Αφηρημένο

-mammalian στόχος Η φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάση (PI3K) της ραπαμυκίνης (mTOR) άξονας σηματοδότησης έχει αναδειχθεί ως ένα νέο στόχο για θεραπεία του καρκίνου. Παράγοντες που αναστέλλουν την PI3K, mTOR ή και οι δύο είναι επί του παρόντος υπό ανάπτυξη. Ο αναστολέας mTOR αλλοστερική, RAD001, και του αναστολέα κινάσης διπλής ΡΙ3Κ /mTOR, BEZ235, είναι παραδείγματα αυτών των παραγόντων. Ήμασταν ενδιαφέρονται να αναπτύξουν στρατηγικές για την ενίσχυση της θεραπείας Caner mTOR στοχευμένες. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι BEZ235 μόνη ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη της ραπαμυκίνης ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο συνδυασμός υπο-βέλτιστες συγκεντρώσεις του RAD001 και BEZ235 ασκείται συνεργιστική αναστολή της ανάπτυξης των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μαζί με επαγωγή της απόπτωσης και G1 σύλληψης. Επιπλέον, ο συνδυασμός ήταν επίσης πιο αποτελεσματικό από οποιαδήποτε μόνη της στην αναστολή της ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων καρκίνου του πνεύμονα σε ποντικούς παράγοντα. Ο συνδυασμός έδειξε ενισχυμένη συνέπειες για την αναστολή της σηματοδότησης mTOR και μειώνοντας την έκφραση του c-myc και κυκλίνη D1. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 είναι μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Xu C-X, Li Υ, Yue P, Owonikoko TK, Ramalingam SS, Khuri FR, et al. (2011) Ο συνδυασμός του RAD001 και NVP-BEZ235 Ασκεί Synergistic Αντικαρκινική Δράση κατά του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e20899. doi: 10.1371 /journal.pone.0020899

Συντάκτης: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Μαρτίου του 2011? Αποδεκτές: 12 Μαΐου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 14, Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τη Γεωργία τον Καρκίνο του Συνασπισμού διακεκριμένο βραβείο του καρκίνου Μελετητής, ΝΙΗ R01 CA118450 και P01 CA116676 (Σχέδιο 1), Υπουργείο άμυνας IMPACT (Imaging και Μοριακής Μαρκαδόροι για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα: Προσεγγίσεις με μοριακούς στόχους, Συμπληρωματικά /καινοτόμες θεραπείες, και Θεραπευτική λεπτομέρειες) βραβείο W81XWH-05-0027 (Σχέδιο 5), ΜΑΧΗ (βιοδεικτών που βασίζονται σε προσεγγίσεις στοχευμένης θεραπείας για τον καρκίνο του πνεύμονα εξάλειψη) βραβείο W81XWH-06-1-0303 (Σχέδιο 4) και BESCT (Βιολογία, Εκπαίδευση, διαλογή, χημειοπρόληψη και θεραπεία) βραβείο DAMD17-01-1-0689 (Σχέδιο 2). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

K-Ras, υποδοχέα LKB1 και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι συχνά μεταλλάσσεται σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Αυτές οι μεταλλάξεις οδηγούν σε ανώμαλη ενεργοποίηση του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt /στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) μονοπάτι σηματοδότησης [1], [2], [3]. Ως εκ τούτου, η ΡΙ3Κ /Akt /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτικό στόχο για NSCLC.

RAD001 (Το everolimus) είναι ένα παράγωγο της ραπαμυκίνης και είναι παρόμοιο σε λειτουργία με ραπαμυκίνη ως αναστολέας αλλοστερική του mTOR. Σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των νεφρικών κυττάρων είχαν λάβει προηγουμένως θεραπεία με παράγοντες VEGF στοχευμένες, RAD001 βελτιώνει την επιβίωση χωρίς εξέλιξη και έχει ως εκ τούτου έχουν εγκριθεί από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων για τη συγκεκριμένη ένδειξη [4]. Επίσης, έχει βρεθεί ότι βελτιώνει επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε ασθενείς με καρκίνους neuroendcorine του παγκρέατος. Σε πολλές άλλες κακοήθειες συμπαγών οργάνων, RAD001 και άλλα ανάλογα ραπαμυκίνης (rapalogs) οι rapalogs ασκούν μέτρια αντικαρκινικές επιδράσεις, ότι αν και πολλά υποσχόμενη, δεν επαρκούν για να δικαιολογήσουν τη μονοθεραπεία με αυτούς τους παράγοντες [5].

Οι πρόσφατες προσπάθειες για την να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των rapalogs έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών συνδυασμό. NVP-BEZ235 (BEZ235) είναι ένα μυθιστόρημα και από του στόματος χορηγούμενη διπλή PI3K και mTOR αναστολέα κινάσης. Αυτή η ένωση είναι ένας ισχυρός, αναστρέψιμος αναστολέας της τόσο κατηγορίας Ι καταλυτική δράση PI3K και mTOR κινάσης από ανταγωνιζόμενες μεταξύ τους σε ΑΤΡ-δέσμευσης site τους [6]. BEZ235 είναι επί του παρόντος υπό αξιολόγηση φάσης Ι /ΙΙ των κλινικών δοκιμών. Σε προκλινικές μελέτες, BEZ235 επάγει εντυπωσιακό αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα τόσο σε διαγονιδιακά ποντίκια με ογκογόνο Κ-Ras-επαγόμενη NSCLC και σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν NSCLC ογκογόνο Κ-Ras. Επιπλέον, ευαισθητοποιεί αποτελεσματικά κυτταρικές σειρές NSCLC εκφράζουν ογκογόνο Κ-Ras με τις προ-αποπτωτικών επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας, τόσο

in vitro

και

in vivo

[7]. Όταν BEZ235 συνδυάστηκε με έναν αναστολέα ΜΕΚ, σημειώνονται συνέργεια επιτεύχθηκε σε συρρίκνωση K-Ras μεταλλαγμένο καρκίνων του πνεύμονα ποντικού [8].

