Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο στην αμερικανική άνδρες. Ανάπτυξη και εξέλιξη των κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη εξαρτάται από την σηματοδότηση των ανδρογόνων ανεπιφύλακτα. Οι μεταστατικοί όγκοι είναι αρχικά αποκρίνονται σε αντι-ανδρογόνο θεραπεία, ωστόσο καθίστανται ανθεκτικά σε αυτό το σχήμα κατά την εξέλιξη. Genomic και πρωτεομική μελέτες έχουν εμπλέξει ένα ρόλο για ανδρογόνων στη ρύθμιση μεταβολικές διεργασίες στον καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, δεν έχουν υπάρξει μελέτες που μεταβολομική profiling διεξαχθεί μέχρι σήμερα που έχουν εξεταστεί ανδρογόνο ρυθμίζονται βιοχημικές διεργασίες στον καρκίνο του προστάτη. Εδώ, έχουμε χρησιμοποιήσει αμερόληπτη μεταβολομική προφίλ σε συνδυασμό με την χαρτογράφηση βιολογικές διεργασίες εμπλουτισμού που βασίζεται στην απόκτηση γνώσεις σχετικά με τις βιοχημικές μεταβολές που προκαλούνται από ανδρογόνων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η έκθεση των ανδρογόνων καταλήγει σε ανύψωση του μεταβολισμού αμινοξέος και τις μεταβολές του δυναμικού μεθυλίωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Περαιτέρω, μελέτες μεταβολισμού φαινοτυπική επιβεβαιώνουν υψηλότερη ροή μέσω οδών που σχετίζονται με το μεταβολισμό αμινοξέων στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη σε επεξεργασία με ανδρογόνων. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν πληροφορίες για τις πιθανές βιοχημικές διεργασίες που ρυθμίζονται από ανδρογόνο σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη. Κλινικά, εάν επικυρωθεί, αυτά τα μονοπάτια θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που συμπληρώνουν την τρέχουσα ανδρογόνων επεμβατικές θεραπείες, ενώ οι παρατηρούμενες ανδρογόνο ρυθμίζονται μεταβολικές υπογραφές θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες που προμηνύουν την ανάπτυξη του ευνουχισμού-ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη.

Παράθεση: Putluri Ν, Shojaie Α, Vasu VT, Nalluri S, Vareed SK, Putluri V, et al. (2011) μεταβολομική Profiling αποκαλύπτει ένα ρόλο για ανδρογόνων στην ενεργοποίηση αμινοξέων του μεταβολισμού και της μεθυλίωσης στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (7): e21417. doi: 10.1371 /journal.pone.0021417

