Αφηρημένο

Μυθιστόρημα στρατηγικές που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχουν οδηγήσει στην κλινική ανάπτυξη μονοκλωνικών αντισωμάτων, τα οποία τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου (mCRC), αλλά μόνο υποομάδες ασθενών με αυξημένη άγριου τύπου KRAS και το γονίδιο EGFR αντίγραφο, ανταποκρίνονται σε αυτούς τους παράγοντες. Επιπλέον, η αντίσταση σε αποκλεισμό EGFR αναπόφευκτα συνέβη, καθιστώντας τις μελλοντικές θεραπεία δύσκολη. Μυθιστόρημα βιο-απεικόνισης (ΔΠΚ) οι μέθοδοι μπορεί να βοηθήσει στην κβάντωση του EGFR σε mCRC ιστό συμπληρώνοντας έτσι τη μεθοδολογία ανοσοϊστοχημεία, στην καθοδήγηση της μελλοντικής θεραπεία αυτών των ασθενών. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τη χρησιμότητα των εγγύς υπέρυθρο-επισημασμένο EGF (EGF-NIR) για βιο-απεικόνισης της CRC χρησιμοποιώντας το

in vitro

και

in vivo

μοντέλα CRC ορθοτοπική όγκου και

ex vivo

ανθρώπινους ιστούς CRC. Περιγράφουμε την παρασκευή και τον χαρακτηρισμό του EGF-NIR και διερεύνηση δέσμευσης, χρησιμοποιώντας ΔΠΚ ενός πάνελ της CRC μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας που μοιάζει ετερογένεια των ανθρώπινων ιστών CRC. EGF-NIR ήταν ειδικά και επιλεκτικά δεσμεύεται από EGFR κύτταρα που εκφράζουν CRC, η ένταση του σήματος EGF-NIR αναλογία υποβάθρου (SBR) αντανακλάται επίπεδα EGFR, δόσης-απόκρισης και η πορεία του χρόνου πειράματα απεικόνισης που δίδει βέλτιστες συνθήκες για κβάντωση των επιπέδων του EGFR με ΔΠΚ. EGF-NIR απεικόνιση των ποντικών με ΗΤ-29 ορθοτοπικό όγκο CRC έδειξε ότι EGF-NIR είναι πιο απομακρύνεται αργά από τον όγκο και την υψηλότερη SBR μεταξύ όγκου και φυσιολογικών γειτονικό ιστό επετεύχθη δύο ημέρες μετά την ένεση. Επιπλέον, οι εικόνες του αποσυντίθενται ιστών κατέδειξε συσσώρευση του EGF-NIR στον όγκο και το συκώτι. EGF-NIR ειδικά και έντονα επισημανθεί EGFR θετική ανθρώπινους ιστούς CRC ενώ παρακείμενο ιστό CRC και EGFR αρνητική ιστούς εξέφρασε αδύναμα σήματα NIR. Η μελέτη αυτή δίνει έμφαση στην χρήση της EGF-NIR για προκλινικές μελέτες. Σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους, EGF-NIR θα μπορούσε να παρέχει μια πρόσθετη βιο-απεικόνισης συγκεκριμένο εργαλείο στην τυποποίηση των μετρήσεων της έκφρασης EGFR σε ιστούς CRC

Παράθεση:. Cohen G, Lecht S, Arien-Zakay Η, Ettinger Κ , Amsalem O, Oron-Herman M, et al. (2012) Bio-Imaging του καρκίνου του παχέος εντέρου μοντέλα που χρησιμοποιούν Near Infrared Επισημασμένο αυξητικού παράγοντα Επιδερμική. PLoS ONE 7 (11): e48803. doi: 10.1371 /journal.pone.0048803

Επιμέλεια: Αντώνης WI. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 17 του Ιουνίου του 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 8, Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Cohen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο που αναφέρονται εδώ υποστηρίχθηκε από την Bio Ιατρικές Photonics (BMP) κοινοπραξία, ισραηλινό Υπουργείο Βιομηχανίας και Εμπορίου, το πρόγραμμα MAGNET. Η διοίκηση της κοινοπραξίας δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό, τη συλλογή και ανάλυση δεδομένων, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες στις δυτικές κοινωνίες. Μακροχρόνια επιβίωση του CRC-διάγνωση ασθενών συσχετίζεται με το στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση. Στα πρώτα στάδια, καθώς και σε επιλεγμένους ασθενείς με προχωρημένη νόσο, η χειρουργική επέμβαση είναι η κύρια τροπικότητα της θεραπείας [1]. Τουλάχιστον το 40% των ασθενών με CRC θα αναπτύξουν είτε σύγχρονη ή metachronous απομακρυσμένες μεταστάσεις, οι περισσότεροι από αυτούς θα υποκύψει στην ασθένεια τους και να πεθάνουν [2]. Μερικά από τα χαρακτηριστικά του κακοήθους φαινοτύπου του CRC συσχετίζονται με υπερέκφραση και υπερ-ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης υποδοχέα όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), οι οποίες καθιστούν αυτούς τους υποδοχείς ελκυστικούς στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου [3]. Στους περισσότερους ασθενείς CRC, η εξέλιξη από την κανονική βλεννογόνο του κόλου σε καρκίνο εμπλέκει ένα καθορισμένο καταρράκτη μοριακών αλλαγών, που απλώνεται πάνω από χρόνια [4]. Ενδοσκοπική πολυπεκτομή είχε αποδειχθεί ότι μειώνει CRC που σχετίζονται με τη θνησιμότητα [5]. Αυτή η διαδικασία απαιτεί ινο-οπτικές κολονοσκόπηση απεικόνιση του ιστού CRC ακολουθούμενη από ιστολογική αξιολόγηση. Επιπλέον οι ιστοί CRC αξιολογούνται συχνά με RT-PCR [6], ανοσοϊστοχημεία [7] και

in situ υβριδισμού

[8] τεχνικές, οι οποίες έδειξαν ένα πολύ υψηλότερο βαθμό από ασυμφωνία μεταξύ προκριματικές και συναφών μεταστάσεις CRC [ ,,,0],9].

