Αφηρημένο

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι η πιο συχνή ενδοκρινική κακοήθης νόσος και η συχνότητα αυξάνεται.

DACT2

βρέθηκε συχνά μεθυλιώνονται στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Προκειμένου να διερευνηθεί η επιγενετική αλλαγή και το ρόλο του

DACT2

στον καρκίνο του θυρεοειδούς, καρκινικές κυτταρικές σειρές 7 θυρεοειδούς, 10 περιπτώσεις δειγμάτων μη καρκινικά θυρεοειδικό ιστό και 99 περιπτώσεις των δειγμάτων καρκίνου του θυρεοειδούς πρωτογενούς συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. DACT2 εκφράστηκε και μη μεθυλιωμένη στο Κ1, SW579, FTC-133, TT, W3 και κυτταρικές σειρές 8505C. Απώλεια της έκφρασης και πλήρης μεθυλίωση βρέθηκε σε κύτταρα TPC-1. Αποκατάσταση της έκφρασης DACT2 προκλήθηκε με 5-αζα-2’δεοξυκυτιδίνη θεραπεία. Αποδεικνύει ότι η έκφραση του

DACT2

διέπονταν από την περιοχή του υποκινητή μεθυλίωση. Σε ανθρώπινα πρωτογενή θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, 64,6% (64/99) μεθυλιώθηκε και μεθυλίωση του DACT2 σχετιζόταν με λεμφαδένα μετάσταση (ρ & lt? 0,01). Re-έκφραση του

DACT2

καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και τη μετανάστευση σε κύτταρα TPC-1. Η δραστηριότητα του TCF /LEF αναστάλθηκε από DACT2 σε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένα κύτταρα β-κατενίνης. Η δραστηριότητα του TCF /LEF αυξήθηκε με συν-επιμόλυνση DACT2 και Dvl2 σε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένα κύτταρα β-κατενίνης. Η υπερέκφραση του άγριου τύπου β-κατενίνης προάγει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε DACT2 εκφράστηκε σταθερά κύτταρα. Η έκφραση της β-κατενίνης, c-myc, cyclinD1 και ΜΜΡ-9 μειώθηκαν και το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης β-κατενίνης (ρ-β-κατενίνης) αυξήθηκε μετά την αποκατάσταση της έκφρασης σε κύτταρα DACT2 TPC-1. Η έκφραση της β-κατενίνης, c-myc, cyclinD1 και ΜΜΡ-9 αυξήθηκαν και το επίπεδο της π-β-κατενίνης μειώθηκε μετά knockdown του DACT2 σε W3 και τα κύτταρα SW579. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι DACT2 καταστέλλει ανθρώπινη θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς ανάπτυξη και μετάσταση με αναστολή σηματοδότηση Wnt. Εν κατακλείδι,

DACT2

συχνά μεθυλιωμένη στο θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς. έκφραση DACT2 διέπονταν από την περιοχή υποκινητή μεθυλίωση.

DACT2

καταστέλλει θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση, αναστέλλοντας σηματοδότηση Wnt

Παράθεση:. Zhao Z, Herman JG, Brock MV, Sheng J, Zhang Μ, Liu Β, et al. (2014) Η μεθυλίωση του

DACT2

Προωθεί θηλώδες καρκίνο του θυρεοειδούς Μετάσταση από Ενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt. PLoS ONE 9 (11): e112336. doi: 10.1371 /journal.pone.0112336

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 25, Απρ, 2014? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας (973 Πρόγραμμα Νο 2012CB934002, 2010CB912802), Εθνικό Key επιστημονικό όργανο Ειδικό Πρόγραμμα Κίνα (Grant Νο 2011YQ03013405), Εθνική υψηλής τεχνολογίας Ε & amp? Πρόγραμμα D (863 Πρόγραμμα Νο SS2012AA020314, SS2012AA020821, SS2012AA020303) και το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81121004, 81071953, 81161120432). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι η πιο συχνή ενδοκρινική κακοήθεια, και η συχνότητα της αυξάνεται πολύ γρήγορα σε παγκόσμιο επίπεδο [1]. Θυλακοειδών επιθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από καρκίνο του θυρεοειδούς κατηγοριοποιήθηκε σε τρεις ιστολογικών τύπων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του θυρεοειδούς θηλώδες (PTC, 80%), θυρεοειδή θυλακιώδη καρκίνο (FTC, 15%), και αναπλαστικό καρκίνο του θυρεοειδούς (ATC, 2-5%). Ενώ το μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς (MTC), το οποίο αναπτύχθηκε από παραθυλακιώδη κύτταρα C, είναι πολύ σπάνια [2] – [4]. Αν και η πρόγνωση του καρκίνωμα του θυρεοειδούς είναι πολύ καλύτερη, εξακολουθεί να είναι πολύ δύσκολο να επιλέξει θεραπευτική μέθοδο. Η στρατηγική της θεραπείας PTC περιλαμβάνει κυρίως χειρουργική εκτομή, συμπληρωματική εκτομή ραδιενεργό ιώδιο και καταστολή θυρεοτροπίνης. Η έκταση της θυρεοειδεκτομή και λεμφαδενεκτομής παραμένει αμφιλεγόμενη [5]. Επιγενετικές αλλαγές μπορεί να χρησιμεύσει ως ντετέκτιβ, προγνωστικές και θεραπευτικές δείκτης στον καρκίνο του θυρεοειδούς.

