Abstract

Σε πολλούς τύπους καρκίνων, μία πλευρική πληθυσμός (SP) έχει ταυτοποιηθεί με βάση την υψηλή ικανότητα εκροής, έτσι εμπλουτίζοντας για χημειοθεραπεία κύτταρα καθώς επίσης και για τις υποψήφιες καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC). Εδώ, θα διερευνηθεί κατά πόσον παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα του ανθρώπου (PDAC) περιέχει ένα SP, και αν το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του συνδέεται με χημειοαντίσταση, CSC και την πρόγνωση. Μετά διασπορά σε απλά κύτταρα και επώαση με βαφή Hoechst, αναλύσαμε τα ανθρώπινα PDAC εκτομές των δειγμάτων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACS). Έχουμε εντοπίσει ένα SP και κύρια πληθυσμού (MP) σε όλα τα δείγματα εκτομή του ανθρώπου PDAC (n = 52) που αναλύθηκαν, αλλά ανιχνεύεται ανοσοποιητικού (CD45

+) και ενδοθηλιακά (CD31

+) κυττάρων σε αυτό το κλάσμα μαζί με τα καρκινικά κύτταρα . Τα κύτταρα SP και ΜΡ, ή περισσότερο καθαρισμένων κλασμάτων απεμπλουτισμένου από CD31

+ /CD45

+ κύτταρα (PSP και ΠΜΣ), ταξινομήθηκαν με FACS και υποβλήθηκαν σε ανάλυση έκφρασης ολόκληρου γονιδιώματος. Αυτό αποκάλυψε προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με την αντίσταση στην θεραπεία και των δεικτών που προσδιορίζονται πριν από το υποτιθέμενο παγκρέατος CSC. γονίδιο υπογραφές πάροχο 32 ή 10 σε απότομη ανωφέρεια ή μειωτικά γονίδια αναπτύχθηκαν και δοκιμάστηκαν για διακρίσεις αρμοδιοτήτων μεταξύ PSP και PMP στη διαφορετικά σύνολα δειγμάτων PDAC. Η προγνωστική αξία των γονιδίων pSP ελέγχθηκε σε μια μεγάλη ανεξάρτητη σειρά ασθενών PDAC (n = 78) με τη χρήση nCounter ανάλυση της έκφρασης (σε όγκο

έναντι

περιβάλλοντα παγκρεατικού ιστού) και Cox παλινδρόμησης για ελεύθερη νόσου και τη συνολική επιβίωση. Από αυτά τα γονίδια, τα επίπεδα έκφρασης

ABCB1

και

CXCR4

συσχετίστηκαν με χειρότερη επιβίωση του ασθενούς. Έτσι, η μελέτη μας για πρώτη φορά καταδεικνύει ότι το ανθρώπινο PDAC περιέχει ένα SP. Αυτός ο υποπληθυσμός όγκου μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα πολύτιμο θεραπευτικό στόχο δίνεται chemoresistance- και CSC που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά της γονιδιακής έκφρασης με τους πιθανούς προγνωστική αξία

Παράθεση:. Van den Broeck Α, Vankelecom Η, Van Delm W, Gremeaux L, Wouters J , Allemeersch J, et al. (2013) Η ανθρώπινη καρκίνο του παγκρέατος Περιέχει μια πλευρά πληθυσμού που εκφράζει τον Καρκίνο Stem Cell-Associated και προγνωστικά γονίδια. PLoS ONE 8 (9): e73968. doi: 10.1371 /journal.pone.0073968

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 15, 2013? Αποδεκτές: 23, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Van den Broeck et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίζεται από το Ταμείο Επιστημονικής Έρευνας Φλάνδρα (FWO ASP-08-00379? 3M080177). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά το μεγάλο προσπάθειες για τη βελτίωση της πρόγνωσης της, τον καρκίνο του παγκρέατος (αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου ή PDAC) παραμένει μια σημαντική αιτία της θνησιμότητας λόγω καρκίνου που σχετίζονται με [1]. Καθυστερήσει την ανίχνευση και την αντίσταση θεραπεία είναι βασικοί παράγοντες της αποτυχίας της θεραπείας PDAC. Μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών στους οποίους βασίζεται η αντίσταση θεραπεία είναι επομένως απαραίτητη. Σε διάφορους τύπους καρκίνου, μία πλευρική πληθυσμός (SP) έχει ταυτοποιηθεί ως ένα υποπληθυσμό που εμπλουτίζει για κύτταρα που είναι χημείο- και ραδιο-ανθεκτικών λόγω της παρουσίας των μεταφορέων πολυφαρμάκου και την ικανότητα για την επισκευή βλάβης του DNA και αντέχουν απόπτωσης [2]. Με βάση την ικανότητα εκροής τους, τα κύτταρα SP προσδιορίζονται στο κυτταρομετρίας ροής (FACS) ως πλευρικό κλάδο των «Hoechst-χαμηλή» κύτταρα μετά από επώαση με τη χρωστική Hoechst33342 [3].

αντίσταση Therapy θεωρείται επίσης ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των λεγόμενων «βλαστικά κύτταρα του καρκίνου» (CSC) [4]. CSC πιστεύεται να επιβιώσουν συμβατικές θεραπείες και, ως εκ τούτου υπεύθυνος για την υποτροπή του όγκου. Υποψήφιες παγκρεατική πληθυσμοί CSC έχουν πρόσφατα ταυτοποιηθεί με βάση δείκτες κυτταρικής μεμβράνης. CD24

+ /CD44

+ /επιθηλιακό μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM)