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου του 2010? Δεκτές: 1 Ιούν 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Putluri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγεί RO1CA133458-04 (AS), 1 R03 CA139489-01 (AS) και RCA145444A (AS), το Ίδρυμα Doris Duke και Μοριακής Φαινοτυπική Core και DK089503 (όλα SP). AS υποστηρίζεται από τη Γεωργία Cancer Research βραβείο Διακεκριμένου Επιστήμονα. Το έργο υποστηρίζεται επίσης από την Agilent Technologies που παρέχονται κατευθύνσεις σχετικά με τη μεθοδολογία. TS και SF απασχολούνται με την Agilent Technologies. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η συχνότερη στερεό. κακοήθεια όργανο διαγιγνώσκεται στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο στις αμερικανικές άνδρες [1]. Ανδρογόνων και το ανδρογόνο υποδοχέα (AR) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του προστάτη, και ανδρογόνων είναι μία από τις κύριες θεραπευτικές επιλογές για τη θεραπεία του τοπικά προχωρημένου ή μεταστατικού PCa [2]. Σχεδόν το 90% όλων των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη αρχικά ανταποκρίνονται σε απόσυρση ανδρογόνου ευνουχισμό επαγόμενη? Ωστόσο, αυτή η θεραπεία είναι συχνά αποτελεσματική για λιγότερο από 2 χρόνια και στη συνέχεια εξελίσσεται σε ένα ανθεκτικό ευνουχισμό κατάσταση (ευνουχίσει ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη, CRPC). CRPC είναι ένα θανατηφόρο ασθένεια. [3]. Παρά την κλινική αντοχή του σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, CRPC εκφράζει AR [4] και επιδεικνύει δραστική ανδρογόνων σηματοδότηση μέσω μη παραδοσιακών ενεργοποίηση του άξονα σηματοδότησης υποδοχέα ανδρογόνων [5]. Αυτό φαίνεται καλύτερα από την παρατήρηση της αύξησης των επιπέδων του ορού του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), το οποίο είναι ένα ανδρογόνο ρυθμίζεται πρωτεΐνη και χρησιμοποιούνται σήμερα ως δείκτης για βιοχημική υποτροπή του όγκου, παρά την ανάπτυξη των CRPC [6]. Είναι ακόμη υπό συζήτηση ως προς το αν αυτή η δραστηριότητα AR σε CRPC διαμεσολαβείται από τους υποδοχείς υψηλής συγγένειας που είναι ευαίσθητες σε χαμηλά επίπεδα κυκλοφορούντων ανδρογόνων ή, εάν τα κέρδη που υποδοχέων την ικανότητα να αλληλεπιδρούν αδιάκριτα με άλλες στεροειδείς ορμόνες [4], [7], [8]. Το τελευταίο υποστηρίζεται από μελέτες που έχουν περιγράψει μια συχνή μετάλλαξη (T877A) εντός του πεδίο σύνδεσης ορμόνης των AR που την καθιστά ανεκτικό για πρόσδεση άλλων στεροειδών ορμονών και έτσι να ξεπεραστεί μια συγκεκριμένη απαίτηση για ανδρογόνα [9], [10], [11 ]. Είναι σημαντικό ωστόσο, δεν υπάρχουν δείκτες που διατίθενται σήμερα, για να προβλέψει εάν ο όγκος θα προχωρήσει σε ένα ανθεκτικό ευνουχισμού κατάσταση. Έτσι, μια κατανόηση των μοριακών μεταβολών που προκύπτουν από ανδρογόνο δράση στον καρκίνο του προστάτη είναι απαραίτητη. Πολλαπλές ομάδες έχουν ανακρίνεται ανδρογόνο ρυθμίζονται αλλαγές στα επίπεδα μεταγραφικό και πρωτεώματος σε κυτταρικές γραμμές PCa, χρησιμοποιώντας συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης και φασματομετρία μάζας [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Μια τέτοια Σπουδαία μελέτη χρησιμοποιώντας Affymetrix συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων υπογράμμισε τη σύνδεση της σηματοδότησης των ανδρογόνων στα κύτταρα του προστάτη με μεταβολικές διεργασίες που σχετίζονται με τις απαντήσεις του στρες [19]. Επιπλέον, ανδρογόνα οδηγείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων προστάτη έχει αποδειχθεί ότι περιλαμβάνει ενεργοποίηση του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (m-TOR) [20], [21], [22], [23] που από μόνη της είναι ευαίσθητη σε μεταβολικές διαταραχές στην όγκου [24], [25]. Παρά αυτής της σύνδεσης, υπάρχει περιορισμένη γνώση των βιοχημικών μεταβολών που προκαλούνται από ανδρογόνο δράση στα κύτταρα του προστάτη. Χρησιμοποιώντας ενοποιητική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης συμφωνημένα και πρωτεομικά δεδομένα, νωρίτερα είχαμε προβλέψει την ενεργοποίηση του μεταβολισμού αμινοξέων στην αγωγή ανδρογονο-LNCaP (ανδρογόνο ευαίσθητα) κύτταρα καρκίνου του προστάτη [26]. Η προσδοκία αυτή ενισχύθηκε περαιτέρω με μεταβολομική προφίλ του προστάτη ιστών που αποκάλυψε το μεταβολισμό αμινοξέων ως ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά για την πρώιμη ανάπτυξη του όγκου [27]. Εδώ, θα απασχολούν φασματομετρία μάζας με βάση το προφίλ των μεταβολιτών της ανδρογόνων-κατεργασμένων κυττάρων προστάτη, ορίζουν αλλαγμένη μεταβολίτες, τον εντοπισμό και την επικύρωση βιοχημικές οδούς και να αξιολογήσει την ορμόνη που σχετίζεται υπογραφή σε ιστούς που λαμβάνονται από ασθενή. Τα αποτελέσματά μας είναι ενδεικτικά των ανδρογόνων που προκαλείται ανύψωση του μεταβολισμού αμινοξέος και τις μεταβολές του δυναμικού μεθυλίωσης σε κύτταρα PCa, αμφότερα τα οποία επιβεβαιώνουν προηγούμενα ευρήματα μας χρησιμοποιώντας ασθενή προερχόμενο εντοπισμένη και μεταστατικών ιστών προστάτη [27].

Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές

προστάτη κυτταρικές γραμμές (Απαθανάτισε καλοήθης – RWPE? ανδρογόνα δεν ανταποκρίνεται – PC3, DU145 και αποκρίνονται στο ανδρογόνο – VCAP, και LNCaP) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, VA). κύτταρα RWPE αναπτύχθηκαν σε κερατινοκύτταρα SFM μέσα (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και /ml εκχύλισμα βόειου pitutary 50 μg (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). κύτταρα VCAP αναπτύχθηκαν σε DMEM-Glutamax μέσα (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Hyclone Labs, Thermo Scientific , Rockford, IL). κύτταρα DU145 αναπτύχθηκαν σε ελάχιστα βασικά μέσα (ΜΕΜ) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% FBS (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL), 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford , IL) και 1% HEPES (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). PC3 και LNCaP κύτταρα, αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Hyclone Labs , Thermo Scientific, Rockford, IL) .. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2.

ανδρογόνων (R1881) θεραπεία

Ίδιος αριθμός κυττάρων vcap ήταν επιμεταλλωμένα και αναπτύχθηκαν σε 60% συρροή σε μέσο DMEM-Glutamax όπως περιγράφεται παραπάνω. Μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε για δύο ημέρες με ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). Ένα σύνολο κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ συνθετικό ανδρογόνο, μεθυλοτριενολόνη (R1881? Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ), είτε για 24 ή 48 ώρες, ενώ τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (επεξεργασία με αιθανόλη) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα, σε επεξεργασία με θρυψίνη, σφαιροποιήθηκαν, πλύθηκαν με 50 mM αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS, ρΗ 7.4) και αποθηκεύτηκε στους -140 ° C μέχρι περαιτέρω αναλύσεων.