Όπως ραπαμυκίνη, RAD001 προκαλεί ενεργοποίηση Akt σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων κυττάρων NSCLC ενώ αναστέλλει την mTOR σηματοδότηση [9]. Έχουμε πρόσφατα ανέφεραν σχετικά με την ενισχυμένη αποτελεσματικότητα του συνδυασμού του RAD001 με έναν αναστολέα ΡΙ3Κ στην ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC τόσο

in vitro

και

in vivo

[9]. Είναι ενδιαφέρον, BEZ235 μπορούσε να ξεπεράσει την αντίσταση ραπαμυκίνη όπως ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των rapamycin- ή RAD001-ανθεκτικά κύτταρα NSCLC. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα του συνδυασμού του RAD001 και BEZ235 για την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC και διαπίστωσαν ότι ο συνδυασμός ήταν πιο αποτελεσματικό από κάθε παράγοντα μόνο στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων NSCLC τόσο

in vitro

και

in vivo

. Η έκθεση αυτή θα τεκμηριώνει κυρίως ευρήματα της έρευνας μας σε αυτόν τον τομέα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήριο

RAD001 και BEZ235 παρασχέθηκαν από την Novartis Pharmaceuticals Corporation (East Hanover, NJ), διαλύθηκαν σε DMSO και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Αντισώματα έναντι Akt, ρ-Akt (S473), ρ-S6 (S235 /S236), S6, ρ-4EBP1 (S65) p-4EBP1 (Thr37 /46), 4EBP1, eIF4G, eIF4E, και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση (PARP), αντίστοιχα, αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, ΜΑ). Goat πολυκλωνικό mTOR (FRAP? Ν-19) και μονοκλωνικά ποντικού c-Myc (9Ε10) αντισωμάτων αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), αντίστοιχα. Πολυκλωνικός Rictor αντίσωμα (BL2178) αγοράστηκε από Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, ΤΧ). Ποντίκι μονοκλωνικό κυκλίνης D1 αντίσωμα αγοράστηκε από την Dako (Carpinteria, CA).

κυτταρικές σειρές και Cell Culture

Το ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές σειρές Α549, Η460 και Η157 περιγράφηκαν προηγουμένως [10]. HCC827 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection ATCC (Manassas, VA). Η ραπαμυκίνη ανθεκτική Α549 κυτταρική σειρά (Α549-RR) ιδρύθηκε προηγουμένως [9]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μονοστρωματική καλλιέργεια σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που αποτελείται από

2 και 95% αέρα 5% CO.

Αναστολή ανάπτυξης Δοκιμασία

τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία η επόμενη ημέρα με τα μέσα που αναφέρονται. Αριθμού βιώσιμων κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό σουλφοροδαμίνης Β (SRB), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. δείκτης συνδυασμού (CI) για την αλληλεπίδραση φαρμάκων (π.χ., η συνέργεια) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό CompuSyn (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ).

Colony Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα αποτελέσματα της δεδομένης φάρμακα για σχηματισμό αποικιών σε τρυβλία μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

ανίχνευση απόπτωσης

η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρώση αννεξίνης V χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-ΡΕ αγοράστηκε από την BD Biosciences ( San Jose, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανάλυση Western blot

Παρασκευή ολόκληρων κυτταρολυμάτων κυτταρικής πρωτεΐνης και ανάλυση στυπώματος Western έχουν περιγραφεί προηγουμένως [12], [13].

m

7GTP Τραβήξτε προς τα κάτω για την ανάλυση των eIF4F Complex Σχηματισμός

eIF4F συγκρότημα σε εκχυλίσματα κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας m

7GTP-Sepharose όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

ανίχνευση συμπλεγμάτων mTOR (mTORCs)

mTORCs συμπεριλαμβανομένων mTORC1 και mTORC2 ανοσοκαταβυθίστηκαν με κατσίκα πολυκλωνικό mTOR (FRAP? Ν-19) αντίσωμα και ακολουθήθηκε με κηλίδωση Western για την ανίχνευση του mTOR, αρπακτικών και rictor, αντίστοιχα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9].

Καρκίνο του πνεύμονα Ξενομοσχεύματα και θεραπείες

τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Πανεπιστημίου Emory. Ο αριθμός πρωτοκόλλου είναι 222 με 2008. Πέντε έως παλιά γυναικεία χωρίς θύμο αδένα (ηυ /ηυ) ποντίκια 6 εβδομάδων παραγγέλθηκαν από την Taconic (Hudson, Νέα Υόρκη) και στεγάζονται υπό συνθήκες άνευ παθογόνου σε κλουβιά μικροαπομονωτικά με εργαστηριακή τροφή και νερό