+ κύτταρα και CD133

+ κύτταρα φαίνεται να εμφανίζει ιδιότητες CSC [5], [6]. Ωστόσο, μόνο μερική επικάλυψη βρέθηκε μεταξύ των διαφορετικών αυτών παγκρέατος πληθυσμούς CSC, υποδεικνύοντας την ανάγκη για εναλλακτικές στρατηγικές αναγνώρισης. Σε διάφορους τύπους καρκίνου, το SP έχει δειχθεί να εμπλουτιστεί για CSC (-όπως) φαινότυπο και δραστηριότητα [7]. Όσον αφορά τον καρκίνο του παγκρέατος, ένας SP είχε προηγουμένως βρεθεί σε καλλιεργημένες κυτταρικές σειρές [8] – [11], και πρόσφατα, η ομάδα μας εντόπισε SP σε ξενομοσχεύματος όγκους που αναπτύσσονται από ανθρώπινα δείγματα PDAC σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς [12]. Αυτά τα ΚΕΕ απέδειξε ότι διαθέτει χημειοθεραπεία ικανότητα. Ωστόσο, δεν έχει αποδειχθεί κατά πόσον PDAC απευθείας από τον ασθενή, χωρίς να παρεμβαίνει καλλιέργεια ή την επέκταση στο περιβάλλον ξενιστή ποντικού, περιέχει επίσης ένα SP. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι PDAC απομονώθηκαν από ασθενείς φιλοξενεί ένα SP και ότι αυτή η SP εκφράζει γονίδια που σχετίζονται με παγκρεατική CSC και χημειοαντίσταση, καθώς και με την πρόγνωση των ασθενών.

Υλικά και Μέθοδοι

PDAC δείγματα και SP Ανάλυση

Μεταξύ του 2008 και του 2010, PDAC χειρουργική εκτομή δειγμάτων ελήφθησαν από 52 ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Leuven (UZ Leuven, Βέλγιο), μετά από έγγραφη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας UZ /KU Leuven πριν από την πρόσληψή του ασθενούς, και έλαβε τον αριθμό μελέτης ML3452. Η μελέτη καταχωρήθηκε στο clinicaltrials.gov υπό τον αριθμό NCT00936104. Μετά την εκτομή, μπλοκ όγκου κόβονται σε μικρά τεμάχια και επωάστηκαν με κολλαγενάση τύπου IV (1 mg /ml σε μέσο 199? Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) για 2-3 ώρες ενώ μηχανικά διασκορπίζονται σε τακτά 20 λεπτών χρονικά σημεία. Το τελικό κυτταρικό εναιώρημα διηθήθηκε μέσω ενός 40 μm νάιλον πλέγματος (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium), και ο αριθμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε. Η βιωσιμότητα των κυττάρων που λαμβάνονται μετά τη διασπορά των ιστών PDAC ήταν συνήθως ~ 50% και η απόδοση του 400 mm

3 πρόσφατα ληφθέντα δείγματα PDAC ήταν περίπου 3 × 10

6 ζωντανά κύτταρα.

SP ανάλυση έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως

3. Τα κύτταρα επωάστηκαν με Hoechst33342 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium) κατά τη διάρκεια 90 min σε μια τελική συγκέντρωση 5 μg /ml, και αναλύθηκαν με FACS (FACSVantage SE, που είναι εξοπλισμένα με FACS λογισμικό DIVA, έκδοση 6.0? BD Biosciences). Τα λέιζερ χρησιμοποιήθηκαν ήταν: κοντά-UV (375 nm, 10 mW έξοδος), μπλε (488 nm, 13 mW) και το κίτρινο-πράσινο (561 nm, 30 mW). Τα φίλτρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 450/40 για τη Hoechst μπλε? 630/22 και 610 LP για Hoechst κόκκινο? 530/30 και 520 LP για FITC? και 582/15 για το PE. Ιωδιούχο προπίδιο (2 μg /ml? Sigma-Aldrich) προστέθηκε για να σηματοδοτήσει μη βιώσιμα κύτταρα, με εξαίρεση τα συντρίμμια στην Hoechst-μπλε και Hoechst-κόκκινο κανάλι. Dual-μήκους κύματος ανάλυση FACS εντόπισε πλευρικό κλάδο των κυττάρων «Hoechst-χαμηλή» ως SP, επαληθεύεται περαιτέρω με συν-προσθήκη βεραπαμίλη (100 μΜ? Sigma-Aldrich) που έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους SP μπλοκάροντας την εκροή χρωστικής μέσω πολυφαρμάκου μεταφορέα (-ων). Ο κύριος πληθυσμός (MP) ήταν περιφραγμένο με το μεγαλύτερο μέρος της «Hoechst-φωτεινό» κύτταρα. Για περαιτέρω χαρακτηρισμό, τα κύτταρα PDAC ανοσοχρωματίστηκαν για την ενδοθηλιακή CD31 δείκτη και του αιμοποιητικού /ανοσοποιητικό CD45 δείκτη. Μετά την επώαση με τη Hoechst, τα κύτταρα διαλύθηκαν σε χρώση ρυθμιστικό (PBS + 2% FBS), και φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου αντι-ανθρώπινο CD31 και φυκοερυθρίνη (ΡΕ) -σημασμένου αντισώματα αντι-ανθρώπινο CD45 προστέθηκαν χρησιμοποιώντας αραιώσεις που συνιστώνται από τον κατασκευαστή (BD Biosciences). Τόσο ισοτύπου (BD Biosciences) και θετικοί έλεγχοι διεξήχθησαν. Πρόσθετες χρώσεις δεν έγιναν όπως αυτά θα μπορούσε να εμποδίσει την ανάλυση του αποτελέσματος FACS.

