Abstract

καρκίνο καχεξίας είναι μια σύνθετη μεταβολική πάθηση που χαρακτηρίζεται από την προοδευτική απώλεια του σωματικού λίπους και την υποβάθμιση της μυϊκής μάζας. Αν και οι κυτταρικοί και μοριακοί μηχανισμοί της καχεξίας είναι ελλιπώς κατανοητές, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μιτοχονδριακή δυσλειτουργία σε μοντέλα ποντικών της καχεξίας καρκίνου. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τη μεταβολική μετατόπιση στον καρκίνο που προκαλείται από καχεξία, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της ενισχυμένης οξειδωτικής ικανότητας για μυϊκής απώλειας χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γάμμα συνενεργοποιητή-1α (PGC-1α) σε σκελετικό μυ σε ένα Lewis πνεύμονα καρκίνωμα-εμφυτεύεται μοντέλο. Αυξημένη μιτοχονδριακό βιογένεση παρατηρήθηκε στον σκελετικό μυ των ποντικών με όγκο εμφυτεύεται. Ωστόσο, οι αυξήσεις αυτές δεν εμποδίζουν ή να αντιστρέψει την απώλεια μυϊκής μάζας σε ποντίκια που φέρουν όγκους. Επιπλέον, το μέγεθος του όγκου ήταν αυξημένη σε μυς PGC-1α υπερεκφράζουν ποντικούς. Βρήκαμε παρόμοια επίπεδα των κυκλοφορούντων φλεγμονωδών κυτοκινών σε όγκο ζώα εμφυτεύονται, το οποίο δεν επηρεάζεται από την αυξημένη μυϊκή έκφραση του PGC-1α. Τα δεδομένα μας έδειξε ότι η αυξημένη μιτοχονδριακή βιογένεση σε σκελετικό μυ δεν επαρκεί για να διασώσει σχετίζονται με όγκους, οξεία απώλεια μυών, και θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου, ενδεχομένως μέσω της απελευθέρωσης του myokines

Παράθεση:. Wang Χ, Pickrell ΑΜ, Zimmers TA, Moraes CT (2012) αύξηση της μυϊκής μιτοχονδριακή βιογένεση δεν εμποδίζει Μυϊκή Απώλεια αλλά Αυξημένη Tumor Μέγεθος σε ένα μοντέλο ποντικού της οξείας Καρκίνου-Induced καχεξία. PLoS ONE 7 (3): e33426. doi: 10.1371 /journal.pone.0033426

Επιμέλεια: Antoni Λ Andreu, Νοσοκομείο Vall d’Hebron, Ισπανία

Ελήφθη: 28 Νοέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 12η Φεβρουαρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 12 Μάρτη του 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας και η μυϊκή δυστροφία Association. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κλινικά, η καχεξία ορίζεται ως «μια σύνθετη μεταβολικό σύνδρομο σχετίζεται με υποκείμενη ασθένεια και χαρακτηρίζεται από απώλεια της μυϊκής με ή χωρίς απώλεια της λιπώδους μάζας» [1]. Έχει βρεθεί σε πολλές χρόνιες ή τελικού σταδίου ασθένειες όπως το AIDS, η φυματίωση, και τον καρκίνο [2]. Έως και 50% των ασθενών με καρκίνο χωρίς θεραπεία βιώνουν προοδευτική απώλεια λίπους και άλιπης μάζας σώματος, χωρίς πείνα, ένα πολύπλοκο σύνδρομο που αναφέρεται ως καρκίνος που προκαλείται από καχεξία [3]. Η παρουσία της σπατάλης συνδέεται συνήθως με δυσανεξία στη θεραπεία, κακή ποιότητα ζωής και την υψηλή θνησιμότητα σε ασθενείς [4].

Παρά το γεγονός ότι έχουν εκτεταμένες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, οι υποκείμενοι μηχανισμοί που προκαλούν καχεξία του καρκίνου είναι δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Ένας από τους κορυφαίους θεωριών είναι ότι οι παράγοντες που προέρχονται από όγκους είναι υπεύθυνα για την αποδόμηση της μάζας του σώματος, συμπεριλαμβανομένου του μυός [2]. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες διαδραματίζουν βασικό ρόλο σε όλες τις οδούς που οδηγούν σε υπερ καταβολισμό και την απώλεια βάρους που σχετίζεται με τον καρκίνο καχεξία [5]. Η παρουσία της συστηματικής φλεγμονής συνήθως συνδέεται με χειρότερη πρόγνωση σε ασθενείς [6].

