Αφηρημένο

Σκοπός

Υπάρχει ανάγκη να συμπληρώσει ή να αντικαταστήσει το συμβατικά διαγνωστικά εργαλεία, δηλαδή, κυστεοσκόπηση και Β-τύπου υπερήχων, για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης (BC). Έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει νέες δείκτες της μεθυλίωσης DNA για την BC μέσω γονιδιώματος-ευρεία προφίλ των κυτταρικών σειρών π.Χ. και μετέπειτα μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) διαλογή των κλινικών δειγμάτων ούρων.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Η μεθυλίου -ϋΝΑ περιοχή πρόσδεσης (MBD) τεχνική σύλληψη, methylCap /επ, εκτελέστηκε για τη διαλογή συγκεκριμένων υπερμεθυλίωση νησίδων CpG σε δύο κυτταρικές σειρές π.Χ. (5637 και Τ24). Οι κορυφαίοι εκατό υπερμεθυλιωμένων στόχοι διαδοχικά διαλογή με MSP σε δείγματα ούρων για να περιορίσετε σταδιακά τον αριθμό-στόχο και τη βελτιστοποίηση της σύνθεσης του διαγνωστικού πίνακα. Η διαγνωστική απόδοση του ληφθέντος πίνακα αξιολογήθηκε σε διάφορες κλινικές περιπτώσεις.

Αποτελέσματα

Ένα σύνολο 1627 υπερμεθυλίωση προαγωγού στόχων στις κυτταρικές γραμμές BC ταυτοποιήθηκε με ανάλυση αλληλουχίας Illumina. Οι κορυφαίοι 104 υπερμεθυλίωση στόχοι μειώθηκαν σε οκτώ γονίδια (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, ΤΑΙ1, PROX1, SLC6A20, και LMX1A) μετά την προβολή του DNA των ούρων σε ένα μικρό μέγεθος δείγματος 8 κανονικός έλεγχος και 18 άτομα. Π.Χ. Επικύρωση σε ένα ανεξάρτητο δείγμα 212 ασθενών π.Χ. επέτρεψε τη βελτιστοποίηση των πέντε στόχους μεθυλίωσης, συμπεριλαμβανομένων VAX1, KCNV1, ΤΑΙ1, PPOX1 και CFTR, η οποία ελήφθη σε προηγούμενη μελέτη μας, για την BC διάγνωση με ευαισθησία και ειδικότητα του 88,68% και 87,25 %, αντίστοιχα. Επιπλέον, η μεθυλίωση του VAX1 και LMX1A βρέθηκε να σχετίζεται με BC υποτροπή.

Συμπεράσματα

Εντοπίσαμε ένα πολλά υποσχόμενο πίνακα διαγνωστικό δείκτη για την έγκαιρη μη επεμβατική ανίχνευση και μετέπειτα επιτήρησης. Π.Χ.

Παράθεση: Zhao Υ, Guo S, η Sun J, Huang Ζ, Zhu Τ, Zhang H, et al. (2012) Methylcap-Seq Αποκαλύπτει Μυθιστόρημα μεθυλίωσης του DNA δείκτες για τη διάγνωση και Επανεμφάνιση Πρόβλεψη καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε ένα κινεζικό πληθυσμό. PLoS ONE 7 (4): e35175. doi: 10.1371 /journal.pone.0035175

Επιμέλεια: Άντζελα H. Ting, Cleveland Clinic Foundation, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιαν, 2012? Αποδεκτές: 9 Μαρτίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17, Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις National Science Foundation (30872963)? το Χημείο του Κράτους Κλειδί των ογκογονιδίων και γονιδίων που σχετίζονται με θεμέλιο (91-11-01)? Ιατρική έργου οδηγός από Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής, της Σαγκάης (114119a4100)? επιχορηγήσεις Shanghai Science Foundation (09ZR1429900)? και τη Σαγκάη Ινστιτούτο Καρκίνου, πλοίαρχος & amp? διδακτορική θεμελίωσης (SB09-07). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι μια από τις κύριες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται και την έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο [1]. Στην Κίνα, η συχνότητα εμφάνισης του BC συνεχίζει να αυξάνεται [2]. Π.Χ. συχνότητα αυξάνεται με την ηλικία? η μέση ηλικία κατά το χρόνο της διάγνωσης είναι περίπου 60 χρόνια, και είναι 3 φορές πιο συχνή στους άνδρες παρά στις γυναίκες [3]. Το κάπνισμα και η έκθεση σε καρκινογόνους παράγοντες έχουν αναγνωριστεί ως παράγοντες κινδύνου [4]. Περίπου το 75-80% των νέων περιπτώσεων π.Χ. προκύψει ως επιφανειακές ή καρκίνωμα

in situ

βλάβες, ενώ το υπόλοιπο 20-25% παρούσα ως μια πιο προχωρημένη νόσο, με κακή πρόγνωση. Ωστόσο, ακόμη και στις επιφανειακές όγκους, μόνο το 20% είναι ιάσιμη. Περίπου το 60-70% των ασθενών θα υποτροπιάσουν μέσα σε 5 χρόνια, και 10-20% των όγκων θα προχωρήσει σε μια πιο επιθετική νόσο [5], η οποία απαιτεί συχνή παρακολούθηση για υποτροπή της νόσου [6]. Κυστεοσκόπηση είναι η πιο κοινή διαγνωστική διαδικασία π.Χ., και αυτό δείχνει την υψηλή ευαισθησία (SN) και ειδικότητας (SP). Ωστόσο, κυστεοσκόπηση απαιτεί επάρκεια υψηλή χειριστή, και η επεμβατική φύση της κυστεοσκόπηση μειώνει την αξία της ως εργαλείο ανίχνευσης. Άλλες βέλτιστες μεθόδους που απαιτούνται για την έγκαιρη, μη επεμβατική διάγνωση και παρακολούθηση των π.Χ.

