Αφηρημένο

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (ΤΚΙ), όπως gefitinib, έχει αποδειχθεί αποτελεσματικά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό ενός υποσυνόλου μη καρκίνων μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC). Δυστυχώς, η πλειοψηφία των NSCLC που εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου είναι κατά κύριο λόγο ανθεκτική στη θεραπεία του EGFR ΤΚΙ. Εδώ, δείχνουμε ότι ο πολλαπλασιασμός του gefitinib ανθεκτικές NSCLC κυτταρικές σειρές Η460 και Α549 μειώνεται από το μικρό μόριο SecinH3 οποία εξασθενεί έμμεσα την ενεργοποίηση του EGFR με αναστολή της cytohesins, μια κατηγορία που ανακαλύφθηκε πρόσφατα κυτταροπλασματικής ενεργοποιητές EGFR. SecinH3 και gefitinib έδειξε μια συνεργιστική αντι-πολλαπλασιαστική δράση, η οποία σχετίζεται με μια βαθιά αναστολή της ενεργοποίησης Akt και την έκφραση survivin. Θεραπεία ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα Η460 με SecinH3 έδειξε την αντιπολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα SecinH3 in vivo. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η στόχευση του EGFR έμμεσα αναστέλλοντας κυτταροπλασματική ενεργοποιητές της, τα cytohesins, έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τη θεραπεία του κυρίως EGFR-ΤΚΙ καρκίνους του πνεύμονα ανθεκτικό

Παράθεση:. Bill Α, Schmitz Α, König Κ, Heukamp LC, Hannam JS, Famulok Μ (2012) Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των Cytohesin Αναστολή σε Gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (7): e41179. doi: 10.1371 /journal.pone.0041179

Επιμέλεια: Άννα Μαρία Delprato, BioScience Έργου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 15, 2012? Αποδεκτές: 18 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2012

Copyright: © 2012 Bill et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft και τη Συνεργατική Ερευνητικά Κέντρο 645 (SFB 645). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Schmitz και ο Δρ Famulok είναι συνιδιοκτήτες ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας σε μικρό μόριο cytohesin αναστολείς της με τίτλο «Η χρήση των αναστολέων cytohesin για χημικά διέγερσης μακροζωίας» (WO2008058995, US 20100048594). Ο Δρ Famulok είναι συν-εφευρέτης σε μια αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας με τίτλο «αναστολείς Cytohesin» (European Patent Application EP2286808 (WO2006053903). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

εισαγωγή

Η εισαγωγή του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙ) στην θεραπεία του καρκίνου μη μικρού κυττάρου του πνεύμονα (NSCLC) που φέρει μεταλλάξεις ενεργοποίησης του EGFR έχει μετατοπιστεί το παράδειγμα μεταχείριση από ένα χημειοθεραπευτικό σε μια στοχοθετημένη προσέγγιση. Δυστυχώς, μόνο το 20 τοις εκατό του αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα αρκούδα ενεργοποιούμενες μεταλλάξεις του EGFR και αποκρίνονται σε θεραπεία στοχεύει EGFR. Επιπλέον, οι ασθενείς υπό θεραπεία ΤΚΙ στοχεύουν EGFR αναπτύσσουν δευτερογενή αντίσταση κατά τη διάρκεια της θεραπείας. μεταλλάξεις στο παιχνίδι EGFR αποφασιστικό ρόλο στην απόκριση του όγκου στην θεραπεία που στοχεύει EGFR. η ενεργοποίηση των μεταλλάξεων, ειδικότερα στα εξώνια 19 και 21, είναι προγνωστικά για ευνοϊκή αρχική ανταπόκριση σε EGFR-TKIs [1], [2], [3]. Αντίθετα, η μετάλλαξη του λεγόμενου θέση ρυθμιστή στο θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ της περιοχής κινάσης του EGFR, δηλαδή υποκατάσταση της θρεονίνης 790 με μεθειονίνη, καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά [4], [5], [6]. Η μετάλλαξη gatekeeper είναι η πιο κοινή αιτία για την ανάπτυξη της δευτερογενούς αντίστασης ανταποκρίνεται όγκων. Η πλειοψηφία των NSCLCs εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου και είναι, ως εκ τούτου, κυρίως ανθεκτικά σε EGFR-TKIs [7]. Περίπου 25% αυτών των NSCLCs φέρουν μεταλλαγμένη μορφή του Ras πρωτο-ογκογονιδίου, KRAS G61H ή G12V, και η παρουσία αυτής της μετάλλαξης είναι ένα σχεδόν αλάνθαστο δείκτης αντοχής σε θεραπεία στοχεύει EGFR [8]. Παρ ‘όλα αυτά, μελέτες in vitro με τη χρήση siRNA μεσολάβηση knock-down του EGFR δείχνουν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων NSCLC εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου και φέρει μεταλλαγμένο KRAS εξακολουθεί να εξαρτάται σε κάποιο βαθμό από την EGFR [9], [10], [11 ], [12] υποδηλώνοντας ότι οι ανθεκτικά κύτταρα EGFR-ΤΚΙ δεν είναι εντελώς ανεξάρτητος από τον EGFR και ότι, ως εκ τούτου, η στόχευση του EGFR με άλλα μέσα εκτός TKIs μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη πολλαπλασιασμό ακόμα και σε ανθεκτικά κύτταρα EGFR-ΤΚΙ. Εδώ, δείχνουμε ότι η θεραπεία με SecinH3 του NSCLC κυτταρικές σειρές που εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου εξασθενεί την ενεργοποίηση EGFR και σηματοδότηση, μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων in vitro και in vivo, και τα καθιστά αποκρίνεται στο gefitinib EGFR-ΤΚΙ. Όπως SecinH3 αναστέλλει κυτταροπλασματική ενεργοποιητές EGFR της οικογένειας cytohesin [13] τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η στόχευση του EGFR εμμέσως με αναστολή των ενεργοποιητών του μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ανάπτυξη EGFR-στοχευμένες θεραπείες για την πλειοψηφία των NSCLCs τα οποία δεν εκφράζουν μεταλλαγμένο EGFR.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