EGFR συχνά υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία στερεών όγκων, του εγκεφάλου, του μαστού, του πνεύμονα, των ωοθηκών και του παγκρέατος, και σχετίζεται με αυξημένη μεταστατικό δυναμικό και κακή πρόγνωση του CRC [10]. Βιολογικούς παράγοντες που αναστέλλουν EGFR έχουν καταδείξει κλινική δραστικότητα ως μεμονωμένοι παράγοντες ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, η πλέον υποσχόμενη από αυτούς τους παράγοντες είναι το cetuximab και panitumumab. Δυστυχώς, αυτά τα αντισώματα είναι κλινικά αποτελεσματικές μόνο σε μια μειοψηφία των ασθενών με CRC [11]. Η κλινική επιτυχία αυτών των μονοκλωνικών αντισωμάτων θεραπειών είναι ομοιόμορφα περιορίζεται από την εξέλιξη της επίκτητης αντίστασης σε αποκλεισμό EGFR [12]. Ένας μηχανισμός για αντοχή πρόσφατα διευκρινισθεί: cetuximab ανθεκτικά κύτταρα περιέχουν μια μετάλλαξη EGFR στο εξωκυτταρικό πεδίο (S492R) που παρεμποδίζει cetuximab, αλλά όχι Επιδερμικού Παράγοντα Ανάπτυξης (EGF) σύνδεση [12]. Ως εκ τούτου, δεδομένου ότι η απόκριση στη θεραπεία απαιτεί ο στόχος EGFR να είναι παρόν, η ανάπτυξη μεθόδων ΔΠΚ για ποσοτική ανίχνευση των επιπέδων της πρωτεΐνης EGFR σε CRC πρωτογενείς και δευτερογενείς ιστούς όγκων είναι απαραίτητο, προκειμένου να καθοδηγήσει την αντιμετώπιση των μεμονωμένων επιλεγεί για EGFR στοχευμένη αντίσωμα θεραπείας και ιδίως εκείνων που υποτροπιάζουν, ενώ στη στόχευση του EGFR θεραπείες [13]. Η έλευση του EGFR-στοχευμένες αντισώματα, cetuximab και panitumumab άνοιξε το δρόμο για την εξατομικευμένη ιατρική mCRC. Τα τρέχοντα δεδομένα δείχνουν ότι η αξιολόγηση του KRAS και BRAF μετάλλαξη και PI3K /PTEN αλλαγή θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την επιλογή των ασθενών που είναι απίθανο να ανταποκριθούν σε αντισώματα αντι-EGFR-στοχευμένες. Διαπιστώθηκε ότι ανταποκρίνεται όγκοι CRC φέρουν άγριου τύπου KRAS /BRAF και τείνουν να έχουν μια μέτρια, την αύξηση του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου EGFR, το οποίο μεταφράζεται σε μια μέτρια αύξηση του επιπέδου του EGFR. Ως εκ τούτου, το γονίδιο EGFR ανίχνευσης αριθμό αντιγράφων και ποσοτική αξιολόγηση του επιπέδου της πρωτεΐνης EGFR θα βελτιώσει την πιθανή προσαρμογή του cetuximab και panitumumab θεραπειών για ασθενείς με mCRC [12]. Ωστόσο, οι τεχνικές δυσκολίες της τεχνικής ανοσοϊστοχημεία, το οποίο χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της έκφρασης του EGFR σε σταθερές ιστούς, μπορεί να έχουν περιορίσει την ανίχνευση μικρών αύξησης επίπεδο πρωτεΐνης EGFR βαθμό [11]. Ως εκ τούτου, οι ευαίσθητες νέες μεθόδους ΔΠΚ του επιπέδου της πρωτεΐνης EGFR σε mCRC που απαιτούνται. EGFR σπινθηρογραφία, αντιπροσωπεύει μία τέτοια μέθοδος η οποία βασίζεται στον δεσμευτικό, εσωτερίκευση, και διατήρηση των ραδιοσημασμένων στοχεύουν EGFR παράγοντες σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα και έχει αποδειχθεί με ραδιοεπισημασμένο EGF και με ραδιοσημασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον του EGFR [14]. Ωστόσο, το μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι η χρήση ραδιενεργών υλικών

Κοντά υπέρυθρο (NIR) οπτική ΔΠΚ προσφέρει μοναδικά πλεονεκτήματα για τη διάγνωση του mCRC:. Που προσφέρει υψηλή ευαισθησία, μπορεί να χρησιμοποιηθεί με διαφορετικές ετικέτες NIR και μπορούν να προσφέρουν δυναμική, σε πραγματικό χρόνο

in vitro

και

in vivo

εικόνες από μη ραδιενεργό μέσο [15]. NIR φως (700-1000 nm μήκος κύματος) μπορεί να διεισδύσει μέσα στον ιστό, και προσφέρει μια δυνητικά ασφαλή, μη επεμβατική μέθοδο χαρακτηρισμού όγκων [16]. Στις περισσότερες εφαρμογές, NIR ΔΠΚ χρησιμοποιείται για την υποβοήθηση στοχευμένη φθορισμού παράγοντες αντίθεσης που όχι μόνο παρέχουν ενισχυμένη αντίθεση, αλλά επίσης και, το πιο σημαντικό, να αποκαλύψει ειδικές μοριακά γεγονότα που συνδέονται με την έναρξη του όγκου CRC και την εξέλιξη [17]. Πρόσφατες μελέτες έχουν καθιερώσει τη χρήση Affibody μεσολάβηση στόχευση των NIR ευερέθιστη φθορισμού παραγόντων αντίθεσης για την ανίχνευση των κακοήθων κυττάρων και όγκων [18].

