Abstract

Η σισπλατίνη χρησιμοποιείται συνήθως στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, ωστόσο, χημειοαντίσταση να σισπλατίνη παραμένει μια μεγάλη κλινική πρόκληση. Οι ογκογόνοι μεταγραφικού παράγοντα FOXM1 έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο των ωοθηκών. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τον πιθανό ρόλο των FOXM1 σε καρκίνους των ωοθηκών με χημειοαντίσταση με σισπλατίνη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι FOXM1 ρυθμίζεται αυξητικά σε χημειοθεραπεία δείγματα καρκίνου των ωοθηκών και υπερασπίζεται ωοθηκών καρκινικά κύτταρα έναντι κυτταροτοξικότητος της σισπλατίνης. FOXM1 διευκολύνει την επιδιόρθωση του DNA μέσω ρύθμισης άμεσο στόχο μεταγραφική EXO1 για την προστασία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα από σισπλατίνη απόπτωση. Εξασθένηση της έκφρασης FOXM1 και EXO1 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA, αυξάνει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας κατά του καρκίνου των ωοθηκών. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η στόχευση FOXM1 και το γονίδιο EXO1 στόχο της θα μπορούσε να βελτιώσει τη σισπλατίνη επίδραση στον καρκίνο των ωοθηκών, επιβεβαιώνοντας το ρόλο τους στη διαμόρφωση της ευαισθησίας σισπλατίνη

Παράθεση:. Zhou J, Wang Υ, Wang Υ, Γιν Χ, Υ Εκείνος, Chen L, et al. (2014) FOXM1 διαμορφώνει Cisplatin ευαισθησία ρυθμίζοντας EXO1 στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (5): e96989. doi: 10.1371 /journal.pone.0096989

Επιμέλεια: Αλέξανδρος James Roy Επίσκοπος, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστήμη Κέντρο Υγείας στο San Antonio, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Οκτ, 2013? Αποδεκτές: 14 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 13, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Στην επίτευξη αυτού του χειρογράφου, οι συγγραφείς έχουν λάβει την υποστήριξη του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81272882,81302275, 81072137) και την Επιτροπή Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας (Grant Νο 12411950200). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια στον κόσμο, με 225.500 νέα κρούσματα και 140.200 θάνατοι εκτιμάται για το 2008 [1]. Οι περισσότερες γυναίκες με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) παρόντες με προχωρημένη νόσο (στάδιο III ή IV) κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Τρέχουσα τυπική θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών, και στις δύο πρώιμο και προχωρημένο στάδιο, αποτελείται από την πλήρη κυτταρομειωτική χειρουργική ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία, συνήθως βασίζεται σε πλατίνα και ταξάνιο δυάδα [2]. Όμως, η ανάπτυξη του χημειοαντίσταση παρουσιάζει ακόμα ένα σημαντικό εμπόδιο για την επιτυχή θεραπεία. Οι περισσότεροι ασθενείς υποκύπτουν σε χημειοαντίσταση και υποτροπής, και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι περίπου 31% [3]. Μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής βάσης της αντίστασης σισπλατίνη μπορεί να οδηγήσει σε νέες στρατηγικές κατά του όγκου που θα ευαισθητοποιήσει αδιάφορη καρκίνους των ωοθηκών σε σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση.

θηλαστικών παράγοντα μεταγραφής Forkhead Box Μ1 (FOXM1) ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια Forkhead παράγοντες μεταγραφής. Τα μέλη της οικογένειας Forkhead εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα των βιολογικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της εμβρυογένεσης, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, την απόπτωση, μετασχηματισμό, την ογκογένεση, τη μακροζωία, και μεταβολικής ομοιόστασης [4]. Σε αντίθεση με τους άλλους παράγοντες που FOX-μεταγραφής, FOXM1 σχετίζεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και υπερεκφράζεται σε καρκίνο. Για παράδειγμα, τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, του μαστού, του πνεύμονα, των ωοθηκών, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, του στομάχου, της ουροδόχου κύστης, των ωοθηκών, του ήπατος, των νεφρών και, αποκάλυψε ότι FOXM1 υπερεκφράζεται σε όλους τους καρκινώματα [5] – [9]. Η υπερέκφραση του FOXM1 σε διάφορους όγκους υποδεικνύει μια ισχυρή εξάρτηση των κυττάρων του όγκου σε FOXM1 [10]. Επιπλέον, στον καρκίνο των ωοθηκών, το ολοκληρωμένο ανάλυση μονοπάτι έδειξε ότι το δίκτυο παράγοντας μεταγραφής FOXM1 μεταβάλλεται σημαντικά στο 87% των υψηλής ποιότητας ορώδες καρκίνο των ωοθηκών [11]. FOXM1 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή στον καρκίνο των ωοθηκών [12]. FOXM1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανταπόκριση των ναρκωτικών και της αντίστασης. Για παράδειγμα, έχει δειχθεί ότι απορυθμισμένη έκφραση FOXM1 μπορεί να προσδώσει αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η σισπλατίνη και επιρουβικίνη [13], και προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από βλάβη του DNA που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο στον καρκίνο του μαστού [14]. Ωστόσο, παραμένει αόριστη αν η FOXM1 παίζουν παρόμοιο ρόλο υπεύθυνο για προσδίδει αντίσταση σισπλατίνη στον καρκίνο των ωοθηκών.

