Abstract

Ιστορικό

Παλμιτική, ένα κορεσμένο λιπαρό οξύ (FA), είναι γνωστό ότι προκαλεί τοξικότητα και θάνατο των κυττάρων σε διάφορους τύπους κυττάρων. Η ρεσβερατρόλη (RSV) είναι σε θέση να αποτρέψει παθογένεση και /ή επιβραδύνουν την πρόοδο μιας ποικιλίας ασθενειών. Αρκετές

in vitro

και

in vivo

μελέτες έχουν επίσης δείξει μια προστατευτική επίδραση του RSV σε συσσώρευση λίπους που προκαλείται από FAS. Επιπλέον, ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) στρες έχει πρόσφατα συνδεθεί με την κυτταρική αδιπογονική αποκρίσεις. Για την αντιμετώπιση της υπόθεσης ότι η επίδραση του RSV σε συσσώρευση υπερβολικού λίπους που προωθείται από αυξημένα κορεσμένα ΕΧΟ μπορούσε να διαμεσολαβείται εν μέρει από τη μείωση του ER στρες, μελετήσαμε τη δράση του RSV σε πειραματικά προκαλούμενη στρες ER χρησιμοποιώντας παλμιτικό σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές.

Principal Εκτίμηση

Θα δείξουμε ότι, αναπάντεχα, RSV προωθεί ένα ενίσχυση του παλμιτικού τοξικότητας και κυτταρικό θάνατο, και ότι ο μηχανισμός αυτός είναι πιθανόν να οφείλεται σε διαταραχή του παλμιτικού συσσώρευσης, με τη μορφή τριγλυκεριδίων και σε μια λιγότερο σημαντική ρευστότητα της μεμβράνης παραλλαγή. Επιπλέον, RSV μειώνει ρίζα είδη οξυγόνου (ROS) σε παλμιτικό-επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά οδηγεί σε δεσμευτική πρωτεΐνη-1 (XBP1) μάτισμα ενισχυμένη X-box και /ΕΒΡ ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP) έκφραση C. Αυτά τα μοριακά αποτελέσματα που επάγονται συγχρόνως σε κασπάση-3 διάσπαση, υποδηλώνοντας ότι RSV προωθεί παλμιτικό lipoapoptosis πρωτίστως μέσω ενός στρες που εξαρτάται μηχανισμός ER. Επιπλέον, η επάνοδος λιποτοξικότητος που προκαλείται από το εικοσαπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) ή με έναν υποδοχέα του ήπατος Χ (LXR) αγωνιστής ενισχύει την υπόθεση ότι η RSV μεσολάβηση αναστολή της παλμιτικό διοχέτευση σε πισίνες τριγλυκεριδίων θα μπορούσε να είναι ένας βασικός παράγοντας για την επιδείνωση του παλμιτικού που προκαλείται κυτταροτοξικότητα.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η RSV ασκεί κυτταροτοξικά ρόλο της στα καρκινικά κύτταρα εκτίθενται σε κορεσμένα πλαίσιο FA κυρίως από τριγλυκερίδια αναστολή της συσσώρευσης, πιθανώς οδηγώντας σε ενδοκυτταρική παλμιτικό συσσώρευσης που προκαλεί ένα λιπίδιο μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, αυτό το κυτταρικό θάνατο προωθείται από ER στρες μέσω μιας αποπτωτική διαδικασία CHOP μεσολάβηση και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή αντικαρκινική στρατηγική

Παράθεση:. Rojas C, Pan-Καστίγιο Β, Valls C, Pujadas G, Garcia-Vallvé S, Arola L, et al. (2014) Η ρεσβερατρόλη Ενισχύει Παλμιτική-Induced στρες ER και απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (12): e113929. doi: 10.1371 /journal.pone.0113929

Επιμέλεια: Guillermo Velasco, Πανεπιστήμιο Complutense, Ισπανία

Ελήφθη: 14η Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 3 του Νοεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 Δεκέμβρη, 2014

Copyright: © 2014 Rojas et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό reserach υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ministerio de Educación y Επιστημών της ισπανικής Αυτοδιοίκησης (AGL2008-00387 /ALI και AGL2011-25831 /ALI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Λιποκύτταρα έχουν μια μοναδική ικανότητα να αποθηκεύει περίσσεια λιπαρών οξέων (FAS) με τη μορφή τριγλυκεριδίων σε σταγονίδια λιπιδίων, ενώ τα μη λιπώδεις ιστούς, όπως το ήπαρ, έχουν περιορισμένη ικανότητα για την αποθήκευση λιπιδίων. Μια υπερφόρτωση του Fas επάγουν λιποτοξικότητος και θάνατο κυττάρου σε μη λιπώδη κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων καρδιομυοκύτταρα, β-κύτταρα και ηπατοκύτταρα [1] – [4]. Υψηλές δόσεις κορεσμένου ΕΧΟ, όπως παλμιτικό, μπορεί να προκαλέσει κυτταρική βλάβη και ακόμη και θάνατο των κυττάρων, ενώ αυξημένες συγκεντρώσεις του ελαϊκού και λινελαϊκό, τα οποία είναι ακόρεστα ΕΧΟ, είναι καλύτερα ανεκτές [1], [2]. Παρά το γεγονός ότι οι λεπτομερείς μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω FA-επαγόμενη λιποτοξικότητος παραμένουν ασαφή, είναι γενικά αποδεκτό ότι αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) του στρες είναι τα κύρια ενδοκυττάρια μηχανισμούς που εμπλέκονται [4] – [8].