Ολόκληρο-γονιδίωμα Ανάλυση έκφρασης από μικροσυστοιχιών

25000 SP και 25000 κύτταρα MP (ολική ή εξαντλημένα από CD45

+ /CD31

+ κύτταρα) ταξινομήθηκαν με FACS σε ψυχρό διάλυμα λύσης του RNeasy Micro Kit (Qiagen, Venlo, Ολλανδία). Ολικό RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα προσδιορίστηκαν φασματοφωτομετρικά με τη χρήση του συστήματος Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) και η ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Μόνο δείγματα με RNA Ακεραιότητα Αριθμός (RIN) ≥7.5 χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση μικροσυστοιχιών στο VIB Nucleomics πυρήνα (www.nucleomics.be). RNA ενισχύθηκε με το κιτ NuGEN Pico WTA (Nugen Technologies, Σάντα Carlos, CA) και στη συνέχεια βιοτινυλιώθηκε. Το τελικό μείγμα aRNA καθαρίστηκε και αποσπασματική, και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε επί Affymetrix HG U133 Plus 2.0 συστοιχίες (Affymetrix, Santa Clara, CA), που ακολουθείται από χρώση και πλύσιμο σε ένα σταθμό ρευστών GeneChip 450 (Affymetrix) σύμφωνα με τις διαδικασίες του κατασκευαστή. Για τη μέτρηση της ακατέργαστης καθετήρα εντάσεις σήματος, τσιπς σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα GeneChip σαρωτή 3000 (Affymetrix) και αναλύθηκαν με το πακέτο affy_1.26.0 (Bioconductor, Seattle, WA).

Στατιστική και λειτουργική ανάλυση των μικροσυστοιχιών Δεδομένων

Τα στοιχεία των πρώτων μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν εντός συστοιχίες και μεταξύ των συστοιχιών μετά την Στιβαρή πολλαπλών μικροπλακετών Μέση (RMA) διαδικασία [13]. Το 5,0 αλγόριθμο MAS (οδηγίες χρήσης μικροσυστοιχιών σουίτα, έκδοση 5? Affymetrix 2001) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση ανίχνευσης πάνω από το υπόβαθρο. Από τα 54.616 σετ καθετήρα, 10255 ήταν κάτω υπόβαθρο και παραληφθεί από την περαιτέρω ανάλυση. Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) έγινε με το πακέτο pcurve από Bioconductor και χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των κύριων πηγών διακύμανσης μεταξύ των δειγμάτων. Για τη συγκριτική ανάλυση μεταξύ SP και βουλευτής, δεδομένα ζεύγη ανά ασθενή. Το πακέτο limma από Bioconductor χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η αντίθεση μεταξύ SP και MP [14]. Η στατιστική σημαντικότητα αυτής της αντίθεσης δοκιμάστηκε με ένα μετριάστηκε t-test (εφαρμόζονται σε limma). Σημαντικά ανάντη ή μειωτικά γονίδια ορίστηκαν ως γονίδια με ≥2 φορές αλλαγή (log

2 SP /MP≥1 ή ≤-1), σε συνδυασμό με την P & lt? 0.001. Κλασική συστήματα για την προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές μπορεί να οδηγήσει σε χαμηλή στατιστική ισχύ για τις μελέτες των μικροσυστοιχιών. Η αυστηρή cut-off της P & lt? 0,001 χρησιμοποιήθηκε ως μια εναλλακτική, ρεαλιστική προσέγγιση για την εξισορρόπηση του αριθμού των ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών [15]. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης είναι διαθέσιμα από την Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) μέσω του αριθμού ένταξη σειρά GSE42404. Λειτουργική ανάλυση της οδού σε όλα τα σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων σετ ανιχνευτών έγινε με το πρόγραμμα Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com? Redwood City, CA), χτισμένο στην εφευρετικότητα της Γνωσιακής Βάσης, ένα χειροκίνητο επιμέλεια βάση δεδομένων βιβλιογραφίας. Όλα τα σετ καθετήρα με διορθωμένη τιμή p & lt? 0.001 και φορές μεταβολής & gt? 2 ή & lt? -2 Χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος. Στην περίπτωση πολλαπλοί ανιχνευτές που αναφέρονται στο ίδιο γονίδιο, ο μέσος όρος log

2-αναλογία του συνόλου των τιμών εισόδου για αυτό το γονίδιο λήφθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Παραγόμενη δίκτυα διατάχθηκαν από ένα αποτέλεσμα που σημαίνει σημασία, εκτιμάται ως η αναλογία του αριθμού των ανιχνευτών εισόδου που αντιστοιχίζεται στην οδό διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των διερευνητών οδού. Σημασία των βιολογικών λειτουργιών και κανονικών μονοπατιών ελέγχθηκαν με ακριβή τιμή p τεστ Fisher μετά την εφαρμογή της μεθόδου Benjamini-Hochberg πολλαπλών διόρθωση δοκιμών. Μονοπάτια θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05. Πρόσθετες ταυτοποίηση των βιολογικών λειτουργιών (Gene Ontology, GO) και KEGG (Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων) μονοπατιών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID, έκδοση 6.7, http: //www.david.abcc. ncifcrf.org). Για την ανάλυση αυτή, καθετήρα θέτει με διορθωμένο lt τιμή p &? 0.001 και & gt? 2,0 φορές αλλαγή χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος. Η βαθμολογία ευκολία, μια τροποποιημένη exact test p-value του Fisher, χρησιμοποιήθηκε για την προσαρμογή για πολλαπλές δοκιμές.