Η προετοιμασία των δειγμάτων για τη μαζική spectrometry- με βάση την εξέταση των μεταβολιτών σε κυτταρικές γραμμές

φασματομετρία μάζας με βάση μεταβολισμική profiling διεξήχθη επί κατεψυγμένων σφαιρίδια κυττάρου προστάτη (~ 10 εκατομμύρια κύτταρα). Η διαδικασία της εκχύλισης μεταβολίτη εμπλέκονται εισαγωγή του ισομοριακού μίγματος των 11 standard ενώσεις διαλύονται σε μεθανόλη (επιμπρασσινολίδης, [D

3] Η τεστοστερόνη, [

15Ν] Ανθρανιλικό οξύ, Zeatine, γιασμονικό οξύ, Gibberelic οξύ, [D

4] οιστρόνη, [

15N] τρυπτοφάνη, [D

4] θυμίνη, [

13C] κρεατινίνης και [

15Ν] αργινίνη) που ακολουθείται από ομογενοποίηση των κυττάρων. Το ομογενοποίημα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε εκχύλιση με διαδοχική χρήση των υδατικών (παγωμένο νερό) και οργανικά (ψυχρή μεθανόλη και χλωροφόρμιο) διαλύτες στην ακόλουθη αναλογία 1:4:3:1 (water:methanol:chloroform:water) [28]. Τα προκύπτοντα εκχυλίσματα απο-proteinized χρησιμοποιώντας ένα 3 KDa μοριακού φίλτρου (Amicon Ultracel -3K Membrane, Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ) και το διήθημα που περιέχει μεταβολίτες ξηράνθηκαν υπό κενό (Genevac EZ-2

συν, Gardiner, ΝΥ) . Πριν από την ανάλυση φασματομετρίας μάζας, το αποξηραμένο εκχύλισμα επαναιωρήθηκε σε πανομοιότυπο όγκο διαλύτη ένεση που αποτελείται από water:methanol (50:50) με 0.2% οξικό οξύ και υποβλήθηκε σε υγρή χρωματογραφία (LC) φασματομετρία μάζας. Και συμπληρωματικούς ελέγχους για την παρακολούθηση της διαδικασίας χαρακτηρισμού, ένα ισομοριακό μίγμα των 11 standard ενώσεων (επιμπρασσινολίδης, [D

3] Η τεστοστερόνη, [

15N] Ανθρανιλικό οξύ, Zeatine, γιασμονικό οξύ, Gibberelic οξύ, [D

4] οιστρόνη, (

15Ν) τρυπτοφάνη, [D

4] θυμίνη, [

13C] κρεατινίνης, και [

15Ν] αργινίνη) και χαρακτηρίζεται πισίνα του ήπατος του ποντικιού (που λαμβάνεται σε συνδυασμό με κυτταρικές γραμμές) αναλύθηκαν μαζί με τα δείγματα κυτταρική γραμμή. Κάθε ένα από αυτά τα στοιχεία ελέγχου, συμπεριλήφθηκαν πολλές φορές στο σύστημα τυχαιοποίησης τέτοια ώστε τα δείγματα παρασκευή και οι αναλυτικές μεταβλητότητα θα μπορούσε να παρακολουθείται συνεχώς. Επιπλέον, η ανάλυση της κάθε κυτταρικής σειράς διαδέχθηκε από τουλάχιστον δύο κενό τρεξίματα, να αποφευχθεί οποιαδήποτε μεταφορά των μεταβολιτών μεταξύ των δειγμάτων. Σχήμα S1 απεικονίζει την αναπαραγωγιμότητα της διαδικασίας χαρακτηρισμού παρακολουθείται χρησιμοποιώντας το πρότυπο μίγμα που περιγράφεται παραπάνω. Αξίζει να σημειωθεί ότι η CV για όλη τη διαδικασία δημιουργίας προφίλ μετρήθηκε με τη χρήση πέντε ανεξάρτητες επαναλήψεις του εκχυλίσματος ήπατος ποντικού που αναφέρονται παραπάνω ήταν μικρότερη από 5%.

Υγρής Χρωματογραφίας /Φασματομετρίας Μάζας (LC /MS)

Η LC /MS τμήμα του αμερόληπτη πλατφόρμα προφίλ βασίζεται σε 1200 SL Rapid LC ανάλυση και 6520 τετράπολου χρόνος πτήσης φασματόμετρο μάζας (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Τα δείγματα εξετάστηκαν ανεξάρτητα τόσο θετικές όσο και αρνητικές καταστάσεις ιονισμού χρησιμοποιώντας μια διπλή πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI). Σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της διόρθωσης της μάζας φασματομετρία μάζας επιτεύχθηκε με έγχυση ενός προτύπου μίγμα ιόντων αναφοράς χρησιμοποιώντας μία ανεξάρτητη ισοκρατική αντλία 1200 SL Rapid ανάλυση LC εξοπλισμένο με 100:1 διαχωριστή για να εξάγει ένα ρυθμό ροής 5 μΐ /λεπτό. Αυτό το μίγμα αναφοράς που παρέχεται από τον πωλητή περιείχε ιόντα με