SecinH3, Secin16 και XH1009 συντέθηκαν όπως περιγράφεται [14], [15], gefitinib αγοράστηκε από Biaffin. Η460 και Α549 κύτταρα από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (ΡΑΑ) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Lonza). Η ταυτότητα των κυτταρικών σειρών ελέγχθηκε στο τέλος της πειραματικής περιόδου με βάση μικροδορυφόρων γονοτυπική από τη γραμμή ECACC τηλέφωνα Ταυτότητα Υπηρεσία επαλήθευσης. Τα προφίλ STR ταιριάζουν τα προφίλ των κυτταρικών σειρών όπως έχει κατατεθεί στην ATCC και τις βάσεις δεδομένων ECACC STR.

Ο πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

3 × 10

3 κύτταρα ανά 96 φρεατίων σπάρθηκαν σε μια σαφή, πλάκα με επίπεδο πυθμένα 96 φρεατίων (TPP). Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αναστολέων ή διαλύτη (τελική συγκέντρωση DMSO 0,4%) σε RPMI που περιέχει 50 ng /ml EGF ή IGF-1 (Peprotech), αντίστοιχα. Το μέσο αλλάχθηκε καθημερινά για 3 ημέρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με μια 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (Promega) όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα Varioscan αναγνώστη μικροπλάκας (Thermo Scientific). Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Για τον υπολογισμό του ποσοστού σχετικής πολλαπλασιασμού, η απορρόφηση στα κύτταρα DMSO-κατεργασία ορίστηκε ως η μέση 1.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας ανάπτυξης διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [16]. Εν συντομία, 3.000 κύτταρα /πηγάδι σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων, αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της ένωσης ή DMSO για 72 ώρες. Τα κύτταρα αποσπώνται, απλώνονται εκ νέου σε πλάκες έξι φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 7 έως 10 ημέρες σε κανονικό μέσο ανάπτυξης. Οι αποικίες βάφτηκαν με 0.1% Coomassie, 10% οξικό οξύ, 30% μεθανόλη σε PBS και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Οδύσσεια εγγύς υπέρυθρο σαρωτή (LI-COR Biosciences).

ξενομοσχεύματος όγκου

Όλα τα ζωικά διαδικασίες ήταν, σύμφωνα με τους γερμανικούς νόμους για την προστασία των ζώων και εγκρίθηκαν από την τοπική επιτροπή προστασίας των ζώων και τις τοπικές αρχές (Bezirksregierung Köln, Γερμανία). Οι όγκοι που δημιουργούνται από s. ντο. ενέσεις 5 × 10

6 Η460 κύτταρα σε nu /nu αθυμικά αρσενικά ποντίκια. Μετά τα ποντίκια εγκατάσταση όγκου τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες, έλεγχος (όχημα) και SecinH3 αγωγή ποντικούς. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ημερήσια i. Π. ενέσεις (100 μΙ 2,5 mM SecinH3 σε 50% DMSO 50% ισοτονικό διάλυμα ή όχημα /γλυκόζη μόνο). Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε καθημερινά και υπολογίζεται με τον τύπο:

D

L

= μεγαλύτερη διάμετρο?