η ER είναι η κύρια περιοχή στο κελί για την αναδίπλωση των πρωτεϊνών και του λαθρεμπορίου, και πολλές κυτταρικές λειτουργίες εξαρτώνται από αυτό το διαμέρισμα. Η αποτυχία της προσαρμοστικής ικανότητας του ER είναι ορίζεται ως ER στρες, και τα κύτταρα εμφανίζουν διάφορες αντιδράσεις προσαρμογής για την ανακούφιση της κατάστασης αυτής. Η εκτυλίχθηκε απάντηση πρωτεΐνης (UPR) είναι η κύρια προσαρμοστική απόκριση σε ER στρες και διασταυρώνεται με πολλές διαφορετικές φλεγμονώδεις και το στρες σηματοδότηση μονοπατιών [9], [10]. Παρακολούθηση του αυλού ER και σηματοδότηση μέσω των κανονικών κλάδους της UPR διαμεσολαβούνται από τις ακόλουθες συνδεδεμένες με μεμβράνη πρωτεΐνες τρία ER: (α) PERK (PKR-όπως ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης 2α κινάση)? (Β) IRE1 (ινοσιτόλη απαιτώντας ένζυμο 1)? και (γ) ATF6 (ενεργοποιώντας μεταγραφή παράγοντας-6). Όταν ER στρες δεν έχει επιλυθεί, το κύτταρο είναι λειτουργικά σε κίνδυνο και μπορεί να υφίστανται απόπτωση. Επί του παρόντος, αρκετές οδοί έχουν ενοχοποιηθεί άμεσα σε ER στρες απόπτωση. Για παράδειγμα, ο παράγοντας μεταγραφής C /EBP ομόλογη πρωτεΐνη (CHOP) επάγεται από ER στρες στο μεταγραφικό επίπεδο, η οποία ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε απόπτωση με προς τα κάτω ρύθμιση των Β-κυττάρων λεμφώματος 2 (Bcl-2) και την ενεργοποίηση του GADD34 και ERO1α [11], [12]. ER στρες ενεργοποιεί επίσης IRE1 και PERK, τα οποία έχουν εμπλακεί στην ενεργοποίηση της προ-αποπτωτικών c-Jun NH

2-τερματικής κινάσης (JNK) [13], [14].

Αρκετές αναφορές έχουν μελετήσει τη σχέση μεταξύ της ρεσβερατρόλης (RSV) επιπτώσεις (σε προστατευτικά ή κυτταροτοξικά αποτελέσματά της) και ER στρες παράγοντες ως νέων μοριακών στόχων που σχετίζονται με τη δράση των πολυφαινολών [15] – [18]. Επιπλέον, πολλοί

in vitro

και

in vivo

μελέτες έχουν επίσης δείξει μια προστατευτική επίδραση του RSV και άλλων πολυφαινολών στη συσσώρευση λίπους στο ήπαρ που προκαλούνται από κορεσμένα ΕΧΟ ή μια δίαιτα υψηλή σε λιπαρά [19] – [22]. Εκτός από αυτές τις προστατευτικές επιδράσεις, RSV είναι ικανή να αναστείλει την έναρξη του όγκου, την προώθηση και την εξέλιξη σε μια ποικιλία συστημάτων κυτταρικής καλλιέργειας και ζωικών μοντέλων με μηχανισμούς που περιλαμβάνονται διακοπή του κυτταρικού κύκλου, η αναστολή της κινάσης οδών και την ενεργοποίηση της απόπτωσης [23] – [26].

είναι ενδιαφέρον, μεταβολικές αλλοιώσεις, που χαρακτηρίζεται από αυξημένη γλυκόλυση και λιπογένεσης, είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων [27], [28]. Ως εκ τούτου, πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα ενεργά παρούσα όχι μόνο ποσοτικές αλλαγές σε

de novo

λιπίδιο βιοσύνθεσης αλλά και τροποποιήσεις στη σύνθεση των λιπιδίων της μεμβράνης, που επηρεάζουν τη ρευστότητα της μεμβράνης, μεταγωγή σήματος και γονιδιακή έκφραση [29], [30]. Μια ευρεία ποικιλία καρκίνων παρούσας αλλαγές στη σύνθεση των λιπιδίων της μεμβράνης, η οποία χαρακτηρίζεται κυρίως από κορεσμένα FA και μονοακόρεστα συσσώρευση FA. Αυτή η συσσώρευση φαίνεται να είναι λιγότερο οφείλεται σε αυξημένη πρόσληψη κορεσμένων ΕΧΟ και μονοακόρεστα ΕΧΟ από το να επιδεινωθεί η σύνθεση της ενδογενούς ΕΧΟ [31], [32].