κατά βούληση

. Α549 κύτταρα σε 5 × 10

6 σε μέσο ελεύθερο ορού ενέθηκαν s.c. στην περιοχή του πλευρού γυμνών ποντικών. Όταν οι όγκοι έφθασαν σε μέγεθος περίπου 100 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες (η = 6 /ομάδα) ανάλογα με τον όγκο του όγκου και τα σωματικά βάρη για τις ακόλουθες επεξεργασίες: ελέγχου του οχήματος, BEZ235 (20 mg /kg /ημέρα, og), RAD001 (3 mg /kg /ημέρα? og), και ο συνδυασμός τους. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μετρήσεις δαγκάνα μία φορά κάθε δύο ημέρες και υπολογίζεται με τον τύπο

V

= π (μήκος Χ πλάτος

2) /6.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων ή μεταξύ πολλών ομάδων αναλύθηκε με δύο όψεων unpaired Student του

t

δοκιμές (για την ίση αποκλίσεις) ή με διορθωμένη

t

δοκιμή του Welch (άνισες διακυμάνσεις) ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με χρήση του Graphpad Instat 3 λογισμικό. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικά σημαντική σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

BEZ235 αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των ραπαμυκίνη ανθεκτικά NSCLC κύτταρα

μια προηγούμενη μελέτη, ιδρύσαμε ένα ραπαμυκίνης-ανθεκτική κυτταρική σειρά (δηλαδή, Α549-RR). Αυτή η κυτταρική γραμμή είναι επίσης ανθεκτική σε RAD001 [9]. Εμείς Αναμένεται ότι αυτή η κυτταρική σειρά θα είναι, τουλάχιστον εν μέρει, ανθεκτικό σε BEZ235, δεδομένου ότι είναι μια PI3K και mTOR διπλή αναστολέα. Απροσδόκητα, BEZ235 απέδειξαν ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Α549-RR (Εικ. 1Α). Επιπλέον, BEZ235 επάγεται επίσης απόπτωση στα Α549-RR κύτταρα (Σχ. 1Β). Στην πραγματικότητα, η επαγωγή της απόπτωσης και αναστολής της ανάπτυξης με BEZ235 ήταν ελαφρώς πιο αποτελεσματικό σε κυτταρικές Α549-RR σε σύγκριση με τα πατρικά κύτταρα Α549 (Σχ. 1). Έτσι, η ραπαμυκίνη ανθεκτικά κύτταρα δεν εμφανίζουν διασταυρούμενη αντοχή σε BEZ235.

A

, Τα αναφερόμενα κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις BEZ235 όπως υποδεικνύεται τη δεύτερη μέρα. Μετά από 3 ημέρες, οι αριθμοί των κυττάρων εκτιμήθηκαν με τη χρήση δοκιμασίας SRB. Σημεία, μέσα από τέσσερις πανομοιότυπες προσδιορισμών? μπαρ, ± SD.

B

, οι αναφερόμενες κυτταρικές γραμμές επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και στη συνέχεια κατεργάζεται επόμενη μέρα με διαφορετικές συγκεντρώσεις BEZ235 όπως υποδεικνύεται. Μετά από 24 και 72 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανίχνευση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V. Στήλες, μέσα διπλών προσδιορισμών? μπαρ, ± SD.

Η

Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 συνεργιστικά αναστέλλει την ανάπτυξη των NSCLC κύτταρα μαζί με επαγωγή της απόπτωσης και G1 σύλληψη

Έχουμε ήδη αποδείξει ότι ο συνδυασμός της ραπαμυκίνης ή RAD001 με το LY294002 αναστολέα της ΡΙ3Κ είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη ανάπτυξη-ανασταλτικές επιδράσεις έναντι κυττάρων NSCLC τόσο

in vitro

και

in vivo

[9], [15]. Έχουμε τώρα μελετηθεί αν ο συνδυασμός του BEZ235 και RAD001 εξασκεί επαυξημένης αντικαρκινική δράση σε κύτταρα NSCLC. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι ο συνδυασμός χαμηλών συγκεντρώσεων BEZ235 και RAD001 ήταν πολύ πιο ισχυρή από κάθε μεμονωμένο παράγοντα στην αναστολή της ανάπτυξης αρκετών NSCLC κυτταρικές σειρές (π.χ., Α549, Η460, Η157 και HCC827). Τα πιστωτικά ιδρύματα για τους περισσότερους συνδυασμούς ήταν & lt? 1 (Σχ. 2Α, δεξί πάνελ), υποδεικνύοντας συνεργιστικά αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων NSCLC. Σε συμφωνία, ο συνδυασμός του BEZ235 και RAD001 ήταν σημαντικά πιο ισχυρή από κάθε μεμονωμένο παράγοντα στην επαγωγή της απόπτωσης (Εικόνα 2Β). Και G1 σύλληψης (Σχήμα 2C). (

P

& lt? 0.001). Έτσι, ενισχυμένη επαγωγή τόσο της απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου σύλληψης συμβάλλει στην ανάπτυξη επαυξημένης-ανασταλτικές επιδράσεις που προκαλούνται από το συνδυασμό

A

, οι υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και., Στη συνέχεια, κατεργάζεται επόμενη μέρα με διαφορετικές συγκεντρώσεις BEZ235 (BEZ), RAD001 (RAD) και των αντίστοιχων συνδυασμών τους, όπως υποδεικνύεται. Μετά από 3 ημέρες, οι αριθμοί των κυττάρων υπολογίστηκαν με χρήση της ανάλυσης SRB και ΚΠ υπολογίστηκαν με λογισμικό CompuSyn (δεξιά πάνελ). Σημεία, μέσα από τέσσερις πανομοιότυπες προσδιορισμών? μπαρ, ± SD.