Ανάπτυξη ενός Gene Υπογραφή

επιτηρούμενο στρατηγική μάθησης εφαρμόστηκε στα δεδομένα μικροσυστοιχιών του CD45

– /CD31

– SP και των πληθυσμών MP (δηλαδή το καθαρισμένο SP ή το pSP, και το ΠΜΣ). Μια λίστα των 200 γονιδίων που ενδιαφέρουν αποτελούνταν βασίζεται σε μια εμπεριστατωμένη μελέτη της βιβλιογραφίας, χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους όρους: «καρκίνο του παγκρέατος», «καρκίνος των βλαστικών κυττάρων», «πλευρά του πληθυσμού», «κανονική μονοπάτια», «βλαστική ικανότητα γονίδια», «επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) »,« πολυφαρμακευτική αντίσταση »,« ογκογονίδια »και« Polycomb γονίδια ». Τα προεπεξεργασμένα δεδομένα περιορίστηκαν σε 512 σύνολα ανιχνευτή (195 γονίδια) που είχε τα σύμβολα γονιδίου στον κατάλογο των 200 γονιδίων που ενδιαφέρουν. Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν 29 διαφορετικές προσεγγίσεις ταξινόμησης, που αντιπροσωπεύουν διάφορους συνδυασμούς των 5 μοντέλα κατάταξης, 3 τρόποι επιλογής χαρακτηριστικών και 3 κατάταξη μεθόδους [16]. Η αξιολόγηση αυτών των προσεγγίσεων έγινε χρησιμοποιώντας την άδεια-one-out-διασταυρωμένης επικύρωσης (LOOCV) για να δημιουργήσει ένα χαρακτηριστικό λειτουργίας λήπτη (ROC) καμπύλη [17]. Οι μονομεταβλητές μέθοδοι επιλογής χαρακτηριστικών αποδείχθηκε ότι δεν έχουν καμία προστιθέμενη αξία από την βέλτιστη προσέγγιση με την υψηλότερη περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC) και το χαμηλότερο ισορροπημένη ποσοστό σφάλματος (BER) αποτελείται από μια μηχανή διανυσμάτων υποστήριξης χωρίς προηγούμενη χαρακτηριστικό κατάταξη ή την επιλογή (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται ). Για να μειωθεί περαιτέρω το γονίδιο υπογραφή, χρησιμοποιήσαμε τη στρατηγική Πίντα για υποψήφιο γονίδιο προτεραιοτήτων [18]. Με την εξέταση διαφορική έκφραση της γειτονιάς ενός γονιδίου σε ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης μεταξύ πρωτεϊνών γονιδιώματος σε επίπεδο, η στρατηγική Pinta εκτελεί αποτελεσματικά πολυμεταβλητή επιλογής χαρακτηριστικών μέσω της ενσωμάτωσης προηγούμενη γνώση της μοριακής βιολογίας. Μια ομάδα 32 γονιδίων ορίστηκε ως σημαντικές, και επιλέχθηκαν τα σετ καθετήρα με το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης. Τέλος, η υπογραφή Πίντα περαιτέρω περιορίστηκε σε αυτές τις 10 γονίδια με τη μεγαλύτερη αλλαγή φορές (προς τα πάνω ή προς τα κάτω).

Η προγνωστική αξία της 32-γονιδίου και της μειωμένης 10-γονίδιο υπογραφή επικυρώθηκε με LOOCV σε διαφορετικές SP

συνόλων δεδομένων σε σχέση με

MP.

nCounter Ανάλυση

Μεταξύ του 2006 και του 2010, δείγματα ιστών συλλέχθηκαν, μετά από ενυπόγραφη συναίνεση, από τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε παγκρεατικά εκτομή για PDAC. Τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C σε RNAlater (Qiagen). Από τον πρωτογενή όγκο 143 ασθενείς και από τον περιβάλλοντα μη-καρκινικές παγκρεατική (έλεγχος) ιστού από τους 14 ασθενείς, ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μόνο δείγματα με αριθμό ακεραιότητα του RNA (RIN) της & gt? 7.0 χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση, δηλαδή 78 δείγματα PDAC (θηλυκό αναλογία ανδρών /: 41/37? Ηλικία: 32 – 80 yr με διάμεση τιμή 64 έτη) και 6 ιστούς ελέγχου (αρσενικό /θηλυκό αναλογία: 4/2? ηλικία: 51-66 yr με διάμεση τιμή 63 έτη). Τα χαρακτηριστικά του όγκου και προγνωστικά χαρακτηριστικά (με παρακολούθηση μέχρι τον Ιούλιο του 2011) από τους 78 ασθενείς που παρέχονται (βλέπε πίνακα S1). Χρησιμοποιώντας το σύστημα nCounter (Nanostring Technologies, Seattle, WA), τα επίπεδα έκφρασης των παραπάνω καθορισμένων γονιδίων υπογραφή προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε παγκρεατικά καρκινικά

έναντι

περιβάλλοντα ιστό (VIB Nucleomics Πυρήνας) [19].

ABCB1 ανοσοϊστοχημεία σε PDAC εκτομή δείγματα

για να αναλυθεί η έκφραση των πρωτεϊνών ABCB1 με ανοσοϊστοχημεία, 5-μm τομές παρασκευάζονται από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη PDAC δείγματα από τους 11 ασθενείς των οποίων η pSP και ρΜΡ RNA χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυσης μικροσυστοιχιών. Μετά αποπαραφινώσεως και ενυδάτωσης των διαφανειών, ανάκτηση στόχου έγινε με EnVision FLEX στόχος Ανάκτηση Λύση (Dako, Glostrup, Δανία) κατά τη διάρκεια 20 λεπτών. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο EnVision υπεροξειδάσης-Blocking (Dako) επί 5 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (αντι-ανθρώπινο ABCB1 από Monosan, Uden, The Netherlands) στη συνιστώμενη αραίωση (1/20) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα πλακίδια υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας το EnVision διπλής σύνδεσης (Dako). Το συγκρότημα οπτικοποιήθηκε με DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη? Dako), ακολουθούμενο από ένα αιματοξυλίνη (Dako) αντιχρωματισμός. Εικόνες ελήφθησαν με μια Leica DC 300 φωτογραφική μηχανή σε ένα μικροσκόπιο Leica DMLB

Στατιστική Ανάλυση

στατιστικού λογισμικού SAS (έκδοση 9.1? SAS Institute, Cary, NC). Χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) ήταν υπολογίζονται με τη μέθοδο Kaplan-Meier (Πίνακας S1). Για να δοκιμαστεί προγνωστική αξία των γονιδίων, μονοπαραγοντική ανάλυση για DFS και OS διεξήχθη χρησιμοποιώντας Cox παλινδρόμησης με και χωρίς περιορισμούς κυβικά splines (RCS), που ακολουθείται από πολυπαραγοντική ανάλυση για το OS χρησιμοποιώντας Cox παλινδρόμησης. Ένα επιλεγμένο μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των ανεξάρτητων μεταβλητών που έχουν ήδη συσχετιστεί με την επιβίωση (ECLNI, το φύλο, PM και ΠΡ? Βλέπε πίνακα S1).