m /z

121.050873, 922.009798 και 119.03632, 966.000725 για μαζική διόρθωση στο θετικό (+) και αρνητικό (-) ιονισμού τρόπους αντίστοιχα. Ένα εύρος μάζας μεταξύ 50-1000 m /z χρησιμοποιήθηκε για ολόκληρη τη διαδικασία αμερόληπτη προφίλ. Η απόκτηση των δεδομένων κατά την ανάλυση ελέγχθηκε με τη χρήση του λογισμικού απόκτησης δεδομένων εργασίας Μαζικής Hunter. Οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της φασματομετρίας μάζας περιελάμβανε τα εξής: 1) συνθήκες πηγή: τριχοειδής τάση, 4000 V (τρόπος λειτουργίας: αρνητικός 3500 V), 2) θερμοκρασία πηγής ήταν 325 ° C, 3) του αερίου ξήρανσης χρησιμοποιήθηκε σε 10 l /min 4) , πίεση εκνεφωτή διατηρήθηκε στους 45 psig (ιόν αναφορά εκνεφωτή 10 psig), 5) τάση κατατεμαχιστή καθορίστηκε σε 140, και 6) τάση skimmer διατηρήθηκε στους 65 V. Για ολόκληρη την ανάλυση, υπερυψηλή καθαρό άζωτο χρησιμοποιήθηκε ως νεφελοποιητής και του φυσικού αερίου σύγκρουση. Για επαγόμενη από σύγκρουση διάσπαση (CID) πειράματα, που επιλέγονται ο πρόδρομος ιόντων με τη χρήση του αναλυτή τετραπόλου ρυθμιστεί σε λειτουργία υψηλής ανάλυσης, ενώ τα ιόντα προϊόν αναλύθηκαν από τον αναλυτή TOF. Οι ενέργειες κρούσης σε όλα τα πειράματα που μεταξύ 10-40 eV εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Τα φάσματα για τα δείγματα που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη καταγράφηκαν υπό ταυτόσημες πειραματικές συνθήκες. διαλύτες LC που χρησιμοποιείται για το σύνολο της μελέτης αγοράστηκαν από την Burdick 1,8 μm) που διατηρείται στους 37 ° C και ταχύτητα ροής 0,2 ml /min. Ο διαλύτης κατά την έναρξη της βαθμίδωσης ήταν 2% Β, η οποία στη συνέχεια σταδιακά ενταθούν και 30% Β σε διάστημα 6,5 λεπτών, που ακολουθείται από αύξηση στο 90% Β για τα επόμενα 0,5 λεπτά, 95% Β για 5 επιπλέον λεπτά και παραιτήθηκαν έως 2% Β για χρονικό διάστημα 8 λεπτών. Αυτό ακολουθήθηκε από μια εξισορρόπηση μετα-δείγμα για επιπλέον 5 λεπτά. Συγκεκριμένα, η στήλη πλύθηκε και επισκευασμένα μετά από κάθε 50 ενέσεις

Η υδατική κανονικής φάσης (ΑΝΡ) χρωματογραφικό διαχωρισμό για την LC-QQQ χρησιμοποιείται μια βαθμίδα που περιέχει Acetonitirle (ACN, διαλύτης Α):. Το νερό (διαλύτης Β) με τα δύο διαλύτες τροποποιηθεί με την προσθήκη 0,2% οξικού οξέος και 0,1% μυρμηκικό οξύ. Ο ρυθμός ροής ρυθμίστηκε σε 0,4 ml /min. Η αρχική διαλύτης ήταν 95% Α με μία βαθμίδα από 95% Α έως 90% Α επί διάστημα 3 λεπτών, 90% Α-80% Α σε 2 min, ακολουθούμενο από 80% Α-75% Α σε 1 λεπτό, 75% Α -55% Α σε 2 min, 55% Α-40% Α σε 2 min, 40% Α-30% Α σε 2 λεπτά, 30% Α-20% Α σε 2 min, 20% Α-95% Α σε 1 min και 95% Α επί 5 λεπτά. Η στήλη στη συνέχεια επισκευασμένα πίσω σε συνθήκες εκκίνησης. Μια στήλη Diamond υδριδίου (MicroSolv Τεχνολογίας, Eatontown, NJ) (4 um, 100A 2.1 × 150 mm) διατηρήθηκε σε ελεγχόμενης θερμοκρασίας θάλαμο (37 ° C) και χρησιμοποιείται για την ένωση διαχωρισμού. Κατά τη διάρκεια της αμερόληπτη και στοχευμένη μεταβολομική διαδικασία δημιουργίας προφίλ λίγες ενώσεις έχουν πλεονασμό απεικονιστεί σε πολλαπλές πλατφόρμες. Με την προϋπόθεση ότι η ευαισθησία και η γραμμικότητα είναι πολύ διαφορετικό από το περιβάλλον για τη διασύνδεση, οι εν λόγω απολύσεις χρησιμοποιηθεί ως μέρος της διαδικασίας ελέγχου ποιότητας. Επιπλέον, ο αυστηρός έλεγχος της ποιότητας που εγκρίθηκαν σε αυτή τη μελέτη συμμετείχαν ένα χρωματογραφικό διαχωρισμό που είχε διακύμανση μικρότερη από 0,1 λεπτό σε χρόνο κατακράτησης ανιχνεύεται ενώσεων μεταξύ των πειραμάτων (Σχήμα S1). Επιπρόσθετα χρησιμοποιήσαμε επίσης τα εσωτερικά πρότυπα που περιέχει ισομοριακό μίγμα των καθαρών ενώσεων, καθώς και μια πισίνα χαρακτηρισμένο του δείγματος ήπατος για τον έλεγχο παραλλαγή διαδικασία που σχετίζεται. Και οι δύο αυτοί έλεγχοι επανειλημμένα αναλυθεί σε συνδυασμό με τα δείγματα κυτταρική σειρά. Επίσης, για να διασφαλιστεί η ομοιομορφία στη διαδικασία δημιουργίας προφίλ, όλες οι στήλες και οι διαλύτες αγοράστηκαν από την παρτίδα ενός μόνο κατασκευαστή κατά την έναρξη αυτών των πειραμάτων.