B

και

C

, οι αναφερόμενες κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ηΜ μόνος BEZ235, μόνος 2 ηΜ RAD001, και ο συνδυασμός τους. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την ανίχνευση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V (

A

) και για την ανάλυση του κύκλου κυττάρου με κυτταρομετρία ροής (

C

). Στήλες, μέσα διπλών προσδιορισμών? Μπαρ, ± SD. *,

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 και ***,

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο του DMSO? ###,

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με RAD001 ή BEZ235 μόνη

Η

Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 αναστέλλει αποτελεσματικά το σχηματισμό και την ανάπτυξη των κυτταρικών αποικιών NSCLC

Προσδιορίσαμε περαιτέρω τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις του συνδυασμού RAD001 και BEZ235 επί της ανάπτυξης των κυττάρων NSCLC σε μία δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Αυτή η δοκιμασία μας επιτρέπει να επαναλάβουμε τα θεραπείες για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα (π.χ., 12 ημέρες). RAD001 σε δόση 1 ηΜ και BEZ235 σε 5 ηΜ μόνος είχε ελάχιστο αποτέλεσμα επί της καταστολής του σχηματισμού αποικίας των κυττάρων NSCLC? Ωστόσο, ο συνδυασμός είτε εξαλειφθεί το σχηματισμό αποικιών (π.χ., Α549) ή μειωθεί δραστικά τους αριθμούς αποικιών (π.χ., Η460 και Η157) (Σχ. 3). Έτσι, είναι σαφές ότι ο συνδυασμός είναι πολύ πιο αποτελεσματική από ό, τι είτε απλός παράγων στην αναστολή του σχηματισμού αποικίας και την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC (

P

& lt? 0.001). Συγκρίναμε επίσης την επίδραση της ακολουθίας της χορήγησης των δύο παραγόντων επί του σχηματισμού αποικίας των κυττάρων NSCLC. Υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται ανωτέρω, διαδοχικές κατεργασίες με RAD001 ακολουθείται πρώτα από κατεργασία BEZ235 (RAD001 → BEZ235) ή BEZ235 και εν συνεχεία πρώτα από κατεργασία RAD001 (BEZ235 → RAD001) έδειξε επιδράσεις συγκρίσιμες με κάθε μόνος με ελάχιστη καταστολή της ανάπτυξης των αποικιών κυττάρων NSCLC . Η ταυτόχρονη συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ήταν πολύ πιο ισχυρή από είτε διαδοχική θεραπεία στην αναστολή του σχηματισμού και την ανάπτυξη των αποικιών NSCLC (

P

& lt? 0.001) (Εικ. 2). Ως εκ τούτου, η ταυτόχρονη χορήγηση του RAD001 και BEZ235 είναι σαφώς ανώτερη από διαδοχικές θεραπείες στην αναστολή της ανάπτυξης των αποικιών NSCLC κυττάρου.

Οι υποδεικνυόμενες γραμμές κυττάρων σε πυκνότητα περίπου 200 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Τη δεύτερη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 nM RAD001 (RAD), 5 nM BEZ235 (BEZ) ή ταυτόχρονη συνδυασμοί τους (RAD + BEZ). Τα κύτταρα υπέστησαν επίσης αγωγή με 1 ηΜ RAD001 για 6 ημέρες ακολουθούμενες με 5 ηΜ BEZ235 για άλλες 6 ημέρες (RAD → BEZ) ή με 5 ηΜ BEZ για 6 ημέρες ακολουθούμενες με 1 ηΜ RAD001 για άλλες 6 ημέρες (BEZ → RAD). Μετά από 12 ημέρες, οι πλάκες βάφτηκαν για το σχηματισμό των αποικιών των κυττάρων με κρυσταλλικό ιώδες χρώμα. Η εικόνα των αποικιών στη συνέχεια μεταφέρθηκε με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (

Α

) και οι αριθμοί των αποικιών μετρήθηκαν (

Β

). ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο του DMSO? ###,

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με όλες τις άλλες θεραπείες

Η

Είμαστε σε σύγκριση περαιτέρω τα αποτελέσματα του συνδυασμού των RAD001 και LY294002 με διαδοχικές θεραπείες για σχηματισμό αποικιών των κυττάρων NSCLC. . Σταθερά, η ταυτόχρονη θεραπεία συνδυασμού, αλλά όχι η διαδοχική θεραπεία είτε με RAD001 ακολουθείται πρώτα από LY294002 ή με LY294002 ακολουθούμενη από RAD001, που δημιουργούνται επαυξημένης επιδράσεις στην αναστολή του σχηματισμού αποικίας των κυττάρων NSCLC (Εικ. S1).

Η συνδυασμός RAD001 και BEZ235 ασκεί ενισχυμένη δραστηριότητα ενάντια στην ανάπτυξη του NSCLC Ξενομοσχεύματα σε άτριχα ποντίκια

Λόγω των πολλά υποσχόμενων ανάπτυξης-ανασταλτικές επιδράσεις του συνδυασμού RAD001 και BEZ235 σε κύτταρα NSCLC

in vitro

, εμείς τότε επικύρωσε την αποτελεσματικότητα του συνδυασμού έναντι της ανάπτυξης των όγκων σε ποντίκια NSCLC. Τόσο RAD001 και BEZ235 μερικώς, αλλά σημαντικά, ανέστειλε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων Α549 (

P

& lt? 0,01)? Ωστόσο, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ήταν σημαντικά πιο ισχυρή από κάθε μεμονωμένο παράγοντα στην αναστολή της ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων, όπως μετράται με τα δύο μεγέθη και βάρη των όγκων (