Ως εκ τούτου, οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν να αναπτύξει και να χαρακτηρίσει μυθιστόρημα

μοντέλα in vitro

CRC που έμοιαζε CRC ετερογένεια και να εκτιμήσει κατά πόσον είναι δυνατόν να ποσοτικοποιηθεί το επίπεδο του EGFR σε

ex vivo

δείγματα φρέσκου CRC ιστού, ορθοτοπική όγκων σε ποντίκια και αναπτύχθηκαν πρόσφατα μοντέλα κυτταρικών σειρών με τη χρήση του ΕΤΠ συζευγμένο με IRDye 800CW (EGF-NIR) καθετήρα. Βρήκαμε ιδανικές συνθήκες για ΔΠΚ του EGFR χρησιμοποιώντας ανιχνευτή EGF-NIR σε αυτά τα μοντέλα, που ισχύουν για ενδοσκοπική και η Οδύσσεια Infrared Imager αναλύσεις. Επιπλέον, με τη χρήση ανάλυσης επεξεργασίας εικόνας και κηλίδωση Western επιβεβαιώσαμε ότι η ένταση του σήματος EGF-NIR αναλογία φόντο αντανακλά το επίπεδο της πρωτεΐνης EGFR στους

in vitro

CRC μοντέλα και

in situ

ανθρώπινο CRC ιστούς διερευνήθηκε.

(Α) το σχήμα αντίδρασης για τη σύνθεση του προϊόντος σύζευξης EGF-NIR, το πρώτο αμινοξύ ασπαραγίνη στο αμινο τερματικό ενδείκνυται ως ASN1. (Β) διαχωρισμός του μίγματος της αντίδρασης σύνθεσης σε χρωματογραφία διεισδύσεως γέλης και του EGF-NIR δείγμα από διαπέρασης γέλης επί (Γ) χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων? EGF-NIR-πλήρη σειρά (800 nm)? κλίση NaCl-διακεκομμένη γραμμή? μη-συζευγμένου γραμμή EGF-διάστικτη. (D) HPLC διαχωρισμός του EGF-NIR καθαρίζεται από χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων. Πλήρης γραμμή παριστάνει απορρόφηση στα 226 nm και διακεκομμένη γραμμή δείχνει την κλίση. Τοποθετήστε-12% SDS-PAGE ανάλυση των 10 μg EGF-NIR σαρωθεί με Οδύσσεια και μη τροποποιημένο EGF χρωματίστηκαν με coomassie blue. (Ε) NIR φάσμα της EGF-NIR [διέγερσης (γκρι γραμμή) και εκπομπών (μαύρη γραμμή)]? Εισάγετε-IRDye 800CW NHS εστέρα? (F) EGF-NIR επαγόμενη φωσφορυλίωση Erk.

Η

ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C (Α) και 4 ° C (Β) με 7 ηΜ EGF-NIR στην παρουσία ή απουσία 100 ηΜ EGF. πειράματα ανταγωνισμού με 500 nM του cetuximab, ΤΟΡ-α ή NRG1 διεξήχθησαν επίσης. Σε πειράματα ελέγχου οι καλλιέργειες επωάστηκαν με 7 ηΜ NIR-Dye για την αξιολόγηση μη ειδική σήμανση των κυττάρων. Η ένταση NIR στα 800 nm υπολογίστηκε υπό τις ίδιες συνθήκες για όλους τους πολιτισμούς και την μέση τιμή ± SD (n = 9) παρουσιάζεται. Άνω ένθετα: σαρώσεις NIR? κάτω ένθετα: μικροφωτογραφίες φάσης-αντίθεσης των πολιτισμών, * ρ & lt? 0,05 έναντι NIR-Dye? ** Ρ & lt? 0,05 έναντι EGF-NIR

Η

ΗΤ-29 κύτταρα μορφομετατράπηκαν για 2 ημέρες με 5 ηΜ αντι-ΕΟΡΚ Silencer επιλέξτε siRNA ή κωδικοποιημένο RNA ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (έλεγχος).. Αξιολόγηση της έκφρασης EGFR έγινε από Σε κυττάρων NIR απεικόνισης με χρήση 7 nM EGF-NIR (μαύρες μπάρες) και κηλίδωση Western (γκρι ράβδοι). Οι τιμές είναι μέσες ± SD (η = 3). * P & lt?. 0,05 έναντι ομελέτα ή τον έλεγχο

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο παχύ έντερο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ΗΤ-29, SW620, ΟοΙο205, Α431 επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου πλακώδους καρκινώματος και αρουραίου λεπτό έντερο των επιθηλιακών κυττάρων του κλώνου IEC 6 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και προσαρμοσμένο για ανάπτυξη σε τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle του Medium (DMEM) που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM L -γλουταμίνη και 10.000 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C, 6% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν υπό συνθήκες ΟΕΠ χρησιμοποιώντας ένα καθαρό δωμάτιο, σύμφωνα με ISO7 απαιτήσεις (10.000 σωματίδια /m

3).