καχεξία του καρκίνου προκαλεί συστημικές αλλαγές στο μεταβολικό προφίλ των ασθενών, προκειμένου να υποστηρίξει την ανάπτυξη των όγκων. Έχει αναφερθεί ότι δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων σε σκελετικό μυ, συμπεριλαμβανομένης μειωμένης οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) ικανότητα και διαταράσσεται μιτοχονδριακή δυναμική, εμπλέκεται με συστηματική φλεγμονή και σκελετικό μυ σπατάλη [7]. Το ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχείς (PPARs) παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας και διαμορφωτή PPAR-γ συν-ενεργοποιητή-1α τους (PGC-1α) είναι ο κύριος ρυθμιστές της μιτοχονδριακής βιογένεσης και του μεταβολισμού της ενέργειας [8]. Οι Μιτοχονδριακή αποσύνδεσης πρωτεΐνες (UCPs) 1, 2, και 3 αυξορρυθμίζεται ατροφούν μυ? και μεταβολική ανωμαλία με αυξημένη πρωτεόλυση στο μυ έχει υπονοηθεί σε καχεκτικούς ασθενείς [9], [10]. Η ενεργοποίηση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών ΤΝΡα επαγόμενη ΝΡ-κΒ έχει δειχθεί ότι μειώνουν μετενεργοποίηση υποκινητή και μεταγραφική δραστικότητα των ρυθμιστικών του μιτοχονδριακού βιογένεσης (PGC-1α, PPARa, και TFAM) και επηρεάζουν κατάντη δείκτες οξειδωτικού (κιτρικό συνθάσης, και κυτόχρωμα

γ

οξειδάση) [11]

Κλινικές παρεμβάσεις έχουν αναπτυχθεί για τη γενική διαχείριση των συμπτωμάτων αυτής της καταστροφικής κατάστασης.? Ωστόσο, τα μέτρα αυτά είναι μόνο παρηγορητική, χωρίς να στοχεύουν ειδικά την πρόκληση παράγοντα της καχεξίας και τα αποτελέσματα δεν είναι ικανοποιητικά [12].

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η πιθανή θεραπευτική επίδραση της αύξησης των μιτοχονδρίων βιογένεση από υπερεκφράζουν PGC-1α στο σκελετικό μυ σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού της καχεξίας καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αύξηση της μιτοχονδριακής βιογένεσης στο μυ δεν ήταν επαρκής για να μεταβάλλουν τα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών και την πρόληψη της απώλειας μυών που σχετίζεται με την εμφύτευση του όγκου. Επιπλέον, η αύξηση της μυϊκής PGC-1α μπορεί επίσης να έχει την παρενέργεια της προώθησης της ανάπτυξης του όγκου.

Αποτελέσματα

Tumor-εμβολιάστηκαν διαγονιδιακά MCK-PGC-1α ποντικούς διατηρούν αυξημένη μιτοχονδριακό βιογένεση σε γαστροκνήμιο και τετρακέφαλο

Τα διαγονιδιακά MCK-PGC-1α ποντικούς υπερεκφράζουν PGC-1α στο σκελετικό μυ, οδηγείται από την κινάση της κρεατίνης των μυών (ΜΟΚ) υποκινητή [13]. Παρατηρήσαμε μια αύξηση του

Ppargc1a

επίπεδα mRNA της 13-φορές στην γαστροκνήμιο, ένα μυ που αποτελείται από παρόμοια επίπεδα Τύπου Ι (οξειδωτική) και II (γλυκολυτικά) ίνες τύπου και 19-πλάσια στον τετρακέφαλο, μια μυς αποτελείται ως επί το πλείστον από ίνες τύπου ΙΙ, σε 4-μηνών άνευ όγκου διαγονιδιακά MCK-PGC-1α ποντικούς (Εικόνα 1Α). Μια παρόμοια αύξηση παρατηρήθηκε για τα ποντίκια που φέρουν όγκο (Σχήμα 1Α). Όταν προσδιορίζεται το σταθερής κατάστασης επίπεδα πρωτεΐνης PGC-1α σε γαστροκνήμιο και τον τετρακέφαλο ομογενοποιήματα, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση σε διαγονιδιακά ποντίκια σε σύγκριση με ελέγχους, με ή χωρίς όγκους. Τα αποτελέσματα για gastrocnemious και τετρακέφαλο ήταν ουσιαστικά ίδιες για τις δύο γονότυπων (Σχήμα 1Β, C και δεν παρουσιάζονται).