Επιπλέον, κορεσμένα και ακόρεστα ΕΧΟ διαφέρουν σημαντικά ως προς τη συμβολή τους στην λιποτοξικότητος. Προηγούμενες μελέτες με πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων και κυτταρικές σειρές καρκίνου έχουν προτείνει ότι λιποτοξικότητος από τη συσσώρευση μακράς αλύσου ΕΧΟ είναι ειδικό για κορεσμένη FAS. Αυτή η επιλεκτικότητα έχει αποδοθεί στην παραγωγή συγκεκριμένων ειδών προαποπτωτικών λιπίδιο ή μόρια σηματοδότησης σε απόκριση σε κορεσμένα αλλά όχι ακόρεστο ΕΧΟ [33]. Η φύση αυτών των σημάτων μπορεί να διαφέρει κατά μήκος των κυτταρικών τύπων, αλλά περιλαμβάνει την παραγωγή ROS,

de novo

κηραμιδίου σύνθεση, παραγωγή νιτρικού οξειδίου, μειώνεται σε φωσφατιδυλινοσιτόλη-3-κινάση, και πρωτογενείς επιπτώσεις στη μιτοχονδριακή δομή και λειτουργία. Long ΕΧΟ αλυσίδα μπορεί επίσης να καταστείλει την καταπολέμηση αποπτωτικών παραγόντων, όπως η Bcl-2 [33].

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η απομείωση RSV της υπερβολικής συσσώρευσης λίπους που προκαλείται από αυξημένα κορεσμένα ΕΧΟ θα μπορούσε να διαμεσολαβείται εν μέρει από τη μείωση του ER αντίδραση στο στρες, μπορούμε πειραματικά επαγόμενη ER στρες χρησιμοποιώντας παλμιτικό σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές, με ή χωρίς RSV. Απροσδόκητα, υπο-τοξικά επίπεδα RSV (25 μΜ) δεν διασώθηκε κύτταρα από παλμιτικό επαγόμενη ER-στρες και lipoapoptosis. Σε αντίθεση, λάβαμε τα ακόλουθα: (α) ένα διαμεσολαβείται RSV απόπτωση μόνο παρουσία του κορεσμένου FA, και (β) μια ισχυρή προώθηση της λιποτοξικότητος από την ταυτόχρονη αύξηση του ποσού FA. Εμείς χαρακτηρίζεται αυτό το αποτέλεσμα RSV σε μοριακό επίπεδο και διαπίστωσε ότι η στεαροϋλ-ΟοΑ 1 (SCD 1) ρόλο (εμπλουτισμός μη κορεσμού) είναι πιθανόν σχετίζονται με αυτό το κυτταρικό «φαινότυπος», αλλά κυρίως παλμιτικό αποθήκευσης τριγλυκεριδίων πισίνες φαίνεται να εμπλέκεται κριτικά το υψηλότερη ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στον παλμιτικό επαγόμενη λιποτοξικότητος. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν μια σχετικά άγνωστη κυτταροτοξική μηχανισμό RSV που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν με στόχο την προώθηση της απόπτωσης σε μετασχηματισμένα κύτταρα.

Αποτελέσματα

RSV προκαλεί ER στρες στα κύτταρα HepG2

Το σχήμα 1 δείχνει ότι τα κύτταρα HepG2 εκτεθειμένα σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις RSV (που κυμαίνονται από 5 έως 100 μΜ) για διάφορες διάρκειες (4, 8 και 24 ώρες) έχουν μεταβολές στην ομοιόσταση ER, κατά συνέπεια παρουσιάζοντας ενεργούς μηχανισμούς ER στρες. Η λεπτομερής αποτέλεσμα σε δέσμευση X-box πρωτεΐνη-1 (XBP1) μάτισμα και ψιλοκόψτε έκφραση αξιολογήθηκε (σχήμα 1Α και 1Β). Η μέγιστη αύξηση στην XBP1 μάτισμα (σχεδόν όλο το XBP1 στο ματισμένο μορφή) και στην έκφραση CHOP (51.29 ± 4.81 φορές αλλαγή? Ρ & lt? 0.001) ήταν σε μια συγκέντρωση 100 μΜ RSV και 24 h επώαση. Αν και το στρες ER στις 24 ώρες είναι προφανές, υπάρχει μια έλλειψη συσχετισμού με τη βιωσιμότητα του κυττάρου, γεγονός που υποδηλώνει ότι αν και το κύτταρο είναι κοντά σε αποτυχία λόγω της δυσλειτουργίας ER, παραμένει βιώσιμο? η μείωση της βιωσιμότητας εμφανίζεται μετά από 24 ώρες θεραπείας RSV (σχήμα 1C) με μία τιμή -40% σε 28 h (ρ & lt? 0.001). Σημειώστε ότι η επιλεγμένη συγκέντρωση RSV (25 μΜ) χρησιμοποιήθηκαν σε περαιτέρω πειράματα δεν ήταν σε θέση να επάγει σημαντική στρες ER σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο.