Προετοιμασία, Καθαρισμός και Χαρακτηρισμός της EGF-NIR

ΕΟΡ- NIR συνετέθη σύμφωνα με την LI-COR Βιοεπιστημών (Lincoln, ΝΕ, USA) οδηγίες χρησιμοποιώντας IRDye 800CW NHS εστέρα (2-(3-{5-[7-(5-amino-1-carboxy-pentylcarbamoyl)-heptanoylamino]-1-carboxy-pentyl}ureido)-pentanedioic οξύ) για σύζευξη με ανθρώπινη ανασυνδυασμένη EGF (Peprotech, Ασία, Rehovot, Israel). Εν συντομία, EGF (32 nmole) επωάστηκε με 5 ισοδύναμα IRDye 800CW NHS εστέρα σε 1 Μ Κ2ΗΡΟ4, ρΗ 9,0, επί 2 ώρες στο σκοτάδι στους 20 ° C, με ανάδευση. Μετά τη σύζευξη, το μείγμα σύζευξη δωρεάν αντιδραστήρια και EGF-NIR εφαρμόστηκε σε HiPrep 26/10 (Fine Sephadex G-25, μεγέθους σωματιδίων 90 μm) στήλη αφαλάτωσης (GE Healthcare, βιοεπιστήμες, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο) ενός όγκου 55 ml (Vo = 15 ml). Αυτή η στήλη ισορροπήθηκε και εκλούστηκε στα 10 ml /min με απεσταγμένο νερό χρησιμοποιώντας όργανο FPLC AKTA P900 (GE Healthcare-Life Sciences, Buckinghamshire, UK). Αυτό ακολουθήθηκε από συλλογή του αποκλείεται κορυφή και τη ρύθμισή του σε ρΗ 8,0 με προσθήκη 1 ml 0.02 Μ ρυθμιστικού διαλύματος Tris HCl (ρΗ 8,0). Το διάλυμα εφαρμόσθηκε για χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων επί Hitrap DEAE FF (DEAE Sepharose υψηλής ροής, GE Healthcare, Βιολογικές επιστήμες, Buckinghamshire, UK), εξισορροπημένη με 0,02 Μ ρυθμιστικού διαλύματος Tris HCl (ρΗ 8,0) εις ταχύτητα ροής 1 ml /min και EGF -NIR εκλούστηκε από τη στήλη χρησιμοποιώντας βαθμίδα 1-100% NaCl στο ρυθμιστικό εξισορρόπησης. Το καθαρισμένο EGF-NIR διυλίσθηκε σε 3.000 αποκοπεί σάκους διαπίδυσης (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA) για 14 ώρες σε σκοτάδι στους 4 ° C έναντι απεσταγμένου ύδατος. Το απεσταγμένο διάλυμα λυοφιλίστηκε, και 0,1 mg ξηρού δειγμάτων του EGF-NIR διαλυμένο σε 1% τριφθοροξικό οξύ (ΤΡΑ) τελικά διαχωρίστηκαν με HPLC χρησιμοποιώντας μια στήλη Sperisorb DDS2 (όργανα ΕΚΒ, Gaithersburg MD) χρησιμοποιώντας δύο γραμμικά βαθμίδες: η πρώτη βαθμίδα από 10-35%, ακολουθούμενη από μία δεύτερη βαθμίδα 35-85% ακετονιτρίλιο σε 1% TFA. Ο καθαρισμός διεξήχθη σε ρυθμό ροής 4,7 ml /min (100 bar πίεση). Η πλήρης κίνηση συνεχίστηκε για 45 λεπτά και η κορυφή EGF-NIR εκτιμήθηκε από την οπτική απορρόφηση στα 226 και 700 nm. Μοριακές συγκεντρώσεις των βαφών και EGF υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μοριακή συντελεστές απόσβεσης των 270.000 M

-1 εκατοστά

-1 για IRDye 800CW στα 780 nm, και 18.000 Μ

-1 εκατοστά

-1 για το ΕΤΠ. Η απορρόφηση στα 280 nm χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό EGF συγκέντρωση πρωτεΐνης με βάση συντελεστή μοριακής απόσβεσης του. Διπλή απορρόφηση μήκος κύματος χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί βαφή: αναλογία πρωτεΐνης. εκπομπή EGF-NIR μετρήθηκε σε PBS χρησιμοποιώντας Φθορο-Max 4 φασματοφθορόμετρο (JY Horiba, Edison, NJ, USA) με ένα τόξο λάμπα Xenon ως πηγή διέγερσης των 774 nm σε κυψελίδα του 1 cm, και με ρυθμό σάρωσης 80 nm /sec. Για την επικύρωση, EGF-NIR από LI-COR Βιοεπιστημών (Lincoln, ΝΕ, USA) χρησιμοποιήθηκε επίσης. EGF-NIR υποβλήθηκε για ανάλυση σε 12% SDS-PAGE σε σύγκριση με εγγενή, μη επισημασμένη ΕΤΠ. Δείγματα 10 μα πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν και οπτικοποιήθηκαν με κυανή χρώση Commassie και η εκπομπή NIR μετρήθηκε με τοποθέτηση και τη σάρωση του πηκτώματος στο Odyssey® απεικόνισης υπερύθρων (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ, USA).

Κηλίδωση Western του EGFR και Erk φωσφορυλίωσης

Τα επίπεδα του EGFR σε κυτταρικές σειρές και CRC ιστού και φωσφορυλίωση ΕΚΚ, εκτιμήθηκαν κατά την εκχύλιση με ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, ΜΑ, USA). Η ικανότητα του EGF-NIR να διεγείρει φωσφορυλίωση ERK σε κύτταρα Α431 σε σύγκριση με εκείνη του μη επισημασμένου EGF. 2 × 10

6 κύτταρα σε 90% συρροή σε μια πλάκα 6 φρεατίων στερήθηκαν ορό για 2 ώρες. Η πείνα μέσο αντικαταστάθηκε με κανονικό μέσο που περιέχει 7 ηΜ EGF-NIR. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και συλλέχθηκαν. 50 μg προϊόντα λύσης πρωτείνης διαχωρίστηκαν με 10% πολυακρυλαμιδίου SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε πάγο σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (90 V για 1,5 ώρες? Whatman, Dassel, Germany). Μη ειδική σύνδεση παρεμποδίστηκε με επώαση των μεμβρανών επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (RT) με 5% άπαχο γάλα σε σκόνη (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween-20. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-EGFR (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, ΜΑ, USA) ή πρωτογενή αντισώματα (1:1,000) έναντι φωσφο-ή παν-Erk1 /2 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, ΜΑ, USA), που ακολουθείται από υπεροξειδάση αρμορακίας (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ, USA) και αναπτύχθηκε με ECL (Pierce, Rockford, IL, USA)