D

S

= μικρότερη διάμετρο.

Η δοκιμασία TUNEL διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες (ApopTag Plus υπεροξειδάσης In Situ απόπτωση Kit, η Merck Millipore) του κατασκευαστή.

Διασπασμένη έκφραση κασπάσης 3 προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία επί σταθεροποιημένων με φορμαλίνη και τομές ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για διασπασμένης κασπάσης 3 (1:750, Cell Signaling Technology) μετά την ανάκτηση αντιγόνου σε ρΗ 6 όπως περιγράφεται [17].

Α, δομές των αναστολέων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Β – Γ, στον πολλαπλασιασμό των Α549 (Β) και κύτταρα Η460 (C) προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε παρουσία των υποδεικνυόμενων αναστολέων. ***, Ρ & lt?. 0.001 σε σχέση με κύτταρα DMSO-αγωγή

Η

ανοσοστυπώματα

Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό επί μία νύκτα με την παρουσία του υποδεδειγμένου αναστολέα ή DMSO (τελική συγκέντρωση DMSO 0,4 %). Το μέσο και αναστολείς ανανεώνονται 1 ώρα πριν από τη διέγερση. Η διέγερση ήταν για 5 λεπτά με 50 ng /ml EGF ή IGF-1, αντίστοιχα. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris-Cl, ρΗ 7.5 /150 mM NaCl /1 mM EDTA /1 mM EGTA /2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο /1 mM β-γλυκεροφωσφορικό /1 mM βαναδικό νάτριο /1% Triton Χ-100 ) συμπληρωμένο με πρωτεάσης-αναστολέα-mix HP (Serva). Κανονικοποιημένη ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 6% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: pAkt (Thr473) (Cell Signaling Technology), pEGFR (Tyr1086) (Epitomics), pIRS1 (Tyr612) (Life Technologies), EGFR, survivin, p27 (SantaCruz Biotechnology), Hsc70 (Enzo Life Sciences). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε σε ένα σαρωτή Οδύσσεια χρησιμοποιώντας DyLight800-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα (Thermo Scientific)

A -. Β, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Η460 παρουσία gefitinib ή SecinH3 μόνες ή σε συνδυασμό τους προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ ( Α) είτε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (Β). Στο Α οι αριθμοί δίνουν τη σχετική αξία του πολλαπλασιασμού με μη επεξεργασμένα κύτταρα οριστεί ως 1. Ο πολλαπλασιασμός υποθέτοντας μια αθροιστική δράση της SecinH3 και gefitinib (αναμενόμενη) συγκρίνεται με την αξία που βρέθηκαν στα πειράματα (παρατηρήθηκε). Παρατηρούμενες τιμές κάτω από τις αναμενόμενες τιμές δείχνουν συνέργεια

Η

-. C, Η460 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για μία νύχτα με 1 μΜ gefitinib, 15 μΜ SecinH3 ή συνδυασμό τους. Α, η έκφραση του ρ27Κίρ και survivin αναλύθηκε με στύπωμα Western. B, C, Στατιστική αξιολόγηση των δεδομένων κηλίδας Western φαίνεται στο Α ** στην Β δεικνύει ρ & lt? 0.01 σχέση με τους ελέγχους DMSO-αγωγή, καθώς και σε κύτταρα gefitinib φάρμακο. *** Σε C δεικνύει ρ & lt? 0.001 σχέση με τους ελέγχους DMSO-θεραπεία. n = 3.

Η

Α – D, τα κύτταρα στερούνται ορού διεγέρθηκαν με EGF για 5 λεπτά και ανιχνεύθηκαν με western blot για την ενεργοποίηση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα Western. Β – Δ, Στατιστική αξιολόγηση της φωσφορυλίωσης του EGFR (Β), IRS1 (C), και Akt (D) σε Η460 κύτταρα EGF διεγείρεται παρουσία gefitinib, SecinH3, ή ένα συνδυασμό και των δύο inhbitors. p υποδεικνύει την φωσφορυλιωμένη, δηλαδή ενεργοποιηθεί, μορφή της πρωτεΐνης. Τα σήματα ομαλοποιήθηκαν για τον έλεγχο φόρτωσης Hsc70. Οι μπάρες σφάλματος δίνουν το τυπικό σφάλμα. *, P & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σχέση με το EGF-επεξεργασμένα κύτταρα εκτός από τα συγκρίσεις οι οποίες καθορίζονται από αγκύλες

Η

Στατιστικά

αποτελέσματα δίδονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με Prism (GraphPad Software) εφαρμόζοντας μονόδρομη ANOVA με Tukeýs μετα-τεστ για την in vitro πειραμάτων και τη t-test για τις ξενομοσχεύματα. Οι διαφορές των μέσων θεωρήθηκαν σημαντικές σε επίπεδο σημαντικότητας 0,05.