EXO1 είναι μία πρωτεΐνη με δραστικότητα 5 ‘έως 3’ εξωνουκλεάσης καθώς και μια δραστηριότητα RNase Η, η οποία αλληλεπιδρά με MSH2 και η οποία εμπλέκεται στην αναντιστοιχία επισκευή και ανασυνδυασμό [15], [16]. Πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι EXO1 συμβάλλει στην πρόκληση των σημείων ελέγχου βλάβης του DNA και συμμετέχει στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA [17], [18].

Στην παρούσα μελέτη, παρέχουμε τις ενδείξεις ότι FOXM1 και απευθείας προς τα κάτω την επιδιόρθωση του DNA του γονίδιο EXO1 θα μπορούσε να διαδραματίσει στην αύξηση της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μετά από θεραπεία με σισπλατίνη, και η στόχευση άξονα /EXO1 FOXM1 μπορεί να ευαισθητοποιήσει καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με σισπλατίνη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

τα πρωτόκολλα για το χειρισμό εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα καρκίνου των ωοθηκών και την ανάλυση των δεδομένων των ασθενών είχαν εγκριθεί από τις επιτροπές δεοντολογίας των Renji Νοσοκομείο, Σαγκάη Πανεπιστήμιο Jiao Tong, η Κίνα. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις υπογράφηκαν από κάθε συμμετέχων ασθενής αν ήταν ακόμα ζωντανός ή συγγενής πρώτου βαθμού της, αν έχει πεθάνει. Όλα τα δείγματα ιστού καταγράφηκαν από έναν αριθμό υπόθεσης στη βάση δεδομένων, χωρίς τα ονόματα των ασθενών ή προσωπικές πληροφορίες που αναφέρονται.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τα δείγματα ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένο συλλέχθηκαν από 20 γυναίκες με πρωτοπαθή επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών , stagesIIto IV, ο οποίος είχε υποστεί αρχική χειρουργική επέμβαση στο τμήμα μαιευτικής και γυναικολογίας, Renji Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Shanghai Jiao Tong University μεταξύ 2005-2008. Οι πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού οξέος (ρΗ 6,0, 0,1 Μ) για τη θέρμανση για 10 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης μετά αποκλείστηκαν με επώαση με 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (Beyotime, Κίνα) για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντίσωμα FOXM1 (1:50, της Santa Cruz). Μετά από 10 λεπτά επώασης του βιοτινυλιωμένου δεύτερου αντισώματος, οι αντικειμενοφόρες πλάκες ξανά επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση υπό τις ίδιες συνθήκες. Η ανοσοαντίδρασης έπειτα ορατή με επώαση με διαμινοβενζιδίνη χρωμογόνο (DAB, Maixin-Bio, Κίνα) για 5 λεπτά. Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται, εκκαθαρίζονται και τοποθετημένα. Οι αρνητικοί έλεγχοι επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού και μόνο. Τα αποτελέσματα αυτά θεωρήθηκαν μόνο αν αυτά τα δείγματα ελέγχου έδειξε μια αρνητική χρώση.

Οι κυτταρικές σειρές και Πολιτισμού

Οι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών Α2780 και SKOV3 αγοράστηκαν από την Τράπεζα Κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας επιστήμη (Σαγκάη, Κίνα). Αμφότερες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Hyclone, USA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2 /95% αέρα.

siRNA και το πλασμίδιο διαμόλυνσης και συν-διαμόλυνσης

siRNA διπόλων παρασκευάστηκαν με RiboBio (Guangzhou, Κίνα). SiRNA Η αλληλουχία των siRNAs ήταν ως ακολούθως: FOXM1 siRNA-1: 5′- GCCAAUCGUUCUCUGACAGAATT-3 ‘, siRNA-2: 5′- GGACCACUUUCCCUACUUUUUTT-3′ [19]. EXO1 siRNA-1: 5’-CAAGCCUAUUCUCGUAUUUTT-3 ‘, siRNA-2: 5′-UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCU-3′ [18]. Η αλληλουχία του αρνητικού ελέγχου (NC) ήταν: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘. Η επιμόλυνση ή συν-διαμόλυνση siRNA και του πλασμιδίου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή του λιποφεκταμίνη (Invitrogen).