A

. επίπεδα του mRNA (ΔΔCt) του

Ppargc1a

σε γαστροκνήμιο και τετρακέφαλο κανονικοποιημένη σε

GAPDH

σε 4 μήνες-of-ηλικία σε MCK-PGC-1α και τους ελέγχους χωρίς και με την εμφύτευση του όγκου (η = 4 /ομάδα).

Β, Γ

. Αριστερό πλαίσιο: Αντιπροσωπευτικά κηλίδωση Western ανάλυση των επιπέδων σταθερής κατάστασης του PGC-1α και μιτοχονδριακών πρωτεϊνών (συγκρότημα II υπομονάδα SDHA, συγκρότημα UQCRC1 υπομονάδα III, και συμπλόκου Ι υπομονάδας NDUFB8) σε 4 μήνες-της-ηλικίας από μυ ομογενοποιήματα του MCK-PGC- 1α και τους ελέγχους. Δεξιά πίνακα: Οπτική πυκνότητα (Ο.Π.) ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών του ενδιαφέροντος κανονικοποιημένη τουμπουλίνης toα (n = 3 /ομάδα στο

Β

, n = 4 /ομάδα στο

C

). Οι ράβδοι σφάλματος είναι μέση τιμή ± SEM.

Η

PGC-1α είναι ένα μεταγραφικό συνενεργοποιητή που ρυθμίζει προς τα πάνω τη μεταγραφή του πυρηνικού κωδικοποιημένα μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, την τόνωση μιτοχονδριακή βιογένεση [14], [15], [16]. Εμείς ποσοτικοποιούνται τα επίπεδα μιτοχονδριακών πρωτεϊνών σε 4-μηνών MCK-PGC-1αmice και βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα αρκετών δεικτών μιτοχονδριακής σε ποντικούς χωρίς ή με όγκους (Σχήμα 1Β και 1Γ). Τα επίπεδα του mtDNA τόσο γαστροκνήμιο και τον τετρακέφαλο ήταν αυξημένα σε PGC-1α που εκφράζουν ποντικούς (Σχήμα 2Α). Σε συμφωνία με τα σημάδια αυξημένης μιτοχονδριακή βιογένεση, παρατηρήσαμε σημαντικές αυξήσεις στην κιτρική συνθάση (CS) και κυτόχρωμα

γ

οξειδάση (COX) δραστηριότητες τόσο στο γαστροκνήμιο και τετρακέφαλο (Σχήμα 2Β, C).

A.

αριθμού αντιγράφων mtDNA του γαστροκνημίου και τετρακέφαλο του 4-μηνών-old MCK-PGC-1α και άγριου τύπου ποντίκια, χωρίς και με την εμφύτευση του όγκου (η = 5 /ομάδα).

Β-Γ.

COX και CS ενζυματική δραστηριότητα του γαστροκνημίου (

Β

) και τετρακέφαλο (

C

) των μυών ομογενοποιημένων κανονικοποίηση ως προς την πρωτεΐνη από όγκο MCK-PGC-1α και ελέγχους της ίδιας ηλικίας (η = 5 /ομάδα).

D-E.

Επίπεδα mRNA (ΔΔCt) του

PPARγ και

,

PPARg

,

Ppard

, και

Ppargc1b ​​

στο γαστροκνήμιο (

D

) και τετρακέφαλο (

E

) κανονικοποιημένη στο

GAPDH

σε 4-μηνών-old όγκου MCK-PGC1-α και ηλικίας-μάρτυρες (n = 4 /ομάδα). Οι ράβδοι σφάλματος είναι μέση τιμή ± SEM.

Η

Είναι ενδιαφέρον, έχουμε παρατηρήσει μια διαφορική ρύθμιση ενός άλλου μέλους της οικογένειας PGC-1, PGC-1β στο γαστροκνήμιο και τετρακέφαλο στον όγκο εμβολιασμένα ζώα. Ενώ παρέμεινε αμετάβλητη στον ιστό γαστροκνήμιο,

Ppargc1b ​​

mRNA επίπεδα μειώθηκαν σημαντικά σε τετρακέφαλο ιστού που φέρουν όγκο MCK-PGC-1αmice (Σχήμα 2D, E). Κατά συνέπεια, τα επίπεδα έκφρασης παραγόντων μεταγραφής

PPARγ και

και

PPARg

ήταν σημαντικά αυξημένα σε γαστροκνήμιο αλλά όχι σε τετρακέφαλο μυ (Σχήμα 2D, E).