P

& lt? 0,01) (Τα Σχ. 4Α και 4Β). Αυτά τα

in vivo

στοιχεία αποδεικνύουν επίσης ότι ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 εμφανίζει επαυξημένης αντικαρκινική δράση. Παρατηρήσαμε ένα υψηλότερο βαθμό απώλειας βάρους σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με το συνδυασμό (έως και 19% των ποντικών ελέγχου) ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της περιόδου έγκαιρη θεραπεία. Η διαφορά βάρους στο τέλος του πειράματος βελτιώθηκε σε μόνο 13% του ελέγχου (Εικ. 4C), προτείνοντας ενδεχόμενη προσαρμογή και καλύτερη ανοχή της θεραπείας συνδυασμού,

ξενομοσχεύματα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία (μία φορά την ημέρα) με όχημα ελέγχου, RAD001 (3 mg /kg, og), BEZ235 (20 mg /kg, og) και ο συνδυασμός τους (BEZ + RAD) ξεκινώντας την ίδια μέρα μετά την ομαδοποίηση. Τα μεγέθη των όγκων (

A

) και το σωματικό βάρος (

C

) μετρήθηκαν μία φορά κάθε δύο ημέρες. Μετά από 14 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν (

B

). Κάθε μέτρηση είναι μια μέση τιμή ± SD (η = 6). Οι αριθμοί στο

C

αντιπροσωπεύουν απώλεια σωματικού βάρους στην ομάδα του συνδυασμού σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος? **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος? ***

P

& lt? 0.001 σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος?

##

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με RAD001 ή με BEZ235

Η

Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ασκεί Ενισχυμένη Επιδράσεις στην καταστολή της σηματοδότησης mTOR και ρύθμιση προς τα κάτω του c. Myc έχει και κυκλίνης D1

για να αποκτήσουν εικόνα για τους μηχανισμούς μέσω των οποίων ο συνδυασμός των εξασκούν ενισχυμένη αντικαρκινική δράση RAD001 και BEZ235, αναλύσαμε τις επιπτώσεις του συνδυασμού για τη σηματοδότηση του mTOR και στην έκφραση των ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών του σε σύγκριση με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Στις δόσεις που δοκιμάστηκαν, BEZ235 είχε ελάχιστη επίδραση επί μειωμένα επίπεδα ρ-S6, αλλά καμία επίδραση στα επίπεδα του p-4EBP1 (τόσο S65 και Τ37 /46), c-Myc και κυκλίνη D1. Στην πραγματικότητα, παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα 4EBP1 (Τ37 /46) (και στις δύο Α549 και Η157) και c-Myc (π.χ., σε Η157). RAD001 σε 2 nm ισχυρά ανέστειλε S6 και 4EBP1 (S65) φωσφορυλίωση, αλλά δεν μείωσε τα επίπεδα του p-4EBP1 (Τ37 /46), c-Myc και Κυκλίνη D1. Παρόμοια με BEZ235, RAD001 αύξησε επίσης τα επίπεδα του p-4EBP1 (Τ37 /46) και c-Myc και στα δύο κύτταρα Α549 και Η157. Ωστόσο, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 είτε κατήργησε την αύξηση των π-4EBP1 (Τ37 /46) (π.χ., σε κύτταρα Α549) που προκαλείται από την μονοθεραπεία ή ασκείται ενισχυμένο αποτέλεσμα στη μείωση (/46 Τ37) τα επίπεδα ρ-4EBP1 (π.χ. στα κύτταρα Η157). Σημαντικά, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 είχε επαυξημένης αποτελέσματα επί μειώνοντας τα επίπεδα της c-Myc και κυκλίνης D1 και στα δύο κύτταρα Α549 και Η157 σε σύγκριση με κάθε μεμονωμένο παράγοντα μόνο (Σχ. 5).

Ένα

, η ενδεδειγμένη κυτταρικές γραμμές απλώθηκαν σε δίσκους των 10 cm κυτταρικής καλλιέργειας διαμέτρου και κατεργάστηκε επόμενη μέρα με τις δεδομένες συγκεντρώσεις των BEZ-235 απουσία και παρουσία RAD001 για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για παρασκευή προϊόντων λύσης πρωτείνης ολικού κυττάρου και ανάλυση κηλίδας Western μετά την ανίχνευση των υποδεικνύονται πρωτεΐνες.

B

, Τα αναφερόμενα κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2 ηΜ RAD001, 10 ηΜ BEZ235 ή συνδυασμός τους. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την παρασκευή των προϊόντων λύσης πρωτείνης ολικού κυττάρου και την επακόλουθη m

7GTP pull-down δοκιμασίας που ακολουθείται με ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση των πρωτεϊνών δίνονται.

Η

RAD001 αυξημένη Akt φωσφορυλίωση σε δύο γραμμές Α549 και Η157 κυττάρων όπως έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν [9]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε χαμηλές δόσεις, BEZ235 αύξησε επίσης ρ-Akt επίπεδα. Η παρουσία του BEZ235 στην δοκιμασμένη δόση κυμαίνεται είτε ασθενώς μείωσε τα επίπεδα του p-Akt προκαλείται από την RAD001 (π.χ., σε κύτταρα Α549) ή δεν επηρέασε RAD001 επαγόμενη αύξηση των π-Akt (π.χ., σε κύτταρα Η157) (Σχ. 5). Έτσι, φαίνεται ότι ο συνδυασμός RAD001 και BEZ235 μπορεί να εμφανίσει ενισχυμένη συνέπειες για την καταστολή της σηματοδότησης mTOR και την έκφραση των ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών με περιορισμένο ή καθόλου ανασταλτικές επιδράσεις στην Akt φωσφορυλίωσης.

Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 Ασκεί Βελτιωμένη επιδράσεις στην καταστολή eIF4F Συνέλευση

από σηματοδότησης mTOR είναι γνωστό ότι ρυθμίζει θετικά καπάκι που εξαρτώνται από την έναρξη της μετάφρασης, θα αναλυθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα του συνδυασμού RAD001 και BEZ235 στο καπάκι δέσμευση του eIF4E και eIF4G (π.χ., συναρμολόγηση eIF4F) με το m

7GTP-Sepharose γκρεμίζουν δοκιμασία. Όπως παρουσιάζεται στο Σχ. 5Β, RAD0001 και BEZ235 μειωθεί και μόνο τα ποσά των eIF4G που είχαν συναλλαγές με eIF4E. Ωστόσο, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ήταν πολύ πιο αποτελεσματική ότι είτε παράγοντα μόνο στη μείωση των ποσών των eIF4G σύνδεσης προς eIF4E. Διατριβές αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ασκεί την ενισχυμένη συνέπειες για την καταστολή της δέσμευσης της eIF4E και συναρμολόγησης eIF4G ή eIF4F καπάκι.

Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 δεν παρουσιάζει ενισχυμένη Επιδράσεις στην αναστολή της συναρμολόγησης του mTORCs

είναι γνωστό ότι η συναρμολόγηση ή σύνδεση του mTOR με τους εταίρους της (π.χ., αρπακτικών και rictor) είναι απαραίτητη για ξεχωριστές δραστηριότητες του ενζύμου και βιολογικές λειτουργίες. RAD001, όπως ραπαμυκίνη, καταστέλλει την σηματοδότηση mTOR αναστέλλοντας τη συναρμολόγηση των mTORCs [16]. Έτσι, αποφασισμένοι περαιτέρω κατά πόσον ο συνδυασμός των RAD001 και BEZ235 ασκείται ενισχυμένη ανασταλτικές επιδράσεις στη συνέλευση των mTORCs συμπεριλαμβανομένων mTORC1 (mTOR /αρπακτικών) και mTORC2 (mTOR /rictor). Για το σκοπό αυτό, κάναμε ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ) με αντι mTOR-αντισώματος για να τραβήξει προς τα κάτω τόσο mTORC1 και mTORC2 και στη συνέχεια ακολούθησε με κηλίδωση Western για τον εντοπισμό των αρπακτικών και rictor στα ανοσοκαταβύθισης. Όπως παρουσιάζεται στο Σχ. 6, BEZ235 είχε ελάχιστες επιπτώσεις στη μείωση των επιπέδων των αρπακτικών και rictor στα ανοσοκαθιζήματα, ενώ RAD001 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα των δύο αρπακτικών και rictor τράβηξε κάτω από mTOR αντισώματος. Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 είχαν παρόμοια ισχύ με RAD001 μόνη της σε μείωση των επιπέδων των αρπακτικών και rictor στα ανοσοκαθιζήματα, υποδεικνύοντας ότι ο συνδυασμός δεν παρουσιάζει ενισχυμένη συνέπειες για αναστολή της συναρμολόγησης του mTORC1 και mTORC2.

Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 ηΜ RAD001, 10 ηΜ BEZ235 ή συνδυασμός τους. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την παρασκευή των προϊόντων λύσης πρωτείνης ολικού κυττάρου και την επακόλουθη IP-κηλίδωση Western.

Η

Συζήτηση

Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας ραπαμυκίνη είναι ένα κρίσιμο ζήτημα στη θεραπεία του καρκίνου με ραπαμυκίνη και τα ανάλογά της [17]. BEZ235 είναι ένας αναστολέας της διπλής κινάσης PI3K και mTOR [6]. Η μελέτη μας έδειξε ότι BEZ235 ανέστειλε την ανάπτυξη της ραπαμυκίνης-ανθεκτικά κύτταρα και απόπτωση που επάγεται από το ίδιο αποτελεσματικά όπως έκανε στα συμφωνημένα μητρικά κύτταρα. Στην πραγματικότητα, η ραπαμυκίνη ανθεκτικά κύτταρα ήταν ελαφρώς πιο ευαίσθητα από τα γονικά κύτταρα τους να BEZ235 (Εικ. 1). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ραπαμυκίνη-ανθεκτικά κύτταρα δεν εμφανίζουν διασταυρούμενη αντοχή σε BEZ235. Δεδομένου ότι αυτή η κυτταρική γραμμή είχε δειχθεί ότι είναι πλήρως ανθεκτικά σε RAD001, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι BEZ235 αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω διαφορετικών μηχανισμών από αυτούς που προκαλούν τις δράσεις της rapalogs. Θα είναι ενδιαφέρον να μάθουμε αν BEZ235 διαθέτει επιπλέον μηχανισμό πέρα ​​από διπλή αναστολή των PI3K και BEZ235. Δίπλα, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν επίσης ότι BEZ235 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ξεπεράσει την αντίσταση ραπαμυκίνη.