Αποτελέσματα

Ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος Περιέχει μια πλευρά Πληθυσμός

δείγματα εκτομής Ανθρώπινα PDAC αναλύθηκαν για την παρουσία ενός πλευρικού πληθυσμού (SP). Σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν (n = 52), ένα SP εντοπίστηκε αντιπροσωπεύει μεταξύ 0,2 και 21,5% (μέσος όρος: 1,8%). Του συνόλου των PDAC κύτταρα (Εικ. 1Α)

Α) Dot οικόπεδο διπλής μήκος κύματος ανάλυση FACS των νωπών ανθρωπίνων κυττάρων PDAC μετά από επώαση με Hoechst33342 απεικονίζει μια ουρά του «Hoechst-χαμηλή» κύτταρα (SP), σε σχέση με ένα μεγαλύτερο όγκο του «Hoechst-φωτεινά» κύτταρα, ο κύριος πληθυσμός (ΜΡ) (

αριστερά πάνελ

). Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα παρουσιάζεται και το ποσοστό SP ενδείκνυται. PI

(νεκρά) κύτταρα pos εξαιρέθηκαν από την ανάλυση για Hoechst33342, CD45 και CD31 επισήμανση. Η boxplot (

ένθετο

) συνοψίζει τις αναλογίες SP των δειγμάτων 52 PDAC αναλύονται. μπλοκ βεραπαμίλη Hoechst εκροή, μειώνοντας έτσι το μέγεθος του SP και επιβεβαιώνοντας το φαινότυπο SP (

δεξί πάνελ

). Β) FACS dot πλοκή του PDAC SP, ανοσοχρώση για CD45 και CD31. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα φαίνεται. Οι αριθμοί δείχνουν τις αναλογίες των CD45

+, CD31

+ και CD45

– /CD31

– κυττάρων εντός του SP. Ανάλυση C) Principal Component (PCA) του πλήρους προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος που λαμβάνεται από το CD45

– /CD31

– SP (PSP,

κόκκινο

) και CD45

– /CD31

– MP (PMP,

μπλε

) (n = 11). Δ) Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ABCB1 σε PDAC δείγματα εκτομής (n = 11). Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα (4% SP στην ανάλυση FACS) εμφανίζεται. Αρχική μεγέθυνση: x200 (

αριστερά

) και X400 (

δεξιά

)

Η

SP και κύτταρα «κύριο πληθυσμό» (MP) (βλέπε σχήμα 1Α για.. gating) ταξινομήθηκαν με FACS και υποβλήθηκαν σε προφίλ έκφρασης ολόκληρου γονιδιώματος (n = 10 PDAC). Ingenuity Pathway Analysis (ΙΡΑ) αποκάλυψε στα γονίδια SP και τα μονοπάτια που σχετίζονται με ανοσολογικές διαδικασίες, όπως «διαφοροποίηση Τ-βοηθητικών κυττάρων», «Η επικοινωνία μεταξύ έμφυτη και προσαρμοστική ανοσοκύτταρα» και «ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). κύτταρα ανοσοποιητικού-τύπου, καθώς επίσης και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, είναι γνωστό ότι συν-διαχωρίζονται σε κυμαινόμενες εκτάσεις στο SP των ιστών και όγκων. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την ανθρώπινη PDAC SP με κυτταρομετρία ροής για την έκφραση του ανοσοποιητικού /αιμοποιητικών CD45 δείκτη και το CD31 ενδοθηλιακού δείκτη. Περίπου το 60% των κυττάρων SP είναι CD45

+ (διάμεσος: 61,4%, εύρος: 19,5 – 75,4%? N = 18), ενώ μόνο ένας μικρός αριθμός κυττάρων SP είναι CD31

+ (διάμεσος: 0,7%, εύρος: 0,2 έως 2,1%? n = 15) (Σχήμα 1Β).. CD45

+ και CD31

+ κυττάρων παρατηρήθηκαν επίσης στο MP σε συγκρίσιμα επίπεδα (διάμεση τιμή 63,7% και 1,6%? Και το εύρος: 41,1 – 75,4% και το 0,1 – 6,7%, αντίστοιχα). Για τις επόμενες αναλύσεις, το SP και βουλευτής είχαν εξαντληθεί από τον CD45

+ και CD31

+ κύτταρα.

Το καθαρισμένο PDAC SP δείχνει την έκφραση του CSC που σχετίζονται με γονίδια

Εμείς ταξινομημένο το CD45

– /CD31

– SP και CD45

– /CD31

– κύτταρα MP (αναφέρεται επίσης ως καθαρισμένα SP ή το pSP, και να καθαριστούν βουλευτής ή PMP, αντίστοιχα) από 11 δείγματα PDAC και και πάλι εκτελούνται σε ολόκληρο το γονιδίωμα του προφίλ έκφρασης. Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) δείχνει ότι το σύμπλεγμα ΠΥΠ και να διαχωρίζει από τους PMPs (Σχήμα 1C).