Dapper, ένα Dishevelled που σχετίζεται με ανταγωνιστή της β-κατενίνης (dAct), απομονώθηκε από μια οθόνη για πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με Dishevelled, ένας βασικός παράγοντας στην σηματοδότηση Wnt. Dapper και Dishevelled συν-εντοπισμένη ενδοκυτταρικώς και σχηματίζεται ένα σύμπλοκο με Axin, GSK3 και β-κατενίνης [6]. Ανθρώπινα DACT2 αναγνωρίστηκε από Katoh et al. και βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 6q27 [7]. Waxman JS και Li Xiao et al. διαπίστωσε ότι DACT2 προωθεί Wnt σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στο zebrafish και το ποντίκι δόντια [8], [9]. προηγούμενες μελέτες μας διαπίστωσε ότι DACT2 είναι ένας αναστολέας της Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση στον πνεύμονα και στο ήπαρ καρκίνωμα [10], [11]. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την επιγενετική αλλαγή και τη λειτουργία των DACT2 σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με το κατευθυντήριες γραμμές του 1975 Διακήρυξη του Ελσίνκι και σύμφωνα με τις τοπικές ρυθμιστικές απαιτήσεις και κατευθυντήριες γραμμές ορθής κλινικής πρακτικής. Όλα τα δείγματα που συλλέγονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που έχουν εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο του. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς έχουν περιγραφεί προηγουμένως [12] – [14]. Οι πειραματικές μέθοδοι που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της κινεζικής PLA Γενικό Νοσοκομείο (Αριθμός Άδειας: 20090701 – 015 και 20140423 έως 001).

Πρωτογενή ανθρώπινα θηλώδους δείγματα καρκίνου του θυρεοειδούς και κυτταρικές σειρές

συνολικά 99 περιπτώσεις πρωτογενούς θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και 10 περιπτώσεις κανονικής θυρεοειδικού ιστού συλλέχθηκαν ως κατεψυγμένα ιστού από το Πεκίνο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. Όλα τα δείγματα που συλλέγονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που έχουν εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο του. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του θυρεοειδούς 7 (Κ1, TPC-1, SW579, FTC-133, ΤΤ, W3 και 8505C) συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς είχαν προηγουμένως καθοριστεί από πρωτογενή καρκίνο του θυρεοειδούς. κυτταρικές γραμμές Κ1, TPC-1, SW579, FTC-133 και ΤΤ διατηρήθηκαν σε 90% RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για τη συμπλήρωση με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C με 5% CO2. W3 και κυτταρικές 8505C γραμμές διατηρήθηκαν σε 90% ϋΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για τη συμπλήρωση με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C με 5% CO2. Τα κύτταρα περάστηκαν 1:03 φορά το 80% συρροή επιτεύχθηκε σε μια φιάλη 75 cm2 πολιτισμού (NEST Βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έχουν αναφερθεί προηγουμένως [12] – [14]

θεραπείες

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης

κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς χωρίστηκαν σε χαμηλή πυκνότητα. 12 ώρες πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα) (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) σε συγκέντρωση 2 μΜ εντός του μέσου ανάπτυξης, η οποία έγινε ανταλλαγή κάθε 24 ώρες για ένα σύνολο 96 θεραπεία ώρας . Στο τέλος της διάρκεια της θεραπείας, το RNA εκχυλίστηκε.

απομόνωση RNA και η τακτική PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης και φασματοφωτομετρική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ποιότητας και της ποσότητας RNA. Ο πρώτος κλάδος cDNA συνετέθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα σύνολο 5 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για να συνθέσει cDNA πρώτου κλώνου χρησιμοποιώντας το κιτ Superscript ΙΙΙ-ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το μίγμα της αντίδρασης στη συνέχεια αραιώθηκε σε 100 μΙ με νερό. 2.5 μΙ του αραιωμένου μείγματος cDNA χρησιμοποιήθηκε για 25 μl αντίδρασης PCR. Εκκινητές PCR έχουν ως εξής: 5′-GGC TGA GAC AAC ΑΟΟ ACA TCG-3 ‘(F) και 5′-GAC CGT CGC TCA TCT CGT ΑΑΑΑ-3′ (R). Η κατάσταση του ποδηλάτου είναι 95 ° C 5 λεπτά, (95 ° C 30 s, 64 ° C 30 s, 72 ° C 40 s χ 3 κύκλους, (95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 40 s ) × 3 κύκλους, (95 ° C 30 s, 58 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) χ 3 κύκλους, (95 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) × 24cycles, . 72 ° C 7 λεπτά GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος Οι εκκινητές αλληλουχίας έχουν ως εξής:. 5’-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC-3 ‘(F), και 5’-GTC CAC CAC ΚΔ Γ.Ο.Σ. GCT GTA- 3 ‘(R). Η προϋπόθεση ποδηλασίας είναι 95 ° C 5 λεπτά, (95 ° C 30 s, 63 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) × 25cycles, 72 ° C 7 λεπτά.

τροποποίηση όξινου θειώδους, μεθυλίωση ειδική PCR (MSP) και όξινου θειώδους αλληλουχίας (BSSQ)