Εκτός από την αμερόληπτη προφίλ που περιγράφεται παραπάνω, η αξιολόγηση των αλανίνης και σαρκοσίνης ήταν διεξάγεται χρησιμοποιώντας αέριο αραίωσης ισοτόπων χρωματογραφία-συζευγμένο φασματομετρία μάζας. Εδώ υπολειμματικό νερό απομακρύνθηκε από τα δείγματα με σχηματισμό αζεοτροπικό μίγμα με 100 υί διμεθυλοφορμαμιδίου (DMF), και ξήρανση του αιωρήματος υπό κενό. Όλα τα δείγματα εγχύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα on εγχυτήρα στήλης και ένα χρωματογράφο αερίου Agilent 6890N εφοδιασμένο με DB-5 τριχοειδής στήλη 15 m (εσωτερική διάμετρος, 0,2 mm? Πάχος φιλμ, 0,33 micron? J & amp? W Scientific Folsom, CA) διασυνδεθεί με ένα Agilent 5975 MSD ανιχνευτή μάζας. Η

t

-βουτυλο διμεθυλοσιλυλο παράγωγα σαρκοσίνης ήταν ποσοτικά με παρακολούθηση επιλεγμένου ιόντος (SIM), χρησιμοποιώντας αραίωση ισοτόπου ιονισμού ηλεκτρονίων επιπτώσεις GC /MS. Τα επίπεδα της αλανίνης και σαρκοσίνης που εκλούεται σε 3,8 και 4,07 λεπτά, αντίστοιχα, μετρήθηκαν με αντίστοιχη αναλογία τους μεταξύ των ιόντων του

m

/

z

232 προέρχονται από την πατρίδα του μεταβολίτη ([MO-

t

-βουτυλο-διμεθυλοσιλυλο]

-) και τα ιόντα του

m

/

z

233 και 235, αντίστοιχα, για αλανίνης και σαρκοσίνη, που προέρχεται από το ισοτοπικά επισημασμένο δευτεριωμένου εσωτερικό πρότυπο [

2Η

3] για σαρκοσίνη. Το όριο ανίχνευσης (σήμα /θόρυβος & gt? 10) ήταν -0.1 picomole για σαρκοσίνη χρήση GC αραίωση ισοτόπου /MS

μεταβολομική μικροσυστοιχίες Φαινοτυπική

Το μεταβολικό φαινοτυπική πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 96-φρεατίων που περιέχουν. διάφορους μεταβολίτες ως μοναδικό θρεπτικών υποστρωμάτων. Το θρεπτικό που περιείχε πλάκες ελήφθησαν από Biolog Inc (Hayward, CA) και η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα σύνολο 88 σακχάρων, 5 νουκλεοτίδια και 29 αμινοξέων εξετάστηκαν ως υποστρώματα σε δύο πλάκες 96-φρεατίων, επισημασμένα Μ1 και Μ2 από τον κατασκευαστή. Ουσιαστικά, η δοκιμασία μετρά την χρησιμοποίηση αυτών των μεταβολιτών από τα αναπτυσσόμενα κύτταρα ως συνάρτηση του NADH ροή η οποία με τη σειρά της μετράται από την έκταση της μείωσης της βαφής τετραζολίου. Η τελευταία ποσοτικοποιείται με φασματοφωτομετρία στα 590 nm, ενώ οποιαδήποτε μη-ειδική δραστικότητα υποβάθρου εκτιμάται σε 790 nm. Για τους μεταβολικές μελέτες φαινοτύπου, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής Vcap για 96 ώρες και σπάρθηκαν σε φρεάτια της πλάκας 96 φρεατίων σε πυκνότητα 20.000 κύτταρα /φρεάτιο. Αξιοσημείωτα, τα κύτταρα Vcap είτε σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 ή όχημα (αιθανόλη) κατά το χρόνο της σποράς. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες στους 37 ° C σε 5% CO

2. Μετά 24 ώρες επώαση, NADH ροή μετρήθηκε με παρακολούθηση της οπτικής πυκνότητας στα 590 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Ταυτόχρονα, ελήφθησαν επίσης μετρήσεις στα 790 nm για την αξιολόγηση δραστηριότητα φόντο. Η πρώτη ανάγνωση ελήφθη στις 24 ώρες μετά την προσθήκη των ανδρογόνων και μετέπειτα αναγνώσεις λήφθηκαν σε διαστήματα 1 h έως 30

η ώρα, που ακολουθείται από τρεις επιπλέον μετρήσεις σε 34

ου, 42

ου και 48

ου ώρες μετά ανδρογόνων προσθήκη. Τα δεδομένα συνοψίζονται σε ένα φύλλο excel και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Στατιστικές Μέθοδοι.

μεταβολομική Βιβλιοθήκες

Metlin βιβλιοθήκη (Agilent, Santa Clara, CA) χρησιμοποιήθηκε για να αναζητήσετε τα φασματικά δεδομένα μάζας. Η βιβλιοθήκη δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας περίπου 1.000 εμπορικά διαθέσιμες ενώσεις των οποίων η κατακράτηση φορά ορίστηκε χρησιμοποιώντας το RP και χρωματογραφικές μεθόδους ΑΝΡ που περιγράφονται παραπάνω. Επιπλέον, η πληροφορία μάζα και ιόντων θραύσμα για κάθε μία από αυτές τις πρότυπες ενώσεις ελήφθησαν επίσης σε τόσο θετικές όσο και αρνητικές καταστάσεις ιονισμού και περιλαμβάνονται στην βιβλιοθήκη Metlin.