Από τις 1861 σειρές ανιχνευτών που εκφράζονται διαφορικά (≥2 φορές, σ & lt? 0.001)., 993 είναι υπερεκφράζεται στο pSP και 868 είναι μειωτικά (βλ GEO, αριθμός ένταξης GSE42404). Ο μεταφορέας πολυανθεκτικά

ABCB1

(

MDR1

,

P-γλυκοπρωτεΐνη

) είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται στο ΠΜΣ

έναντι

η ρΜΡ (πάσο: 5.3, p & lt ? 0.001), και δυνητικά υποκείμενων το φαινότυπο SP. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε έκφραση ABCB1 σε κύτταρα όγκου PDAC, που βρίσκεται κυρίως στην κορυφαία επιφάνεια των κυττάρων (η = 11 δείγματα PDAC? Σχ. 1D).

ABCG2

, ένα άλλο μεταφορέα που μπορεί να μεσολαβήσει SP εκροή, δεν εκφράζονται διαφορικά (ρ & gt? 0.5), αλλά το σήμα μικροσυστοιχία ήταν γενικά χαμηλή και δεν πάνω από το υπόστρωμα στο μισό των δειγμάτων. Είναι ενδιαφέρον, που περιγράφηκε προηγουμένως παγκρέατος δείκτες CSC (συμπεριλαμβανομένων των

CD44, CD133

και

CXCR4

) υπερεκφράζονται σημαντικά στο PSP (Πίνακας S2). Επιπλέον, άλλες (καρκίνο) «βλαστική ικανότητα» γονίδια (όπως

LGR4, SOX9, KLF5

και

MET

) επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω στο PSP.

Από όλους διαφορικά εκφρασμένων σετ καθετήρα, 1690 θα μπορούσαν να αντιστοιχίζονται με τα γονίδια της Ingenuity Γνωσιακής Βάσης και υποβλήθηκαν σε ΙΡΑ (Πίνακας S3). Τα δίκτυα πιο απορυθμίζεται στο ΠΜΣ είναι «οξύ μεταβολισμό αμινο» (που περιλαμβάνει

HNF4A

ή «ηπατοκυττάρων πυρηνικού παράγοντα 4α», διπλός: 2,7, p & lt? 0.001), «κυττάρων-να-κυττάρων σηματοδότησης» ( η οποία περιλαμβάνει

TJP2

ή «σφιχτά διασταύρωση πρωτεΐνη 2 ‘, διπλός: 2.4, p & lt? 0.001) και« κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό «(που περιλαμβάνει

ΕρίιΑ2

ή« Α2 υποδοχέων εφρίνης », διπλώστε : 2,1, p & lt? 0.001? και

EphA4

, διπλός:. 2.6, σ & lt? 0.001)

Βιολογικές λειτουργίες εμπλουτισμένο στο ΠΜΣ

έναντι

την ρΜΡ περιλαμβάνει «Cellular κίνημα »,« ΟβΙΙ-προς-κύτταρο σηματοδότηση και αλληλεπίδραση »,« κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό »,« Εμβρυϊκή ανάπτυξη »,« μορφολογία Tumor »και« του καρκίνου »(Πίνακας S3). Να διακρίνει μεταξύ pSP- και ΡΜΡ συνδέονται βιολογικών λειτουργιών με περισσότερες λεπτομέρειες, εφαρμόστηκε ανάλυση DAVID. Clusters που σχετίζονται με την «κυττάρου-κυττάρου διασταύρωση» (Εμπλουτισμός Score ή ES: 6,8), «Η δράση κινάσης πρωτεϊνών» (ES: 3.4), «Ανάπτυξη» (ES: 3,0), «μιτογόνο ενεργοποιημένη (ΜΑΡ) δραστηριότητα κινάσης» (ES: 1.8), «η ιντεγκρίνη σηματοδότηση» (ES: 1,6) και «ο κανονισμός της απόπτωσης» (ES: 1.4) είναι εμπλουτισμένα στο ΠΜΣ

Canonical μονοπάτια, με βάση διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, επίσης αναλύθηκαν με τη χρήση του ΜΠΒ.. Ένας αριθμός 46 κανονικών μονοπατιών φτάσει το σημαντικό εμπλουτισμό SP αποκοπής του ρ & lt? 0,05, συμπεριλαμβανομένης της «Human πλειοδυναμία εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα», «Tight σηματοδότηση διασταύρωση», «σηματοδότηση ΝΡ-κΒ», «σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, «Η ιντεγκρίνη σηματοδότηση» και «εφρίνης σηματοδότηση» (Πίνακας S3). Περαιτέρω λεπτομερή ανάλυση χρησιμοποιώντας DAVID (οδοί KEGG) έδειξε προς τα πάνω ρύθμιση του «μονοπατιού σηματοδότησης ErbB» (συμπεριλαμβανομένων των

ErbB3

, διπλός: 2,1, p & lt? 0.001). Στο ΠΜΣ

Υπογραφές Gene που εισάγουν διακρίσεις η PDAC από το pSP το ρΜΡ

Χρησιμοποιώντας μια εποπτευόμενη στρατηγική μάθησης που εφαρμόζονται στα δεδομένα έκφρασης ολόκληρου του γονιδιώματος από το 11 CD45

– /CD31

– pSP και ρΜΡ ζεύγη όπως αναλύθηκε παραπάνω, έχουμε αναπτύξει μια το σύνολο των 512 σετ καθετήρα (195 γονίδια) ως πιθανούς «γονίδιο υπογραφή pSP». Η ακρίβεια να διακρίνει μεταξύ PSP και ρΜΡ χρήση αυτής της υπογραφής ήταν 95% στην ομάδα της κατάρτισης, όπως αξιολογήθηκε με LOOCV (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Χρησιμοποιώντας Πίντα (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), αυτό το μεγάλο γονίδιο υπογραφή pSP μειώθηκε σε 32 γονίδια, εκ των οποίων 19 είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω και 13 ρυθμίζεται προς τα κάτω (Πίνακας S4). Επικύρωση του μειωμένου αυτού του γονιδίου υπογραφή PSP στα αρχικό σύνολο δεδομένων (n = 11 δείγματα PDAC) έδειξε ένα 91% ακρίβεια ταξινόμησης των PSP και PMP, συγκρίσιμη με την πρόβλεψη χρησιμοποιώντας την 195-γονίδιο υπογραφή. Εντός της 32-γονιδίου υπογραφή, γονίδια υπερεκφράζεται στο ΠΜΣ περιλαμβάνουν προταθεί προηγουμένως παγκρέατος δείκτες CSC (

CXCR4

,

CD133

) ή να παίξουν ένα ρόλο στην αντίσταση σε πολλά φάρμακα (

ABCB1

) και στα μονοπάτια σημαντικά στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου (βλέπε πίνακα S4).