γενωμικό DNA παρασκευάστηκε με τη μέθοδο πρωτεϊνάσης-Κ. το γονιδιωματικό ϋΝΑ με όξινο θειώδες τροποποιημένου όπως περιγράφηκε προηγουμένως. MSP εναρκτήρες σχεδιάστηκαν σύμφωνα με γονιδιωματικές αλληλουχίες γύρω έναρξης της μεταγραφής sites (TSS) και συντίθεται (BGI, Πεκίνο, Κίνα) για την ανίχνευση μη μεθυλιωμένη (U) και μεθυλιωμένα (Μ) αλληλόμορφα MSP εκκινητών έχουν ως εξής:. 5′-GCG CGT GTA GAT TTC GTT ΤΤΤ CGC-3 ‘( MF)? 5’-AAC CCC ACG AAC GAC GCCG-3 ‘(MR)? 5′-TTG GGG TGT ΟΤΟ TAG ΑΤΤ TTG ΤΤΤ TTTGT-3 (UF) και 5′-CCC ΑΑΑ CCC CAC ΑΑΑ CAA CAC CA-3 »(UR). Το μέγεθος του προϊόντος PCR unmethylation είναι 161 bp και μεθυλίωση PCR προϊόν είναι 152 bp. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές BSSQ πλευρίζουν τις στοχευμένες περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της MSP εναρκτήρες χώρων και τη θέση έναρξης της μεταγραφής. εκκινητές Sequencing ήταν ως εξής: 5’-GGG GGA GGT GGT YGY GAT ΤΤ-3 ‘(F) και 5′-ACC TAC RAC RAT CCC AAC CC-3’ (R). Bisulfite αλληλούχιση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [11].

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

ανοσοϊστοχημεία (IHC) διεξήχθη σε 5 μm πάχους σειριακές τομές που προέρχονται από φορμαλδεΰδη-σταθερό μπλοκ παραφίνης του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και σε συνδυασμό παρακείμενο ιστό. Μετά αποπαραφίνωση και την επανυδάτωση, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε για 30 λεπτά σε μεθανόλη που περιέχει 0,3% υπεροξείδιο του υδρογόνου. Μετά ανάκτηση αντιγόνου, μια περίοδος υπαναχώρησης 20 λεπτά προηγήθηκε της επώασης με το πρωτογενές αντίσωμα. DACT2 αντίσωμα (ΟηΟεηε Tech, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε σε όλη τη νύχτα αραίωση 1/1000 σε 4 ° C. Η ένταση χρώσης και η έκταση της λεκιασμένη περιοχή βαθμολογήθηκαν σύμφωνα με το λογισμικό NIS-ΣΤΟΙΧΕΙΑ Imaging (Nikon, Tokyo, Japan) χρώση ένταση του κυτταροπλάσματος (ασθενής χρώση = 1? Μέτρια χρώση = 2? Ισχυρή χρώση = 3)? έκταση της χρωματισμένων κυττάρων (0% = 0, 0-5% = 1, 5-10% = 2, 10-15% = 3, 15-20% = 4). Η τελική ανοσο-αντιδραστική σκορ (0-12) προσδιορίστηκε πολλαπλασιάζοντας βαθμολογία της έντασης με την έκταση της προετοιμασμένα κύτταρα σκοράρει.

Κατασκευή λεντοικής DACT2 Φορείς έκφρασης

Ανθρώπινο πλήρους μήκους

DACT2

(αριθμός πρόσβασης GenBank NM_214 462) cDNA ενισχύθηκε από τον φορέα pCMV-DACT2 [11]. Εκκινητών ήταν ως εξής: 5′-TGA TCA ATG ΤΟΟ ACG CCG GGC-3 ‘(F) και 5′-GTC GAC TCA CAC CAT GGT CAT GAC-3’ (R). Το PCR προϊόν στη συνέχεια υποκλωνοποιείται εντός του φορέα pLenti6-GFP. Τα ένθετα επιβεβαιώθηκαν με πέψη περιορισμού και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA.

λεντοϊών λοιμώξεις και σταθερή έκφραση κύτταρα επιλογή

293Τ κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε 90% ϋΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) με τη συμπλήρωσή 10% βόειο εμβρυϊκό ορό στους 37 ° C με 5% CO2. DACT2 εκφράζεται διάνυσμα Lentivirus διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (5 × 10

6 ανά 100 mm δίσκο) χρησιμοποιώντας διάλυμα πολυαιθυλενοϊμίνη (P.E.I.) σε 3:01 αναλογία (μάζα P.E.I.: μάζα DNA). Μετά από 48 ώρες, υπερκείμενο ιού συλλέχθηκε και διηθήθηκε. Στη συνέχεια, ιικό υπερκείμενο προστέθηκε στο καλλιεργητικό μέσο των κυττάρων TPC-1 και εκφράζεται σταθερά κύτταρα επιλέχθηκαν με Blasticidin (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) σε 0.2 μg /ml για 2 εβδομάδες.

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

Κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε καθημερινά για 72 ώρες χρησιμοποιώντας ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) Kit (keygen Biotech, Jiangsu, Κίνα), σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα χαράσσονται ως μέσο ± SD.

Colony

δοκιμασία σχηματισμού

DACT2 εκφράζονται σταθερώς TPC-1 κύτταρα και DACT2 ανέκφραστη TPC-1 κύτταρα αραιώθηκαν και επανακαλλιεργήθηκαν σε 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 6- φρεατίων καλλιέργειας εις τριπλούν. Το μέσο ανάπτυξης, ρυθμισμένο με Blasticidin στα 0,2 μg /ml, ανταλλάχθηκε κάθε 24 ώρες. Μετά από 14 d, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 75% αιθανόλη για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες για την οπτικοποίηση και καταμέτρηση.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Μετά από 12 ώρες το συγχρονισμό με ασιτία ορού, DACT2 εκφράζονται σταθερά κύτταρα TPC-1 και DACT2 ανέκφραστη κύτταρα TPC-1 καλλιεργήθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) επί 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 50 μg ml ιωδιούχου προπιδίου /(keygen Biotech, Jiangsu, Κίνα). Τα κύτταρα στη συνέχεια κατατάσσονται σύμφωνα με FACS Caliber (BD Biosciences, San Jose, CA) και αναλύθηκαν από το λογισμικό ΜΟϋΡΙΤ.

Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής δοκιμασία

TPC-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μονοστιβάδες συρροής σε 6- φρεατίων και ένα ρύγχος πιπέτας χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία πληγών γραμμικής μηδέν. Μέσο χωρίς ορό εμβρύου μόσχου χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τραύματος εικόνες ελήφθησαν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή τοποθετείται σε οπτικό μικροσκόπιο σε 0, 36 και 72 ώρες. Τα πλάτη χάσμα του τραύματος μετρήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού J Image

Transwell δοκιμασία

Μετανάστευση:. TPC-1 κύτταρα προστέθηκαν στον άνω θάλαμο της μm μέγεθος πόρων συσκευές Transwell 8.0 (Corning, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής ) σε μια πυκνότητα 4 χ 10

4 κύτταρα (100 μΐ) ανά θάλαμο και επωάστηκε για 13 ώρες που ακολουθείται από την απομάκρυνση των κυττάρων που παρέμειναν στον άνω θάλαμο με μπατονέτες. Εισβολή: Η άνω βουλή ήταν επικαλυμμένα με Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). κύτταρα TPC-1 προστέθηκαν στον άνω θάλαμο σε πυκνότητα 6 × 10

4 κύτταρα (100 μΐ) ανά θάλαμο και επωάστηκε για 36 ώρες που ακολουθείται από την απομάκρυνση των κυττάρων που παρέμειναν στον άνω θάλαμο με μπατονέτες. Τα κύτταρα που διείσδυσαν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με 0.2% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν σε υψηλής απόδοσης πεδία (100 Χ) με μικροσκόπιο φωτός.

Dual-Luciferase δοκιμασίας ρεπόρτερ

κύτταρα Tpc-1 σπάρθηκαν σε 8 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας των 24 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Για να εξεταστεί μεταγραφική δραστηριότητα καθοδηγείται από TCF /LEF, Tpc-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον φορέα 100 ng /φρεάτιο TOP flash ανταποκριτή (TCF /LEF αποκρίνεται ανταποκριτή), 10 ng /φρεάτιο pRL-ΤΚ και PCI-neo-β-κατενίνης που εκφράζουν διάνυσμα (150 ng /φρεάτιο) χρησιμοποιήθηκε για να ενεργοποιήσει το γονίδιο αναφοράς? Ως αρνητικός έλεγχος, μια άλλη ομάδα κυττάρων Tpc-1 επιμολύνθηκαν με 100 ng /φρεάτιο Fopflash φορέα ρεπόρτερ, 10 ng /φρεάτιο φορέα αναφοράς pRL-ΤΚ και β-κατενίνη που εκφράζουν φορέα (150 ng /φρεάτιο). Στη συνέχεια, αυξανόμενες ποσότητες 150 ng /φρεάτιο φορέα DACT2 και 150 ng /φρεάτιο φορέα Dvl2 διαμολύνθηκαν σε κύτταρα μαζί με φορέα αναφοράς Topflash, τον φορέα ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ και PCI-neo-β-κατενίνης για να αξιολογηθεί η ρυθμιστική λειτουργία του DACT2 σε Wnt μονοπάτι σηματοδότησης.

48 ώρες μετά την επιμόλυνση, σχετικές δραστηριότητες λουσιφεράσης μετρήθηκαν με τη διπλή λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού ανταποκριτή (Promega, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για κάθε πείραμα, ο προσδιορισμός λουσιφεράσης εκτελέστηκε τρεις φορές [35].

DACT2 γκρέμισε από siRNA

Ένα επιλεγμένο siRNA (siRNA618) [11] με στόχο DACT2 και RNAi αρνητικού ελέγχου Duplex ήταν που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Οι αλληλουχίες ήταν ως εξής: siRNA duplex (με νόημα: 5-GUC GGU UGA UGA GAC UAC UTT-3? Αντινόημα: 5-AGU AGU CUC AUC AAC CGA CTT-3)? RNAi αρνητικό duplex ελέγχου (νόημα: 5-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3? Αντίθετης φοράς: 5-ACG UGA CAC Ουυ CGG AGA ΑΤΤ-3). RNAi ολιγονουκλεοτίδιο ή RNAi αρνητικός έλεγχος duplex (Gene Pharma Co, Σαγκάη, Κίνα) επιμολύνθηκε σε κύτταρα W3 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

παρασκευάσματος πρωτεΐνης και κηλίδωση Western

Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε λύση σε RIPA ρυθμιστικού λύσης (Beyotime Biotech, Jiangsu, Κίνα). Τα προϊόντα λύσης πρωτείνης στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ηλεκτρο-στυπώθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα και 0,1% Tween-20 σε TBS, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντισώματα. Τα αντισώματα είχαν ως εξής: DACT2 (ΟηΟεηε Tech, MD, USA), cyclinD1 (Bioworld Tech, ΜΝ, USA), c-myc (Bioworld Tech, ΜΝ, USA), ΜΜΡ-9 (Bioworld Tech, ΜΝ, USA), β-κατενίνης (Bioworld Tech, ΜΝ, USA), φωσφο-β-κατενίνης (Bioworld Tech, ΜΝ, USA) και β-ακτίνη (Beyotime Biotech, Jiangsu, Κίνα) .Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Beyotime Biotech, Jiangsu , Κίνα).

Στατιστική Ανάλυση

Η συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA και κλινική-παθολογική παραγόντων στην ανθρώπινη θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς αναλύθηκε από το

χ

2

δοκιμής για ανεξαρτησία διχοτομική μεταβλητές και δοκιμασία t του Student για συνεχείς μεταβλητές. Τα αποτελέσματα κρίθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt? 0,05 (*), p & lt? 0.01 (**), p & lt? 0.001 (***). Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS 19.0 λογισμικού.

