροβιακή κοινότητα υπό κανονικές συνθήκες (Σχήμα 2), καθώς και σε ειδικά γένη μετά DSS /ΑΟΜ, θα μπορούσε να καθορίσει τη διαφορετική ευαισθησία των δύο γονότυπων με κολίτιδα και ο CAC.

δίσκους SPDEF υπερ-ακετυλιωμένες Paneth και ωρίμανση λαγηνοειδών κυττάρων μετά από εντερική ειδικές

SIRT1

διαγραφή

για να καταλάβουμε τις μοριακές αλλαγές που οδήγησαν στη λήψη αυτών εξέχουσα φαινοτύπους, θα διερευνηθούν διάφορες πιθανές οδούς που συμβάλλουν στην Paneth και λαγηνοειδών κυττάρων ανάπτυξη και ωρίμανση. Δεδομένου ότι η εντερική τύπους κυττάρων διαφοροποιούνται από εντερικά βλαστοκύτταρα (ISC) [3], θα αξιολογηθούν πρώτα αν

SIRT1

διαγραφή μπορεί να επηρεάσει τον πληθυσμό ISC.