Τέλος, περιορίζεται περαιτέρω το γονίδιο υπογραφή σε αυτά τα 10 γονίδια με μεγαλύτερη φορές άνω ή προς τα κάτω ρύθμιση (Πίνακας S4, με έντονους χαρακτήρες). Η ακρίβεια αυτής της συνοπτικής γονιδίου υπογραφής για τη διάκριση από το PSP ρΜΡ (90%) είναι συγκρίσιμη με την διακριτική δύναμη του συνόλου 32-γονιδίου.

Ως τελική δοκιμή της διακριτικής αξίας των 32- και 10- γονίδιο υπογραφές, εφαρμόσαμε δύο σύνολα σε ένα πρόσθετο, ανεξάρτητο σειρά 10 SP ζεύγη /MP χρησιμοποιώντας LOOCV. Και οι δύο υπογραφές γονίδιο παρουσίασε διακρίσεις ακρίβεια μεταξύ SP και βουλευτής του 85%.

προγνωστική αξία της ABCB1 και CXCR4

Για να διερευνηθεί αν τα γονίδια του ΠΜΣ (32- και 10-) γονίδιο υπογραφές έχουν προγνωστική αξία, τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά σε μια ανεξάρτητη σειρά των ασθενών (n = 78? Πίνακας S1) σε όγκο

έναντι

περιβάλλοντα ιστό χρησιμοποιώντας ανάλυση nCounter (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε μονοπαραγοντική ανάλυση για δυνητικούς συσχέτιση με την πρόγνωση /επιβίωσης. Κατ ‘αρχάς, τα γονίδια υπογραφή υπερεκφράζεται στον ΙΦΣ που σχετίζονται με την πρόγνωση, ενώ δεν βρέθηκε συσχέτιση με γονίδια υπογραφή μειωτικά στο PSP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση του

ABCB1

και

CXCR4

σημαντικά συσχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση, δηλαδή με χαμηλότερο λειτουργικό σύστημα και DFS (Πίνακας S5). Η πολυπαραγοντική ανάλυση στη συνέχεια διεξήχθη στα γονίδια με p & lt? 0.1 στην μονοπαραγοντική ανάλυση (

ABCB1

,

ADAM10

,

Cdh1

,

CXCR4

,

ESRP1

,

MMP1

,

RAB25

,

ST14

), ορίζει

ABCB1

ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της κακής OS (Πίνακας S5) .

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, εντόπισε SP στον ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που περιγράφει την παρουσία ενός SP σε PDAC αναλύθηκαν από ασθενείς. Όπως και σε άλλους ιστούς και όγκους, ο PDAC SP περιέχει ένα κλάσμα του CD31

+ ενδοθηλιακά κύτταρα και CD45

+ ανοσοκύτταρα [20]. Στην παρούσα μελέτη, εστιάσαμε στη μη-ενδοθηλιακή, μη ανοσοποιητικό SP (PSP) και ελέγχεται το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του. Το ΠΜΣ αντιπροσωπεύει κυρίως καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων με δεδομένη την υψηλή έκφραση του

Cdh1

,

EpCAM, TJP1

και

TJP2

[21]. Σε αυτό το PDAC pSP βρήκαμε αυξορρύθμιση του μεταφορέα πολλαπλών φαρμάκων

ABCB1

, η οποία μπορεί να είναι υπεύθυνη για χημειοαντίσταση αυτών των κυττάρων. Ανοσοβαφή επιβεβαίωσε την παρουσία του ABCB1 στο PDAC, που βρίσκονται κυρίως στην κορυφαία επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, όπου μπορεί να προκύψει ενεργή μεταφορά ναρκωτικών. Προς τα πάνω ρύθμιση των παραγόντων απόπτωσης ρύθμισης (

Bcl2L11,

φορές: 2,9, p & lt? 0.001?

EphA2

, δείτε αποτελέσματα) στην PDAC pSP μπορεί να υποστηρίξει περαιτέρω χημειοθεραπεία χαρακτήρα του. Δείξαμε πρόσφατα ότι το SP είναι εξαιρετικά ανθεκτικό σε gemcitabine σε ένα μοντέλο ποντικού στο οποίο PDAC αναπτύχθηκε όπως ξενομοσχεύματα [12]. Αντίσταση του SP σε γεμσιταβίνη έχει επίσης αναφερθεί σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

in vitro

[8], [9], [11]. Στο σύνολό τους, το SP φαίνεται να αντιπροσωπεύει μια χημειοθεραπεία υποπληθυσμό του παγκρεατικού όγκου, και μπορεί έτσι να είναι ένας από τους δράστες για την αποτυχία της θεραπείας και υποτροπή του καρκίνου.

Σε διάφορους τύπους καρκίνου, το SP είναι εμπλουτισμένο για υποψήφιες CSC [7], [22]. Βρήκαμε ότι οι δείκτες που προσδιορίζονται πρόσφατα στην υποθετική πληθυσμούς CSC του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος, ρυθμίζονται προς τα άνω στην PDAC PSP. Επιπλέον, εντοπίσαμε κάποιες άλλες δείκτες «καρκίνος βλαστική ικανότητα» (π.χ.

LGR4, SOX9, KLF5, ΚΟΑ

), καθώς και του παγκρέατος παράγοντες εμβρυογένεση που σχετίζονται με τα οποία μπορεί να ξεκινήσει εκ νέου στο CSC (π.χ.