Αν και BEZ235 αναστέλλει τόσο PI3K και mTOR, σε συνδυασμό με RAD001, ασκεί συνεργιστικά αποτελέσματα στην αναστολή της ανάπτυξης ενός πάνελ των κυττάρων NSCLC ως καταδείχθηκε σε μια μονοστρωματική καλλιέργεια 3 ημερών (με δοκιμασία SRB) και σε μια μακροπρόθεσμη δοκιμασία 12 ημέρες σχηματισμού αποικιών (Σχ. 2 και 3). Αυτή η συνέργια είναι πιθανό να οφείλεται στην αυξημένη επιδράσεις στην επαγωγή του κυτταρικού κύκλου G1 σύλληψη και απόπτωση (Σχ. 2). Σε συμφωνία, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματική από τον κάθε παράγοντα στην αναστολή της ανάπτυξης του NSCLC ξενομοσχευμάτων σε γυμνούς ποντικούς (Εικ. 4). Στη μελέτη σε ζώα, διαπιστώσαμε ότι ο συνδυασμός προκάλεσε αρχικά σημαντική απώλεια σωματικού βάρους (έως και 19% του ελέγχου)? Ωστόσο, στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί που έλαβαν τη θεραπεία συνδυασμού φάνηκε να ανακτήσει μέρος της απώλειας βάρους (13% του ελέγχου). Αυτό υποδηλώνει ότι τα ποντίκια μπορούν να προσαρμοστούν και τελικά να ανεχθούν τη θεραπεία με το συνδυασμό του RAD001 και BEZ235. Παρ ‘όλα αυτά, θα πρέπει να γνωρίζουν το δυναμικό ενισχύεται δυσμενείς επιπτώσεις που προκαλούνται από το συνδυασμό, ενώ ο συνδυασμός δείχνει πολλά υποσχόμενη συνεργιστική αντικαρκινική δράση.

χρονοδιαγράμματα θεραπεία μπορεί να επηρεάσει την τελική έκβαση του συγκεκριμένου συνδυαστική θεραπεία. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι οι διαδοχικές αγωγές με RAD001 ακολουθούμενη από BEZ235 ή με BEZ235 ακολουθούμενη από RAD001 ελάχιστα ανέστειλε την ανάπτυξη των αποικιών NSCLC? Σε αντίθεση, η ταυτόχρονη θεραπεία RAD001 και BEZ235 ανέστειλε ουσιαστικά την ανάπτυξη των αποικιών NSCLC ή εξαλείφεται ο σχηματισμός αποικίας (Εικ. 3). Αυτό ισχύει επίσης για τον συνδυασμό της ραπαμυκίνης και LY294002 (Εικ. S1). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ταυτόχρονη συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 μπορεί να είναι η βέλτιστη για την περαιτέρω ανάπτυξη αυτού του συνδυασμού.

Τα IC

’50 (συγκεντρώσεις αναστολής της ανάπτυξης 50% των κυττάρων) του BEZ235 σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC κυμαίνονται από 10 ηΜ έως 100 ηΜ (μη δημοσιευμένα δεδομένα μας). Σε πειράματα συνδυασμού μας, χρησιμοποιείται συνήθως χαμηλή δόση κυμαίνεται από BEZ235 (π.χ., 1-10 nM). Σε αυτές τις δόσεις, BEZ235 είχε ασθενή ανασταλτική επίδραση επί της φωσφορυλίωσης ρ-S6, αλλά δεν ρυθμίζουν φωσφορυλίωση ρ-4EBP1 ή τα επίπεδα του c-myc και κυκλίνη D1. Σε μια δόση από 2 ηΜ, RAD001 ανέστειλε αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση της S6 και 4EBP1 (S65), αλλά δεν κατάφερε να καταστείλει 4EBP1 φωσφορυλίωση (Τ37 /46) και c-Myc και κυκλίνη D1 έκφραση. Ωστόσο, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ανέστειλε αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση ρ-4EBP1 (στο Τ37 /46) και μείωσε τα επίπεδα του c-myc και κυκλίνης D1 (σχ. 5Α). Επιπλέον, δείξαμε ότι ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 ήταν πολύ πιο ισχυρή από είτε μονοθεραπεία σε παρεμπόδιση της πρόσδεσης του eIF4E και eIF4E ή συναρμολόγησης eIF4F (Εικ. 5Β) καπάκι, πράγμα που σημαίνει ότι ο συνδυασμός ασκεί την ενισχυμένη ανασταλτική επίδραση στην έναρξη καπάκι εξαρτώμενη . Δεδομένου ότι c-Myc και κυκλίνη D1 είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από το mTOR σηματοδότηση μέσω cap-εξαρτώμενη πρωτεϊνική μετάφραση [18], τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 εξασκεί ενισχυμένη επίδραση στην αναστολή της σηματοδότησης mTOR και την έκφραση του του ρυθμίζονται ογκογόνες πρωτεΐνες (π.χ., c-Myc και κυκλίνη D1). Η επίδραση αυτή μπορεί να συμβάλει στην συνεργική δράση έναντι της ανάπτυξης των κυττάρων του NSCLC

in vitro

και

in vivo

από το συνδυασμό των RAD001 και BEZ235.