Αποτελέσματα

DACT2

έχει σιγήσει περιοχή του υποκινητή υπερμεθυλίωση στο θυρεοειδή καρκινικά κύτταρα

Για να εξερευνήσετε την έκφραση του

DACT2

στον καρκίνο του θυρεοειδούς, η τακτική PCR χρησιμοποιήθηκε.

DACT2

έκφραση ανακαλύφθηκε στον καρκίνο του θυρεοειδούς ανθρώπινη κυτταρική σειρά K1, SW579, FTC-133, TT, W3 και 8505C με τακτικές PCR. Απώλεια

DACT2

έκφραση ανιχνεύθηκε στην κυτταρική σειρά TPC-1 (Σχ. 1Α). Εξετάσαμε την επόμενη

DACT2

μεθυλίωση χρησιμοποιώντας ειδική της μεθυλίωσης PCR (MSP) σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Πλήρης μεθυλίωση βρέθηκε σε κύτταρα TPC-1 και unmethylation βρέθηκε σε Κ1, SW579, FTC-133, κυτταρικές σειρές 8505C (Εικ. 1Β) ΤΤ, W3 και. Απώλεια

DACT2

έκφραση συσχετίστηκε με την περιοχή υποκινητή υπερμεθυλίωση. Για την περαιτέρω επικύρωση

DACT2

έκφραση ρυθμίζεται από περιοχή προαγωγού μεθυλίωση, κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα). Re-έκφραση του

DACT2

βρέθηκε στο TPC-1 κυτταρική γραμμή και καμία μεταβολή έκφραση αποκαλύφθηκαν σε Κ1, SW579, FTC-133, ΤΤ, W3 και κυτταρικές σειρές 8505C μετά από αγωγή 5-Αζα (Σχ. 1Α ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

DACT2

έκφραση ρυθμίζεται από την περιοχή υποκινητή μεθυλίωση. Για να δείτε την απόδοση της μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP) εκκινητών και την πυκνότητα μεθυλίωσης σε

DACT2

περιοχή του υποκινητή, πραγματοποιήσαμε θειώδους αλληλουχίας (BSSQ? Εικ. 1Γ). αποτελέσματα MSP είναι συνεπή με όξινο θειώδες αποτελέσματα αλληλουχίας πολύ καλά και

DACT2

περιοχή προαγωγού πυκνά μεθυλιώνονται σε κύτταρα TPC-1. Ανταλλακτικά θέσεις μεθυλίωσης στην περιοχή προαγωγού βρέθηκαν στο Κ1, W3 και τα κύτταρα SW579

Α:.

DACT2

έκφραση αναλύθηκε με τακτική PCR πριν (-) και μετά (+) 5-Αζα θεραπεία. Κ1, TPC-1, SW579, FTC-133, ΤΤ, W3 και 8505C είναι θυρεοειδούς καρκινικές κυτταρικές σειρές. H2O: διπλά αποσταγμένο νερό. GAPDH: τον εσωτερικό έλεγχο. Β: Τα αποτελέσματα MSP δείχνουν

DACT2

κατάσταση μεθυλίωσης. IVD (ίη vitro μεθυλιωμένο DNA) χρησίμευσε ως έλεγχος μεθυλίωσης. NL (κανονική DNA των λεμφοκυττάρων) χρησίμευσε ως έλεγχος unmethylation. Μ: μεθυλιωμένο αλληλόμορφα? U: μη μεθυλιωμένη αλληλόμορφα. C: Εκπρόσωπος θειώδους αποτελέσματα αλληλουχίας στο

DACT2

περιοχή του υποκινητή. Διπλό βέλος αντιπροσωπεύει την περιοχή ενίσχυσης MSP. Μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν μεθυλιωμένα CpG θέσεις και οι ανοικτοί κύκλοι υποδηλώνουν μη μεθυλιωμένα CpG θέσεις. TSS:. Μεταγραφικής θέσης έναρξης

Η

DACT2

συχνά μεθυλιωμένη στην πρωτοβάθμια θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και μεθυλίωση του DACT2 σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα

Για να εξερευνήσετε τις αλλαγές μεθυλίωσης στο

DACT2

στην ανάπτυξη καρκίνου του θυρεοειδούς, 99 περιπτώσεις πρωτογενούς θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς είχαν εντοπιστεί από MSP. 64 περιπτώσεις προχωρημένου καρκίνου του θυρεοειδούς (64,6%) ήταν μεθυλιωμένα (Εικ. 2Α). Δεν μεθυλίωση βρέθηκε σε 10 περιπτώσεις μη καρκινικά δείγματα ιστού του θυρεοειδούς (Εικ. 2Β). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η μεθυλίωση του

DACT2

συνδέθηκε με λεμφαδένα μετάσταση σημαντικά (ρ & lt? 0,01). Δεν βρέθηκε κάποια σχέση μεταξύ

DACT2

μεθυλίωση και την ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, το ποτό, το οικογενειακό ιστορικό και την ιστορία την έκθεση σε ακτινοβολία. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση του

DACT2

συνδέεται με τη μετάσταση καρκίνου του θυρεοειδούς. Παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεθυλίωση του

DACT2

μπορεί να χρησιμεύσει ως ντετέκτιβ και μεταστατικού δείκτη του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς

Α:. Αποτελέσματα Εκπρόσωπος MSP της

DACT2

σε ανθρώπινα πρωτογενή θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς . Β: τα αποτελέσματα Εκπρόσωπος MSP της