Αποτελέσματα

NSCLC κύτταρα που εκφράζουν την φυσικού τύπου EGFR Απάντηση σε SecinH3

Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα NSCLC εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου δεν αποκρίνονται σε κλινικά σχετικές συγκεντρώσεις του EGFR-TKIs πολλαπλασιασμό τους φαίνεται να εξαρτάται σε κάποιο βαθμό από σηματοδότηση EGFR όπως έχει δειχθεί από τον EGFR knockdown πειράματα [9], [10], [11], [12]. Ως εκ τούτου, το ερώτημα εάν ο πολλαπλασιασμός του NSCLC κυτταρικής γραμμής Α549, που εκφράζει EGFR φυσικού τύπου και Kras με την ενεργοποίηση μετάλλαξη G12S επηρεάστηκε από την κατεργασία των κυττάρων με SecinH3 (Εικ. 1Α). SecinH3 είναι ένας αναστολέας cytohesin [14], [15] και δεν αναστέλλει τη δράση της κινάσης τυροσίνης του EGFR άμεσα [13]. Cytohesins είναι γνωστό από καιρό ως παράγοντες εναλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης για μικρές πρωτεΐνες G της οικογένειας ARF [18] αλλά έχουν πρόσφατα αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στην ενεργοποίηση του EGFR [17]. Ο μηχανισμός της ενεργοποίησης EGFR cytohesin μεσολάβηση, η οποία είναι ακόμη άγνωστο λεπτομερώς, περιλαμβάνει την άμεση αλληλεπίδραση του cytohesins με το EGFR, είναι ARF-ανεξάρτητη, και μπορεί να ανασταλεί με SecinH3. Όταν τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με SecinH3 ή το σχετικό αναστολέα cytohesin Secin16 [19], παρατηρήθηκε μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στον πολλαπλασιασμό (Εικ. 1Β). Σε σύγκριση με τις ιδιαίτερα EGFR-εθισμένος PC9 κύτταρα τα οποία εκφράζουν ένα EGFR που φέρει μία διαγραφή στο εξώνιο 19 [20], ο πολλαπλασιασμός των οποίων αναστέλλεται πλήρως σε 15 μΜ SecinH3 [17], η μείωση στον πολλαπλασιασμό ήταν λιγότερο έντονη σε κύτταρα Α549 η οποία είναι σε συμφωνία με το μικρότερο εξάρτηση των κυττάρων Α549 σε σηματοδότηση EGFR. Η αναστολή δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα υπό θεραπεία με την ένωση XH1009 ελέγχου που σχετίζεται δομικά με SecinH3 αλλά δεν αναστέλλει cytohesins [14]. Gefitinib χρησιμοποιούνται στη θεραπευτική συγκέντρωση 1 μΜ ανέστειλε μόνο οριακά τον πολλαπλασιασμό κυττάρων Α549. Η δραστικότητα του χρησιμοποιούμενου gefitinib επαληθεύτηκε με κατεργασία του gefitinib ευαίσθητη κυτταρική γραμμή PC9 [20], όπου 100 ηΜ gefitinib ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σχεδόν πλήρως (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να αποκλειστεί ότι η επίδραση της SecinH3 περιοριζόταν σε κύτταρα Α549 τα πειράματα επαναλήφθηκαν σε Η460 κύτταρα, μία κυτταρική γραμμή που εκφράζει NSCLC επίσης φυσικού τύπου EGFR, αλλά μια διαφορετική Kras μεταλλαγμένο, δηλαδή G61H (Εικ. 1 C). Όπως και στα κύτταρα Α549, 15 μΜ SecinH3 οδήγησε σε περίπου 50% μείωση του πολλαπλασιασμού. Αυτή η τιμή ταιριάζει αρκετά καλά με την ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση του SecinH3 για την καταλυτική δραστικότητα του καθαρισμένου cytohesins η οποία είναι 10-12 μΜ [14].

SecinH3 και Gefitinib είναι συνεργιστικά

Έχοντας δείξει ότι SecinH3 εξασθενημένο τον πολλαπλασιασμό gefitinib-ανθεκτικών κυττάρων NSCLC ζητήσαμε εάν η θεραπεία με SecinH3 θα μπορούσε να καταστήσει τα κύτταρα ανταποκρίνονται σε gefitinib και, ως εκ τούτου, δρουν συνεργιστικά με αυτή του EGFR ΤΚΙ. Ως εκ τούτου, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Η460 προσδιορίσθηκε με μία δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) με την παρουσία 1 μΜ gefitinib και αυξανόμενες συγκεντρώσεις SecinH3 (Εικ . 2Α). Για κάθε συνδυασμό η αναστολή που αναμένεται για Bliss ανεξαρτησία των δύο ενώσεων υπολογίστηκε με την μέθοδο κλασματικής προϊόν [21] και σε σύγκριση με το παρατηρούμενο βαθμό αναστολής [22]. Για δοκιμάστηκαν και οι τρεις συνδυασμοί, συνεργική δράση του gefitinib και SecinH3 βρέθηκε. Η δοκιμασία ΜΤΤ προσδιορίζει πολλαπλασιασμού έμμεσα με μέτρηση της μεταβολικής δραστηριότητας του κυτταρικού πληθυσμού. Για να αποκτήσουν επιπλέον και πιο άμεση απόδειξη για την αναστολή του πολλαπλασιασμού ένας προσδιορισμός σχηματισμού αποικιών διεξήχθη (Εικ. 2Β). Επίσης σε αυτή τη δοκιμασία, ο συνδυασμός SecinH3 με gefitinib ήταν πιο αποτελεσματικό από κάθε αναστολέα και μόνο. ​​

Α, Η460 κύτταρα στερήθηκαν ορό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία επί μία νύκτα με 0,5 μΜ AG1024, 15 μΜ SecinH3 ή συνδυασμός τους. Μετά από διέγερση με IGF1 για 5 λεπτά η κατάσταση φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών υποδεικνύονται αναλύθηκε με στύπωμα Western. Τα γραφήματα συνοψίζουν 3 πειράματα, οι ράβδοι σφάλματος δίνουν το τυπικό σφάλμα. *, P & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 σε σχέση με τα κύτταρα IGF1-θεραπεία, εκτός από εκείνες τις συγκρίσεις που καθορίζονται από παρενθέσεις. Β, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Η460 υπό την παρουσία των υποδεικνυόμενων αναστολέων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Οι αριθμοί δίνουν την σχετική αξία του πολλαπλασιασμού με μη επεξεργασμένα κύτταρα οριστεί ως 1. Ο πολλαπλασιασμός εάν ένα προσθετικό αποτέλεσμα των SecinH3 και gefitinib Υποτίθεται (αναμενόμενο) συγκρίνεται με την τιμή που βρέθηκε στα πειράματα (παρατηρήθηκε). Παρατηρούμενες τιμές κάτω από τις αναμενόμενες τιμές δείχνουν συνέργεια. ***, Ρ & lt?. 0.001

Η

Αναστολή της EGFR σηματοδότησης σε EGFR κυττάρων που εξαρτώνται είναι γνωστό ότι οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και να οδηγήσει στην επαγωγή της απόπτωσης. Όπως υποκατάστατοι δείκτες για διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, προσδιορίσαμε την έκφραση του αναστολέα πρόοδο του κυτταρικού κύκλου p27kip1 και την survivin αναστολέα της απόπτωσης (Σχ. 3Α). Κατεργασία των κυττάρων με SecinH3 ή gefitinib οδήγησε σε μείωση της survivin (Σχ. 3Β) και την αύξηση των p27kip1 (Σχ. 3C), αντίστοιχα. Αυτή η επίδραση ήταν περισσότερο έντονη σε κύτταρα κατεργασμένα με δύο αναστολείς.

Ως έκφραση και των δύο πρωτεϊνών, p27kip1 και survivin, ρυθμίζεται από Akt σηματοδότηση της φωσφορυλίωσης του Akt αναλύθηκε σε απόκριση σε EGF διέγερση των κυττάρων (Σχ. 4Α). Ότι η προκαλούμενη από EGF φωσφορυλίωσης του EGFR και του υποστρώματος ινσουλίνη υποδοχέα πρωτεΐνη προσαρμογέας 1 (IRS1) μειώθηκε δραματικά με gefitinib (Σχ. 4Β, C), η φωσφορυλίωση της Akt δεν (Εικ. 4D), υποδεικνύοντας ότι Akt σηματοδότηση ήταν αμετάβλητη στα κύτταρα Η460 gefitinib-θεραπεία. Σε αντίθεση, SecinH3 είχαν λιγότερο ανασταλτική δράση επί EGFR και φωσφορυλίωση IRS1 αλλά έδειξε σημαντική αναστολή στην ενεργοποίηση Akt. Κατά συνέπεια, ο συνδυασμός SecinH3 και gefitinib οδήγησε σε σχεδόν πλήρη αναστολή της φωσφορυλίωσης και των τριών πρωτεϊνών. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας /gefitinib SecinH3 οφείλεται στην αποτελεσματική αναστολή του EGFR -. Akt άξονας σηματοδότηση

Ποντικοί που φέρουν υποδόρια ξενομοσχεύματα Η460 υποβλήθηκαν σε αγωγή με SecinH3 με ημερήσιες ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις. Α, όγκος όγκου προσδιορίστηκε κάθε μέρα. Την ημέρα 9, το πείραμα έπρεπε να διακοπεί, επειδή ο όγκος του όγκου στα ζώα ελέγχου υπερέβη 1 cm

3. Β, η διανομή των όγκων του όγκου κατά την ημέρα 9. Γ – Δ, ο βαθμός απόπτωσης αναλύθηκε στα τμήματα των όγκων κατά την ημέρα 9. C, ο αριθμός των κατακερματισμένων πυρήνων προσδιορίσθηκε με χρώση TUNEL. D, που διασπάται, δηλαδή ενεργοποιηθεί, κασπάσης-3 ανιχνεύτηκε με imunohistochemistry. Αντιπροσωπευτικά τμήματα του όγκου φαίνεται. 5 × 40 × δείχνουν τη μεγέθυνση του στόχου. Για όλες τις γραφικές παραστάσεις, σημαίνει και δείχνονται τα πρότυπα σφάλματα (η = 14). *, P & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

SecinH3 Μειώνει IGF1R-εξαρτώμενη σηματοδότησης και του πολλαπλασιασμού

Εκτός από τον EGFR, η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα-1 υποδοχέα (IGF1R) είναι ένας κύριος ρυθμιστής της ενεργοποίησης Akt και cross-talk μεταξύ IGF1R και EGFR ή τα μέλη της οικογένειας EGFR όπως Her2 έχει αναφερθεί ως ένας μηχανισμός αντίστασης ενάντια φάρμακα που στοχεύουν EGFR ή Her2 σε αρκετές τύποι καρκίνων [16], [23], [24], [25], [26]. Όπως SecinH3 αναστέλλει σηματοδότηση κατάντη του υποδοχέα ινσουλίνης [15], [27] η οποία μοιράζεται βασικά χαρακτηριστικά με IGF1R σηματοδότησης ελέγξαμε εάν η θεραπεία των κυττάρων με Η460 SecinH3 οδήγησε σε μειωμένη ενεργοποίηση του IGF1R – Akt μονοπάτι σηματοδότησης (Εικ. 5Α). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται για τον υποδοχέα ινσουλίνης, η αυτοφωσφορυλίωση του IGF1R δεν μειώθηκε κατά την αγωγή SecinH3, αλλά αυξήθηκε. Παρ ‘όλα αυτά, η ενεργοποίηση των IRS1 και Akt ουσιαστικά μειωθεί. Η αναστολή της ενεργοποίησης Akt δεν παρατηρήθηκε κατά gefitinib θεραπεία. Η αύξηση στην φωσφορυλίωση IGF1R κατά την κατεργασία με gefitinib και SecinH3 είναι σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι η αναστολή των αποτελεσμάτων EGFR σε αυξημένη ενεργοποίηση του IGF1R [16], [22], [25], [26]. Στη συνέχεια το ερώτημα αν SecinH3 μειωμένη πολλαπλασιασμό παρουσία του IGF1 (Εικ. 5Β). Πράγματι, ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε κατά την επεξεργασία SecinH3 και η μείωση ήταν συνεργιστική με τον αναστολέα IGF1R AG1024. Ο συνδυασμός του gefitinib και AG1024 έδειξε επίσης μια συνεργική αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση αν και λιγότερο έντονη από ό, τι το συνδυασμό SecinH3 και gefitinib.

SecinH3 Retards ανάπτυξη των Η460 ξενομοσχευμάτων in vivo

Έχοντας δείξει ότι SecinH3 μειώνει τον πολλαπλασιασμό του EGFR-άγριου τύπου κύτταρα NSCLC in vitro ζητήσαμε αν η ανάπτυξη του όγκου θα ανασταλεί επίσης in vivo. Ως εκ τούτου, γυμνών ποντικών που φέρουν υποδόρια ξενομοσχεύματα Η460 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ημερήσιες ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις SecinH3. Η θεραπεία με SecinH3 σημαντικά καθυστερημένη ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 6Α). Όταν οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά από 9 ημέρες θεραπείας παρατηρήθηκαν σημαντικά μικρότερους όγκους στην ομάδα που SecinH3 αγωγή σε σύγκριση με την ομάδα διαλύτη-αγωγή (Σχ. 6Β). Σε ιστολογικές τομές των όγκων χρώσης TUNEL αποκάλυψε ένα αυξημένο ρυθμό απόπτωσης στα ζώα που υπέστησαν αγωγή (Σχ. 6C), η οποία ήταν επίσης εμφανής από την κασπάση-3 χρώση (Εικ. 6D). Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι SecinH3 in vitro και in vivo μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου.

Συζήτηση

Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι τα κύτταρα NSCLC εμφανίζουν πρωτογενή αντίσταση έναντι του gefitinib EGFR-ΤΚΙ ανταποκρίνονται στη θεραπεία με SecinH3, η οποία αναστέλλει την EGFR έμμεσα με τη στόχευση κυτταροπλασματική ενεργοποιητές της οικογένειας cytohesin. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να εμφανιστεί απροσδόκητη επειδή η αντίσταση ενάντια gefitinib μπορεί να ερμηνευθεί ως η ανεξαρτησία της σηματοδότησης EGFR. Αυτό είναι, όμως, δεν συμβαίνει. Η θεραπεία με EGFR-ειδικό siRNAs διαφορετικών ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές EGFR-ΤΚΙ NSCLC που εκφράζουν EGFR φυσικού τύπου είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων [9], [10], [11], [12] που υποδεικνύει ότι η αντίσταση του EGFR ΤΚΙ και EGFR η ανεξαρτησία δεν είναι πάντα τουλάχιστον ισοδύναμες. Κατά συνέπεια, έχει δειχθεί ότι ο EGFR συμβάλλει στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων ανεξάρτητη από δραστικότητα κινάσης της [28]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο EGFR κινάσης ανέστειλε εξακολουθεί να είναι σε θέση να ενεργοποιήσει οδούς που διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό ή να αναστείλει κυτταρικό θάνατο σηματοδότησης. Προς υποστήριξη αυτής της υπόθεσης είναι η παρατήρηση ότι η αναστολή του EGFR με erlotinib προκαλεί ετεροδιμερισμού του EGFR με την IGF1R που ενεργοποιεί το IGF1R και σηματοδότηση του στους μεταγενέστερους κινάσες συμπεριλαμβανομένων Akt [16]. έχουν Cytohesins δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν απευθείας με το EGFR και με αυτόν τον τρόπο να επηρεάσει διαμόρφωση του [17]. Ως μία ιδιαίτερη διαμόρφωση του EGFR, της ασύμμετρης διμερές, αποτελεί προϋπόθεση για την ενεργοποίηση της κινάσης [29], η διαμόρφωση του EGFR διάπλασης έχει ενοχοποιηθεί στην ενεργοποίηση του EGFR με cytohesins, μια διαδικασία η οποία αναστέλλεται από SecinH3. Καθώς η κατεργασία των κυττάρων Η460 με SecinH3 οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση της IGF1R παρόμοια λειτουργία του cytohesins κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης του IGF1R από τον EGFR μπορεί να αποκλειστεί. Προφανώς, SecinH3 αναστέλλει σηματοδότηση από τον EGFR που ενεργοποιείται IGF1R καθοδικά του υποδοχέα. Αυτό το εύρημα είναι σε πλήρη συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι SecinH3 δεν επηρέασε την ενεργοποίηση του υποδοχέα της ινσουλίνης, αλλά ανέστειλε σηματοδότησης καθοδικά του υποδοχέα στο επίπεδο του υποδοχέα της ινσουλίνης πρωτεΐνη προσαρμογέας υπόστρωμα-1 με αποτέλεσμα τη μειωμένη ενεργοποίηση Akt [15], [27], [ ,,,0],30]. Έτσι, η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα των SecinH3 σε EGFR-ΤΚΙ κύτταρα ανθεκτικά NSCLC μπορεί να εξηγηθεί από τη διπλή ανασταλτική δράση της επί δύο, EGFR και IGF1R σηματοδότηση, η οποία μπορεί να αποτρέψει τα κύτταρα από το να παρακάμπτουν την αναστολή του EGFR από αυξημένη σηματοδότηση IGF1R. Θα ήθελα να επισημάνω ότι τα δεδομένα μας δεν αποκλείουν το ενδεχόμενο ότι η συνεργιστική αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των SecinH3 με gefitinib μπορεί να προκύψει από SecinH3 επηρεάζουν τη σηματοδότηση από RTKs εκτός από την IGF1R. Ειδικότερα, η ενίσχυση της ηπατοκυττάρων υποδοχέα αυξητικού παράγοντα c-ΜΕΤ [31] και η παρουσία της πρωτεΐνης σύντηξης EML4-Alk [32] έχουν σχέση με την αντίσταση του EGFR ΤΚΙ. Η ενεργοποίηση αυτών των RTKs από cytohesins έχει, ωστόσο, δεν έχει ακόμη διερευνηθεί και έτσι εμείς σήμερα δεν γνωρίζουμε αν σηματοδότηση από αυτές τις RTKs ενδέχεται να επηρεαστούν από SecinH3.

Ενισχυμένη ενεργοποίηση του IGF1R έχει αναγνωριστεί ως ένα σημαντικό αιτία της αντίστασης ενάντια EGFR-στοχευμένες θεραπείες σε καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης. Κατά συνέπεια, σε πειράματα in vitro έδειξαν συνδυασμένη αναστολή της IGF1R και τη δραστηριότητα του EGFR για να μειωθεί πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων συνεργικά [16], [23], [24], [25], [26]. Δυστυχώς, τα αποτελέσματα αυτά δεν μεταφράζονται σε κλινικές δοκιμές, όπου, μέχρι τώρα, ο συνδυασμός θεραπειών εφαρμογή EGFR και στοχεύει IGF1R θεραπείες απέτυχε να δείξει σημαντικές βελτιώσεις σε σχέση μόνο θεραπεία [33], [34]. Οι λόγοι για αυτές τις απογοητευτικά αποτελέσματα είναι προς το παρόν άγνωστη, αλλά μπορεί να βρίσκεται στην ελλιπή κατανόηση των μοριακών λεπτομέρειες της λογομαχία μεταξύ EGFR και σηματοδότησης IGF1R που αποκλείει την ορθολογική επιλογή των ασθενών που μπορούν να ωφεληθούν από τη θεραπεία συνδυασμού. Μεταλλάξεις οι οποίες προβλέπουν απόκριση σε στοχευμένη θεραπεία, όπως και για το EGFR, δεν έχουν αναφερθεί για την IGF1R [35] και μπορεί, έτσι, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επιλογή ασθενών. Σε μια κλινική μελέτη που ψάχνουν για βιοδείκτες πρόβλεψη όφελος από τη συνδυασμένη EGFR /IGF1R αναστολή μεταλλαγμένου KRAS αναγνωρίστηκε [36]. In vitro μελέτες έδειξαν, όμως, αντικρουόμενα στοιχεία σχετικά με την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της συνδυασμένης αναστολής του EGFR και την IGF1R σε Η460 κύτταρα KRAS-μεταλλαγμένα. Εκτιμώντας ότι μια μελέτη δεν διαπίστωσε συνέργεια [25] Μια άλλη μελέτη έκανε [16]. Στη μελέτη μας, ένας ασθενής συνέργεια του gefitinib και AG1024 βρέθηκε ενώ ισχυρότερη συνέργεια βρέθηκε για συνδυασμούς, είτε αυτών των ενώσεων με SecinH3. Αυτές οι διαφορές υπογραμμίζουν την έννοια ότι η αναστολή πανομοιότυπα στόχων από διαφορετικούς αναστολείς ή στρατηγικές αναστολή μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικά βιολογικά αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, οι προσεγγίσεις που δεν βασίζονται σε άμεση αναστολή των δραστηριοτήτων κινάσης EGFR και IGF1R αλλά στοχεύουν αυτούς τους υποδοχείς έμμεσα μέσω ενεργοποιητή ή προσαρμογέα μόρια τους μπορεί να παρέχει πληρέστερη κατανόηση αυτών των οδών σηματοδότησης και έτσι να παρέχουν ακόμη μη αναγνωρισμένο στόχους για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Γ Aschenbach-Paul, Α Florin και U. Rommerscheidt-αναστάτωση για την τεχνική βοήθεια.