Η

Η επιγενετική πτυχή του γονιδιώματος συνδέει το γονότυπο ενός ατόμου σε περιβαλλοντικές επιρροές που διαμορφώνουν την κληρονομική μορφή μεταγραφής γονιδίων και Ως εκ τούτου, να επηρεάσει την φαινότυπο του κυττάρου [7]. Κανονισμού κατά τη επιγενετικό επίπεδο είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη των ανώτερων ευκαρυωτικών [8], και παρεκκλίνουσα ρύθμιση μπορεί άμεσα ή /και έμμεσα να επηρεάσουν την γενετική πρότυπο ακεραιότητα και έκφραση γονιδίων των κυττάρων, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη των διαφόρων τύπων διαταραχών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [ ,,,0],9]. Η τοπική υπερμεθυλίωση των γονιδίων καταστολής όγκων [10] και την παγκόσμια υπομεθυλίωση του γονιδιακού DNA [11], [12], [13] συχνά συμβαίνουν σε ανθρώπινους καρκίνους [14], [15]. Οι πρόσφατες εξελίξεις έχουν δείξει ότι η μη φυσιολογική υπερμεθυλίωση των γονιδίων καταστολής όγκων είναι μια αναδυόμενη βιοδείκτη για τη διάγνωση του καρκίνου και την πρόγνωση. Σε π.Χ., αρκετές μεθυλιωμένα γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί, και ο ρόλος τους ως ουρική δείκτες έχει επίσης αξιολογηθεί [16]. Αυτές οι μελέτες έχουν καταδείξει σαφώς τα πλεονεκτήματα της χρήσης πολλαπλών γονιδίων υπερμεθυλίωση αναλύσεις σε δείγματα ιστού και ούρων για να ληφθεί διαγνωστικές και προγνωστικές πληροφορίες. Για παράδειγμα, στην προηγούμενη μελέτη μας, εντοπίσαμε ένα πάνελ 11 μεθυλιωμένων γονιδίων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες των ούρων και βασιζόμενων BC διαλογή? Ωστόσο, αυτό το πάνελ είχε περιορισμούς. Ο αριθμός γονίδιο στον πίνακα ήταν υπερβολικά μεγάλο για άνετη κλινικές δοκιμές, και η ειδικότητα ήταν ανεπαρκής [17]. Για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της διάγνωσης και τον εντοπισμό στόχων γονίδιο που μπορεί να προβλέψει υποτροπή ή εξέλιξη, είναι απαραίτητο να βρούμε νέα στόχους και να επικυρώνει την κλινική αξία τους σε μια μεγάλη ομάδα. Ωστόσο, μέχρι στιγμής, λίγες μελέτες BC έχουν χρησιμοποιήσει μια γονιδιωματική κλίμακας προσέγγιση υψηλής απόδοσης για διαλογή διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια [18], [19]

MethylCap-seq είναι ένα πρόσφατα ανεπτυγμένη τεχνική για την ευρεία γονιδιώματος προφίλ της μεθυλίωσης του DNA? Αυτή η τεχνική συνίσταται σύλληψη των μεθυλιωμένου DNA θραύσματα από περιοχές μεθυλο-CpG δέσμευσης τους (MBDS) και την επακόλουθη βαθιά αλληλούχιση του DNA εκλούεται. Μια έκλουση αλάτι κλίση κατατάσσει το γονιδίωμα σε κλάσματα με διαφορετικές καταστάσεις μεθυλίωση. Τα προφίλ που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο παρέχει λεπτομερή γονιδίωμα-ευρεία χάρτη της μετουσιωμένο περιοχές και επιτρέπει την ανίχνευση της μεθυλίωσης του DNA σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος [20].

Η γονιδιωματική πλαίσιο ορίζεται ως εκείνοι που βρίσκονται στη βάση δεδομένων UCSC. Η περιοχή μεθυλίωση χαρακτήρισε διαφορικό (DMR) τη διανομή στο BCC που και BMS που: (α) η γενική κατανομή? (Β) τη διανομή στο refGene? (Γ) τη διανομή τόσο refGene και CGI.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε την πρώτη MBD MethylCap-seq να αποκτήσει ένα συνολικό προφίλ μεθυλίωσης των κυτταρικών σειρών π.Χ. (BCC που), η οποία πιστεύαμε θα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με BC-ειδική παρεκκλίνουσα μεθυλίωση. Στη συνέχεια, το DNA από τα ούρα των ασθενών BC σαρώθηκε για τα 100 υπερμεθυλιωμένο στόχων από τα BCC για τον εντοπισμό BC-ειδικές θέσεις μεθυλίωσης. Ο αριθμός αυτός μειώθηκε σταδιακά, και η ποιότητα δείκτης βελτιώθηκε κατά τα στάδια της διαδικασίας ελέγχου. Τέλος, έχουμε αποκτήσει μια νέα σειρά διαγνωστικών δεικτών μεθυλίωσης του DNA που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την έγκαιρη, μη επεμβατική διάγνωση και παρακολούθηση των π.Χ.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενών και του δείγματος ελέγχου συλλογής

με την εν επιγνώσει συναίνεση και την έγκριση του Ιατρικού συμβουλίου Institutional Review του Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan, δείγματα ούρων συλλέχθηκαν από 212 ασθενείς με επιβεβαιωμένη π.Χ. διάγνωση, 41 ασθενείς με μη καρκινικό ουροποιητικού βλάβες στο νοσοκομείο κατά την ίδια χρονική περίοδο, και 149 φυσιολογικούς μάρτυρες. Μια ομάδα ζεύγη ακυρώνεται δείγματα ούρων, επίσης, που συλλέγονται από τους ασθενείς 21 π.Χ., πριν και μετά την χειρουργική επέμβαση που περιλαμβάνονται διουρηθρική εκτομή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης συν ενδοκυστική χημειοθεραπεία (TURBC + IC). Επιπλέον, μια άλλη ομάδα 48 δειγμάτων ούρων συλλέχθηκαν από ασθενείς με έντονα υποψία ότι έχει έναν κακοήθη όγκο της ουροδόχου κύστης. Όλοι οι ασθενείς π.Χ. και οι έλεγχοι προήλθαν από δύο νοσοκομεία: το Τμήμα Ουρολογίας στο Zhongshan Νοσοκομείο, Σαγκάη, Κίνα και το νούμερο 2 Shimen οδό Κοινοτικό Κέντρο Υγείας, Jingan District, Shanghai. Τα δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 2006 και 2009. Η όγκου-node-μετάσταση (TNM) στάσης /ταξινόμηση των δειγμάτων των ασθενών π.Χ. προσδιορίστηκε σύμφωνα με αμερικανική μεικτής επιτροπής σχετικά με τις κατευθυντήριες γραμμές του καρκίνου [21] (Πίνακας 1). Τα δείγματα (50 ml φρέσκου ούρων) φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απορρίφθηκε και το σφαιρίδιο πλύθηκε μία φορά με 1 χ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και αμέσως καταψύχεται στους -80 ° C.

Η εικόνα Περούκα από τη βάση δεδομένων UCSC είναι στα αριστερά και το BSP αποτέλεσμα όπου τουλάχιστον 5 κλώνοι αλληλουχήθηκαν για κάθε θέση είναι στα δεξιά. Ο μαύρος κύκλος δείχνει μετουσιωμένο C στο πλαίσιο CpG? το λευκό κύκλο υποδεικνύει μη μεθυλιωμένη C στο πλαίσιο CpG

Η

Οι κυτταρικές σειρές και φυσιολογικό βλεννογόνο της ουροδόχου κύστης ιστό

Δύο BCC που, Τ24 (ATCC No: ΗΤΒ-4). και 5637 (ATCC Όχι : ΗΤΒ-9), αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν έως ότου έφθασαν λογαριθμική φάση σε L-DMEM μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C σε ένα 5 % CO

2 υγροποιημένο εκκολαπτήριο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση, και τα σφαιρίδια του κυττάρου ξεπλύθηκαν δύο φορές με 1 χ PBS. Δύο φυσιολογικούς ιστούς του βλεννογόνου της κύστης (BM1 και BM2) ελήφθησαν από δότες υγιή οργάνων. Για οικονομικούς λόγους, οι δύο BCCs συνενώθηκαν για να κατασκευαστεί η βιβλιοθήκη BCC, όπως ήταν τα δύο δείγματα ΒΜ. Με αυτόν τον τρόπο, θα μπορούσε να αποκτήσει όλες τις πληροφορίες μεθυλίωσης από κάθε ένα από τα 2 δείγματα.

MBD methylCap-seq πληροφορίες χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή γονιδίων διαφορικά υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ο αριθμός δειγμάτων στο σχήμα αναφέρεται σε εκείνη της διαδικασίας διαλογής. Η κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου στόχου σαρώθηκε σε δείγματα με διαφορετικά μεγέθη. Σε αυτή τη φάση, ο αριθμός των δειγμάτων αυξήθηκε προοδευτικά, ενώ ο αριθμός των γονιδίων μειώθηκε σταδιακά.

Η

MBD-methylCap-αλληλούχιση

Ένα παρασκεύασμα DNA από κατεψυγμένα ιστούς και κυτταρικές σειρές δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο συμβατική πρωτεϊνάση Κ /οργανική εκχύλιση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Ίσες ποσότητες DNA από τα κύτταρα 5637 και Τ24 συνενώθηκαν για να σχηματίσουν τη βιβλιοθήκη BCC, και ίσες ποσότητες DNA από τα κύτταρα BM1 και BM2 συνενώθηκαν για να σχηματίσουν τη βιβλιοθήκη BM. Σε σωλήνες φυγοκέντρησης 1,5-ml, 1,5 μg των συνδυασμένων δειγμάτων DNA (BCC ή ΒΜ) σε 100 μl ΤΕ ρυθμιστικού σε υπερήχους για να αποδώσει την επιθυμητή περιοχή μεγέθους (200-300 bp). End-επισκευή, αδενοσίνη προσθήκης βάσης και απολίνωση προσαρμογέας βαθμίδες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Η εμπορική MethylMiner ™ μεθυλιωμένο ϋΝΑ Εμπλουτισμός Kit (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή μεθυλιωμένα DNA για αλληλούχιση. Για κάθε ομάδα, 1,2 μg του επεξεργασμένου DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από μια βαθμιδωτή έκλουση NaCl, συλλέξαμε τα δύο τελευταία κλάσματα άκρως μεθυλιωμένου DNA, τα οποία αντιστοιχούσαν σε 1 Μ και 2 Μ NaCl συγκεντρώσεις. Η ακίδα-in ελέγχου DNA που παρέχονται με το κιτ χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ακρίβεια της δοκιμασίας. Το ανακτηθέν DNA (στην κλίμακα νανογραμμαρίων) ποσοτικοποιήθηκε με qubit ™ (Invitrogen), και 12 κύκλους ενίσχυσης PCR διεξήχθησαν για να ληφθεί αρκετό υλικό (στην κλίμακα μικρογραμμαρίων) για βαθιά αλληλούχιση. Τέλος, 1 μg του προϊόντος PCR εφαρμόστηκε στη Genome Analyzer II (Illumina, Inc., San Diego, CA) για να δημιουργηθεί το 75 bp μήκους ασύζευκτα διαβάζει. διπλότυπα PCR απομακρύνθηκαν από την ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε τα εργαλεία ευθυγράμμισης BWA με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις για τη χαρτογράφηση αυτών διαβάζει στην hg19 συναρμολόγηση ανθρώπινου γονιδιώματος αναφοράς (UCSC) [24]. Στη συνέχεια, οι κορυφές (υπερμεθυλίωση περιοχές) προσδιορίστηκαν με χρήση MACS λογισμικού [25], και τα ανθρώπινα νησιά CpG (CGIs) είχαν κατεβάσει από τη βάση δεδομένων UCSC. Η γενωμική προφίλ μεθυλίωσης που παράγεται φορτώθηκε σε μια δημόσια βάση δεδομένων (Gene Expression Omnibus: GSE 33.839)

Η

MSP και BSP

Bisulfite μετατροπή και την ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] . Το όξινο θειώδες αλληλουχίας PCR (BSP) και ζεύγη εκκινητών μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) σχεδιάστηκαν με τη βοήθεια του κατάλληλου λογισμικού online (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html? Πίνακα S1, S2 Πίνακας). Τα προϊόντα MSP κλωνοποιήθηκαν και επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας. Η

in vitro

μεθυλιωμένο DNA από τα κύτταρα 5637 και Τ24 ελήφθησαν με το CpG μεθυλτρανσφεράση Μ Sss Ι (ΝΕΒ) και χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Νερό χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος μη-πρότυπο. Bisulfite αλληλούχιση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [17], και τα αμπλικόνια της PCR καθαρίστηκαν επί πηκτής και κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα pBS-T II (TianGen Συμπ., Beijing, Κίνα). Τουλάχιστον 5 κλώνοι αλληλουχήθηκαν ξεχωριστά να εξακριβώσει τα μοτίβα μεθυλίωσης του στοχευόμενου τόπου. Το ποσοστό μεθυλίωσης BSP υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μεθυλιωμένων κυτοσίνες διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των κυτοσίνες σε όλα τα αμπλικόνια που αναλύθηκαν.

Στατιστικά

Οι κυριότερες στατιστικά τελικά σημεία σε αυτήν την μελέτη περιελάμβανε τη σύγκριση του μεθυλίωση καταστάσεις των γονιδίων πιστεύεται ότι συνδέονται με BC και σχετικές κλινικές μεταβλητές τους στους ασθενείς ελέγχου και τον καρκίνο. Η παρουσία ή η απουσία της μεθυλίωσης χρησιμοποιώντας MSP αξιολογήθηκε για τον προσδιορισμό των ενώσεων μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης και του καρκίνου ή κλινικές μεταβλητές χρησιμοποιώντας cross-πινακοποιήσεις και την κατάλληλη χ

2 ή ακριβή t-τεστ του Fisher. Η ένωση των π.Χ. επανάληψης με το γονίδιο μεθυλίωσης και κλινικές μεταβλητές αξιολογήθηκε μέσω αναλύσεων ομοιόμορφη και πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμησης. Το αποτέλεσμα που επιλέγεται για την ανάλυση παρακολούθησης ήταν το σωρευτικό κίνδυνο υποτροπής, η οποία ορίστηκε ως ο χρόνος από τη διάγνωση π.Χ. μέχρι την ημερομηνία της επανεμφάνισης του όγκου. Ομοιόμορφη και πολυπαραγοντική αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της γονιδιακής μεθυλίωσης και άλλες κλινικές μεταβλητές της υποτροπής της νόσου. Η αθροιστική καμπύλη κινδύνου επανάληψης δημιουργήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και επιβλέπεται από την δοκιμασία log-rank. Όλες οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS 13.0 λογισμικό στατιστικό πακέτο (SPSS Inc., Chicago, IL). Δύο όψεων τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Μια πολλαπλή μονοπαραγοντική λογιστικής παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των δεδομένων μεθυλίωση των 9 γονιδίων για να αξιολογήσει τη σχέση μεταξύ γονιδίων μεθυλίωσης και των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά του BC. Οι λεπτομέρειες περιγράφονται στο κείμενο. * P & lt?. 0.05

Η

Αποτελέσματα

Γονιδιωματική μεθυλίωση προφίλ των βιβλιοθηκών BCC και ΒΜ αποκάλυψε χαρακτηριστικά μοτίβα μεθυλίωσης π.Χ.

Εμείς προφίλ το γονιδίωμα ευρύ κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των βιβλιοθηκών BCC και BM από τη δημιουργία MBD-methylCap εμπλουτισμένο βιβλιοθήκες DNA. Οι MBD εμπλουτισμένα κλάσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση αλληλουχίας υψηλής διεκπεραιωτικότητας χρησιμοποιώντας ένα Illumina Γονιδίωμα Analyzer II για να εξασφαλίσουν πλήρη χάρτες μεθυλίωσης. Εννοιολογικά, οι υπερμεθυλιωμένων θραύσματα DNA εμπλουτίστηκαν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας κατασκευής της βιβλιοθήκης? Ως εκ τούτου, η αποκτηθείσα αλληλούχιση διαβάζει αντιστοιχούν με τις υπερμεθυλιωμένων περιοχές του γονιδιώματος. Βαθιά αλληλούχιση των παρασκευασμένων βιβλιοθηκών BCC και ΒΜ παρήγαγε περίπου 6 εκατομμύρια διαβάζει (75 βάσεις /ανάγνωσης) για κάθε βιβλιοθήκη, η οποία προήλθαν από περίπου 470 εκατομμύρια βάσεων (Πίνακας S3). Αυτή η ποσότητα βάσεων αλληλούχιση θα μπορούσε να καλύψει το γενωμικό CGI σε περίπου 10 φορές το βάθος. Έτσι, Τα σύνολα δεδομένων που παρέχονται επιτυχώς πληροφορίες γονιδίωμα-ευρεία.

Η

Όταν αυτά διαβάζει χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα, η άνιση κατανομή σχηματίζονται κορυφές που αντιπροσωπεύουν τις υπερμεθυλιωμένων περιοχές του γονιδιώματος. Συνολικά, πετύχαμε 210.051 κορυφές (μέση διάρκεια των κορυφών: 778 bp) στις BCCs και 229.538 κορυφές (μέση διάρκεια των κορυφών: 659 bp) σε το BMS (

P

& lt? 0.001, MACS2.0? Πίνακας S3).

Για να αποκτήσετε τις σχετικές πληροφορίες μεθυλίωση, συγκρίναμε τις κορυφές μεταξύ των BCCs και το BMS. Σχεδόν τα δύο τρίτα των συνολικών κορυφών ήταν κοινά μεταξύ των δύο βιβλιοθηκών, και εμείς τους αγνοούνται για την ανάλυση αυτή. Το υπόλοιπο ένα τρίτο των κορυφών ήταν μοναδικές είτε τα BCCs ή το BMS, το οποίο ονομάζεται διαφορικά-μεθυλιωμένου περιοχές (αιτήσεις συντήρησης δεδομένων), που αντιπροσωπεύουν το σχετικά υψηλό κατάστασης μεθυλίωσης των γονιδιωματικών περιοχών έναντι αντίστοιχό του. Έχουμε λάβει 70.432 και 83.690 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων στα BCCs και το BMS, αντίστοιχα (Πίνακας S3, Σχήμα 1 Α). Αυτή η μεγάλη ποσότητα DMR ήταν διάσπαρτα μέσα διαφορετικά γονιδιωματική πλαίσια, και αναλύσαμε τη σύνδεση της DMR με τις διαφορετικές γονιδιωματικές πλαίσια. Η refGene σχετίζονται DMR ήταν 55.237 και 45.522 στα BCCs και το BMS, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μία σχεδόν ισορροπημένη κατανομή στις δύο βιβλιοθήκες (Πίνακας S3, Εικόνα 1 Β). Ωστόσο, όταν ερευνήθηκαν αιτήσεις συντήρησης δεδομένων εντός του CGIs, βρήκαμε ότι τα BCC που διατηρούνται 21.179 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων, ενώ το BMS διατηρούνται μόνο 1945? Αυτό αντιπροσωπεύει μια διαφορά δέκα φορές. Όταν μελετήθηκαν οι αιτήσεις συντήρησης δεδομένων που έλαβαν χώρα εντός του CGIs του refGene, οι BCC που και το BMS περιείχε 4.256 και 201 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων για κάθε βιβλιοθήκη, αντίστοιχα. Τέλος, όταν υπολογίστηκε εμπλοκή υποκινητή, 1627 και 66 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων συνδέθηκαν σε αυτή την περιοχή στις BCCs και το BMS, αντίστοιχα (Πίνακας S3, Σχήμα 1 C). Στο σύνολό τους, παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση εμφανίστηκαν πιο συχνά στην CGIs και τις περιφέρειες υποστηρικτής των BCC που. Οι ακόλουθες μελέτες της επιλογής δείκτη μεθυλίωση επικεντρώθηκε σε υποστηρικτές BCC.

Η επικύρωση του ξεχωριστό προφίλ μεθυλίωσης BCC χρήση θειώδους αλληλουχίας

Για να επιβεβαιώσετε ότι η βιβλιοθήκη αντανακλάται με ακρίβεια την πραγματική κατάσταση της μεθυλίωσης του μελέτησαν υλικό , επιλέξαμε 24 διαφορετικές υπερμεθυλιωμένων στόχους για την επαλήθευση θειώδους αλληλουχίας. Από αυτούς, 22 στόχοι ήταν διάσπαρτα μέσα στα 1.627 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων υποκινητή που σχετίζονται με τα καρκινώματα βασικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των 17 από τις 100 κορυφαίες στόχους και 5 από το 100 έως 1.627 φάσμα? οι άλλες 2 στόχοι ήταν από τις 66 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων στο BMS. Είναι ενθαρρυντικό ότι, μεταξύ των 24 στόχων που επαληθεύονται, τα αποτελέσματα BSP 23 γονίδια ήταν εξαιρετικά συνεπείς με τις πληροφορίες μεθυλίωση που αποκτήθηκαν στη βιβλιοθήκη (ένας εκπρόσωπος αποτέλεσμα φαίνεται στο Σχήμα 2, Πίνακας S4), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι βιβλιοθήκες BCC και ΒΜ ήταν εξαιρετικά αξιόπιστη για πληροφορίες μεθυλίωση. Για να εκτιμηθεί το δυναμικό της βιβλιοθήκης για την υποβολή προτάσεων κλινικές διαγνωστικές στόχους, ψάξαμε τις πληροφορίες μεθυλίωση των στόχων που προσδιορίζονται στην προηγούμενη εργασία μας σε αυτές τις δύο βιβλιοθήκες [17]. Συνολικά το 90% (19/21) των εν λόγω στόχοι υπερμεθυλιωμένο στη βιβλιοθήκη BCC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, ερευνήσαμε επίσης τα BC-ειδικούς δείκτες που αναφέρθηκαν από άλλους [19], [26]. Οκτώ από τους στόχους 9 βρίσκονταν στη βιβλιοθήκη BCC μας ως υπερμεθυλίωση τόπους. Στο σύνολό τους, οι παρούσες BCC και ΒΜ βιβλιοθήκες παρέχονται έγκυρες πληροφορίες υπερμεθυλίωση σε σχέση με το καθεστώς. Π.Χ.

MSP ελέγχου σε μια μικρή ομάδα των δειγμάτων ούρων για τους πιθανούς βιοδείκτες που δημιουργείται 8 στόχους γονίδιο

παρουσιάστηκε με το μεγάλο παρεκκλίνουσα πληροφορίες μεθυλίωση που παρέχονται από methyCap-seq, χρειαζόμασταν μια μέθοδο για να φιλτράρετε τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης BCC για τον εντοπισμό εφικτό δείκτες π.Χ.. Εμείς ενέκρινε τη στρατηγική του που αρχίζει τη διαδικασία ελέγχου με ένα μεγάλο αριθμό στόχων σε μερικά δείγματα και μειώνοντας σταδιακά τους στόχους με αύξηση στα δείγματα (Σχήμα 3). Όταν υποβάλλεται στους περιορισμούς MSP, μόνο η κορυφή 104 του 1627 υπερμεθυλίωση υποστηρικτές των BCC που ελέγχθηκαν στα δείγματα του DNA των ούρων από 8 φυσιολογικούς μάρτυρες (BNs)? τα ίδια δείγματα BCC και ΒΜ χρησιμοποιούνται στην MethylCap-seq τμήμα της μελέτης συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχοι. Σε αυτές τις συνθήκες, μόνο οι στόχοι που έδειξε μεθυλίωση σε τουλάχιστον μία από τις δύο BCCs αλλά όχι σε περισσότερα από 2 από τα 8 BN προχώρησε στο επόμενο διαλογής (ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα MSP φαίνεται στο Σχήμα S1). Επειδή δεν πληρούν αυτά τα κριτήρια, 55 στόχοι απομακρύνθηκαν από τον πρώτο γύρο της διαλογής. Σαράντα-εννέα στόχους προχώρησε στο δεύτερο γύρο της εξέτασης DNA ούρων από 8 επιπλέον BNs και 18 ασθενείς. Π.Χ. Επιλέξαμε τους στόχους που έδειξε μεθυλίωση σε τουλάχιστον 3 από τα δείγματα 18 π.Χ., αλλά 0 ή 1 από τα 8 BN δείγματα. Σε αυτό το στάδιο, 8 γονίδια (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, ΤΑΙ1, PROX1, SLC6A20 και LMX) πληρούνται οι προϋποθέσεις και επιλέχθηκαν για τη δυνατότητά τους να διακρίνουν π.Χ. από ΒΝ (Σχήμα 3).

Αξιολόγηση της διαγνωστικής αξίας των 8 στόχων σε μια μεγάλη ομάδα

Για να εξασφαλιστεί ότι το δυναμικό των υποψήφιων στόχων π.Χ. αξιολογήθηκε με αξιοπιστία, εμείς εξέτασε τις 8 υποψήφιοι σε μια ανεξάρτητη ομάδα δοκιμών με μεγάλο μέγεθος δείγματος. Λάβαμε δείγματα ούρων από μια μεγάλη ομάδα (n = 402), η οποία περιελάμβανε 212 ασθενείς π.Χ., 149 φυσιολογικούς μάρτυρες και 41 ασθενείς με noncancerous ουροποιητικού βλάβες.

Η συχνότητα μεθυλίωσης των 8 νέων γονιδίων στο DNA των ούρων από ασθενείς BC (212 περιπτώσεις) κυμαίνονταν από 9,43% έως 42,45%, ενώ η συχνότητα μεθυλίωσης σε φυσιολογικούς μάρτυρες (149 περιπτώσεις) κυμαίνονταν από 1,34% έως 6,04%. Όλα τα 8 στόχους έδειξαν σημαντική διαφορά μεταξύ των όγκων και φυσιολογικούς μάρτυρες (

P

& lt? 0,0001)., Η οποία ευνοϊκά υποστήριξε για πιθανή χρήση τους ως διαγνωστικοί δείκτες (Πίνακας 2)

Για να διαφοροποιηθούν όγκου -ειδικές μεθυλίωση από πιθανές μεθυλίωση σχετίζεται με καλοήθη νόσο, 41 noncancerous ουροποιητικού βλάβες συμπεριλήφθηκαν στην μελέτη μας (πίνακες 1 και 2). Η συχνότητα μεθυλίωσης των 8 γονίδια σε αυτή την ομάδα ασθενών κυμαινόταν από 0,00% έως 12,19%, υποστηρίζοντας την άποψη ότι η προέλευση της υπερμεθυλίωσης ήταν πιο στενά συνδεδεμένη με όγκους από καλοήθη νόσο (

P

& lt? 0,04? Πίνακας 2). Ως εκ τούτου, αυτές οι 8 στόχοι μπορούν δυνητικά να χρησιμεύσουν ως δείκτες για την κλινική ανίχνευση π.Χ. και να διακρίνει π.Χ. από την κανονική τους ελέγχους και καλοήθεις βλάβες του ουροποιητικού.

Με δεδομένη την ετερογένεια της μεθυλίωσης του όγκου, ένα ενιαίο μεθυλιωμένο δείκτης δεν μπορεί να παρέχει επαρκή SN και SP για τη διάγνωση των όγκων [27]. Ως εκ τούτου, συνδυάζοντας μια ομάδα γονιδίων ως ένα πάνελ ήταν μια εναλλακτική λύση [28]. Λαμβάνοντας την περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) με απόφαση της διαγνωστικής ικανότητας, ένας συνδυασμός από 4 γονίδια (VAX1, KCNV1, ΤΑΙ1, PROX1) επιλέχθηκε για να σχηματίσουν ένα διαγνωστικό πίνακα, η οποία έδειξε μια SN του 76,89% και SP των 88.59% (Πίνακας S5).

για να βελτιωθεί περαιτέρω η διαγνωστική δυνατότητες αυτού του πίνακα, προσθέσαμε CFTR και SALL3, τα δύο κορυφαία στόχους π.Χ. από προηγούμενες εργασίες μας [17], τα οποία επίσης βρίσκονται εντός των 1.627 υποστηρικτές που σχετίζονται με την αιτήσεις συντήρησης δεδομένων στα καρκινώματα βασικών κυττάρων. Η CFTR εμφάνισε αξιοπρεπή δυναμικό για τη διάγνωση BC, με SN και SP από 52,36% και 96,64%, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Ωστόσο, SALL3 δεν παρουσιάζουν μια καλή SP σε μια αξιολόγηση μεγάλης κοόρτης και ως εκ τούτου απομακρυνθεί (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Τέλος, ένας πίνακας 5-γονίδιο (VAX1, KCNV1, ΤΑΙ1, PROX1 και CFTR) με την οποία αποκαλύφθηκε διαγνωστική απόδοση, με SN, SP, θετική προγνωστική αξία (PPV), και αρνητική προγνωστική αξία (NPV) των 88,68%, 87,25% , 90,82% και 84,42%, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Τα παρόμοια αποτελέσματα επίσης obtaind σε μια ανεξάρτητη μικρή ανάλυση επικύρωση κοόρτη αποτελούνταν από 24 BC και 22 έλεγχοι (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η διαγνωστική ικανότητα του πάνελ πέντε-γονίδιο είναι συγκρίσιμη με κυστεοσκόπηση

Η απόδοση των πέντε στόχων στην αξιολόγηση των ύποπτων κλινικών ασθενών είναι κρίσιμη. Ως εκ τούτου, θα χρησιμοποιηθούν για MSP για την αξιολόγηση της ούρα των ασθενών που είχαν υποψία ουροεπιθηλιακά κακοήθειες. Από τους 48 ασθενείς, οι 32 ασθενείς BC επιβεβαιώθηκαν τελικά με κυστεοσκόπηση, και 25 από αυτά ήταν MSP-θετικά για τουλάχιστον ένα από τα πέντε γονίδια. Από τους 16 ασθενείς οι οποίοι δεν εμφανίζουν κακοήθεια με κυστεοσκόπηση, 14 ήταν αρνητικά για τον ΘΧΣ. Ως εκ τούτου, ο στόχος του 5-γονιδίου έδειξε καλή συμμόρφωση με κυστεοσκόπηση (81,25%? 25 θετικά και 14 αρνητικά σε συνολικά 48 ασθενείς και από τις δύο διαδικασίες).

Ο πίνακας πέντε-γονιδίου θα μπορούσε επίσης να προβλέψει την αποτελεσματικότητα των χειρουργικών εκτομή

Όλα τα 21 (100,0%) των ασθενών π.Χ. ήταν MSP-θετικά για τουλάχιστον 1 από τα 5 γονίδια πριν από την επέμβαση, ενώ μόνο 2 από τους 21 ασθενείς π.Χ. (9,5%) διατήρησε MSP-θετική γενετικούς τόπους μετά την επέμβαση (

P

& lt? 0,0001). Τα αποτελέσματα αυτά προσθέσετε επιπλέον στήριξη στην προηγούμενη ανακάλυψη και την υπόθεση [17] μας και επιβεβαιώνουν την ιδέα ότι υπάρχει στενή σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης παρατηρείται στα ιζήματα των ούρων και του αντίστοιχου όγκου της ουροδόχου κύστης.

Η υπερμεθυλίωση VAX1 και LMX1A είναι σημαντικό για την πρόβλεψη υποτροπής του καρκίνου

Εκτός από τη σχέση μεταξύ της κατάστασης του γονιδίου μεθυλίωσης και την κακοήθη φαινότυπο του ίδιου του όγκου, μελετήσαμε επίσης τη συσχέτιση μεταξύ μεθυλιωμένων στόχων και διαφορετικές κλινικές παραμέτρους.

Η πολλαπλή μονοπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης της 9ης στόχους γονιδίου (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, ΤΑΙ1, PROX1, SLC6A20, LMX1A και CFTR) έδειξε ότι VAX1 και LMX1A μεθυλίωση ήταν πιο συχνή σε δείγματα ούρων από υποτροπιάζουσες περιπτώσεις από ό, τι σε δείγματα από την πρωτοβάθμια περιπτώσεις η αρχική ανάλυση των 212 ασθενών π.Χ. (πρωτοβάθμια: 157? επανάληψης: 55), με HR = 2,37 (95% CI, 1,27 έως 4,44, P & lt? 0,05) και HR = 2.59 (95% CI, 1,01 έως 6,65, P & lt? 0,05 ), αντίστοιχα (Σχήμα 4). Πολυμεταβλητή μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε ότι η ΥΕ των VAX1 και LMX1A ήταν 2,27 (95% CI, 1,20 – 4,32?

P

= 0,047) και 2,63 (95% CI, 1,01 – 6,85?

P

= 0,012), αντιστοίχως (Πίνακας 3). Και η ένωση ήταν περισσότερο εμφανής όταν αυτά τα δύο γονίδια αναλύθηκαν σε συνδυασμό, με HR 4,73 (95% CI, 1,39 έως 16,08?

P

= 0,013). Η στενή σύνδεση των δύο αυτών γονιδίων με υποτροπή ήταν εμφανής στα δεδομένα παρακολούθησης βασίζεται σε 145 περιπτώσεις (χωρίς υποτροπή: 108? Επανάληψης: 37) με ανέπαφη πληροφορίες παρακολούθησης. Η πολυπαραγοντική Cox μοντέλα αναλογικών κινδύνων έδειξε ότι το HR της VAX1 και LMX1A ήταν 2,11 (95% CI, 01.08 – 04.11?

P

= 0,029) και 3,31 (95% CI, 1,27 – 8,59?

P

= 0,014? Πίνακας 4), αντίστοιχα. Ο συνδυασμός των δύο γονιδίων αποκάλυψε μια πιο υψηλή HR 7,25 (95% CI, 2,41 έως 21,79?

P

= 0,014). Επιπλέον, κατά Kaplan-Meier για αποκάλυψε ότι το σωρευτικό κίνδυνο υποτροπής σε μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων VAX1 και LMX1A διέφεραν σημαντικά (

P

= 0.034 και

P

= 0,013, αντίστοιχα). Πιο sigficance λήφθηκε όταν VAX1 και LMX1A αναλυθούν από κοινού (

P

& lt? 0,0001, Σχήμα 5). Η επικύρωση σε μια μικρή ανεξάρτητη ομάδα αποτελούνταν από 24 π.Χ. και 22 έλεγχοι αποκάλυψαν την ίδια τάση με HR 9,11 (95% CI, 0,89 έως 93,7,

P

= 0.063) για τον συνδυασμό δύο γονιδίων με οριακή σημασία έχουν στην ιδιοκτησία τους για να το μικρό μέγεθος του δείγματος ίσως (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν τη σημασία που έχει για τον προσδιορισμό της κατάστασης μεθυλίωσης VAX1 και LMX1A για την πρόγνωση της υποτροπής της νόσου.

Σε additioin να LMX1 /VAX1, επίσης προσπάθησε να αξιολογήσει τη συμμετοχή των άλλων 7 γονίδια σε μορφή δύο -γονίδιο συνδυασμό ζεύγους. Η κατάσταση υπερμεθυλίωση σε μερικά από αυτά τα γονίδια έδειξαν υψηλή σύμπτωση με BC υποτροπή, όμως αυτή η ένωση δεν μπορεί να διατηρηθεί στην ανάλυση των δεδομένων παρακολούθησης. Ως εκ τούτου, η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση σε αυτά τα γονίδια θα μπορούσαν να είναι τα αποτελέσματα και όχι η σκανδάλη του BC υποτροπής.

Η κατάσταση μεθυλίωσης του ECEL1 και TMEM26 σημαντικά σχετίζονται με ένα υψηλό βαθμό διαφοροποίησης του όγκου, με HR = 2,43 (95% CI, 1,19 να 4,97? Ρ = 0,01) και 2,32 (95% CI, 1,11 να 4,85?.

P

= 0,03), αντίστοιχα (Σχήμα 4), γεγονός που υποδηλώνει ότι εμπλέκονται στην π.Χ. κακοήθεια και την εξέλιξη

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, θα αναφέρονται οι λεπτομέρειες της δημιουργίας βιολογικών δεικτών που σχετίζονται με την BC μεθυλίωση, τα οποία έχουν ως εξής: (i) το συνολικό προφίλ μεθυλίωσης των δύο BCC που και BMs από MBD methylCap-seq ? (Ii) παρεκκλίνουσα DNA π.Χ. μεθυλίωση χάρτες, μέσω της σύγκρισης του προφίλ μεθυλίωσης του BCC που με BMs? (Iii) μια ομάδα που υπόσχεται στόχους μεθυλίωσης ειδικά π.Χ.? (Iv) δύο ενημερωτικές στόχους γονίδιο κατατοπιστική για την BC υποτροπής? και (v) δύο γονίδια μεθυλίωσης συνδέονται με την BC ιστολογική διαφοροποίηση.

Ιδρύθηκε κυτταρικές σειρές καρκίνου γενικά αναμένεται να μοιραστούν πολλές (αν όχι όλες) γενετικών και επιγενετικών χαρακτηριστικά με όγκους

in vivo

, και οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται ευρέως για μελέτες ογκογένεση. Μια μελέτη της ανθρώπινης ορθοκολικού καρκίνου διαπίστωσε ότι κυτταρικές σειρές 6 καρκίνος είχε προτύπων μεθυλίωσης που ήταν πολύ παρόμοια με του πρωτογενούς όγκου σε σχέση με 60 στόχους γονίδιο μεθυλίωσης [29]. Ως εκ τούτου, αρχίσαμε γονιδιώματος σε όλη μας μεθυλίωση προφίλ με τα BCC και χρησιμοποίησε την κλινική διαλογή του δείγματος για να συγκεντρώσει BC-συγκεκριμένες πληροφορίες μεθυλίωσης.

Kaplan-Meier εκτιμήσεις της επιβίωσης χωρίς υποτροπή στην παρακολούθηση ομάδα 145 ασθενών ανάλογα με την παρουσία του μεθυλιωμένης VAX1 και LMX1A (Α και Β). VAX1 ή LMX1A μεθυλίωση συσχετίστηκε σημαντικά με κακή πρόγνωση για τους ασθενείς BC (Ρ = 0.034 και Ρ = 0.013, αντίστοιχα). Ανάλυση των δύο γονιδίων σε συνδυασμό δείχνει πιο στατική ισχύς (P & lt? 0.0001).

Η

Πολλά γονίδια έχουν αναφερθεί να υπερμεθυλίωση π.Χ.. Πρόσφατα, μελέτες με νέες προσεγγίσεις διαλογής, όπως συστοιχίες μεθυλίωση, έχουν εντοπίσει δείκτες μεθυλίωση με υψηλή SN και SP [30], [31], [32]. Αυτή η γονιδιωματική προσέγγιση διαλογής παρέχει μια αποτελεσματική και αξιόπιστη μέθοδος για τον καθορισμό ενός προφίλ παρεκκλίνουσα μεθυλίωση σχετίζονται με τη νόσο. Υιοθετήσαμε την MBD methylCap-επόμενα τεχνική σε μελέτες μας, διότι είναι μια ανοιχτή πλατφόρμα για νέες θέσεις μεθυλίωσης χωρίς προηγούμενη γνώση των τοπικών συνθηκών ακολουθία. Ως εκ τούτου, προβλήθηκε τα BCC και σε σύγκριση με τους στο BMS για να προσπαθήσει να ανακαλύψει παρεκκλίνουσα πληροφορίες π.Χ. μεθυλίωση.

Εκτός από την ιδιότητα του γονιδίου μεθυλίωσης υποκινητή, πήραμε το συνολικό πληροφορίες του προφίλ μεθυλίωσης του γονιδιώματος σε επίπεδο, το οποίο περιλαμβάνει διάφορα γονιδιωματικής πλαίσια , όπως ενισχυτές, κατάντη των ρυθμιστικών αρχών, η 5’UTR, εξώνια, εσώνια και microRNAs. Η εγκυρότητα των συγκριτικών καταστάσεων μεθυλίωσης επιβεβαιώθηκε από BSP και MSP. Αυτό αντιπροσωπεύει περισσότερες πληροφορίες μεθυλίωσης DNA για διαφορετικούς γονιδιωματική χαρακτηριστικά πλαίσιο από τη μεθοδολογία συστοιχία, η οποία περιορίζεται από αλληλουχίες ανιχνευτή.

Μια διαγνωστική μέθοδος με υψηλή SN και SP είναι σημαντική για κάθε κλινικά σχετίζονται δοκιμή. Υπήρξαν αρκετές αναφορές σχετικά με τη μεθυλίωση των χαρακτηριστικών των ιζημάτων ούρων για την ανίχνευση BC [17], [19], [26], [33], [34], [35], [36]. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις μελέτες περιλαμβάνουν συμβατικά MSP, qPCR, ένθετα-MSP, και MethyLight. Οι διαγνωστικές πάνελ ενδεικτών συνήθως αποτελείται από 3 έως 11 στόχους γονίδιο που κυμαίνονται στο SN από 77% έως 94% και SP από 67% έως 100% (Πίνακας S6).