Σε αυτή τη μελέτη, RAD001 αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt τόσο στο Α549 και Η157 κύτταρα? Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις μας [9]. Στις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (π.χ., 1-10 ηΜ), BEZ235 αυξημένη ρ-Ακί επίπεδα, καθώς και. Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με μια προηγούμενη αναφορά, στην οποία BEZ235 έδειξε να αυξάνει Akt φωσφορυλίωση σε χαμηλές δόσεις (π.χ., 10 ηΜ) [19]. Είχε δειχθεί προηγουμένως ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις του BEZ235 απαιτείται (π.χ. & gt? 100 ηΜ) για την αναστολή της Akt σε σύγκριση με την εν λόγω (π.χ., & gt? 10 ηΜ) που απαιτείται για την αναστολή της φωσφορυλίωσης S6 [19]. Έτσι, φαίνεται ότι BEZ235 κατέχει πρωτίστως mTOR ανασταλτική δραστηριότητα σε χαμηλές κλίμακες συγκεντρώσεων. Συνεπώς, είναι κατανοητό ότι BEZ235 σε χαμηλές κλίμακες συγκέντρωσης αυξάνει τη φωσφορυλίωση της Akt, όπως θα ήταν αναμενόμενο από ένα rapalog [9], [15]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 δεν μειώνουν π-Akt επίπεδα, τα οποία ήταν τόσο υψηλές όσο εκείνες σε κύτταρα κατεργασμένα με RAD001 ή BEZ235 μόνο (Σχ. 5). Δεδομένου ότι ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC όπως συζητήθηκε παραπάνω, φαίνεται ότι ο συνδυασμός της RAD001 και BEZ235 μπορούν να ασκήσουν ενισχυμένη αντικαρκινική δραστικότητα με αυξημένα επίπεδα ρ-Akt.

mTOR εξασκεί του κρίσιμους ρόλους στην προώθηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πρωτίστως μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες όπως αρπακτικών (σχηματίζοντας mTORC1) και rictor (σχηματίζοντας mTORC2) [18], [20]. mTORC2 είναι γενικά πιστεύεται ότι είναι ευαίσθητα στην rapalogs [18]. Ωστόσο, η παρατεταμένη θεραπεία με αυτούς τους αναστολείς mTOR διαταράσσει τη συναρμολόγηση του mTORC2 όπως αποδεικνύεται από εμάς [9] και άλλοι [21]. Σε αυτή τη μελέτη, μετά από μια θεραπεία 24 ώρες, RAD001, αλλά όχι BEZ235, αναστέλλουν αποτελεσματικά την συναρμολόγηση ή δραστηριότητα και των δύο mTORC1 και mTORC2. Ο συνδυασμός του RAD001 και BEZ235 δεν μειωθούν περαιτέρω τα επίπεδα των αρπακτικών και rictor στα ανοσοϊζήματα (Εικ. 6), αποδεικνύοντας ότι ο συνδυασμός δεν εμφανίζεται ενισχυμένη συνέπειες για αναστολή της συναρμολόγησης του mTORCs. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, εμείς εικάζουν ότι οι ενισχυμένες επιπτώσεις στην καταστολή της σηματοδότησης mTOR από τον συνδυασμό είναι πιθανό να οφείλεται στην χαρακτηριστική επιδράσεις τους στην αναστολή της συναρμολόγησης mTORC και δραστικότητα κινάσης mTOR. Είναι γενικά πιστεύουν ότι μια συνέργεια επιτυγχάνεται μέσω μιας εταιρείας των δύο φαρμάκων που λειτουργούν μέσω διακεκριμένων μηχανισμών. Από BEZ235 αναστέλλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των ραπαμυκίνης-ανθεκτικά κύτταρα, είναι επίσης πιθανό ότι η συνέργεια μεταξύ RAD001 και BEZ235 ενάντια στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα συμβαίνει μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού του BEZ235, η οποία χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

εν περιλήψει, η τρέχουσα μελέτη έδειξε ότι ο συνδυασμός του RAD001 και του BEZ235 αναστολέα ΡΙ3Κ /mTOR εμφανίζει συνεργική αναστολή επί της ανάπτυξης των κυττάρων του NSCLC

in vitro

και

in vivo

και ως εκ τούτου αποτελεί ένα νέα στρατηγική για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με mTOR στόχευση καρκίνου. Τα ευρήματά μας παρέχουν τη λογική να αξιολογήσει αυτό το συνδυασμό σε κλινικές δοκιμές για ασθενείς με rapalog ευαίσθητα και πυρίμαχα κακοήθειες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ταυτόχρονη συνδυασμός ραπαμυκίνης και LY294002 είναι πιο αποτελεσματική από διαδοχικές θεραπείες στην αναστολή του σχηματισμού και την ανάπτυξη των αποικιών NSCLC. Τα υποδεικνυόμενα γραμμές κυττάρων σε πυκνότητα περίπου 200 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Τη δεύτερη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ηΜ ραπαμυκίνη (Rap) μόνο, 5 ηΜ LY294002 (LY) μόνο, η ταυτόχρονη συνδυασμός ραπαμυκίνης και LY294002 (Rap + LY), ραπαμυκίνης για 3 ημέρες και στη συνέχεια άλλαξαν σε θεραπεία LY294002 (Rap → LY), LY294002 για 3 ημέρες και στη συνέχεια άλλαξαν σε ραπαμυκίνη θεραπεία (LY → Rap). Οι ίδιες κύκλοι από τις επεξεργασίες επαναλήφθηκαν κάθε 3 ημέρες. Μετά από 12 ημέρες, οι πλάκες βάφτηκαν για το σχηματισμό των αποικιών των κυττάρων με κρυσταλλικό ιώδες χρώμα. Η εικόνα των αποικιών στη συνέχεια μεταφέρθηκε με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Α) και οι αποικίες μετρήθηκαν (

Β

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020899.s001

(PDF)

Ευχαριστίες

TKO, SSR, FRK και S-Y.S.