(α) Αριστερά: α. σύστημα CRC πολύποδας με υψηλή κηλίδες των μετασχηματισμένων κυττάρων CRC (εστιακή ζώνη) και ετερογενή περιοχή, συμπεριλαμβανομένων τόσο φυσιολογικά και μετασχηματισμένα κύτταρα CRC? Μέση: παραγωγή ενός ετερογενούς μίγματος σε διαφορετικές αναλογίες (%) μεταξύ ΗΤ-29 και SW 620? 0 – Δεν κύτταρα? + /++ -παρουσία Διαφορετικές συγκεντρώσεις κυττάρων? Δεξιά: εστιακή επένδυση (σε έναν δακτύλιο) του ΗΤ-29 και Α431 μονοστρωματική περιβάλλεται από SW620 μονοστρωματική? τοποθετήστε-το επίπεδο του EGFR (170 kD) και μη ώριμα EGFR (150 kD) στα κύτταρα? (Β) Η σχέση μεταξύ της έντασης NIR 15 min πρόσδεση με 7 ηΜ EGF-NIR (μέση ± SD, η = 9) και το ποσοστό των SW620 στο μείγμα κυττάρων είτε με ΗΤ-29 (μαύροι κύκλοι) ή HCT116 (ανοιχτά κύκλοι) * p & lt? 0,05 έναντι 100% SW620? (Γ) Η σχέση μεταξύ SBR (μέση ± SD, η = 9) και η συγκέντρωση EGF-NIR? Α431 (ανοικτοί κύκλοι)? ΗΤ-29 (μαύροι κύκλοι)? σύνδεσης διεξήχθη για 15 λεπτά. Εισάγετε: σαρώσεις NIR? * P & lt? 0,05 έναντι 0,01 nM? (Δ) Η κινητική της 7 ηΜ EGF-NIR πρόσδεση (μέση ± SD, η = 9) προς εστιακή καλλιέργειες Α431 (ανοικτοί κύκλοι) ή ΗΤ-29 (μαύροι κύκλοι)? Εισάγετε: σαρώσεις NIR? * P & lt?. 0,05 έναντι 0 λεπτά

Η

Προετοιμασία

in vitro

CRC Μοντέλα και στο τηλέφωνο NIR απεικόνισης (IC-NIR)

Ομογενείς μονοστιβάδα ένα άτομο κυτταρική γραμμή.

κύτταρα CRC απλώθηκαν σε πυκνότητα 150.000 κύτταρα /φρεάτιο σε 12 φρεάτια πλακών καλλιέργειας ιστού (Nunc, Rochester, ΝΥ, USA) δύο ημέρες πριν από τα πειράματα παράγουν ομογενή μονοστοιβάδα κυττάρων. Στη συνέχεια, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 7 ηΜ EGF-NIR, για 15 λεπτά στους 4 ° C και 37 ° C, για τη μέτρηση της συνολικής πρόσδεσης. Στο τέλος του πειράματος οι καλλιέργειες πλύθηκαν τρεις φορές με 1 ml PBS και συναφείς κυτταρικές ένταση NIR εκτιμήθηκε. Για την αξιολόγηση της μη ειδικής δέσμευσης, η αδελφή καλλιέργειες επωάστηκαν με την ίδια συγκέντρωση του EGF-NIR, υπό τις ίδιες συνθήκες, με την παρουσία περίσσειας 100 ηΜ EGF. Η ειδική δέσμευση με απεικόνιση EGF-NIR ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της έντασης NIR της συνολικής δέσμευσης και NIR ένταση του μη ειδική δέσμευση. Πειράματα ανταγωνισμού με 500 ηΜ είτε cetuximab, παράγοντας μετασχηματισμού α ανάπτυξης (ΤΟΡ-α) ή neuregulin 1 (NRG1) διεξήχθησαν από την ταυτόχρονη επώαση του ανταγωνιστή με EGF-NIR. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (η = 9). Το απεικόνισης NIR εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Οδύσσεια Infrared Imager στις ακόλουθες συνθήκες κυμαίνονται: ανάλυση: 170-340 microns? περιοχή pixel: 0,03 χιλιοστά

2 (περίπου 15-20 κύτταρα)? ποιότητας: medium-low? επικεντρώνονται offset: 1-3? κανάλια: 800 nm? Ένταση:. 1-3

ετερογενής εστιακό μονοστιβάδα κυττάρων CRC

Για να μιμούνται υψηλά σημεία των μετασχηματισμένων κυττάρων CRC στον πολύποδα [19] και να επιτρέψει άμεσες μετρήσεις του σήματος προς υπόβαθρο. το ίδιο πείραμα, χρησιμοποιήθηκε ένα κομβικό προσέγγιση κυτταρικής καλλιέργειας. Διαφορετικές ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (με διαφορετικά επίπεδα του EGFR) ή 15 × 10

3 Α431 (υψηλά επίπεδα EGFR) καλλιεργήθηκαν σε συρροή μέσα σε μια 4 mm εσωτερική διάμετρος του δακτυλίου κλωνοποίησης (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA ) τοποθετείται στο κέντρο ενός καλά. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 2 ώρες σε μια συσκευή επώασης. Στη συνέχεια, 15 × 10

3 SW620 κύτταρα (που στερούνται EGFR) απλώθηκαν σε ελεύθερο κυττάρων περιοχή γύρω από το δαχτυλίδι κλωνοποίησης και αφήνεται να προσκολληθούν για 2 ώρες στις ίδιες συνθήκες. Διεξήχθησαν δύο τύποι τέτοιων πειραμάτων: α. μια εστίαση. σι. δύο εστίες. Στο τέλος του σταδίου προσκόλληση των κυττάρων, ο δακτύλιος κλωνοποίηση απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο καλλιέργειας. Δύο ημέρες μετά την παραγωγή του μοντέλου, οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε δεσμευτική και πειράματα απεικόνισης όπως περιγράφηκε προηγουμένως. αναλογία σήματος /Ιστορικό (SBR) τιμές δείχνουν την αναλογία του σήματος φθορισμού NIR του κεντρικού κύκλου (εστιακό χώρο του CRC ή κύτταρα Α431) στο σήμα φθορισμού NIR του έξω από την περιοχή (SW620).