DACT2

σε φυσιολογικούς ιστούς του θυρεοειδούς από noncancerous ασθενείς. C: Εκπρόσωπος χρώση DACT2 αποτελέσματα θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και των παρακείμενων ιστών καθορίζεται από την IHC. (A, b, 200 ×? Γ, δ, 400 Χ). Δ: Οι βαθμολογίες έκφραση DACT2 εμφανίζονται ως οικόπεδα κουτί, οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν την μέση βαθμολογία? το κάτω και το πάνω μέρος από τα κουτιά που αντιπροσωπεύουν τα 25 και 75ο εκατοστημόριο, αντίστοιχα? κάθετες μπάρες αντιπροσωπεύουν το εύρος της έκφρασης. DACT2 έκφραση είναι σημαντικά διαφορετική σε 50 περιπτώσεις συνδυάζεται όγκου και των παρακείμενων δειγμάτων ιστού, σ & lt? 0.001. Ε: Η ένωση της απώλειας /μείωση της DACT2 έκφρασης και υποστηρικτής υπερμεθυλίωση αναλύθηκε

x

2

δοκιμή σε 50 περιπτώσεις συμφωνημένα πρωτογενή καρκίνο του θυρεοειδούς θηλώδες και δίπλα δείγματα ιστών. (P & lt? 0,05)

Η

Για να διερευνήσουν τη σύνδεση των DACT2 έκφρασης και της περιοχής υποκινητή υπερμεθυλίωση στην πρωτοβάθμια θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, η έκφραση DACT2 εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε 50 περιπτώσεις. διαθέσιμος συμφωνημένα θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και των παρακείμενων δείγματα ιστών. χρώση DACT2 παρατηρήθηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα, όπως αναφέρονται στις άλλες μορφές καρκίνου. Βρήκαμε ότι η έκφραση DACT2 μειώθηκε σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς ιστούς σε σύγκριση με τα γειτονικά δείγματα ιστού (ρ & lt? 0.001, Σχήμα 2C και D).. Και μειωμένη έκφραση συσχετίστηκε με την περιοχή DACT2 υποκινητή υπερμεθυλίωση σημαντικά (p & lt? 0,05? Σχ. 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση DACT2 ρυθμίζεται από περιοχή προαγωγού υπερμεθυλίωση σε πρωτογενείς θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς.

Αποκατάσταση της έκφρασης DACT2 καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει G1 σύλληψης σε καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς

Για να αξιολογηθεί το αποτέλεσμα του DACT2 στην θυρεοειδή καρκινογένεση, τη βιωσιμότητα των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών αξιολογήθηκαν πριν και μετά την αποκατάσταση της έκφρασης σε κύτταρα DACT2 TPC-1 (Σχ. 3Α). Η βιωσιμότητα των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών κατεστάλη μετά την εκ νέου έκφραση του DACT2 σε κύτταρα TPC-1 (Σχήμα 3Β και C, ρ & lt?. 0.01). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι DACT2 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς. Για την περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού, κυτταρομετρία ροής δοκιμασία που χρησιμοποιείται. Η κατανομή των φάσεων κυττάρων σε DACT2 ανέκφραστη και επανα-εκφράζεται TPC-1cells είχαν ως εξής: G0 /1 φάση:. 32.24 ± 1.61%

vs

55,49 ± 3,09% (ρ & lt? 0.001)? S φάση: 38.06 ± 2.34%

vs

25.23 ± 1.15% (p & lt? 0,05)?. G2 φάση /M: 29.70 ± 3.38%

vs

. 19.27 ± 2.32% (p & lt? 0,05). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι G0 /1 φάση αυξήθηκε, φάση S και G2 /M φάση μειώθηκαν μετά την αποκατάσταση της έκφρασης DACT2 σε TPC-1cells (Σχ. 3D). Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, καμία απόπτωση που επάγεται από DACT2 σε κύτταρα TPC-1 (p & gt? 0,05)

Α:. Επανέκφραση του DACT2 βρέθηκε μετά από επιμόλυνση του φορέα έκφρασης DACT2 σε κύτταρα TPC-1. Β: Αποτελέσματα ΜΤΤ: DACT2 καταστέλλει την βιωσιμότητα των κυττάρων TPC-1 (ρ & lt? 0.001). C: Αποτελέσματα σχηματισμός αποικίας πριν και μετά την εκ νέου DACT2 έκφραση σε κύτταρα TPC-1. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές (ρ & lt? 0,01). Λευκή γραμμή: άδειο φορέα? μαύρη γραμμή: DACT2 φορέα έκφρασης. D: G1 σύλληψη προκλήθηκε από DACT2 στα κύτταρα TPC-1. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές (ρ & lt? 0.001). Λευκή γραμμή: άδειο φορέα? μαύρη γραμμή:. DACT2 φορέα έκφρασης

Η

Αποκατάσταση της έκφρασης DACT2 αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή στην θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς

Όπως DACT2 μεθυλίωση συνδέεται με θηλώδους θυρεοειδούς μετάσταση του καρκίνου, με την επίδραση των DACT2 στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση αναλύθηκε σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα. Επούλωση δοκιμασία επούλωση και Transwell χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α και 4Β, η κυτταρική μετανάστευση αναστέλλεται προφανώς μετά την εκ νέου έκφραση του DACT2 σε κύτταρα TPC-1 (ρ & lt? 0.001). Στην δοκιμασία transwell χωρίς επικάλυψη ECM, ο αριθμός των μετανάστευσαν κύτταρα κάθε υψηλής ισχύος πεδίο ήταν 354,50 ± 47,44

vs.