Real-time PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen), και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου PrimerScript RT (Takara). Για πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR, ίση ποσότητα cDNA προστέθηκαν SYBR πρόμιγμα ΕΧ Taq ΙΙ (Takara) και να τρέξει σε StepOne σύστημα πραγματικού χρόνου PCR (Applied Biosystem). Το πρόγραμμα κύκλων ήταν 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Τα εμπρός και όπισθεν εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: FOXM1: 5′-GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3 ‘και 5′-GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3′, EXO1: 5’-CCTCGTGGCTCCCTATGAAG-3 ‘και 5′-AGGAGATCCGAGTCCTCTGTAA-3’. PLK4: 5′-AAGCTCGACACTTCATGCACC-3 ‘και 5′-GCATTTTCAGTTGAGTTGCCAG-3’. ΧΚΧΧ1: 5′-CCTTTGGCTTGAGTTTTGTACG-3 ‘και 5′-CCTCCTTCACACGGAACTGG-3’. BRCA2: 5′-TGCCTGAAAACCAGATGACTATC-3 ‘και 5′-AGGCCAGCAAACTTCCGTTTA-3’. Rad51: 5′-CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3 ‘και 5′-TTCTTTGGCGCATAGGCAACA-3’. β-ακτίνης:. 5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ‘και 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Μετά την επιμόλυνση NC ή γονιδίου-ειδικό siRNA, τα κύτταρα υποβλήθηκαν στην υποδεικνύεται συγκέντρωση σισπλατίνης για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο και απλώνονται σε πλάκα καλλιέργειας κυττάρων των 6-φρεατίων σε πυκνότητα 500 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά την επώαση στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2 /95% αέρα για 8-10 ημέρες, μέσα αλλάζονταν κάθε 3 ημέρες. Στο τέλος της καλλιέργειας, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 1% μπλε του μεθυλενίου σε 50% μεθανόλη για 20 λεπτά, πλύθηκε με νερό, και μετρήθηκαν οι αποικίες (≥50 κύτταρα).

κηλίδος Western

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA με συμπλήρωμα του αναστολέα πρωτεάσης PMSF, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα 14.000 g για 10 λεπτά. Στο τέλος της φυγοκέντρισης, κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων μετρήθηκε. Ίση ποσότητα των πρωτεϊνών (10-20 μα) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore). Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 5% αλβουμίνη ορού βοοειδών /Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα Tween-20 σε 4 ° C όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα σήματα πρωτεΐνη ανιχνεύθηκαν με Odessey σαρωτή. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνονται: ανθρώπινη FOXM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology), φωσφο-ιστόνης H2A.X (γH2AX, 1:1000, Cell Signaling Technology), κασπάσης-3 (1:1000, Cell Signaling Technology) , EXO1 (1:100, Thermo Fisher Scienfitic), β-ακτίνη (1:2000, Abcam).

η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τηλέφωνο Μετρώντας Kit-8 δοκιμασία ( Dojindo Μοριακής Technologies). Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε διαφορετική μεταχείριση. Μετά 48 ώρες επώασης στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2/95% αέρα, τα δείγματα επωάστηκαν για άλλες 2 ώρες με το αντιδραστήριο CCK8. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας FLx800 φθορισμού Microplate Reader (Biotek).

γH2AX ανοσοφθορισμού χρώση

Α2780 και τα κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν με NC ή ειδικού γονιδίου siRNA. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση σισπλατίνης για 1 h, και άλλαξαν φρέσκο ​​μέσο. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε χρώση αντι-γH2AX (Ser139). Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη για 15 λεπτά, στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton-100 σε 10% FCS για 10 λεπτά. Τα δείγματα δεσμεύτηκαν με 5% ορό κατσίκας σε 10% FCS για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάζονται όλη τη νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού αντι-γH2AX (Ser139? 1:400? Cell Signaling). Μετά από πλύσεις με PBS, δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-TRITC (1:400? Sigma-Aldrich) προστέθηκε στα δείγματα για 1 ώρα. Τα κύτταρα αντίθετα με DAPI πριν από την τοποθέτηση. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ Ομοεστιακή TCS SP5 (Leica). Για εστίες ποσοτικού προσδιορισμού, τα κύτταρα με περισσότερο από 10 εστίες μετρήθηκαν ως θετικοί σύμφωνα με την τυπική διαδικασία [20]. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν.

Η κυτταρομετρία ροής

Η απόπτωση exmamined με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνης V και χρώση ΡΙ (BD) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, μετά την ενδεικνυόμενη θεραπεία, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml, στη συνέχεια 5 μΙ FITC αννεξίνης V και 5 μΙ ΡΙ προστέθηκαν σε 1 × 10

5 κυττάρων (100 μΐ) και τα κύτταρα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής FC500 /FC500-MPL (Beckman Coulter). Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, σφαιροποιήθηκαν και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (ιωδιούχο 50 μg /ml προπίδιο, 0,1 mg /ml RNaseA και 0,05% Triton-X). Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma. Μετά από 40 λεπτά επώασης, τα κύτταρα αναλύθηκαν με FC500 /FC500-MPL.

χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. 24 ώρες μετά την αγωγή σισπλατίνη, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά για να επιτραπεί σταυροσύνδεσης και στη συνέχεια σβήστηκε με γλυκίνη. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης SDS. Το λύμα υποβλήθηκε σε κατεργασία υπερήχων, προ-εκκαθαριστεί, επωάζονται με αντισώματα και συλλέχθηκαν με Πρωτεΐνη-Α + G αγαρόζης /DNA σπέρματος σολωμού. DNA-πρωτεΐνης διασυνδέσεις αντιστράφηκαν και χρωματίνη DNA καθαρίστηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση PCR. Οι εκκινητές 5′-ΑΑΑ TCT GGC AAC ΚΔ ACC TCA-3 ‘και 5′-ΤΤΑ AGT ΟΤΟ ΚΔ GTC AGT TCC-3′ χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν την EXO1 FHRE1 περιέχουν περιοχή (-1934 /-1575), και οι εκκινητές 5’-CAA ΤΤΤ CGA ΤΤΤ GTA GAG GCA AC-3 ‘και 5′-CGG CTT CCA ACT CAT ΑΟΟ GT-3’ χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν την περιοχή FHRE2 περιέχουν (-459 /-74). Μετά την ενίσχυση, τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης ορατά με GelRed (Biotium).

ρεπόρτερ Promoter και προσδιορισμούς λουσιφεράσης

Η περιοχή EXO1 προαγωγού ΡΟΚ-ενισχύθηκε από γενωμικό DNA εκχυλίζεται από κύτταρα Α2780 χρησιμοποιώντας εμπρός και όπισθεν εκκινητές που περιέχουν NheI και HindIII θέσεις περιορισμού (5′-ΟΤΑ GCT AGC ΑΓΓ ACC ΑΑΑ GAG CCA TCA CA-3 ‘και 5′-CCC AAG CTT CAC GGG ΤΑΑ CTT GCC TAC ACA 3′). Μετά τη χώνευση περιορισμού, το θραύσμα κλωνοποιήθηκε στο βασικό φορέα γονιδίου αναφοράς pGL-3 προς δημιουργείται το κατασκεύασμα υποκινητή EXO1, pGL3-FHER2 προαγωγού κατασκεύασμα -490 /-148 κλωνοποιήθηκε με PCR (εκκινητές: 5’- CTA GCT AGC ΑΑΑ GAA CCC AGC ΟΤΟ AAC TGA-3 ‘, 5′-CCC AAG CTT CAC GGG ΤΑΑ CTT GCC TAC ACA 3’). Υποθετικές Forkhead μεταλλαξιγένεσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ τοποκατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης (ExCell Biology). pGL3-Basic, pGL3-EXO1, άγριου τύπου pGL3-FHRE2, άγριου τύπου pGL3-FHRE2 συν FOXM1 siRNA, και μεταλλαγμένη pGL3-FHRE2 επιμολύνθηκαν σε κύτταρα αντίστοιχα. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη για 24 ώρες και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης τους μετρήθηκαν με σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega).

Στατιστική ανάλυση

Χρησιμοποιήσαμε λογισμικό SPSS19.0 για τον υπολογισμό τυπικές αποκλίσεις και στατιστικά σημαντική διαφορές μεταξύ των δειγμάτων. Οι αστερίσκοι σε κάθε γράφημα δείχνουν στατιστικά σημαντικές αλλαγές, με

αξίες P

υπολογίζεται από τον Φοιτητικό

t

δοκιμή ως εξής: *,

P

& lt? 0,05? **

P

≤0.01? ***

P

≤0.001.

P

τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

1.. έκφραση FOXM1 ήταν ρυθμισμένη σε σισπλατίνη ανθεκτικά ιστούς και κύτταρα ωοθηκών

Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι FOXM1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο των ωοθηκών, και ότι η υπερέκφραση FOXM1 συσχετίστηκε σημαντικά με καρκίνους των ωοθηκών υψηλής ποιότητας, υποδεικνύοντας ότι FOXM1 μπορεί να παίζει έναν ρόλο ογκογόνο στον καρκίνο των ωοθηκών [12]. Μέχρι στιγμής, ο ρόλος των FOXM1 σε σισπλατίνη αντίσταση του καρκίνου των ωοθηκών δεν έχει διευκρινιστεί. Για να διερευνηθεί η έκφραση του FOXM1 σε σισπλατίνη ευαίσθητα ή ανθεκτικά καρκίνο των ωοθηκών, καρκίνο δείγματα ιστού ωοθήκης ελήφθησαν από 10 γυναίκες με υποτροπιάζοντα επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών σε 6 μήνες μετά από καθιερωμένη θεραπεία, και άλλες 10 γυναίκες που ήταν χημειοευαίσθητων. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν βέλτιστη κυτταρομειωτική χειρουργική ακολουθούμενη από 6 κύκλους συστηματική χημειοθεραπεία με το συνδυασμό σισπλατίνης και πακλιταξέλης. Μεταξύ των 10 χημειοευαίσθητων ασθενείς, 7 εκ των οποίων υποτροπίασε μετά από 12 μήνες και 3 από αυτούς δεν επαναληφθεί μέχρι στιγμής. Όλες οι διαφάνειες ήταν από τους ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών εκτομή στην αρχική λειτουργία. Τα πλακίδια εγκλεισμένες σε παραφίνη χρωματίστηκαν ανοσοϊστοχημικά με αντίσωμα FOXM1 και αντιπροσωπευτικές χρώση πλακίδια που φαίνεται στο Σχήμα 1Α και Σχήμα 1Β. Μέτρια έως υψηλή έκφραση FOXM1 ανιχνεύθηκαν σε όσο 8 από 10 ανθεκτικές περιπτώσεις, αλλά μόνο σε 4 από 10 ευαίσθητες περιπτώσεις (Σχ.1 Γ). Στη συνέχεια, σε σύγκριση σισπλατίνη αντίσταση και έκφραση FOXM1 σε τρεις κυτταρικές γραμμές. SKOV3, η οποία έδειξε υψηλότερη έκφραση του FOXM1, ήταν επίσης η πιο ανθεκτική σε cisplatin, ενώ ES2, η οποία ήταν η πιο ευαίσθητη σε σισπλατίνη, εξέφρασε FOXM1 στο χαμηλότερο επίπεδο (εικόνα 1δ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σισπλατίνη ανθεκτικό καρκίνο των ωοθηκών εκθέματα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης FOXM1 σε σύγκριση με τα ευαίσθητα σισπλατίνη καρκίνο των ωοθηκών.

(Α) Εκπρόσωπος FOXM1 ανοσοχρωματίστηκε ενότητα παρουσιάζεται από τη νόσο ευαίσθητη ομάδα ασθενών, (Β) Εκπρόσωπος FOXM1 ανοσοχρωματίστηκε τμήμα είναι φαίνεται από τη χημειοθεραπεία ομάδα ασθενών. (Γ) Οι αριθμοί των περιπτώσεων με το ενδεικνυόμενο επίπεδο έκφρασης FOXM1 στη νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία ομάδα δείξει. (Δ) Το IC

50 αξίες των διαφορετικών κυτταρικών σειρών παρουσιάστηκαν στο άνω πίνακα, και η έκφραση των FOXM1 στο κελί γραμμές εμφανίζονται στο κάτω τμήμα.

η

2. FOXM1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μετά από τη θεραπεία cisplatin

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η μορφή έκφρασης του FOXM1 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, υποβάλλαμε σε αγωγή Α2780 και SKOV3 με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης, και ανακάλυψε το επίπεδο του mRNA του FOXM1 αυξημένη μόνο ελαφρώς μετά από σισπλατίνη θεραπεία (2Α). Βρήκαμε, όμως, ότι FOXM1 πρωτεΐνη αξιοσημείωτα αυξημένο σε συγκέντρωση και εξαρτώνται από το χρόνο τρόπο στις δύο κυτταρικές σειρές, και αντιστοιχούσε στο επίπεδο του γH2AX (Σχ.2Β και Fig.S1), το οποίο είναι το χρυσό πρότυπο της ποσοτικοποίησης βλάβη του DNA [22 ]. Πραγματοποιήσαμε επίσης την επεξεργασία /OFF σισπλατίνης, παρατηρήθηκε αυξημένο επίπεδο FOXM1 πρωτεΐνης σε δύο κυτταρικές σειρές σε 24 ώρες μετά την αγωγή, και η επίδραση που υπέστησαν έως 96 ώρες (Fig.2C). Δεδομένου ότι το αυξημένο επίπεδο FOXM1 πρωτεΐνης δεν αντιστοιχεί στο αυξημένο επίπεδο των FOXM1 mRNA, ήταν δυνατό ότι η πρωτεΐνη αυξημένα FOXM1 ήταν σε μεγάλο βαθμό τη μεσολάβηση σταθεροποίηση πρωτεΐνη [23].

(Α) Α2780 και SKOV3 κύτταρα κατεργάστηκαν με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση σισπλατίνης για 24 ώρες. Μετά τη θεραπεία, τα επίπεδα μεταγραφής mRNA FOXM1 προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Κάθε στήλη και γραμμή αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± Τ.Α. τριπλών προσδιορισμών. (Β) Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν μετά την ίδια αγωγή όπως στο (Α), επιλύονται με SDS-PAGE και υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με τη χρήση αντι-FOXM1, αντι-γH2AX, ή αντι-β-ακτίνης, αντίστοιχα. (Γ) Α2780 και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μg /ml και 4 μg /ml σισπλατίνης για 12 ώρες αντίστοιχα, τότε καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (τη στιγμή προστέθηκε ορίστηκε ως 0 h πλήρες μέσο) . κηλίδα Western διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση του FOXM1 και β-ακτίνης.

Η

3. Στόχευση FOXM1 αυξάνει την ευαισθησία σισπλατίνη στον καρκίνο των ωοθηκών

Δεδομένου ότι FOXM1 υπερεκφράστηκε σε καρκίνο των ωοθηκών, και ήταν ακόμη πάνω ρυθμισμένα σε απόκριση προς την σισπλατίνη θεραπεία, υποθέσαμε ότι η στόχευση FOXM1 μπορούσε ευαισθητοποιούν καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε σισπλατίνη. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα δύο siRNAs που στοχεύουν FOXM1 σε Α2780 και SKOV3, και τα δύο siRNAs αξιοσημείωτα μειωμένη έκφραση FOXM1 και siRNA-2 έχει μεγαλύτερη επίδραση αποσιώπηση στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α και 3Β). 48 ώρες μετά siRNA-2 επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση σισπλατίνης. Κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη σε 1 ώρα μετά τη σισπλατίνη θεραπεία, και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση ενός προσδιορισμού CCK8 στις 48 ώρες μετά την σισπλατίνη θεραπεία. Όπως ήταν αναμενόμενο, FOXM1 siRNA επιμόλυνση σε Α2780 και κύτταρα SKOV3 καθίστανται δύο κυτταρικές σειρές πιο ευαίσθητα σε σισπλατίνη τοξικότητα, όπως αποδεικνύεται από μια σύγκριση των IC

50 τιμές μεταξύ σκαρφάλωμα siRNA και FOXM1 siRNA-κατεργασμένα κύτταρα (-1.7 μg /ml έναντι ~ 4.1 μg /ml σε Α2780, -2.5 μg /ml έναντι ~6.1 μg /ml σε SKOV3) (Σχήμα 3C). Η θεραπεία με FOXM1 siRNA και σισπλατίνη είχε επίσης ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην Α2780 και SKOV3 αριθμών των κυττάρων όπως μετράται με κλωνογόνο προσδιορισμό (~ 17% έναντι -45% σε Α2780, -16% vs ~37% σε SKOV3) (Σχήμα 3D). Επιπλέον, εξετάσαμε αν knockdown του FOXM1 οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση μετά τη θεραπεία cisplatin. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε, σισπλατίνη σε συνδυασμό με FOXM1 siRNA είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένα ποσοστά απόπτωσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (περίπου 18% έναντι ~38% σε Α2780, ~ 20% vs 40% περίπου σε SKOV3). Αντίστοιχες με δοκιμασία απόπτωσης, ανάλυση στυπώματος western επίσης έδειξαν αυξημένη διασπασμένης κασπάσης-3 μετά από συν-θεραπεία με FOXM1 siRNA και σισπλατίνη (Σχήμα 4Α). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση FOXM1 παρέχει μία στρατηγική για την ευαισθητοποίηση του καρκίνου των ωοθηκών σε σισπλατίνη.

Α2780 και τα κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν παροδικά με siRNA (100 ηΜ) που κατευθύνεται έναντι FOXM1. Τα κύτταρα ελέγχου αφέθηκαν μη επιμολυσμένα, ή αρνητικού ελέγχου siRNA (100 ηΜ) -επιμολυσμένα. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, το επίπεδο FOXM1 mRNA (Α) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Β) προσδιορίσθηκε με PCR πραγματικού χρόνου και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. Κάθε στήλη και γραμμή αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± Τ.Α. τριπλών προσδιορισμών. (C) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα Α2780 και SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για άλλη 48 ώρες και τα ποσοστά τους βιωσιμότητας μετρήθηκαν με CCK8 και σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς θεραπεία cisplatin. (D) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, Α2780 και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία SKVO3 για 1 ώρα με 1 μg /ml και 2 μg /ml σισπλατίνης, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων, οι αποικίες χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν μετά από επώαση για 8-10 d. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι γραφικές παραστάσεις παρέχουν ποσοτικοποίηση ως ποσοστό των φρεατίων μη κατεργασμένων. Κάθε στήλη και γραμμή αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± Τ.Α. τριπλών προσδιορισμών. (Ε) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα Α2780 και SKOV3 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για άλλες 48 ώρες με 1 μg /ml και 2 μg /ml σισπλατίνης, αντίστοιχα. Μετά τη θεραπεία, η απόπτωση προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνης V και χρώση ΡΙ. Ο δεξιός πίνακας δείχνει μέσα ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

(Α) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα Α2780 και SKOV3 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με 2 μg /ml και 4 μg /ml σισπλατίνης, αντίστοιχα. Μετά τη θεραπεία, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, επιλύονται με SDS-PAGE και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση ανάλυση του FOXM1, γH2AX, διασπασμένη κασπάση-3 και β-ακτίνης. (Β) Α2780 και κύτταρα SKOV3 με ή χωρίς αποσιώπηση της έκφρασης FOXM1, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /ml και 2 μg /ml σισπλατίνης για 1 ώρα, αντίστοιχα. γH2AX εστίες Α2780 και τα κύτταρα SKOV3 ποσοτικοποιήθηκαν σε διαφορετικά χρονικό σημείο: 24, 48 και 72 ώρες μετά τη θεραπεία cisplatin. Ποσοστό γH2AX θετικών κυττάρων παραστάθηκε γραφικά. Τα ανεπεξέργαστα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Η

4. FOXM1 χτυπήσει τα κάτω αποτελέσματα στην επιδιόρθωση του DNA ανεπάρκεια

Έχει αναφερθεί ότι FOXM1 ρυθμιζόμενη αρκετά γονίδια στο μονοπάτι επιδιόρθωσης του DNA [14], [24], εξετάσαμε έπειτα εάν τα κύτταρα FOXM1 knock-down ήταν ευαίσθητα σε DNA διαλείμματα στον καρκίνο των ωοθηκών. Για το σκοπό αυτό, FOXM1 siRNA-κατεργασμένα κύτταρα και κύτταρα που σκαρφάλωμα επεξεργασμένα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη, και ανάλυση κηλίδωσης Western διεξήχθη 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυξημένη γH2AX ανιχνεύθηκε σε κύτταρα FOXM1 siRNA επεξεργασία μετά ίδια μεταχείριση με σισπλατίνη (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, χρωματίστηκαν για γH2AX 24, 48 και 72 ώρες μετά τη θεραπεία cisplatin. γH2AX εστίες ανά πυρήνα μετρήθηκε σε περισσότερες από 100 κύτταρα σε κάθε χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως επί τοις εκατό του γH2AX θετικών κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο. FOXM1 siRNA-κατεργασμένων κυττάρων εμφανίζεται υψηλό ποσοστό των μη επεξεργασμένων ειδών βλάβες του DNA (γH2AX θετικά κύτταρα) σε 48 ώρες και 72 ώρες μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη σε σύγκριση με αγωνίζομαι επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4Β). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν το συμπέρασμα της ανεπάρκειας επιδιόρθωσης του DNA στα FOXM1 siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα.