Διαφορετικά κύτταρα CRC ήταν εστιακά επιχρυσωμένο με φόντο IEC6 εντεροκυττάρου μονοστιβάδας. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C με 7 ηΜ EGF-NIR παρουσία (μη ειδική σύνδεση – λευκές ράβδοι) ή απουσία (ολικής σύνδεσης – γκρι ράβδοι) 100 ηΜ μη τροποποιημένου EGF. Ο /φόντο αναλογία σήματος (κυτταρική σειρά CRC) (IEC6) εκτιμήθηκε στις ίδιες συνθήκες για όλους τους πολιτισμούς και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD (n = 9). Σπουδαιότητα: * p & lt? 0,05 σε σύγκριση με τις τιμές IEC6? ** Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το σύνολο της σύνδεσης του αντίστοιχου ομάδα ρ & lt? 0.05 σε σύγκριση με Α431 και & amp? p & lt? 0,05 σε σύγκριση με COLO 205? Κάτω ένθετα: σαρώσεις NIR? Άνω ένθετα: αριστερά-EGFR πρωτεΐνη έκφραση με western αποτύπωση? βέλος υποδεικνύει τη θέση του ώριμου EGFR 170 kD πρωτεΐνη και μη-γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη 150 kD? έκφραση δεξιά-mRNA του CEA και β-ακτίνη σε κυτταρικές καλλιέργειες.

Η

ετερογενής αναστολές των κυττάρων CRC.

Για να μιμούνται ετερογενή κατανομή των μετασχηματισμένων κυττάρων CRC στον πολύποδα [20] και να γίνεται δυνατή η αξιολόγηση της ευαισθησίας ανίχνευσης της ελάχιστης ποσότητας EGFR κυττάρων που εκφράζουν μεταξύ ελέγχου κανονική εντεροκύτταρα, ετερογενώς μικτές καλλιέργειες ΗΤ-29 και SW620 κυττάρων παρασκευάστηκαν. πολιτισμών αναστολή των ΗΤ-29 αναμείχθηκαν με τους πολιτισμούς αναστολή των SW620 για να δημιουργήσει διαφορετικό ποσοστό της καλλιέργειας μεμονωμένων κυττάρων στον ίδιο όγκο. SW620 κύτταρα θα μπορούσαν να διακριθούν από κύτταρα ΗΤ-29 με επιμήκη μορφολογία τους. Σε συνθήκες που χαρακτηρίζονται ως «0%» το εναιώρημα περιέχει 0% ΗΤ29 κύτταρα και 100% SW620 κύτταρα, και στο «100%», το εναιώρημα περιέχει 100% κύτταρα ΗΤ-29 και 0% SW620 κυττάρων. Στις άλλες περιπτώσεις, τα ποσοστά δείχνουν την αναλογία μεταξύ του ποσοστού ΗΤ-29 κυττάρων και το ποσοστό των κυττάρων SW620. Οι δεσμευτικές πειραματικές συνθήκες και οι μετρήσεις της έντασης φθορισμού NIR (αυθαίρετες μονάδες /mm

2) των διαφόρων ετερογενών καλλιέργειες πραγματοποιήθηκε όπως παραπάνω.

(Α) Φωτογραφία του ένα ορθοτοπικό όγκο και πρωτεΐνη EGFR έκφραση στο όγκων? (Β) Χρονική πορεία της συσσώρευσης EGF-NIR σε ιστούς ποντικών που φέρουν όγκο. Οι ποντικοί εγχύθηκαν ί.ν. με 1 nmol του EGF-NIR σε ποντικούς άνευ αγωγής (άνω σειρά, η = 6) ή ποντίκια προ-έγχυση με 1 μg /ml cetuximab (κάτω σειρά, η = 4)? υψηλή ανάλυση ΔΠΚ του ποντικιού ένεση με EGF-NIR και κύκλοι δείχνουν τις μετρήσεις ROI (C) Χρόνος πορεία της συσσώρευσης ιστού της EGF-NIR στις 48 ώρες από ποντικούς που παρουσιάζονται σε Β? Η ένταση του σήματος στα 800 nm ομαλοποιήθηκαν σε φθορισμό υποβάθρου χρησιμοποιώντας ένα αυθαίρετο κύκλο του όγκου (10-20 ROIs /ποντίκι) σε σύγκριση με μια πανομοιότυπη περιοχή του πλευρού (παρακείμενο μυς)? * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με EGF-NIR 4 ώρες? ** Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με ποντίκια που ενέθηκαν με EGF-NIR? (D) EGF-NIR σήματος αναλογία /υπόβαθρο σε απομονωμένο ιστό από τα ποντίκια που φέρουν όγκο 48 ώρες μετά την ένεση. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με το μυ, ** p & lt? 0,05 σε σύγκριση με το συκώτι? Εισάγετε: Άνω-φωτογραφίες των ιστών στο πιάτο? εικόνες Μέση-NIR? Κάτω-φασματική χάρτες ένταση? Ένταση κλίμακα-κόκκινο-καφέ (5) υψηλή έκφραση? μπλε (3) πολύ χαμηλή έκφραση.

Η

RT-PCR και EGFR siRNA κατασιγάσει

Ολικό RNA απομονώθηκε και γονιδιωματικό ϋΝΑ αποδομείται από τα παρασκευάσματα RNA, χρησιμοποιώντας την πλήρη απομόνωση RNA SV σύστημα (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). 1 μg του ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα (Promega, Madison, WI, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 50 μΐ που περιείχε 5 μg cDNA, 50 pmol από κάθε ανάντη και κατάντη νόημα εναρκτήρες αίσθηση του CEA ή EGFR [21], [22], και 25 μΙ GoTaq® Πράσινης Master Mix (Promega, Madison , WI). Πειράματα PCR διεξήχθησαν για 35 κύκλους. Για τη δημιουργία διαφόρων θραυσμάτων cDNA, ένα Mastercycler κλίση (Eppendorf, Hamburg, Germany) προγραμματίστηκε ως εξής: μετουσίωση στους 95 ° C για 1 λεπτό, αναδιάταξη στους 61 ° C και επιμήκυνση στους 72 ° C για 1 λεπτό. Να γκρεμίσουμε EGFR το τυπικό πρωτόκολλο παράγοντας επιμόλυνσης αμίνη Ambion (Applied Biosystem, Austin, TX, USA) ακολούθησε. Εν συντομία, 5 nM 21 mer αντι-EGFR σιλανσιέ επιλέξετε μία μικρή παρεμβολή RNA (siRNA) και κωδικοποιημένα RNA ήταν αντίστροφη επιμολύνονται σε καλλιέργειες κυττάρων Α431 χρησιμοποιώντας siPORTNeoFX παράγοντα επιμόλυνσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σε πυκνότητα 80.000 κύτταρα /κ.εκ εφαρμόστηκαν στις 12 φρεατίων και 2 ημέρες μετά αναλύθηκαν επιμολύνσεις. Γκρεμίσουμε του EGFR mRNA επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. Το παρακάτω καρκινο-εμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) και EGFR εκκινητών, που παρασκευάζεται από SyntezzaBioScience Ltd., Ιερουσαλήμ, Ισραήλ, χρησιμοποιήθηκαν:

Ανθρώπινο CEA CAM5: Αίσθηση: 5′-CGCATACAGTGGTCGAGAGA-3 ‘? Φοράς: 5’-ATTGCTGGAAAGTCCCATTG-3 ‘

Rat CEA1: Αίσθηση: 5′-CTACAGGCTGAGGGATGCTC-3′ αντινοηματικό: 5′-GGTCCCGTCACAGTTACGTT-3 ‘

Ανθρώπινο EGFR: Αίσθηση: 5′ CGAGGGCAAATACAGCTT-3 ‘αντι-νόημα: AAATTCACCAATACCTATT-3’

Ανθρώπινο EGFR siRNA: αίσθηση: 5′-CCAUAAAUGCUACGAAUAUtt-3 ‘αντι-νόημα: 5′-AUAUUCGUAGCAUUUAUGGag-3’

Ομελέτα siRNA: αίσθηση: 5 «-UAACGACGCGACGACGUAATT-3 ‘αντι-νόημα: 5′-UUACGUCGUCGCGUCGUUATT-3’

Η

Προετοιμασία και NIR απεικόνισης της CRC ορθοτοπική όγκων σε ποντίκια

Αυτή η μελέτη χρησιμοποιώντας Άντρας Balb /c nude (Harlan , Ισραήλ) ποντίκια εγκρίθηκε, πραγματοποιήθηκε και εποπτεύεται από τις κατευθυντήριες γραμμές του Ιατρικού Κέντρου Animal Care and Use Επιτροπή Chaim Sheba. ΗΤ-29 κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, πλύθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε συγκέντρωση 1 × 10

7 κύτταρα /ml σε PBS. Για την εμφύτευση του όγκου, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ενός μίγματος κεταμίνης (100 mg /kg) και ξυλαζίνης (20 mg /kg). Trans-πρωκτικό ένεση 1 × 10

6 ΗΤ-29 κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό μεγέθυνση μικροσκόπιο (X40) χρησιμοποιώντας 27 g βελόνα. Η ένεση κατευθύνθηκε υποβλεννογόνια στο άπω, οπίσθια ορθού, περίπου 2-3 ​​mm πέρα ​​από το πρωκτικό κανάλι και μέσα στο πρωκτικό βλεννογόνο [23]. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα για την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Οι όγκοι έφθασαν ~ 0,75 cm σε μέγεθος σε 3-4 εβδομάδες.

In vivo

απεικόνιση της EGF-NIR φθορισμού σε ποντίκια έγινε με LI-COR Βιοεπιστημών μικρών ζώων σύστημα απεικόνισης Odyssey MousePOD®. Για την οπτικοποίηση των όγκων, 1 nmol EGF-NIR σε 100 μΙ φυσιολογικού ορού εγχύθηκαν μέσω της φλέβας της ουράς σε όγκο θετική ποντικούς στην παρουσία (n = 4) ή απουσία (n = 6) του cetuximab (1 μg /ml) και αξιολογούνται για συστηματική σουτ από απεικόνισης NIR σε διαστήματα 1-8 ωρών για μία περίοδο τριών ημερών, μετά την οποία χρόνος & gt? είχε εκκαθαριστεί το 95% του σήματος. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν έως και δύο ημέρες μετά την ένεση και σε ευθανασία. Η στατιστική ανάλυση των εικόνων για κάθε ποντικό ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τις ίδιες κλίμακες ένταση, υπό τις συνθήκες που περιγράφηκαν προηγουμένως. SBR υπολογίστηκε ως εξής: μέση ένταση NIR του όγκου διαιρεμένο με μέση ένταση NIR του φόντου του παρακείμενου μυός. Περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) με ίδιες περιοχές χρησιμοποιήθηκαν για τόσο του όγκου και του φόντου. Η τυπική απόκλιση της μέσης υποβάθρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 10-20 ROIs. Λόγω διαφορών μέγεθος του όγκου μεταξύ των ζώων που έλαβαν EGF-NIR, σήμα όγκου διαιρεμένο με το σήμα υποβάθρου παρόμοιου μεγέθους ROI διορθωμένη για την περιοχή (pixel), με την προϋπόθεση του όγκου δύο διαστάσεων (2D) συνολική επισήμανση. Οι όγκοι, σκελετικό μυ και ιστό ήπατος του ευθανασία ποντικών αποκόπηκαν και τα δείγματα ούρων τους συλλέχθηκαν. Οι ιστοί ζυγίστηκαν και εισήχθησαν σε πλαστικούς σωλήνες πιάτα. Τα πιάτα σαρώθηκαν στην Οδύσσεια απεικόνισης υπερύθρων. NIR ένταση του ROI του όγκου συγκρίθηκε με γειτονικά μυ για να δημιουργήσει SBR. αναλύσεις Απομονωμένα ιστού πραγματοποιήθηκαν με σάρωση στα 800 nm κανάλι, για τον ιστό συσσωρευμένη σήμα φθορισμού EGF-NIR και η SBR υπολογίστηκε. Το απεικόνισης NIR εκτιμήθηκε στις ακόλουθες συνθήκες: ανάλυση: 170-340 microns? περιοχή pixel: 0,03 χιλιοστά