64,83 ± 4,48 πριν και μετά την εκ νέου έκφραση του DACT2 σε κύτταρα TPC-1 (Σχ. 4C , p & lt? 0.001). Σύμφωνα με την ανίχνευση εισβολής, η επεμβατική αριθμός των κυττάρων του κάθε υψηλής απόδοσης τομέα ήταν 1091,40 ± 119,55

vs

31.58 ± 16.36 πριν και μετά την αποκατάσταση της έκφρασης DACT2 (Σχήμα 4C, σ & lt?. 0.001).. Αυτό δείχνει ότι DACT2 αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή και τη μετανάστευση στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Παραπάνω αποτελέσματα υπαινίσσονται ότι DACT2 καταστέλλει την μετάσταση του καρκίνου του θυρεοειδούς

Α:. Η μετανάστευση των κυττάρων καταστάλθηκε από DACT2 σημαντικά σε TPC-1 κυττάρων υπό την επούλωση των πληγών ανίχνευσης. Β: Μπλε γραμμή αντιπροσωπεύει το αποτέλεσμα επούλωσης πληγών των κενών ομάδας φορέα και η κόκκινη γραμμή αντιπροσωπεύει την επουλωτική των πληγών αποτέλεσμα DACT2 νέου εκφράζεται σε κύτταρα ομάδα TPC-1 για 72 ώρες (ρ & lt? 0.001). C:. Η μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή κατεστάλη από DACT2 στο TPC-1 κυττάρων υπό μελέτη φρεατίων (p & lt? 0.001)

Η

DACT2 αναστέλλει τη σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στον καρκίνο του θυρεοειδούς

στην κανονική μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, αυξημένη β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα θα προωθήσει τη μετατόπιση του β-κατενίνης στον πυρήνα. β-κατενίνης σε πυρήνες δεσμεύεται με το TCF /LEF σε διάφορους τύπους καρκίνων για μεταγραφική ενεργοποίηση των κατάντη γονιδίων, όπως cyclinD1, c-myc και ΜΜΡ [15] – [21], οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και μετάσταση. Να διερευνήσει την επίδραση της DACT2 για σηματοδότηση Wnt σε ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς, Topflash και (TCF /LEF) σύστημα δημοσιογράφος εργαζόταν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η δραστηριότητα του TCF /LEF ανεστάλη σημαντικά από DACT2. Είναι παρόμοιο με προηγούμενη αναφορά μας στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα [11], η δράση του TCF /LEF αυξήθηκε με συν-επιμόλυνση DACT2 και Dvl2 με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένου τύπου β-κατενίνης. Για την επικύρωση περαιτέρω το αποτέλεσμα του DACT2 στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, β-κατενίνης υπερεκφράστηκε σε DACT2 εκφράζεται σταθερά κύτταρα TPC-1. Ο αριθμός των μετανάστευσαν κύτταρα κάθε υψηλής ισχύος πεδίου ήταν 646 ± 158

vs

867 ± 118 πριν και μετά την υπερέκφραση του β-κατενίνης σε DACT2 εκφράζεται σταθερά κύτταρα TPC-1 (Σχήμα 5Β, σελ & lt?. 0.05). . Ο αριθμός των επεμβατικών κυττάρων για κάθε υψηλής ισχύος πεδίου ήταν 35 ± 32

vs

100 ± 50 πριν και μετά από υπερέκφραση της β-κατενίνης σε DACT2 εκφράζονται σταθερά TPC-1 κύτταρα (Σχήμα 5Β, σελ & lt?. 0.05). . Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν περαιτέρω ότι DACT2 καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή με αναστολή σηματοδότηση Wnt σε ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς. Η φωσφορυλιωμένη β-κατενίνη (ρ-β-κατενίνης) είναι ένα σημαντικό συστατικό αντιπροσωπεύει αποικοδόμηση β-κατενίνης. Στη μελέτη μας, η έκφραση του c-myc, cyclinD1 και ΜΜΡ-9 ήταν μειωμένη, και το επίπεδο της π-β-κατενίνης ήταν αυξημένη μετά την εκ νέου έκφραση του DACT2 σε κύτταρα TPC-1 (Εικ. 5C). Για να επικυρώσετε περαιτέρω την επίδραση της DACT2 για σηματοδότηση Wnt, siRNA νοκ ντάουν τεχνική που χρησιμοποιείται. Η έκφραση του c-myc, cyclinD1 και ΜΜΡ-9 αυξήθηκε, και το επίπεδο της π-β-κατενίνης ήταν μειωμένη σε DACT2 εκφράζονται W3 και τα κύτταρα SW579 (Εικ. 5C). Παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι DACT2 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων θυρεοειδούς και μετάσταση, αναστέλλοντας σηματοδότηση Wnt

Α:. Αποτελέσματα της δοκιμασίας λουσιφεράσης TCF /LEF. β-κατενίνης φορέας έκφρασης συν-επιμολύνθηκαν με TCF /LEF Topflash ρεπόρτερ ή μεταλλαγμένες της, Fopflash σε κύτταρα TPC-1. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. δραστηριότητα Σχετική λουσιφεράσης (ο λόγος του λουσιφεράση πυγολαμπίδας να Renilla λουσιφεράση) κατεστάλη από DACT2. Το πείραμα επαναλήφθηκε για τρεις φορές (* ρ & lt? 0,05). Αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης επάχθηκε με συν-επιμόλυνση DACT2 και Dvl2. Το πείραμα επαναλήφθηκε για τρεις φορές (* ρ & lt? 0,05). Β: Η μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή αυξήθηκε κατά β-κατενίνης σε DACT2 εκφράζεται σταθερά κύτταρα TPC-1 σύμφωνα με τη μελέτη φρεατίων. Το πείραμα επαναλήφθηκε για τρεις φορές (ρ & lt? 0,05). C: Η έκφραση της β-κατενίνης, c-myc, cyclinD1 και ΜΜΡ-9 μειώθηκαν και το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης β-κατενίνης (ρ-β-κατενίνης) αυξήθηκε μετά την αποκατάσταση της έκφρασης σε κύτταρα DACT2 TPC-1. Η έκφραση της β-κατενίνης, c-myc, cyclinD1 και MMP-9 αυξήθηκαν και το επίπεδο της p-β-κατενίνης μειώθηκε μετά γκρεμίζω DACT2 στην W3 και τα κύτταρα SW579.