Η υπερέκφραση του MCK-PGC-1αdoes δεν προστατεύουν από τον καρκίνο που προκαλείται από απώλεια μυών

Προηγουμένως, το εργαστήριο μας έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του PGC-1αin σκελετικών μυών προστατεύεται και επιβράδυνε την εξέλιξη των μιτοχονδριακών μυοπαθειών και την ηλικία που προκαλείται σαρκοπενία [17 ], [18]. Υποθέσαμε ότι με την αύξηση της λειτουργίας των μιτοχονδρίων, MCK-PGC-1α ποντίκια μας θα είναι πιο ανθεκτικά σε απώλεια μυϊκής μάζας αντιστρέφοντας τις μεταβολικές αλλαγές που συμβάλλουν στην καχεξία.

Μετά την επιβεβαίωση αυτή ισχυρή ενίσχυση στη μιτοχονδριακή βιογένεση, εξετάσαμε αν πάνω -έκφραση PGC-1α θα μπορούσε να παρέχει προστασία έναντι της απώλειας των μυών σε ογκογόνο μοντέλο μας. Ακολουθήσαμε το βάρος των MCK-PGC-1α και άγριου τύπου ποντίκια, με ή χωρίς όγκο, ως δείκτης της γενικής υγείας μετά τον εμβολιασμό καρκινικών κυττάρων. Δεν παρατηρήσαμε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων μέχρι μετά την ένεση την ημέρα-12 και -13, όπου MCK-PGC-1α όγκους ποντίκια είχαν σημαντική αύξηση στο ποσοστό σωματικού βάρους σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες 3 ποντικών (Σχήμα 3Α).

Α.

Ποσοστό σωματικού βάρους πάνω από δύο εβδομάδες μετά καρκινικών κυττάρων ή ένεση φυσιολογικού ορού για MCK-PGC-1α ή ελέγχους σε 4 μήνες-της-ηλικίας, ο αριθμός των ζώων, όπως επισημαίνεται.

Β. Ποσοστό

χωρίς όγκο σωματικού βάρους σε 2 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του όγκου του MCK-PGC-1α και τους ελέγχους της ίδιας ηλικίας, ο αριθμός των ζώων, όπως στο πάνελ

A

.

C.

Βάρος όγκου (γραμμάρια) που εξάγεται από θέση έγχυσης 2 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του όγκου (η = 5 για άγριου-τύπου, η = 7 για MCK-PGC-1α).

D.

Σχέση μοντελοποίηση Γραμμική παλινδρόμηση μεταξύ των μεταβολών σε ποσοστό του σωματικού βάρους και του βάρους του όγκου του MCK-PGC-1α και τους ελέγχους που φέρουν όγκο ίδιας ηλικίας, ο αριθμός των ζώων, όπως στο πάνελ

C

.

E.

Βάρος γαστροκνημίου και τετρακέφαλο (γραμμάρια) φυσιολογικό ορό και οι ομάδες του όγκου εμβολιάσθηκαν του MCK-PGC-1α ή ποντίκια άγριου τύπου της ίδιας ηλικίας, ο αριθμός των ζώων, όπως στο πάνελ

A

.

F.

Συγκεντρώσεις ορού IL-6 στον έλεγχο και άγριου τύπου που φέρουν όγκο και MCK-PGC-1α ποντίκια (η = 5 /ομάδα). Οι ράβδοι σφάλματος είναι μέση τιμή ± SEM.