5. Διαλογή για το γονίδιο-στόχο FOXM1 εμπλέκονται στη σισπλατίνη που προκαλείται από επισκευή DSB σε καρκίνο των ωοθηκών

Αρκετά γονίδια στόχους του FOXM1, όπως

BRCA2

,

ΧΚΧΧ1

,

Rad51

,

EXO1

,

PLK4

, έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA μετά από τις σχάσεις διπλού κλώνου DNA (DSBs) [14], [24]. Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να προσδιοριστεί το εάν αυτά τα γονίδια στόχους FOXM1 μεσολαβούν FOXM1 εξαρτώμενη επιδιόρθωσης DNA στον καρκίνο των ωοθηκών. QPCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το προφίλ έκφρασης των ανωτέρω γονιδίων μετά τη θεραπεία cisplatin.

EXO1

mRNA έδειξε την πιο ισχυρή αλλαγή και αντιστοιχούσε με την αλλαγή της FOXM1 πρωτεΐνης μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη στο Α2780 και SKOV3 (Σχ.5). Τα άλλα γονίδια, ωστόσο, ήταν ελαφρώς ή μετρίως επάγεται μετά την ίδια θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι EXO1 πρωτεΐνη δεν ήταν μόνο εντόνως εκφρασμένο σε Α2780 και SKOV3 έναντι ES2 κυττάρων (Fig.S2A), αλλά ήταν ρυθμισμένη σε μια δόση και το χρόνο τρόπο που εξαρτάται σε Α2780 και SKOV3 όταν έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη, ακριβώς όπως πρωτεΐνη FOXM1 (ΕΙΚΟΝΑ 5Β και Fig.S2B). ON θεραπεία /OFF σισπλατίνης είχε επίσης ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του EXO1 έως 96 h (Σχήμα 5C). Δεν ήταν έκπληξη το γεγονός ότι knockdown του FOXM1 συνοδεύτηκε από 60-70% μείωση στην έκφραση του mRNA EXO1 (Σχήμα 5D). Ωστόσο, FOXM1 χτυπώντας-κάτω δεν είχε ως αποτέλεσμα βαθιά διακοπή του κυτταρικού κύκλου (Fig.S2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση των EXO1 δεν ήταν μια έμμεση επίδραση της αλλαγής του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, FOXM1 φίμωση όχι μόνο εξασθενημένα έκφραση πρωτεΐνης EXO1 σε απόκριση σε θεραπεία cisplatin (Fig.S2C), αλλά και μετά ON /OFF σισπλατίνη treatement (Fig.5E). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι EXO1 είναι ένα γονίδιο υποψήφιος στόχος του FOXM1 σε οδού επιδιόρθωσης DNA στον καρκίνο των ωοθηκών.

Α2780 και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση της σισπλατίνης για 24 χρόνου PCR ανάλυση (Α) και κηλίδωση Western (ΣΙ). Τα αποτελέσματα φαίνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. (Γ) Α2780 και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μg /ml και 4 μg /ml σισπλατίνης για 12 ώρες αντίστοιχα, τότε καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (τη στιγμή προστέθηκε ορίστηκε ως 0 h πλήρες μέσο) . κηλίδα Western διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση του EXO1 και β-ακτίνης. (D) Α2780 και τα κύτταρα SKO3 επιμολύνθηκαν με FOXM1 siRNA, 48 ώρες αργότερα, η έκφραση EXO1 προσδιορίστηκε με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Τα αποτελέσματα φαίνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. (Ε) 24 ώρες μετά FOXM1 siRNA επιμόλυνση, Α2780 και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μg /ml και 4 μg /ml σισπλατίνης για 12 ώρες αντίστοιχα, τότε καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​πλήρες μέσο για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (ο χρόνος όταν πλήρες μέσο ήταν Προστέθηκε ορίστηκε ως 0 h). Το βέλος (↓) υποδεικνύει την επιμόλυνση και η επακόλουθη επεξεργασία σισπλατίνη. κηλίδα Western διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση του FOXM1, EXO1 και β-ακτίνης.

Η

6. FOXM1 συνδέεται άμεσα με τον υποκινητή EXO1 και ρυθμίζει τη δραστηριότητά της

υποτεθεί ότι FOXM1 θα μπορούσε να ενισχύσει τη μεταγραφή EXO1 στην ανταπόκριση στη θεραπεία με σισπλατίνη. Ανάλυση αλληλουχίας προσδιόρισε δύο στοιχεία απόκρισης Forkhead συναινετική (FHREs) στην περιοχή υποκινητή (Fig.6A) [25], [26]. Για να καταδειχθεί ότι FOXM1 συνδέεται άμεσα με αλληλουχία ενδογενούς EXO1 προαγωγού μετά σισπλατίνης θεραπεία, εκτελέσαμε chromotatin δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης σε Α2780 και τα κύτταρα SKOV3. Το αντίσωμα αντι-FOXM1, αλλά όχι το αντίσωμα ελέγχου (IgG), καταβυθίστηκε την περιοχή FHRE2 περιέχει (-459 /-74) (Εικόνα 6Β), ωστόσο, η FHRE1 περιέχει περιοχή (-1934 /-1575) δεν ήταν καθιζάνει (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Για να αξιολογηθεί ο λειτουργικός ρόλος του FHRE2 στη ρύθμιση EXO1, πραγματοποιήσαμε ειδική σε θέση μεταλλαξογονία μέσα FHRE2 της EXO1 υποκινητή pGL3-FHRE2 (Fig.6C). Όπως φαίνεται στο Fig.6D, μετάλλαξη του FHRE2 κατήργησε την ικανότητα του να ενεργοποιεί FOXM1 η κατασκευή αναφοράς μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη σε Α2780 και SKVO3, επιπλέον, συν-διαμόλυνση του FOXM1 siRNA και άγριου τύπου pGL3-FHRE2 οδήγησε επίσης σε χαμηλή λουσιφεράσης δραστηριότητα. Είναι ενδιαφέρον, pGL3-FHRE2 έχει ισχυρότερη μεταγραφική δραστηριότητα από την πλήρη αλληλουχία του υποκινητή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι FHRE2 μεσολαβεί στην μεταγραφική δράση του FOXM1 στον υποκινητή EXO1 και ότι ενδέχεται να υπάρχουν κάποιες άλλες θέσεις που μπορούν να αναγνωριστούν με την αναστολή της μεταγραφής παράγοντες στην ανάντη περιοχή του FHRE2.

(Α) Ακολουθία και η θέση της ακολουθίας συναίνεσης FHRE στον υποκινητή EXO1. (Β) δοκιμασίες ChIP έγιναν σε Α2780 και SKOV3 κύτταρα. θραύσματα χρωματίνης των κυττάρων ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-FOXM1 αντίσωμα και αρνητικός έλεγχος IgG και υποβλήθηκε σε PCR. 1% του συνόλου των κυτταρικών λυμάτων υποβλήθηκαν σε PCR πριν ανοσοκαταβύθιση ως εισροές. (C) Σχηματική δομή του φυσικού τύπου (WT) και μεταλλάκτη (Mut) μορφές FHRE2 περιέχουν ρεπόρτερ υποκινητή. (D) δραστηριότητα λουσιφεράσης με ή χωρίς μετάλλαξη σε EXO1 υποκινητή. Α2780 και SKOV3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες FRHE2 περιέχουν ανταποκριτή, ή συν-επιμολύνθηκαν με FOXM1 siRNA και άγριου τύπου αναφοράς (pGL-3-Basic και pGL3-EXO1 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός και θετικός έλεγχος, αντίστοιχα), στη συνέχεια κατεργάζεται με σισπλατίνη για 24 ώρες. Στη συνέχεια, μετρήθηκαν λουσιφεράσης στα κύτταρα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν.

Η

7. ρύθμιση επιδιόρθωση του DNA των FOXM1 εν μέρει διαμεσολαβείται από EXO1

EXO1 έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται άμεσα σε μηχανισμό επιδιόρθωσης του DNA [18], [27], [28]. Έτσι, την επόμενη διερευνηθεί αν EXO1 αντιπροσωπεύει FOXM1 μεσολάβηση αντίσταση σισπλατίνη. Είμαστε παροδικά γκρέμισε την έκφραση της EXO1 στο Α2780 και SKOV3 κύτταρα με siRNA επιμόλυνση. Και οι δύο siRNAs που στοχεύουν EXO1 μείωσε αποτελεσματικά mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε Α2780 και κυτταρικές γραμμές SKOV3 (Σχήμα 7Α και 7Β). Εξόντωση EXO1 ευαισθητοποιημένων επίσης κύτταρα να σισπλατίνη, όπως αποδεικνύεται από μια σύγκριση των IC

50 τιμές (~2.3 μg /ml έναντι -4,2 μg /ml σε Α2780, ~4.1 μg /ml έναντι ~6.4 μg /ml σε SKVO3) και οι αριθμοί κλώνου (~ 23% έναντι ~42% το Α2780, -21% vs ~38% σε SKOV3) μεταξύ αγωνίζομαι siRNA και ειδικά κύτταρα siRNA που έλαβαν EXO1 (Fig.7C και 7D). Σύμφωνα με τα παραπάνω, η ίδια μεταχείριση με σισπλατίνη είχε ως αποτέλεσμα περισσότερο αποπτωτικά κύτταρα σε EXO1 ειδικό siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα (περίπου 18% έναντι ~27% το Α2780, -21% έναντι ~ 33% το SKVO3) σε σύγκριση με ανακατώσει-επεξεργασμένα κύτταρα (Fig.7E). Παρά το γεγονός ότι EXO1 knock-down δεν επηρεάζει την έκφραση του FOXM1, το έκανε ανακεφαλαίωση εν μέρει την επίδραση της σισπλατίνης ευαισθητοποίηση των FOXM1 φίμωση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. EXO1 siRNA-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν επίσης περισσότερα βλάβες του DNA, ενισχυμένη απόπτωση σηματοδότηση μονοπατιών και μειωμένη αποτελεσματικότητα επιδιόρθωσης του DNA, όπως ανιχνεύεται με ανοσοαποτύπωση για γH2AX και διασπάστηκε κασπάσης-3 (Fig.7F), και γH2AX ποσοτικοποίηση (Fig.7G).