HepG2 κύτταρα εκτέθηκαν σε όχημα (0 μΜ) ή αύξουσες συγκεντρώσεις RSV (5, 10 , 25, 50 και 100 μΜ) και συλλέχθηκαν σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία (8, 4 και 24 ώρες). Α) RSV ασκεί χρόνο και τη συγκέντρωση εξαρτώμενη ενεργοποίηση του XBP1 ματίσματος (XBP1 μη ματισμένου-197 bp αμπλικόνιο? XBP1 μάτισμα 171 bp αμπλικόνιο). Αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων Β) RSV πειράματα ασκεί χρόνο και τη συγκέντρωση εξαρτώμενη ενεργοποίηση της έκφρασης CHOP. Γ) RSV μειώνεται βιωσιμότητα HepG2 σε υψηλότερες δόσεις και χρόνους επώασης. Η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα) αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni: *** ρ & lt? 0.001 και * ρ & lt? 0,05

Η

RSV επιδεινώνει παλμιτικό επαγόμενη. κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα HepG2

παλμιτική-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (εκφραζόμενη ως μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα) αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ στα κύτταρα HepG2. Η επίδραση RSV επί παλμιτική-επεξεργασμένα κύτταρα αξιολογήθηκε επίσης. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (που κυμαίνεται από 0.2 mM έως 1 mM) προκάλεσε χρόνου (4, 8 και 24 ώρες) και εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Όταν τα κύτταρα παλμιτικό επεξεργασμένα συν-επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις RSV (που κυμαίνεται από 25 μΜ έως 100 μΜ), περαιτέρω μείωση της βιωσιμότητας HepG2 παρατηρήθηκε. Αυτή η επίδραση ήταν περισσότερο εμφανής στα 50 μΜ (-60% μέγιστη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας? Ρ & lt? 0.001) και 100 μΜ (~ 80% μέγιστη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας? Ρ & lt? 0.001) θεραπείες RSV στις 24 ώρες συν-επώασης (σχήμα 2Β-D). Λόγω της έλλειψης ενός προσθέτου επίδραση της συγκέντρωσης 25 μΜ RSV σε παλμιτικό-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (~ 20% μέγιστη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας? Ns), επιλέχθηκε η συγκέντρωση αυτή να μελετηθεί περαιτέρω η επίδραση του RSV για την ER στρες και τη σχέση της με συσσώρευση λίπους που προκαλείται από αυξημένα FAS.

παλμιτική-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (που εκφράζεται ως το ποσοστό κυτταρικής βιωσιμότητας) αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ σε κύτταρα HepG2. Η επίδραση RSV επί παλμιτική-επεξεργασμένα κύτταρα αξιολογήθηκε επίσης. Α) αύξηση της παλμιτικής συγκεντρώσεις (που κυμαίνονται από 0,2 mM έως 1 mM) προκάλεσε χρόνου (4, 8 και 24 ώρες) και μείωση εξαρτώμενη από τη δόση στην κυτταρική βιωσιμότητα. κύτταρα παλμιτική-αγωγή ήταν επίσης συν-επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του RSV ως ακολούθως: Β) 25 μΜ RSV? Γ) 50 μΜ RSV και D) 100 μMRSV. Μια περαιτέρω μείωση στις HepG2 βιωσιμότητα σε σύγκριση με τις θεραπείες με παλμιτικό μόνος παρατηρήθηκε στο 50 μΜ RSV και 100 μΜ δοκιμασίες RSV. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα) αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni: *** ρ & lt? 0.001 και * ρ & lt? 0,05

Η

RSV αυξάνει παλμιτικό επαγόμενη. ER στρες στα καρκινικά κύτταρα

Η συμβολή της ER στρες σε παλμιτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται αρχικά διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας XBP1 splicing ως δείκτης ER στρες. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι μια υπο-τοξική συγκέντρωση RSV (25 μΜ) προκάλεσε μια ταυτόχρονη αύξηση στην επίδραση παλμιτικό επί XBP1 ματίσματος. Για να επιβεβαιώσετε περαιτέρω τα αποτελέσματά μας, μελετήσαμε άλλους δείκτες ER στρες, όπως ATF4, ATF6 και ψιλοκόψτε. Είναι ενδιαφέρον ότι η επίδραση RSV παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 3Β) σε CHOP (17,03 ± 0,01 έναντι 8,91 ± 0,65? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη αλλαγή φορές ήταν μεταξύ του RSV επεξεργασμένο και οι μη-επεξεργασμένα δείγματα) έκφραση και ATF4 (3,13 ± 0,35 έναντι 1,7 ± 0,09? ρ & lt? 0,01? η μέγιστη αλλαγή φορές ήταν μεταξύ του RSV επεξεργασμένο και οι μη-επεξεργασμένα δείγματα). Το αποτέλεσμα ήταν παλμιτικό-εξαρτώμενη, υποδεικνύοντας ότι αν και η ίδια συγκέντρωση πολυφαινολών ήταν παρόν, το ερέθισμα που προώθησε μια μεγέθυνση των μοριακών επιπτώσεων για σχεδόν όλους τους μελετήθηκαν δεικτών στρες ER ήταν η ανύψωση FA.

κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με ή χωρίς 25 μΜ RSV για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0,25, 0,5, 0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Α) μάτισμα XBP1. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Β) ATF4, CHOP και τα επίπεδα έκφρασης ATF6 mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. κύτταρα HeLa πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με ή χωρίς 25 μΜ RSV για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0,25, 0,5, 0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Γ) Η ευαισθησία των κυττάρων HeLa σε παλμιτικό προκαλούμενη στρες ER. XBP1 μάτισμα. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Δ) RSV επιδεινώνει παλμιτικό επαγόμενη μάτισμα σε κύτταρα HeLa. XBP1 μάτισμα. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται Ε) RSV ενισχύει CHOP μεσολαβούμενη σηματοδότηση. επίπεδα έκφρασης CHOP mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα) αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni:. *** Ρ & lt? 0.001 και ** ρ & lt? 0,01

Η

ATF6 ήταν η μόνη σπούδασε δείκτη ER άγχος που φάνηκε να επηρεάζεται από τη θεραπεία. Ωστόσο, ATF6 μετατόπιση στη συσκευή Golgi απαιτείται για την ενεργοποίηση του? Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι η έκφρασή του παραμένει αμετάβλητη.