Στατιστική Ανάλυση

Οι μεταβολίτες με περισσότερες από 60 % τις τιμές που λείπουν αφαιρέθηκαν από την ανάλυση. Η μεταβολική δεδομένα αφήνεται λογοκριμένη λόγω κατωφλίου των δεδομένων φασματόμετρο μάζας. Για να ληφθούν υπόψη οι διαφορές στα πρότυπα missingness σε διαφορετικές κατηγορίες, διανομή ποσοστό ελλιπών τιμών σε ανδρογόνων ανταποκρίνεται (ARD), ανδρογόνο μη-απόκρισης (ARI) και καλοήθη (Ben) δείγματα εξετάστηκαν και οι ενώσεις με περισσότερο από 85% τις τιμές που λείπουν σε κάθε ομάδα και λιγότερο από 60% τις τιμές που λείπουν συνολικά θεωρήθηκαν ότι έχουν βιολογική missingness. Ανδρογόνων θεραπεία και δείγματα ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία παρομοίως. Λείπει μεταβολίτη μετρήσεις για αυτούς τους μεταβολίτες αντικαταστάθηκαν (τεκμαρτό) με το επίπεδο ανίχνευσης (2000). Τα μέτρα που λείπουν στο υπόλοιπο των μεταβολιτών καταλογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον πλησιέστερο γείτονα αλγόριθμο με k = 5 χρησιμοποιώντας το PAMR R-πακέτο. Τεκμαρτά δεδομένα στη συνέχεια log2 μεταμορφωθεί. Κανονικοποίηση των δεδομένων Q-TOF έγινε χρησιμοποιώντας quantile εξομάλυνση ανά δείγματα χρησιμοποιώντας το limma R-πακέτο. δείγματα QQQ ομαλοποιήθηκαν με μέση κεντράρισμα και IQR κλιμάκωση.

Heatmaps, Boxplots και διαγράμματα Venn συντάχθηκαν με τη χρήση R-πακέτα gplot, στατιστικά και limma, αντίστοιχα. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από διαφορετικές πλατφόρμες στη συνέχεια κλιμακώνεται ανά ένωση και σύγκριση όλη δείγματα. Τα δείγματα για διπλές ενώσεις συνδυάστηκαν με μέσο όρο πάνω από δείγματα προέκυψαν από πολλαπλές εμφανίσεις των ίδιων ενώσεων. Ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας την πλήρη διασύνδεση με συσχέτισης του Pearson. Ένα δύο όψεων t-test χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η σύνδεση της κάθε μεταβολίτη με το ανδρογόνο κατάσταση ανταπόκριση σε μια δοκιμή δύο δειγμάτων. Οι προκύπτουσες τιμές ρ στη συνέχεια ρυθμίστηκαν για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας FDR με q * = 0,2, υπολογίζοντας τις τιμές Q χρησιμοποιώντας το fdrtool R-πακέτο [29].

Τα δεδομένα από μεταβολικές δοκιμασίες φαινοτυπική πρώτα διορθώθηκαν για σήμα υποβάθρου, που λαμβάνεται από αναγνώσεις των κενών φρεατίων. Τα δεδομένα στη συνέχεια ρυθμίζεται με αφαίρεση μέσες τιμές των τριών πηγαδιών αρνητικού ελέγχου από όλα τα άλλα δείγματα σε κάθε χρονικό σημείο. Η επίδραση της θεραπείας ανδρογόνων σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που αναπτύσσονται σε πλάκες αμινοξέος και σακχάρου σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας θερμικούς χάρτες και Boxplots. Επιπλέον, σετ γονιδίων ανάλυση (R-πακέτο GSA [30]) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συνολική εμπλουτισμό των αμινοξέων και ζάχαρη μονοπάτια, στις αντίστοιχες πλάκες, σε κάθε χρονικό σημείο.

Αποτελέσματα

μεταβολομική προφίλ του προστάτη κυτταρικές γραμμές που παράγονται

σε μια προσπάθεια με το προφίλ του ανδρογόνο ρυθμίζονται μεταβολιτών στον καρκίνο του προστάτη, χρησιμοποιήσαμε υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας για να ανακρίνει τα σχετικά επίπεδα των μεταβολιτών σε όλη του προστάτη προερχόμενα κύτταρο γραμμές (Απαθανάτισε καλοήθης – RWPE? ανδρογόνων-μη-απόκρισης – PC3 και DU145 και αποκρίνονται στο ανδρογόνο – VCAP, και LNCaP). Εκτός από την σκιαγράφηση καρκίνου του προστάτη-ειδικό (PCA) μεταβολικά προφίλ, εξετάσαμε επίσης μεταβολικές αλλαγές στο αποκρίνονται στο ανδρογόνο (ARD) έναντι των μη-αποκριτικά κύτταρα (ARI), καθώς και εκείνες που ρυθμίζονται απευθείας από ανδρογόνο σε κύτταρα VCAP. Όπως σκιαγραφείται στο Σχήμα 1, η αμερόληπτη πλατφόρμα μεταβολομική προφίλ που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αποτελούνταν από δύο αντίστροφης φάσης και υδατικής χρωματογραφία κανονικής φάσης σε συνδυασμό με 1) ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) στον τρόπο θετικού ιόντος (+) και 2) ESI στην αρνητικών ιόντων λειτουργία (-). Επιπλέον, μια στοχευμένη αξιολόγηση 57 ενώσεων εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας παρακολούθησης (ΕΥΚ) σε έναν τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας λειτουργεί σε (+) και μόνο αντίδραση (-) ιόν τρόπους αντιστοίχως (Σχήμα 1). Η κυτταρική γραμμή που προέρχεται από μάζα προφίλ φασματομετρίας υποβλήθηκαν σε προ-επεξεργασίας που εμπλέκονται φιλτράρισμα δεδομένων, συμψηφισμού, λογαριθμικό μετασχηματισμό και ομαλοποίηση όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Τα κανονικοποιημένα δεδομένα στην συνέχεια ανακρίνεται για τους μεταβολίτες που διακρίνουν 1) καλοήθη κυτταρική σειρά προστάτη (Ben) από καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PCA) 2) του καρκίνου του προστάτη ανδρογόνο αποκρίνονται κύτταρα (ARD) από ανδρογόνο ανεξάρτητους κύτταρα (ARI) και 3) ανδρογόνο θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κύτταρα από μη κατεργασμένους ελέγχους. Περαιτέρω, οι μεταβολίτες που διακρίνονται κυτταρικές σειρές ARD και ARI αξιολογήθηκαν σε εντοπισμένες και μεταστατικούς ιστούς, με τη χρήση των ιστών που προέρχεται μεταβολομική προφίλ που νωρίτερα δημοσιεύθηκε από την ομάδα μας [27]. Οι μεταβολικές υπογραφές κατηγορία ειδικών υποβλήθηκαν σε χαρτογράφηση βιολογικές διεργασίες εμπλουτισμού που βασίζεται ακολουθούμενη από επικύρωση, χρησιμοποιώντας πειράματα in vitro μεταβολικό φαινοτυπική.