Η

Για να καταλάβετε, όπου η αύξηση του σωματικού βάρους για τα ποντίκια MCK-PGC-1α όγκου προήλθε από, εξετάσαμε το βάρος του σώματος και εξάγεται το βάρος του όγκου. Βρήκαμε ότι χωρίς όγκο σωματικό βάρος μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια που φέρουν όγκο των δύο γονότυπων, και δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαγονιδιακών και ποντικούς άγριου-τύπου (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, οι όγκοι που εξάγονται από MCK- PGC-1α ποντικοί ήταν περίπου 50% μεγαλύτερο από τους ελέγχους (Σχήμα 3C). Όταν τετμημένη τις αλλαγές του σωματικού βάρους κατά το μέγεθος του όγκου, σημειώσαμε μία θετική συσχέτιση σε ποντικούς άγριου τύπου, η οποία διαταράχθηκε σε MCK-PGC-1α όγκους ποντίκια (Σχήμα 3D). Με αυτά τα στοιχεία, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η συνολική αύξηση του σωματικού βάρους για τον όγκο που φέρει MCK-PGC-1α ποντικών που προκαλείται από την αύξηση της μάζας του όγκου και όχι ένα κέρδος σε βάρος των μυών. Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι μεγαλύτερους όγκους, MCK-PGC-1α ποντίκια δεν χάνουν περισσότερο βάρος από ό, τι οι έλεγχοι που φέρουν όγκο.

Τα βάρη των δύο γαστροκνήμιο και τετρακέφαλο ήταν ήπια, αλλά μειώθηκαν σημαντικά σε όγκο ποντίκια άγριου τύπου, υποδεικνύοντας επαγόμενη μοντέλο απώλεια μυών μας (Σχήμα 3Ε). Ωστόσο, δεν υπήρχε διαφορά στις δύο μυϊκή ομάδα σε σύγκριση μεταξύ του όγκου εμβολιάσθηκαν διαγονιδιακών και ποντικών άγριου τύπου (Σχήμα 3Ε). Έχουμε ποσοτικοποιείται επίσης τη συγκέντρωση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών IL-6 στον ορό. Όπως αναμενόταν, η IL-6 επίπεδα ήταν δραματικά αυξημένη σε ποντίκια που φέρουν όγκο των δύο γονότυπων σε σύγκριση με τα ποντίκια χωρίς όγκο, αλλά δεν βρήκαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο γονότυπων (Σχήμα 3F). Έτσι, MCK-PGC-1α δεν φαίνεται να προστατεύει από την απώλεια των μυών ή να μειώσει συστημικών IL-6 επίπεδα σε αυτό το τελικό σημείο.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε MCK-PGC- μοντέλο ποντικού 1α για τη μελέτη της επίδρασης της αυξημένης μιτοχονδριακού βιογένεσης για τον καρκίνο που προκαλείται από απώλεια μυών. Βρήκαμε αυξημένη μιτοχονδριακή βιογένεση στον μυ του MCK-PGC-1α ποντίκια όγκου σε σύγκριση με τα ποντίκια όγκου WT. Αναπάντεχα, βρήκαμε ότι η αυξημένη έκφραση του PGC-1α σε μυς δεν εμπόδισε απώλεια μυϊκού ιστού. Αυτό ήταν ένα απροσδόκητο αποτέλεσμα, όπως μυϊκή PGC-1α φάνηκε από την ομάδα μας και τους άλλους να παρέχουν ευρεία προστασία σε διάφορες καταστάσεις που σχετίζονται με την μυϊκή εκφύλιση [17], [19].

Αν και τα αίτια της καχεξίας είναι ακόμα ελάχιστα κατανοητή, αυξημένη αποικοδόμηση και μειωμένη σύνθεση των μυϊκών πρωτεϊνών από το σύστημα πρωτεασώματος φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο [20]. Συστηματική φλεγμονή φαίνεται να μεσολαβήσει αυτού του μηχανισμού στον καρκίνο που προκαλείται από καχεξία [5]. Rosenberg και οι συνεργάτες του προτείνει ότι τα υψηλά επίπεδα του TNFa και IL-1β στον ορό ήταν οι αιτίες για την απώλεια βάρους στη ρευματοειδή καχεξία [21]. Συστημική κυτοκίνη με γνώμονα φλεγμονώδη απόκριση σε ασθενείς με AIDS με ταυτόχρονη ενεργές λοιμώξεις έχει επίσης συσχετισθεί με την καχεξία [22]. Το μοντέλο της υποδόριας εμφύτευσης όγκου δείχνει επίσης μια αύξηση στην κυκλοφορούσα IL-6 επίπεδα που σχετίζονται με μυ και συνολική απώλεια σωματικού βάρους. Ωστόσο, στα πειράματα μας τα επίπεδα της IL-6 δεν ήταν διαφορετικά μεταξύ άγριου τύπου και MCK-PGC-1α ποντίκια (Σχήμα 3F). Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι αν και PGC-1α μπορεί να προστατεύσει από την απώλεια των μυών που σχετίζονται με τις εγγενείς μεταβολικές δυσλειτουργίες [17], [19], είναι λιγότερο αποτελεσματική στην απαγορεύει απώλεια μυϊκού ιστού που προκαλείται από εξωγενείς φλεγμονώδη σήματα.