Σε παγκόσμιο επίπεδο, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RSV προωθούνται αλλαγές σε αρκετά μοριακούς μηχανισμούς που επιδεινώνεται όταν η ποσότητα του παλμιτικού αυξηθεί.

Είναι αξιοσημείωτο ότι η ίδια πειραματικό αποτέλεσμα ελήφθη όταν ένα άλλο κυτταρική σειρά καρκίνου, κύτταρα HeLa, χρησιμοποιήθηκε (σχήματα 3C, 3D και 3Ε). Αυτό υποδηλώνει ότι αυτή η επίδραση δεν περιορίζεται σε μια συγκεκριμένη καρκινική κυτταρική σειρά.

RSV ευαισθητοποιεί κύτταρα HepG2 να παλμιτική-επαγόμενη απόπτωση

Για να αξιολογηθεί η επίδραση του RSV σε παλμιτικό lipoapoptosis, αναπτύξαμε Western blotting δοκιμασίες του διασπασμένη κασπάση-3. Η προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών κασπάσης-3 συντίθεται ως ένα ανενεργό προένζυμο (32 kDa) που υποβάλλονται σε επεξεργασία σε κύτταρα που υφίστανται απόπτωση με αυτο-πρωτεόλυση ή /και η διάσπαση από άλλο ανάντη πρωτεάσης. Η επεξεργασμένη μορφή της κασπάσης-3 αποτελείται από μεγάλο (17 kDa) και μικρό (12 kDa) υπομονάδες οι οποίες συνδέονται για να σχηματίσουν ένα δραστικό ένζυμο. Η δραστική κασπάση-3 πρωτεολυτικά διασπά και ενεργοποιεί άλλες κασπάσες και σχετικούς στόχους στα κύτταρα, όπως PARP και DFF [34].

Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι οι θεραπείες παλμιτικό επάγεται μόνο μια μικρή αύξηση της κασπάσης-3 διάσπαση σε υψηλότερες δόσεις (0,75 και 1 mM). Όταν προστέθηκε RSV, αντί της μείωσης του αποπτωτικών επίπεδο, προώθησε την lipoapoptotic επίδραση του παλμιτικού. Έτσι, RSV συν-θεραπεία που προκαλείται από τα ακόλουθα: (α) αύξηση της κασπάσης-3 διάσπασης σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρήθηκε με παλμιτικό μόνο? και (β) μείωση του κορεσμένου όριο συγκέντρωσης FA που απαιτείται για να προκαλέσει την αποπτωτική δράση (δηλαδή, 0,5 mM παλμιτικό έναντι 0,5 mM παλμιτικό 25 μΜ RSV).

κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ και μεταφέρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με ή χωρίς 25 μΜ RSV για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0,25, 0,5, 0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Α) Διασπασμένη κασπάση-3 ανάλυση με κηλίδωση Western. Η κηλίδα εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Β) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς 25 μΜ RSV για 28 ώρες. Πριν από ένα 8 h παλμιτική-RSV συν-θεραπεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με DCFH-DA (20 μΜ τελική συγκέντρωση) στους 37 ° C για 30 λεπτά. παραγωγή ROS εμφανίζεται ως η μέση τιμή της RFU (σχετικός φθορισμός Μονάδες) ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα ή παλμιτικό) αναλύθηκαν με t-τεστ του Student ζευγών. *** P & lt? 0.001, ** p & lt? 0.01 και * ρ & lt?. 0.05

Η

παραγωγή ROS μειώνεται κατά RSV σε παλμιτικό επεξεργασμένα κύτταρα HepG2

Η συμβολή του οξειδωτικού στρες σε παλμιτικό-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο ερευνήθηκε με ανίχνευση της παραγωγής ROS. Για την ανίχνευση αυτή, μετρήθηκε το φθορίζον σήμα μετά ενδοκυτταρική οξείδωση με ROS (όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ρίζα υδροξυλίου) της μεμβράνης διαπερατό βαφή 2 ‘, 7’-διχλωρο-διυδρο-φλουορεσκεΐνη διοξεικό (DCFH-DA). Το Σχήμα 4Β δείχνει ότι η καλλιέργεια των κυττάρων HepG2 με αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (που κυμαίνεται από 0.2 mM έως 1 mM) για 8 ώρες προκάλεσε αύξηση του σήματος φθορισμού (1026 ± 104 έναντι 3294 ± 61? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ τα μη-επεξεργασμένα δείγματα και τα παλμιτικό κατεργασμένα δείγματα). Προηγούμενο επωάσεις με 25 μΜ RSV για 20 ώρες μείωσε την ποσότητα της ενδοκυτταρικής ROS σε όλες τις δοκιμασμένες παλμιτικό δόσεις (2478 ± 36 vs. 1222 ± 108? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ του παλμιτικού κατεργασμένων δειγμάτων και την RSV + παλμιτικό επεξεργασμένα δείγματα). Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει την καθιερωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα της πολυφαινόλης [35] και υποδηλώνει ότι οι προαναφερθείσες συνέπειες RSV που συνδέονται με την επιδείνωση της επίδρασης παλμιτικό επί κυττάρων HepG2 δεν είναι κατά κύριο λόγο οφείλεται στην αύξηση της ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS.