Απεικόνιση των διαφόρων σταδίων που εμπλέκονται στην μεταβολομική προφίλ των κυτταρικών σειρών προστάτη. Τα κύρια στάδια που εμπλέκονται εκχύλισης μεταβολίτη και διαχωρισμού, φασματομετρία μάζας με βάση την ανίχνευση, φασματική ανάλυση, κανονικοποίηση των δεδομένων, οριοθέτηση κατηγορία ειδικών μεταβολιτών και μεταβάλλεται οδούς και λειτουργικό χαρακτηρισμό τους. Η μεταβολή στην εξαγωγή του δείγματος, διαχωρισμό και φασματομετρία μάζας ελέγχθηκαν με τη χρήση αιχμηρών πρότυπα και να αξιολογηθούν χρησιμοποιώντας διάφορες παραμέτρους ποιοτικού ελέγχου (Σχήμα S1).

Η

Ένα σύνολο από 1553 ενώσεις ανιχνεύτηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές έξι προστάτη χρησιμοποιώντας οι διαφορετικές μέθοδοι μαζικής φασματομετρίας χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (βλέπε ανωτέρω, Σχήμα 2Α). Από αυτές, 40 ενώσεις ανιχνεύτηκαν μόνο σε Ben ενώ 102 και 55 αντίστοιχα ενώσεις παρατηρήθηκαν σε ARI και κυτταρικές γραμμές ARD (Σχήμα 2Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτή η επιτομή περιείχε 72 ονομάστηκε μεταβολίτες (Σχήμα 2C). Μια ιεραρχική προφίλ ομαδοποίηση με βάση τις ενώσεις με σημαντική διαφορική έκφραση σκιαγραφεί απόλυτα τις κυτταρικές προστάτη γραμμές (Σχήμα 2D).

Α) χάρτης θερμότητας εκπροσώπηση της ιεραρχικής ομαδοποίησης των 1.553 μεταβολιτών σε όλη την κυτταρικές σειρές 5 του προστάτη. Τα μαθήματα του δείγματος που αναφέρεται από τις έγχρωμες γραμμές [καλοήθεις = πράσινο, ανδρογόνο μη ανταπόκριση του προστάτη (ARI): κίτρινο και ανδρογόνων ανταποκρίνεται προστάτη (ARD): κόκκινη γραμμή]. Στήλες αντιπροσωπεύουν ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές και σειρές αναφέρονται σε διακριτά μεταβολίτες. Αποχρώσεις του κίτρινου αντιπροσωπεύουν ανύψωση ενός μεταβολίτη και αποχρώσεις του μπλε αντιπροσωπεύουν μείωση του μεταβολίτη σε σχέση με τα διάμεση μεταβολίτης επίπεδα (βλ χρωματική κλίμακα). Β) διάγραμμα Venn που αντιπροσωπεύει την κατανομή των 1.553 μεταβολιτών μετριέται σε όλη την καλοήθη (RWPE), ARI (DU145 και PC3) και ARD (LNCaP και VCAP) κυτταρικές σειρές με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό φασματομετρία μάζας. Γ) ίδια όπως στο (Α), αλλά για 72 κατονομαζόμενες ενώσεις D) δενδρόγραμμα που αντιπροσωπεύουν ιεραρχική συσταδοποίηση των κυτταρικών γραμμών προστάτη σχετίζονται περιγράφεται στο Β, χρησιμοποιώντας ενώσεις με σημαντική διαφορική έκφραση.

Η

Ειδικά μεταβολικά προφίλ διακρίνουν Μπεν από προστάτη και ARD από ARI

Για να οριοθετηθούν τα μεταβολομική μεταβολές μεταξύ των κυτταρικών σειρών Ben και του προστάτη, χρησιμοποιήσαμε ένα 2-δείγμα

t-test

. Συνολικά 674/1553 ενώσεις ήταν διαφορικό σε αυτές τις δύο κατηγορίες μετά από πολλαπλές προσαρμογή σύγκριση με ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) του 20%. Περιλαμβάνονται στον κατάλογο αυτό ήταν 29 ονομάστηκε μεταβολίτες των οποίων τα σχετικά επίπεδα φαίνονται στο Σχήμα 3Α. Αυτή η αλλοιωμένη μεταβολομική υπογραφή σε κυτταρικές σειρές προστάτη περιείχε αυξημένα επίπεδα αμινοξέων, όπως σαρκοσίνη, θρεονίνη, φαινυλαλανίνη και αλανίνη, καθώς και τα υψηλότερα επίπεδα των ενώσεων που σχετίζονται με το μεταβολισμό του αζώτου, όπως κρεατίνη, κρεατινίνη, κιτρουλίνη και Ν-ακετυλο σπερμίνη. Από την άλλη πλευρά, τα επίπεδα των μεταβολιτών που ανήκουν σε μεταβολισμό τρυπτοφάνη δηλαδή τρυπτοφάνη, 1-μεθυλ τρυπτοφάνη και kyneuric οξύ μειώθηκαν σε σύγκριση με PCa Ben. Παρομοίως, οι ενώσεις 913/1553 άλλαξαν μεταξύ ARI και κυτταρικές γραμμές ARD προστάτη (Σχήμα 3Β). Η αλλαγμένη κατάλογος περιλαμβάνει 52 ονομάστηκε μεταβολιτών μεταξύ των οποίων τα επίπεδα της σπερμίνης, Ν1-acetylspermine και αμινοξέα όπως σερίνη, θρεονίνη, λυσίνη, ομοκυστεΐνη, ασπαραγίνη, αλανίνη, γλουταμινικό οξύ, κλπ, ήταν αυξημένα σε ARD (Σχήμα 3Β). Αντίθετα, τα επίπεδα της S-adenosylmethione (SAM, μεθυλίωση νόμισμα του κυττάρου) μειώθηκαν σε κύτταρα ARD με ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων του διαλείμματος του κάτω προϊόν, ομοκυστεΐνη (Σχήμα 3Β). Αυτό είναι ενδεικτικό της αυξημένης δραστηριότητας μεθυλίωσης στον καρκίνο του προστάτη και είναι σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα μας σε προηγμένες ιστούς καρκίνου του προστάτη [27].

Α) Heat χάρτη που δείχνει 29 ονομάζεται διαφορική μεταβολιτών στα κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε σχέση με καλοήθη κυττάρων γραμμή (

σ

& lt? 0,05, FDR = 20%), που προέρχεται χρησιμοποιώντας ένα

t-test

σε συνδυασμό με μεταθέσεις (

n

= 1.000) για τον προσδιορισμό του

σ

-τιμές για τη σύγκριση των ομάδων. Ο χάρτης θερμότητα που παράγεται μετά καταγραφής κλιμάκωση και quantile κανονικοποίηση των δεδομένων. Ο συνδυασμός χρωμάτων είναι η ίδια όπως στο Σχ. 2Α. Β) ίδια όπως στο (Α), αλλά για 52 ονομάζεται διαφορική μεταβολίτες μεταξύ ARI (κίτρινη μπάρα) και ARD (κόκκινη γραμμή) κύτταρα καρκίνου του προστάτη. άποψη Γ) Δίκτυο ανάλυσης μοριακού αντίληψη για τις μεταβολομική προφίλ μας «αλλαγμένη σε προστάτη κυτταρική γραμμή υπογραφής» (γκρι κόμβο). Κάθε κόμβος αντιπροσωπεύει ένα μοριακό ιδέα ή ένα σύνολο βιολογικά σχετικών γονιδίων. Το μέγεθος κόμβος είναι ανάλογη με τον αριθμό των γονιδίων στην έννοια. Κάθε ακμή αντιπροσωπεύει μια στατιστικά σημαντική εμπλουτισμού (FDR

q

-τιμή & lt? 0,2). Εμπλουτισμένο έννοιες που περιγράφει «το μεταβολισμό αμινοξέων» υποδεικνύονται από κίτρινο γέφυρες.

Η

Ολοκληρωμένες Μοριακής Έννοια Μοντελοποίηση του προστάτη που προέρχονται μεταβολιτών

Κατά την οριοθέτηση των μεταβολομική σχέδια για τον Ben, ARD και ARI προστάτη κυτταρικές σειρές, που στη συνέχεια επιδιώκει την αξιολόγηση αυτών των αλλαγών στο πλαίσιο των βιοχημικών οδών και οριοθέτηση των αλλοιωμένες βιοχημικές διεργασίες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη και τη διατήρηση της προόδου στο πλαίσιο απάντησή της στην ανδρογόνων. Για να οριοθετηθούν οι συνολικές βιολογικές διαδικασίες που έχουν αλλοιωθεί σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, καθώς και σε αποκρίνονται στο ανδρογόνο καρκινικών κυττάρων του προστάτη, τα προφίλ συντονισμένη έκφραση κατηγορία ειδικών μεταβολιτών που περιγράφονται παραπάνω εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Oncomine Concept Maps (OCM, www.oncomine. org) [31], [32]. Εδώ μια «μοριακή έννοια» ορίζεται ως οποιοδήποτε σύνολο των μοριακών συστατικών που σχετίζονται με κάποιο βιολογικά ουσιαστικό τρόπο. Για την ανάλυση αυτή, χρησιμοποιήσαμε μοριακό έννοιες δύο γενικών τύπων: (1) γονίδιο και πρωτεΐνη επισημειώσεις από εξωτερικές βάσεις δεδομένων, και (2) υπολογιστικά προερχόμενο ρυθμιστικών δικτύων. 2Α.