Η MCK- μοντέλο ποντικού PGC-1α έχει μελετηθεί εκτενώς από την ομάδα και τους άλλους μας σε διάφορες μυοπάθειες. Εκτός από το διαγονιδιακό στρατηγική, PGC-1α μπορεί επίσης να προκληθεί από την άσκηση αντοχής [23], [24]. Τόσο αυξημένη μυϊκή έκφραση PGC-1α και η άσκηση έχουν αποδειχθεί ότι βελτιώνει συστηματική φλεγμονή [9], [19], [25]. Ως μέρος των συνδυαστική θεραπεία, άσκηση σύμφωνη με τις φυσικές συνθήκες του ασθενούς είναι συνήθως προτείνεται κατά τη διάρκεια της κλινικής παρέμβασης [26]. Στο μοντέλο μας καρκίνου που προκαλείται από καχεξία πειραματόζωα πεθαίνουν μέσα σε 2 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Τα ποντίκια ανέπτυξαν ήπια απώλεια μυϊκού ιστού μέσα σε ένα χρονικό διάστημα 13 ημερών με ο όγκος που εμφανίζεται ήδη από την 5η ημέρα μετά τον εμβολιασμό. Αν και PGC-1α υπερέκφραση δεν βελτιώνουν την ήπια απώλεια μυός σε οξείες ογκογόνα μοντέλο μας, πιστεύουμε μελλοντικά πειράματα θα πρέπει να εξετάσει την πιθανή θεραπευτική επίδραση της αυξημένης μιτοχονδριακού βιογένεσης σε πιο σοβαρές ή χρόνιες μοντέλα καρκίνου που προκαλείται απώλεια μυϊκής μάζας.

Αν και ο λόγος για αυτό το αρνητικό αποτέλεσμα δεν είναι γνωστή, βρήκαμε επίσης ότι οι όγκοι ήταν περίπου 50% μεγαλύτερο σε ποντικούς που υπερεκφράζουν μυς PGC-1α. Μια πιθανή εξήγηση για αυτήν την παρατήρηση είναι ότι σκελετικό μυ μπορεί να εκκρίνει myokines, όπως IL-6, οι οποίες θα μπορούσαν να έχουν την προώθηση της ανάπτυξης δραστικότητα [27]. Αυτή ήταν μια αναμενόμενη παρατήρηση που δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση με διαφορετικά είδη όγκων και τα μοντέλα.

Εν ολίγοις, το έργο μας έδειξε ότι διεγείρει μιτοχονδριακή βιογένεση δεν ήταν αρκετή για να αποτρέψει ή να αντιστρέψει την απώλεια μυϊκού ιστού κατά τη διάρκεια της οξείας καρκίνου που προκαλείται απώλεια μυϊκής μάζας. Επιπλέον, βρήκαμε αποδείξεις ότι η PGC-1α έκφρασης στους μύες μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη μεγαλύτερων όγκων.

Μέθοδοι

Ζώα

Η γενιά του MCK-PGC-1α διαγονιδιακά ποντίκια περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Θηλυκά ζώα για ανάλυση ήταν καθαρό C57BL /6J MCK-PGC-1α ποντίκια με την ηλικία-μάρτυρες της ίδιας γέννας. Όλες οι διαδικασίες ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι: Θεσμικές Φροντίδα Ζώων και Επιτροπής Χρήση (# 10-071). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε έναν ιό-αντιγόνου-free εγκατάσταση στο Πανεπιστήμιο του Μαϊάμι: Διεύθυνση Κτηνιατρικής Δυναμικού στο πλαίσιο ενός σκότους /12 ωρών φωτός σε θερμοκρασία δωματίου και τροφοδοτείται

κατά βούληση

με τυπική δίαιτα τρωκτικών. Το τελικό σημείο της μελέτης ορίστηκε όταν η φυσική κατάσταση για περισσότερο από το 50% των υπόλοιπα ποντίκια που φέρουν όγκο αξιολογήθηκε ως κρίσιμη και ευθανασία μέσα σε 24 ώρες.

ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών

Θηλυκά άγριου τύπου ποντικούς και MCK-PGC-1α διαγονιδιακά νεογνά (η = 8 /ομάδα) σε 4 μήνα ηλικίας ενέθηκαν υποδορίως με 10

6 Lewis κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα σε 100 μι στείρο έκδοχο, αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), μεταξύ της ωμοπλάτες. Οι έλεγχοι εγχύθηκαν με τον ίδιο τρόπο και σε θέση με PBS (η = 7 για ποντικούς άγριου τύπου, η = 5 για MCK-PGC-1α ποντίκια). Τα βάρη των ζώων καταγράφηκαν και η γενική υγεία τους παρακολουθούνταν καθημερινά μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Τα άτομα που θεωρούνται σε κακή κατάσταση μπορεί να επιβιώσει έως ότου υποβλήθηκαν σε ευθανασία το τελικό σημείο της μελέτης και αποκλείονται από περαιτέρω ανάλυση.

Φασματοφωτόμετρο Αναλύσεις

δοκιμασίες OXPHOS εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, ομογενοποιήματα από τετρακέφαλο και γαστροκνήμιος παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή ιστού (Omni) σε PBS συν κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) επί πάγου. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 800 g για 5 λεπτά και το υπερκείμενο του ομογενοποιημένου προστέθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 10 mM ΚΗ

2PO4, 1 mg /mL BSA, 120 mM λαουρύλ maltoside, και 2 mM κυτοχρώματος

γ

ανάγεται με υδροθειώδες νάτριο σε. Τα μίγματα παρακολουθήθηκαν στα 550 nm με την ανάγνωση της απορρόφησης λαμβάνονται κάθε 11 δευτερόλεπτα για την 2 λεπτά στους 37 ° C. 240 μΜ κυανιούχο κάλιο χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλει την αντίδραση να εξασφαλιστεί κλίση ήταν ειδική για το κυτόχρωμα

γ

οξειδάση (COX). Οι κλίσεις ομαλοποιήθηκαν με συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται με δοκιμασία Bradford.

Για την δοκιμασία δραστικότητας κιτρική συνθάση (CS), τα υπερκείμενα προστέθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 50 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 20 mM ακετυλο CoA, 10 mM 5, 5′-διθειοδις- (2-νιτροβενζοϊκό οξύ), και 0.1% Triton Χ-100. Η δοκιμασία διεξήχθη στους 30 ° C με 50 mM οξαλοξικού (ΟΞΟ) για να ξεκινήσει η αντίδραση. Αναγνώσεις λήφθηκαν κάθε 11 δευτερόλεπτα για την 3 λεπτά. Οι πλαγιές που λαμβάνονται πριν από την προσθήκη OXA εξήχθησαν από την πλαγιά με OXA. Εξομάλυνση ήταν όπως παραπάνω.

Απομόνωση mRNA και ανάστροφης μεταγραφάσης PCR

αποτεμνηθέντες τετρακέφαλο και γαστροκνήμιο μυ ιστοί βυθίστηκαν σε TRIzol® (Sigma /Invitrogen). Οι ιστοί ομογενοποιούνται με χειρός στροφείο ομογενοποιητή (VWR), και το RNA εκχυλίστηκε με διαχωρισμό φάσεων χλωροφορμίου. Χρησιμοποιήσαμε 1 μg RNA για την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA iScript σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BioRad).

Real-time PCR

Maxima SYBR Green /ROX qPCR μάστερ μιξ (Fermentas) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για την εκτέλεση πραγματικού χρόνου PCR. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισμό του cDNA ήταν τα εξής:

Ppargc1a

(5′-CTGCGGGATGATGGAGACA, 5′-AGCAGCGAAAGCGTCACA),

Ppargc1b ​​

(5′-TGGCCCAGATACACTGACTATG, 5′-TGGGCCTCTTTCAGTAAGCT),

PPARγ και

(5′-TTCCCTGTTTGTGGCTGCTAT, 5′-CCCTCCTGCAACTTCTCAATGTAG),

PPARg

(5′-CGGAAGCCCTTTGGTGACTTTA, 5′-GCGGTCTCCACTGAGAATAATGAC),

Ppard

(5′-ACCGCAACAAGTGTCAGTAC, 5′ CTCCGGCATCCGTCCAAAG), και

GAPDH

(5′-TGCACCACCAACTGCTTAG, 5′-GGATGCAGGGATGATGTTC)

Τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του αριθμού αντιγράφων mtDNA σε ολικό DNA (που εξάγεται με φαινόλη.: χλωροφόρμιο διαχωρισμού φάσης):

ND1

(5′-CAGCCTGACCCATAGCCATA, 5′-ATTCTCCTTCTGTCAGGTCGAA),

Actb

(5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG). Συγκριτική μέθοδος Ct χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική αφθονία των γονιδίων ενδιαφέροντος ή mtDNA [29].

Western Blotting Ανάλυση

εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από τετρακέφαλο και τους μυς του γαστροκνημίου που ομογενοποιήθηκαν με ένα χειρός δρομέα (VWR) σε PBS που περιέχει κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Roche). Τα δείγματα στη συνέχεια καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται σε -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Κατά τη χρήση, ομογενοποιήματα αραιώθηκαν 1:10 με ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (62.5 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0,25% SDS, 1 mM EDTA, με αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης προστέθηκε προσφάτως) και επεξεργασία με υπερήχους εν ολίγοις. Τα ομογενοποιήματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 15.000 χ g και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Οι πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford. Ίση ποσότητα πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε ένα πήκτωμα 4-20% SDS-πολυακρυλαμιδίου βαθμίδος (BioRad). Το πήκτωμα στυπώθηκε σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) (BioRad).

Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε Οδύσσεια διάλυμα αποκλεισμού (LI-COR Biosciences) σε αραίωση 1:01 με PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν OXPHOS τρωκτικών κοκτέιλ (Mitosciences), α-τουμπουλίνης (Sigma), PGC1-α (Santa Cruz), SDHA (Mitosciences), β-ακτίνης (Sigma), κυτόχρωμα

γ

(Mitosciences), πορίνη (Mitosciences), και UQCRC1 (Mitosciences). Πρωτογενής αντίσωμα επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν είτε υπέρυθρη συζευγμένα αντισώματα αντι-κουνελιού-700 ή αντι-ποντικού-800 (Rockland) σε συγκεντρώσεις κατασκευαστή προτείνεται. Δευτερεύοντα αντισώματα επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες με υπέρυθρες δευτερογενή αντισώματα απεικονίστηκαν με την Οδύσσεια Infrared System απεικόνισης (LI-COR Biosciences). μετρήσεις οπτικής πυκνότητας ελήφθησαν με τη χρήση του λογισμικού Gel-Pro Analyzer.

Διάδρομος

Endurance αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα διάδρομο έξι λωρίδων με κίνητρο δίκτυο σχεδιασμένο για τρωκτικά (Columbus Instruments). Τα ζώα γίνεται μία μέρα κατάρτιση για να προσαρμοστούν στον εξοπλισμό και το κίνητρο πλέγμα. Την ημέρα της δοκιμής, οι ποντικοί που απαιτείται για να τρέξει με ταχύτητα 8 m /min για 5 λεπτά και ο αριθμός των πίπτει επί του πλέγματος κίνητρο καταγράφηκε για κάθε ποντικό.

Serum IL-6 ποσοτικοποιήσεις

ελήφθη αίμα από την αριστερή κοιλία της βαθιά αναισθητοποιημένων ποντικών πριν ευθανασία. Το αίμα αφέθηκε να πήξει επί πάγου, και ο ορός απομονώθηκε σε 1,000 Χ g σε επιτραπέζια συσκευή φυγοκεντρίσεως (Eppendorf 5424) επί 15 λεπτά στους 4 ° C. Ένα επιπλέον βήμα φυγοκέντρηση του ορού στα 10.000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C διεξήχθη για πλήρη αφαίρεση των αιμοπεταλίων. Ο ορός χρησιμοποιήθηκε σε BD κιτ κυτταρομετρικής συστοιχίας σφαιριδίων κυτοκίνης φλεγμονή ποντίκι σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Biosciences). Τα δείγματα αναλύθηκαν σε αναλυτή κυττάρων BD LSRFortessa (BD Biosciences).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσοι όροι ± STDEV. Σημασία των διαφορών εκτιμήθηκε με 2-way ANOVA που ακολουθείται από Bonferroni μετα-τεστ για πειράματα με περισσότερες από 2 ομάδες ή με unpaired Student t-test μεταξύ 2 ομάδων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05 (*), 0,001 & lt? P & lt? 0.01 (**), p & lt?. 0.001 (***)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Μπρους M. Spiegelman για την παροχή της διαγονιδιακό MCK-PGC-1α ποντικοί που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.