2? ποιότητας: medium-low? επικεντρώνονται offset: 1-3? κανάλια: 800 nm? Ένταση:. 1-3

Ασθενείς και CRC ιστών Συλλογή Δείγματος

18 ασθενείς ηλικίας άνω των 18 ετών με ιστολογικά επιβεβαιωμένο πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου προσφέρθηκαν συμμετοχή στη μελέτη. 5 ασθενείς που έλαβαν προηγούμενη ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία ήταν επιλέξιμες για τη μελέτη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review (IRB, Επιτροπή του Ελσίνκι) του Ιατρικού Κέντρου του Πανεπιστημίου Hadassah-Hebrew. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από συναινούντων ατόμων της μελέτης υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή του όγκου ο οποίος υπέγραψε γραπτή συγκατάθεση. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ρουτίνα μακροσκοπική και μικροσκοπική ανάλυση από σκάφους επικυρωμένο παθολόγος, σύμφωνα με το Σώμα των Αμερικανών Παθολόγων (CAP) κατευθυντήριες γραμμές των εκθέσεων ιστοπαθολογίας (www.cap.org). Οι ιστοί που προσδιορίζονται από τον παθολογοανατόμο μελέτης αδενοκαρκινώματος παχέως εντέρου και των παρακείμενων ιστών [24] χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για την απεικόνιση IC-NIR.

36 Φέτες ιστών CRC και 19 φέτες παρακείμενο ιστό του παχέος εντέρου (n = 10-15 ROI στην κάθε φέτα) υποβλήθηκαν για

ex vivo

προσδιορισμό δέσμευσης για 45 λεπτά στους 37 ° C με 70 ηΜ EGF-NIR παρουσία (μη ειδική) ή απουσία (συνολική δέσμευση) του 1 μΜ μη επισημασμένου EGF. Η ένταση NIR εκτιμήθηκε σε πανομοιότυπες συνθήκες για όλες τις τομές (n = 12). Σπουδαιότητα: * ρ ​​& lt? 0,01 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα σε παρακείμενες EGFR- κόλον, ** ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα στην CRC ιστό EGFR-? Εισαγωγή: τυπικό κηλίδωση Western για EGFR των φετών διερευνήθηκαν

Η

Εικόνες πέντε τυπικών φέτες, ειδικώς επισημασμένο με EGF-NIR, όπως περιγράφεται στη λεζάντα για το Σχ.. 7. Το 800 nm Οδύσσεια Infrared Imager εικόνων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση εφαρμοσμένης φασματικής απεικόνισης λογισμικού, Spectral View. Ένταση κλίμακα-κόκκινο-καφέ (5) υψηλή έκφραση της δέσμευσης EGF-NIR? πράσινο (4) ενδιάμεση έκφραση? μπλε (3) πολύ χαμηλή έκφραση.

Η

NIR ΔΠΚ της CRC ιστοί

Φρέσκα ιστό του όγκου ή παρακείμενους ιστούς του παχέος εντέρου χωρίστηκαν σε οριζόντιες φέτες, 230 μm πάχους, τα οποία παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα vibratome VT1000S (Leica, Nussloch, Germany) και επωάστηκαν σε διάλυμα δέσμευσης παγωμένο DMEM. Οι φέτες μεταφέρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες καλλιέργειας ιστού συμπληρώθηκε με DMEM κορεσμένο με 95% O

2 και 5% CO

2 είναι παρόμοια με τις συνθήκες που επιτρέπουν καλλιέργειες ορθού οργάνου [25]. Οι πλάκες διατηρήθηκαν επί πάγου για 45 λεπτά διάρκεια σε DMEM και το πείραμα σύνδεσης διεξήχθη με την προσθήκη 70 ηΜ EGF-NIR παρουσία (μη ειδική σύνδεση) ή απουσία (συνολική δέσμευση) 1 μΜ μη τροποποιημένων EGF. Από κάθε ιστό, εις τριπλούν φέτες επωάστηκαν με 70 ηΜ NIR-Dye (IRDye800CW) για την αξιολόγηση της μη δεσμευτική της βαφής ειδικών. Το πείραμα πρόσδεσης τερματίστηκε με πλύση του ιστού τρεις φορές με ψυχρό PBS. Τα υγρά φέτες μεταφέρθηκαν σε νέες πλάκες 24 φρεατίων σε 1 ml /φρεάτιο PBS και σαρώνονται για NIR απεικόνιση ένταση χρησιμοποιώντας Οδύσσεια Infrared Imager, υπό τις συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω. Διαδοχικά, κατά τη διάρκεια μιας περιόδου δύο ετών 43 CRC και 23 γειτονικά δείγματα ιστού κόλον αξιολογήθηκαν. ROIs με ταυτόσημες περιοχές χρησιμοποιήθηκαν για φέτες από τις διάφορες πειραματικές ομάδες. Τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις της έντασης NIR (αυθαίρετες μονάδες φθορισμού /mm

2 περιοχή) υπολογίστηκαν με τη χρήση 10-15 ROI που σε κάθε φέτα. Κάθε φέτα που υποβάλλονται για το πείραμα πρόσδεσης EGF-NIR αξιολογήθηκε επίσης μετά τη απεικόνισης για έκφραση EGFR με κηλίδωση Western. Τα δεδομένα επιτευχθεί κατηγοριοποιήθηκε σύμφωνα με EGFR θετική ιστούς CRC, EGFR αρνητική ιστούς CRC και των παρακείμενων ιστών του παχέος εντέρου που στην πλειοψηφία ήταν EGFR αρνητικά. Η έλλειψη EGFR αποδείχθηκε από κηλίδωση Western. Το 85% των φετών συμπεριλήφθηκαν στις στατιστικές αναλύσεις σύμφωνα με την ακόλουθη φαρμακολογική κριτήρια: α. ολική δέσμευση? σι. Σχ. Σύκο.