HNF4A

) [5], [6], [23] – [26]. Επιπλέον,

in silico

λειτουργική ανάλυση των δεδομένων έκφρασης αναδεικνύει την εμφάνιση των μονοπατιών της εμβρυϊκής ανάπτυξης και πλειοδυναμία εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων στην PDAC SP, υποστηρίζοντας περαιτέρω «βλαστική ικανότητα» του. Επίσης, σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές, το SP εμφανίστηκε εμπλουτισμένο σε CSC [9] – [11]. Παρ ‘όλα αυτά, είναι σαφές ότι απαιτούνται περισσότερα στοιχεία για να αποδειχθεί οριστικά το φαινότυπο CSC του PSP, συμπεριλαμβανομένης ογκογόνο δραστηριότητα

in vitro

(σχηματισμός σφαίρα) και

in vivo

(ανάπτυξη του όγκου σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια ).

Η PDAC pSP μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα ενδιαφέρον θεραπευτικό στόχο δίνεται chemoresistance- και CSC που σχετίζονται με το χαρακτήρα. Τα κύτταρα pSP εκφράζουν υψηλά επίπεδα του

CXCR4,

το οποίο κατά την ενεργοποίηση, μπορεί να διεγείρουν τα κύτταρα να μετακινήσετε ή να υποβληθούν σε «επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης» (EMT), μια διαδικασία που οδηγεί την εξέλιξη του καρκίνου και κακοήθεια. Σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές, το SP μπορεί πράγματι να ενεργοποιηθεί προς EMT όταν θεραπεύτηκαν με ΤΟΡβ [21]. Στο PDAC PSP, παρατηρήσαμε ρύθμιση προς τα άνω του

Smad3

, είναι γνωστό ότι μεσολαβούν TGFβ σηματοδότηση. Περαιτέρω ενδιαφέροντα,

CXCL12

, ο συνδετήρας του CXCR4, εκφράζεται έντονα στον περιβάλλοντα παγκρεατικού ιστού του όγκου PDAC (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και μπορεί να δελεάσει κύτταρα έξω του όγκου για εισβολή ή την περαιτέρω διάδοση. Κατ ‘αναλογία, η έκφραση CXCR4 έχει βρεθεί ότι χαρακτηρίζουν έναν υποπληθυσμό του CD133

+ παγκρεατική CSC που φαίνεται να είναι αρμόδιου για την μετάσταση του όγκου [6], [27].

Προς τα πάνω ρύθμιση

EphA2

και

EphA4

στο pSP είναι σύμφωνη με σημαντικό ρόλο του μονοπατιού σηματοδότησης εφρίνης στο PDAC παθογένεια. Έκφραση της EphA2 σε PDAC έχει συσχετιστεί με αυξημένη επεμβατικές και μεταστατική ικανότητα και κακή επιβίωση [28]. Knockdown έκφρασης EphA4 μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων PDAC [29]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η οδός σηματοδότηση ErbB ρυθμίζεται αυξητικά στο ΠΜΣ (ανάλυση KEGG), συμπεριλαμβανομένης της υψηλότερης έκφρασης

ErbB3

. Ο υποδοχέας ErbB3 παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του παγκρέατος, καθώς και σε παγκρεατικά ογκογένεση. Η υπερέκφραση του

ErbB3

συσχετίζεται με την προηγμένη PDAC στάδιο και μειωμένη συνολική επιβίωση, και πρόσφατα, το ρόλο της ως ισχυρός μεσολαβητής της σηματοδότησης ΡΙ3Κ έχει επισημανθεί [30], [31]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του ErbB3 μπορεί να είναι απαραίτητη για την αντίσταση σε μονοθεραπεία αναστολής EGFR. Συγκεκριμένα αναστολή δραστικότητας ErbB3 (π.χ. με MM-121) φαίνεται πολλά υποσχόμενη

in vitro,

και έτσι μπορούν επίσης να έχουν κλινικό δυναμικό [31]. Τόσο οι οδοί σηματοδότησης εφρίνης και ErbB μπορεί να παρουσιάσει πιθανούς θεραπευτικούς στόχους στην PDAC. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η μελέτη μας δεν εξέτασε την προγνωστική αξία του

ΕρίιΑ2

και

ErbB3

δεδομένου ότι αυτά τα γονίδια δεν περιλαμβάνονται στις υπογραφές pSP αξιολογούνται με βάση την επιβίωση.

Η ανεπτυγμένες υπογραφές γονίδιο pSP trustfully διακρίσεις ΠΜΣ από το ρΜΡ. Μερικά από τα αυξητικά γονίδια σχετίζονται με CSC «βλαστική ικανότητα του καρκίνου» /όπως

CXCR4, CD133, EpCAM

και

SOX9

[5], [6], [24], ενώ άλλοι είναι που σχετίζονται με την απόπτωση (

FASLG, TJP2, DUSP4

), η οδός ΜΑΡΚ (

MAP2K4, DUSP4

), και χημειοαντίσταση (

MMP1

, ένας

ETS1

γονίδιο-στόχος) [32], [33]. Επιπλέον, η υπογραφή περιέχει γονίδια που σχετίζονται με αυξημένη κινητικότητα και εισβολή (

ADAM10, RAB25, DUSP4, CXCR4

). Επίσης, ορισμένα από αυτά τα γονίδια μπορεί να αντιπροσωπεύουν υποσχόμενους στόχους.

Τέλος, αξιολογήσαμε την προγνωστική σημασία των γονιδίων που περιλαμβάνονται στις υπογραφές PSP.

CXCR4

και

ABCB1

σχετίζονται αρνητικά με την επιβίωση μετά από θεραπευτική εκτομή, η οποία βρίσκεται επίσης σε άλλες εκθέσεις [34], [35].