η δυναμική SCD1 μεταβάλλεται σε απόκριση προς RSV

έχει προηγουμένως δειχθεί ότι μεταξύ των διατροφικών ερεθίσματα που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου SCD 1, τα κορεσμένα λίπη ήταν ισχυρές ενεργοποιητές. Σε καλλιεργημένα μυοσωληνάρια, παλμιτικό αυξημένη έκφραση της SCD 1 σχετίζεται με την αύξηση των μυών αποθήκευση FA [36]. Το Σχήμα 5Α δείχνει ότι 8 ώρες επεξεργασίας με αυξανόμενη παλμιτικό συγκεντρώσεις προκάλεσε μια σημαντική υπερέκφραση του SCD 1 σε υψηλότερες παλμιτικό δόσεις (1 ± 0,14 έναντι 2,21 ± 0,52? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη αλλαγή φορές ήταν μεταξύ του παλμιτικού αγωγή και τα μη επεξεργασμένα δείγματα ). Σε αντίθεση, όταν τα κύτταρα HepG2 ήσαν προ-θεραπεία για 20 ώρες με RSV, SCD1 υπερέκφραση μειώθηκαν σημαντικά, γεγονός που υποδηλώνει ότι RSV βλάπτει την παλμιτική-επαγόμενη αύξηση της έκφρασης SCD 1 (2,21 ± 0,52 έναντι 0,7 ± 0,12? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ των δειγμάτων αγωγή παλμιτικό και το RSV + παλμιτικού κατεργασμένα δείγματα). Αντιστρόφως, μια μικρή μείωση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη ελήφθη όταν SCD 1 μελετήθηκε σε επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 5Β). Αυτή η έλλειψη συσχέτισης μεταξύ του mRNA SCD1 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης υποδηλώνει ότι παράγοντες (μετα-μεταφραστική παράγοντες, ενζυματική δραστικότητα ρύθμιση), εκτός από την έκφραση του γονιδίου θα μπορούσε επίσης να είναι σημαντική για τη δυναμική SCD1 σε απόκριση προς RSV. Λόγω αυτής της διαφοράς, έχουμε αναπτύξει siRNA νοκ ντάουν πειράματα για να αποσαφηνίσει το ρόλο της SCD 1 στο RSV που προκαλείται ER στρες. έκφραση SCD 1 μειώθηκαν σημαντικά λόγω siRNA επιμόλυνση (σχήμα S1 Α). Τα κύρια επίπεδα αναστολής ελήφθησαν σε συγκέντρωση 10 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας siRNA- (3) ή χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό από τα τρία siRNA ολιγονουκλεοτίδια siRNA- (1, 2, και 3). Κατά συνέπεια, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες SCD 1 (σχήμα S1B) μειώθηκε επίσης σημαντικά λόγω αυτής της πειραματική προσέγγιση. Μόλις το νοκ ντάουν SCD 1 ελέγχθηκε, μελετήθηκε η επίδραση του γονιδίου αυτού αποσιώπηση σχετικά με τους μηχανισμούς ER στρες χρησιμοποιώντας XBP1 μάτισμα ως δείκτης ER στρες. Είναι ενδιαφέρον, όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως από άλλους συγγραφείς [37], SCD1 αναστολή ενεργοποιημένου XBP1 ματίσματος (σχήμα S1c), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση των μη-κορεσμό της μεμβράνης θα μπορούσε να προκαλέσει ER-στρες και του κυτταρικού θανάτου. Έχουμε επιλέξει siRNA (3), και ο συνδυασμός των τριών siRNA ολιγονουκλεοτίδια siRNA- (1, 2, και 3) για να μελετηθεί περαιτέρω η επίδραση της αναστολής SCD 1 σε ένα κορεσμένο πλαίσιο FA (θεραπεία παλμιτικό). Απροσδόκητα, αμφότερα το siRNA αποσιώπηση προσεγγίσεις (σχήματα 5C) έδειξε ότι η μετέπειτα έκθεση του παλμιτικού σε πειραματικά SCD 1-εξαντλημένο κύτταρα δεν επιδείνωσε XBP1 μάτισμα? Αντιστρόφως, με την παρουσία του παλμιτικού, αυτό μάτισμα ήταν ελαφρά μειωμένη. Για να επιβεβαιώσετε ότι αυτή κυτταρικό φαινότυπο δεν οφειλόταν σε μια υποθετική «επιτακτικό» της στρατηγικής της φίμωσης, μελετήσαμε την έκφραση της SCD 1 φορά siRNA- (3) μετασκευάστηκε. Η θεραπεία παλμιτικό δεν ήταν σε θέση να αντιστρέψει το γενετικό καταστολή SCD1 (σχήμα 5D). Ως εκ τούτου, όπως συζητείται παρακάτω, άλλες αντισταθμιστικοί μηχανισμοί που προωθείται από την αναστολή της SCD 1. θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τη σχετική μείωση του ματίσματος XBP1. Επιπλέον, το σχήμα 5Ε δείχνει ότι τα επίπεδα CHOP ελαφρώς αυξημένη, λόγω της SCD-1 αναστολής, υποδεικνύοντας ότι παρά τη σχετική μείωση στην XBP1 μάτισμα, άλλους αισθητήρες του ER στρες, όπως ATF6 ή PERK, θα μπορούσαν να επηρεάζουν την έκφραση CHOP. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτή η αύξηση CHOP δεν είναι συγκρίσιμη με εκείνη που λαμβάνεται προηγουμένως με την RSV + παλμιτικό αγωγές (Σχήμα 3Β).

κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με ή χωρίς 25 μΜ RSV για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0,25, 0,5, 0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Α) τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SCD1. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης SCD 1. Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα των τριπλών ανοσοστυπωμάτων ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο γράφημα αντιπροσωπεύουν την αναλογία του SCD1 /τουμπουλίνης. Ένα αντιπροσωπευτικό ανοσοστύπωμα παρουσιάζεται κάτω από το γράφημα. . Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα ή παλμιτικό) αναλύθηκαν με t-τεστ ζευγών του Student για έκφραση της SCD 1 mRNA και με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni για τον ποσοτικό προσδιορισμό κηλίδος Western *** ρ & lt? 0.001, ** p & lt? 0.01 και * ρ & lt? 0,05. SCD1 knockdown (C) προκαλεί XBP1 μάτισμα αλλά αυτό ματίσματος μειώνεται όταν εξαντλούνται κύτταρα SCD1 εκτίθενται σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Δ) Η μείωση XBP1 μάτισμα σε siRNA + παλμιτικό κύτταρα δεν οφείλεται στην αποκατάσταση SCD1. Το ποσοστό της σχετικής γονιδιακής έκφρασης SCD1 δείχνεται. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Ε) SCD1 σίγηση προωθεί μια μικρή αύξηση της έκφρασης CHOP. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

αναστολή RSV του παλμιτικού συσσώρευση σε πισίνες τριγλυκεριδίων συσχετίζεται με την αύξηση του CHOP και XBP-1 μάτισμα

για να φωτιστούν άλλες μοριακό μηχανισμό δυνατόν RSV που προωθεί την έξαρση της ER στρες που προέρχεται από την απόπτωση, εστιάσαμε την προσοχή μας σε συσσώρευση τριγλυκεριδίων.

τριγλυκεριδίων αποθήκευσης αξιολογήθηκε με χρώση κόκκινου O πετρελαίου. Το Σχήμα 6Α δείχνει ότι η θεραπεία παλμιτικό 8 ώρες προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην HepG2 περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια (0.643 ± 0.006 έναντι 0.994 ± 0.015? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ των μη επεξεργασμένων δειγμάτων και ο παλμιτικό κατεργασμένα δείγματα). Αντίθετα, όταν κύτταρα προεπωάστηκαν για 20 ώρες με RSV, η περιεκτικότητα σε ενδοκυτταρικά λιπίδια μειώθηκε σε όλες τις δοκιμασμένες παλμιτικό συγκεντρώσεις (0,951 ± 0,068 έναντι 0,774 ± 0,011? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ ο παλμιτικό κατεργασμένων δειγμάτων και η RSV + παλμιτικό κατεργασμένα δείγματα). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σύμφωνα με το συσσωρευμένο

in vitro

και

in vivo

απόδειξη της αντι-αδιπογονική επίδραση του RSV [38], [39].

κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με ή χωρίς 25 μΜ RSV για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0,25, 0,5, 0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Α) Λάδι κόκκινο ποσοτικοποίηση χρώση O. Τριγλυκεριδίων συσσώρευση εκφράζεται ως η μέση τιμή της OD (οπτική πυκνότητα) ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Για τις σταθερές συγκεντρώσεις του RSV, τα κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με ένα όχημα (0,1% αιθανόλη), 5, 10, 25, 50 ή 100 μΜ RSV και μία σταθερή συγκέντρωση του παλμιτικού ( 0.25 mM) για 24 ώρες. Β) ποσοτικός προσδιορισμός χρώσης με ερυθρό έλαιο Ο. Τριγλυκεριδίων συσσώρευση εκφράζεται ως η μέση τιμή της OD (οπτική πυκνότητα) ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα) και 0,25 mM παλμιτικό αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni: *** ρ & lt? 0.001. Γ) τα επίπεδα έκφρασης CHOP mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Σημαντικές διαφορές σε σχέση με το μάρτυρα (όχημα) αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni: *** ρ & lt? 0.001 και ** ρ & lt? 0,01. Δ) μάτισμα XBP1. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται.

Η

Επιπλέον, έχουμε αναπτύξει διάφορα πειράματα στην οποία καθορίζεται η συγκέντρωση παλμιτικό (0,25 mM) και εκτέθηκαν σε κύτταρα HepG2 αυξανόμενες συγκεντρώσεις RSV. Αξίζει να σημειωθεί, RSV ήταν σε θέση να μειώσει τριγλυκεριδίων συσσώρευση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 6Β). Παρά αυτήν την μείωση στη συσσώρευση τριγλυκεριδίων, υπήρξε μια ταυτόχρονη ενεργοποίηση ενός πρωτεύοντος συστατικού στρες ER, όπως XBP1 μάτισμα και την ER-παράγοντα προερχόμενο CHOP κατάντη αποπτωτική (Σχήμα 6C και 6D). Αυτό το αποτέλεσμα υποδήλωσε έντονα ότι, παρά την αρχική ευεργετική επίδραση του RSV στη μείωση της συσσώρευσης των τριγλυκεριδίων, υπήρχε ένα κατώφλι του RSV που προκαλείται αναστολή της συσσώρευσης λιπιδίων (25 μΜ RSV) ότι, όταν επιτευχθεί, ενεργοποίησε το ER στρες που προέρχεται από την απόπτωση που επάγεται από παλμιτικό. Ως εκ τούτου, φαίνεται ότι, αν και η ρυθμιστική ικανότητα του παλμιτικού από το κύτταρο αναστέλλεται από RSV (κυρίως από το γνωστό ανασταλτικό αποτέλεσμα RSV του SREBP1c), όταν αυτή η αναστολή είναι υπερβολικά ισχυρή /συνεχής, η ποσότητα του εναπομένοντος παλμιτικό στο εσωτερικό του κυττάρων θα αυξήσει και να προωθήσει τις βλαβερές συνέπειες του κορεσμένου FA (παλμιτικό που προκαλείται ER στρες και την απόπτωση).

επαναφορά των επιπτώσεων RSV λόγω συν-θεραπείες με εικοσιπεντανοϊκό οξύ (EPA) και του υποδοχέα του ήπατος Χ ( LXR) αγωνιστής (TO-901317)

για να εξεταστεί περαιτέρω αν η επαγωγή ER στρες σε RSV + κύτταρα παλμιτικό επεξεργασμένο οφείλεται σε μεταβολές στην ικανότητα επεξεργασίας παλμιτικό του κυττάρου, έχουμε αναπτύξει τις ακόλουθες δύο πειραματικές προσεγγίσεις: ( α) πολυακόρεστο λιπαρό οξύ (PUFA) συμπλήρωση (θεραπεία με ΕΡΑ σε δύο αυξανόμενες συγκεντρώσεις) και (β) την κατεργασία με αγωνιστή LXR (προσθήκη TO-901317 για την τόνωση της έκφρασης SCD1). Εντυπωσιακά, το σχήμα 7C δείχνει ότι η συμπλήρωση των δύο συγκεντρώσεων EPA διασωθεί κύτταρα HepG2 από την αποπτωτική διαδικασία (μειωμένα επίπεδα διασπασμένη κασπάση 3 σε σύγκριση με RSV + παλμιτικό). Αυτή η μειωμένη στάθμη του αποπτωτικού παράγοντα συσχετίζεται με μία μείωση στην XBP1 ματίσματος (σχήμα 7Α) και CHOP έκφρασης (Σχήμα 7Β) (16,54 ± 2,16 έναντι 6,27 ± 0,67? Ρ & lt? 0,001? Η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ του RSV + παλμιτικό κατεργασμένων δειγμάτων και ο RSV + παλμιτικό + EPA επεξεργασμένα δείγματα), γεγονός που υποδηλώνει την αποκατάσταση της λειτουργίας ER.

κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με ένα όχημα (0,1% αιθανόλη), 25 μΜ RSV, 50 μΜ ΥΠΠ ή 100 μΜ EPA για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0, 0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Α) μάτισμα XBP1. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων παρουσιάζεται. Β) Τα επίπεδα έκφρασης CHOP mRNA. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος της πτυχής μεταβολή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Γ) Η σχάση επίπεδο κασπάσης-3 προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Η κηλίδα εμφανίζεται είναι αντιπροσωπευτική εικόνα των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Σημαντικές διαφορές αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni: *** ρ & lt? 0.001 και ** ρ & lt? 0,01

Η

Εναλλακτικά, κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με δύο συγκεντρώσεις (1 μΜ. και 10 μΜ) του αγωνιστή LXR TO-901317 έδειξαν αυξημένη πρωτεΐνη SCD 1 και τα επίπεδα mRNA (σχήμα S2A και S2B). Επιπλέον, το Σχήμα 8 δείχνει ότι η θεραπεία αγωνιστή διορθωθεί επίσης τα αποτελέσματα προωθούνται από παλμιτικό και ενεργοποιείται από RSV. Για παράδειγμα, η θεραπεία αγωνιστή διόρθωσε την αύξηση της διάσπασης κασπάσης-3 (Σχήμα 8Α) και ανακαλούνται οι επιπτώσεις στην ER στρες (Σχήμα 8Β και 8C) σε XBP1 και στην έκφραση CHOP (4,43 ± 0,26 έναντι 1,67 ± 0,26? Ρ & lt? 0.001? η μέγιστη διαφορά ήταν μεταξύ του RSV + παλμιτικό επεξεργασία δειγμάτων και των δειγμάτων κατεργάστηκε RSV + παλμιτικό + TO-901317)

κύτταρα HepG2 πλύθηκαν δύο φορές σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό και μεταφέρονται σε μέσο ελεύθερο ορού με. οχήματα (0,05% αιθανόλη και 0.1% DMSO) και 25 μΜ RSV ή 10 mm έως-901317 για 28 ώρες? 8 ώρες πριν από το τέλος του πειράματος, αυξανόμενες συγκεντρώσεις παλμιτικού (0,75 και 1 mM) προστέθηκαν στο αντίστοιχο φρεάτιο. Α) μάτισμα XBP1. (XBP1 μη ματισμένου-197 bp amplicon? XBP1 συγκολλημένα-171 bp αμπλικόνιο).