Η

Συζήτηση

είναι επιθυμητό να διαχειριστεί τον καρκίνο του θυρεοειδούς προσωπικά βασίζονται σε βιοδείκτες. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν αξιόπιστα βιοδείκτη βρέθηκε για την πρόβλεψη πρόγνωσης και ραδιόφωνο ή χημειο-ευαισθησία στον καρκίνο του θυρεοειδούς [22], [23]. Επιγενετικές μεταβολές βρέθηκαν συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του θυρεοειδούς [24] – [29]. Μεθυλίωσης του DNA μπορούν να χρησιμεύσουν ως διαγνωστικά, προγνωστικά, χημειο-ευαίσθητα και ράδιο-ευαίσθητων δεικτών [30] – [35]. Φιμώνονται έκφραση της βασικής συνιστώσας από μεθυλίωσης του DNA στο σχετίζονται με τον καρκίνο του μονοπατιού σηματοδότησης μπορεί να γίνει ο θεραπευτικός στόχος [34] – [37]

Xenopus Dapper και Xenopus Φρόντο είναι Dishevelled-δεσμευτικές πρωτεΐνες, δείχνοντας 89% συνολικού-αμινο. όξινη ταυτότητα [38]. Xenopus Dapper αξιώνεται ότι αναστέλλει την οδό β-κατενίνης, καθώς και την οδό JNK, ενώ Xenopus Frodo φέρεται να ενεργοποιούν την οδό β-κατενίνης [6], [39]. DACT1 και DACT2 είναι ανθρώπινα ομόλογα του Xenopus Dapper και Φρόντο, τα οποία είναι Dishevelled-δεσμευτικές πρωτεΐνες. DACT1 και DACT2 γονίδια, που αποτελείται από τέσσερα εξόνια, βρέθηκαν να κωδικοποιούν πρωτεΐνη DACT1 (799-αμινοξέα) και πρωτεΐνες DACT2 (774-αμινοξέα), αντίστοιχα. DACT1 και DACT2 έδειξε 28,8% συνολικό-αμινο-οξύ ταυτότητα. Επτά πεδία DAPH, συμπεριλαμβανομένων DAPH2 (φερμουάρ λευκίνης), DAPH3 (πλούσια σε σερίνη) και DAPH7 (δεσμευτική ΡΟΖ), συντηρήθηκαν μεταξύ DACT1 και DACT2. DACT1 και DACT2 γονίδια χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 14q22.3 και την ανθρώπινη 6q27 χρωμόσωμα, αντίστοιχα [7]. Ανθρώπινη 14q22.3-32.1 χρωμόσωμα διαγράφεται στο αστροκύτωμα [40]. Ανθρώπινο χρωμόσωμα 6q27 είναι μια περιοχή συχνή απώλεια ετεροζυγωτίας σε ανθρώπινους καρκίνους [41] – [47]. Με βάση την Εξελικτική και λειτουργική διατήρηση των μορίων σηματοδότησης Wnt καθώς και τα ανθρώπινα χρωμοσωμικό εντοπισμό, DACT1 και DACT2 γονίδια αναμένεται να είναι ισχυρός σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια. Πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι DACT2 αναστέλλει Pitx2 ενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt στην ανάπτυξη εμβρυϊκών των δοντιών [8]. προηγούμενες μελέτες μας διαπίστωσε ότι DACT2 συχνά μεθυλιωμένη στο πνεύμονα και καρκίνο του ήπατος, και μεθυλίωση του DACT2 ενεργοποιεί σηματοδότηση Wnt [10], [11]. Για να κατανοηθεί περαιτέρω ο ρόλος των DACT2 στον καρκίνο του θυρεοειδούς, ανιχνεύσαμε τη μεθυλίωση περιοχής υποκινητή σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς πρώτα. DACT2 συχνά μεθυλιωμένη στο ανθρώπινο θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και μεθυλίωση DACT2 σχετίζεται με μετάσταση στους λεμφαδένες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι DACT2 μεθυλίωση μπορεί να χρησιμεύσει ως ντετέκτιβ και προγνωστικός δείκτης του θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς. Η επούλωση των πληγών και δοκιμασίας Transwell χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η επίδραση της DACT2 επί μετάστασης καρκίνου του θυρεοειδούς. Όπως αναμενόταν, η εκ νέου έκφραση του DACT2 αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε TPC-1cells. Η έκφραση της ΜΜΡ-9 ήταν μειωμένη μετά την αποκατάσταση της έκφρασης DACT2 σε TPC-1cells και αυξήθηκαν μετά knockdown του DACT2 σε W3 και τα κύτταρα SW579. Ως έκφραση DACT2 διέπονταν από την περιοχή του υποκινητή υπερμεθυλίωση στο θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, DACT2 μεθυλίωση μπορεί να περιλαμβάνει στο θυρεοειδή καρκινογένεση. Για να απαντήσουμε στα ερωτήματα αυτά, η λειτουργία της DACT2 μελετήθηκε περαιτέρω. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών αναστάλθηκε, και σύλληψη G1 φάση επάγεται από DACT2 στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα.