Αφηρημένο

Εισαγωγή

Πολλές αντι-αγγειογενετική παράγοντες αναπτύσσεται αυτή τη στιγμή για τον περιορισμό του όγκου ανάπτυξη και μετάσταση. Ενώ αυτά τα φάρμακα προσφέρουν ελπίδα για ασθενείς με καρκίνο, παροδική επίδραση τους στην περιοχή αγγείωσης του όγκου είναι δύσκολο να εκτιμηθεί σε κλινικές ρυθμίσεις. endomicroscopy Ομοεστιακή λέιζερ (CLE) είναι μια νέα ενδοσκοπική τεχνολογία απεικόνισης που επιτρέπει ιστολογική εξέταση του γαστρεντερικού βλεννογόνου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της σκοπιμότητας της χρήσης CLE στην εικόνα του αγγειακού δικτύου σε φρέσκο ​​βιοψίες ανθρώπινου ορθοκολικού ιστού. Για το σκοπό αυτό έχουμε απεικονιστεί δείγματα φυσιολογικών και κακοηθών βιοψία ιστού και σύγκριση των παραμέτρων αγγειακό δίκτυο που λαμβάνεται με CLE με καθιερωμένες τεχνικές ιστοπαθολογία.

Υλικά και Μέθοδοι

Φρέσκα μη σταθερών δείγματα βιοψίας τόσο κανονικής και κακοήθεις παχέος βλεννογόνο βάφτηκαν με σημασμένο με φθορισμό αντι-CD31 αντισώματα και απαθανατίστηκε από CLE χρησιμοποιώντας ένα ειδικό σύστημα endomicroscopy. Αντίστοιχη δείγματα βιοψίας υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική χρώση για CD31, την εκτίμηση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD) και αγγειακές περιοχές για τη σύγκριση με τα δεδομένα CLE, τα οποία μετρήθηκαν χωρίς σύνδεση με τη χρήση ειδικού λογισμικού.

Αποτελέσματα

Τα σκάφη απεικονίστηκαν από CLE τόσο φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα. Η μέση διάμετρος των κανονικών σκαφών ήταν 8,5 ± 0,9 μm, ενώ σε δείγματα όγκων ήταν 13,5 ± 0,7 μm (p = 0,0049). Αγγειακή πυκνότητα ήταν 188,7 ± 24,9 σκάφη /mm

2 στο φυσιολογικό ιστό έναντι 242,4 ± 16,1 σκάφη /mm

2 στις παχέος δείγματα καρκίνου (p = 0,1201). Στα δείγματα ανοσοϊστοχημεία, η MVD ήταν 211,2 ± 42,9 /mm

2 και 351,3 ± 39,6 /mm

2 για κανονικά και κακοήθη βλεννογόνο, αντίστοιχα. Η αγγειακή περιοχή ήταν 2,9 ± 0,5% της συνολικής έκτασης του ιστού για την κανονική βλεννογόνο και 8,5 ± 2,1% για την πρωτογενή ορθοκολικό καρκινικό ιστό.

Συμπέρασμα

Η επιλεκτική απεικόνιση των αιμοφόρων αγγείων με CLE είναι εφικτή σε φυσιολογικό και ορθοκολικού όγκου ιστού με τη χρησιμοποίηση φθοριζόντως επισημασμένα αντισώματα που στοχεύουν ενάντια ενδοθηλιακών δείκτη. Η μέθοδος θα μπορούσε να μεταφραστεί σε κλινικό περιβάλλον για την παρακολούθηση της αντι-αγγειογενετική θεραπεία

Παράθεση:. Cârţână Τ, Σαφτόιου Α, Gruionu LG, Gheonea DI, Pirici D, Georgescu CV, et al. (2012) Ομοεστιακή Laser Endomicroscopy για την Μορφομετρική αξιολόγηση μικροαγγείων στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας στοχευμένες αντι-CD31 αντισώματα. PLoS ONE 7 (12): e52815. doi: 10.1371 /journal.pone.0052815

Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10η Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 21 Νοεμ 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Cârţână et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση της έρευνας με τίτλο «Κλινική και Biomathematical Μοντελοποίηση των αγγειακών αλλοιώσεων Μετά αντι-αγγειογενετική θεραπεία σε προχωρημένους ορθοκολικό καρκίνωμα», που χρηματοδοτείται από το Εθνικό Συμβούλιο έρευνας (CNCs), τη Ρουμανία, αριθμός σύμβασης PN-ΙΙ-ID-PCE-2011- 3-0664. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Anti-αγγειογενετική θεραπεία έχει αυξηθεί πρόσφατα αυξανόμενο ενδιαφέρον λόγω των πιθανών επιπτώσεων που σχετίζονται με στοχευμένη θεραπεία και πρόγνωση διαστρωμάτωση για μια ποικιλία των συμπαγών όγκων [1]. Παρ ‘όλα αυτά, η έλευση του νέου αντι-αγγειογενετική μέσα στην ογκολογική κλινική πρακτική έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ενισχυμένη απεικονιστικές μεθόδους για την αξιολόγηση του δικτύου μικροαγγειακή κατά τη διάρκεια της θεραπείας.

Η αγγειογένεση έχει παραδοσιακά αξιολογείται με τη μέτρηση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD ) σε σταθερά ιστό ανοσοχρώση για μια ποικιλία ενδοθηλιακών δεικτών συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα VIII, CD31, CD34 [2], και προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει πυκνότητα μικροαγγειακή (MVD) ως πιθανό παράγοντα πρόγνωση για έναν αριθμό στερεών όγκων. CD31, γνωστό επίσης ως προσκόλληση αιμοπεταλίων ενδοθηλιακών κυττάρων μόριο-1 (PECAM-1) είναι ένα παν-ενδοθηλιακό δείκτη τόσο για μικρά και μεγάλα σκάφη [2]. Μεταξύ των πολλών λειτουργιών του CD31 έχει επίσης σχετίζονται με την ανάπτυξη και μεταστατική εξάπλωση όγκων, που εμπλέκονται στις διαδικασίες της αγγειογένεσης και αγγειακής διαπερατότητας [3].

Ακόμα, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και MVD να εκτιμηθεί η αγγειογένεση στο πλαίσιο των κλινικών δοκιμών έφερε κάποια ηθικά και πρακτικά προβλήματα που σχετίζονται με την επαναλαμβανόμενη συγκομιδή των βιοψιών από ασθενείς [4]. Λειτουργική απεικόνιση της αγγείωσης του όγκου είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση, αλλά τα περισσότερα από τα κλινικά διαθέσιμες τεχνικές απεικόνισης δεν έχουν τη μικροσκοπική ανάλυση που απαιτείται για κλινικές εφαρμογές [5]. Πρόσφατα, endomicroscopy συνεστιακό λέιζερ (CLE) αναπτύχθηκε για την σε πραγματικό χρόνο

in vivo

ιστολογική ανάλυση του βλεννογόνου του εντέρου. Υψηλής ανάλυσης οπτικές τομές στο οριζόντιο επίπεδο των στοχοθετημένων οθόνη ιστού κυτταρικών και υποκυτταρικών λεπτομέρειες κατά τη διάρκεια της εν εξελίξει ενδοσκόπηση [6]. Μία ποικιλία κλινικών εφαρμογών της τεχνικής έχουν ήδη περιγραφεί στις αλλοιώσεις τόσο της άνω και κάτω γαστρεντερικής οδού, με ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην νεοπλασία, όπου CLE δημιουργεί πραγματικό χρόνο ιστολογική διάγνωση και στοχευμένη βιοψίες των σχετικών περιοχών για μια υψηλότερη διαγνωστική απόδοση από τυχαία βιοψίες [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Σε παχέος βλάβες, CLE έχει δείξει μεγάλη ακρίβεια στην ανίχνευση ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία με βάση το πρότυπο της αγγειακής αρχιτεκτονικής του δικτύου και κρύπτη [7].

Σήμερα εγκριθεί παράγοντες αντίθεσης για κλινικές εξετάσεις endomicroscopy περιλαμβάνουν χρωστικές ουσίες με μη συγκεκριμένο ιδιότητες χρώσης, όπως φλουορεσκεΐνη, ακριφλαβίνη ή ιώδες κρεσυλίου [13]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν διεξαχθεί σε ζωικά μοντέλα και δείγματα ανθρώπινου ιστού χρησιμοποιώντας σημασμένο με φθορισμό αντισώματα που επέτρεψε ειδική endomicroscopic απεικόνισης του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και αυξητικό παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) [14], [15], [16] . Με τη χρήση ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη-σημασμένα αντισώματα, CLE ήταν σε θέση να διαφοροποιούν τα επίπεδα έκφρασης του EGFR σε όγκους ξενομοσχεύματος ποντικού και αφέθηκαν διάκριση των ανθρώπινων νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών ορθοκολικό ιστό με βάση πρότυπα έκφρασης EGFR τους [14]. Η ίδια ομάδα απέδειξε ότι η μοριακή απεικόνιση του VEGF είναι εφικτή σε διάφορα μοντέλα τρωκτικών του γαστρεντερικού καρκίνου. Διαφορές μεταξύ της φθορίζουσας ισχύς του σήματος VEGF φυσιολογικών και κακοήθων δείγματα ανθρώπινου ιστού επίσης καταδείχθηκε [15]. Η μοριακή απεικόνιση του EGFR και survivin, ένα απόπτωση ανασταλτική πρωτεΐνη, επιτεύχθηκε επίσης με τον ανιχνευτή που βασίζεται σύστημα CLE σε οισοφαγική και γαστρικό βλεννογόνο του χοίρου μοντέλων [16].

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η σκοπιμότητα του συστήματος CLE για απεικόνιση του αγγειακού δικτύου των ανθρώπινων δειγμάτων ορθοκολικού ιστού και των δύο φυσιολογικών και κακοηθών βλεννογόνο χρησιμοποιώντας σημασμένο με φθορισμό αντι-CD31 αντισώματα. Δεδομένου ότι επί του παρόντος δεν υπάρχουν CD-31 δείκτες που έχουν εγκριθεί για ανθρώπινη χρήση, έχουμε χρησιμοποιήσει την τεχνική απεικόνισης CLE σε φρέσκα μη σταθερών δείγματα ανθρώπινου βιοψίας βάφονται με αντι-CD31 αντισώματα για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι το σύστημα CLE προσφέρει κατάλληλη ανάλυση για την απεικόνιση του όγκου αγγειακό σύστημα και τη συλλογή αγγειακές παραμέτρους παρόμοιες με τις επί του παρόντος αποδεκτές τεχνικές ιστοπαθολογική εξέταση.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Η παρούσα μελέτη σκοπιμότητας πραγματοποιήθηκε σε ενδοσκοπικές βιοψίες ελήφθησαν από τέσσερις ασθενείς με προχωρημένη παχέος αδενοκαρκινώματα, τα οποία διαγνώστηκαν κατά τη διάρκεια της ρουτίνας κολονοσκόπηση διαδικασίες. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε συμβατική λαβίδες βιοψίας δειγματοληψία των ζευγών περιοχών της κανονικής βλεννογόνου του κόλου (που λαμβάνονται τουλάχιστον 10 cm από τον όγκο) και του παχέος μάζας. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Ιατρικής και Φαρμακευτικής του Craiova. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση τους μετά τη λήψη ένα τυποποιημένο έντυπο για τη συλλογή βιοψία μέσω κολονοσκόπησης στην οποία αναφέρεται ότι τα δείγματα βιοψίας αναλύθηκαν περαιτέρω με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές και χρησιμοποιούνται για ερευνητικούς σκοπούς. Οι βιοψίες αναλύθηκαν σύμφωνα με ένα κοινό πρωτόκολλο χρώσης (κάτω) για τα συμβατικά ιστοπαθολογική εξέταση και εξετάσεις CLE μετά από χρώση με ειδικά αντισώματα.

Πρωτόκολλο CLE Ανοσοβαφή

Ένα αντιστοιχισμένο δείγμα φρέσκου ανθρώπινου βιοψίες περίπου 2-3 mm σε διάμετρο συλλέχθηκε κατά την διάρκεια κατώτερη ενδοσκοπικές διαδικασίες τόσο από φυσιολογικών και νεοπλασματικών παχέος βλεννογόνο του κάθε ασθενή και βυθίζεται σε φυσιολογικό ορό. Τα φρέσκα βιοψίες επωάστηκαν στο σκοτάδι με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (IgG 1, κλώνος ΜΕΜ-05, αραίωση 1:10) στρέφεται εναντίον ανθρώπινου CD31 /PECAM-1 (Exbio, Πράγα, Τσεχική Δημοκρατία) και επισημαίνονται με Alexa-Fluor 488 για 1 ώρα στους 37 ° C, και ξεπλένονται με φυσιολογικό ορό για να απομακρυνθεί οποιοδήποτε μη συνδεδεμένο αντιδραστήριο. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και αμέσως απαθανατίστηκε από CLE για αγγειακές δομές. Για τη βελτιστοποίηση της τεχνικής, διάφορες αραιώσεις αντισώματος σε 1% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), που κυμαίνονται από 1:5 να 1:30, είχαν προηγουμένως δοκιμαστεί σε φρέσκα, μη σταθερό δείγματα ιστού και απεικονίζεται με ένα αυτοματοποιημένο μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon 90i, Tokyo, Japan). Ένα χρονικό πλαίσιο περίπου 60 λεπτά που επιτρέπει την πρόσδεση των αντισωμάτων στο στόχο τους και απεικόνισης δείγματος χωρίς υποβάθμιση του ιστού Διαπιστώθηκε επίσης.

CLE Imaging

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα CLE που ενσωματώνει ένα μικροσκοπικό μικροσκόπιο συνεστιακό στο περιφερικό άκρο ενός συμβατικού εύκαμπτο ενδοσκόπιο (ΕΚ-3870 CIFK, Pentax, Tokyo, Japan). Το ομοεστιακό φακός στο περιφερικό άκρο είναι ελαφρά προωθείται έξω από το ενδοσκόπιο, επιτρέποντας στοχευμένη σάρωση των δομών. Κατά τη διάρκεια της σάρωσης, το λέιζερ παραδίδει ένα μήκος κύματος διέγερσης 488 nm με μέγιστη ισχύ εξόδου λέιζερ ≤1 mW στην επιφάνεια του ιστού η οποία ελέγχεται από τον χρήστη κατά την εξέταση για βέλτιστη αντίθεση απεικόνισης. Το μέγιστο βάθος της απεικόνισης είναι 250 μm από την επιφάνεια του βλεννογόνου. Οι προκύπτουσες οπτικές τομές έχουν μια πλευρική ανάλυση του 0,7 μm για 7 μm πάχους φέτα (άξονα Ζ) και ένα οπτικό πεδίο του 475 × 475 μm.

Η endomicroscope τοποθετήθηκε επί ένα σταθερό πλαίσιο και τις βιοψίες τοποθετήθηκαν σε γυάλινα πλακίδια ιστολογία, σε άμεση και απαλή επαφή με το απώτατο άκρο του συνεστιακού λέιζερ endomicroscope. Οι εικόνες συλλήφθηκαν με το πάτημα ενός πεντάλ του διακόπτη ποδιού και ψηφιακά αποθηκευμένα στο σκληρό δίσκο του συστήματος, όπως εικόνες γκρι κλίμακας (150-250 για κάθε δείγμα βιοψίας) για μεταγενέστερη λήψη και την επεξεργασία.

Μετρήσεις αγγειακό δίκτυο

Αναλύσαμε τις εικόνες CLE χρησιμοποιώντας Image J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). Πέντε εικόνες με το ισχυρότερο σήμα φθορισμού και μια καλή εμφάνιση του αγγειακού δικτύου επιλέχθηκαν από κάθε δείγμα ιστού για την ανάλυση των αγγειακών δομών. Για μια πιο σαφή διάκριση των σκαφών, ένα χρώμα επικάλυψη προστέθηκε για να ταιριάζει με το μέσο σκίασης φθορισμού (Σχήμα 1). Το εργαλείο ευθεία γραμμή χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί με το χέρι τη διάμετρο του κάθε αγγειακού τμήματος μεταξύ είτε δύο σημείων διακλάδωσης ή ενός σημείου διακλάδωσης και ένα χαλαρό άκρο. Κάθε αγγειακό τμήμα ονομάστηκε και υπολογίζονται για την αγγειακή πυκνότητα. Τα αποτελέσματα εξήχθησαν σε ένα αρχείο Excel και αναφέρονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SE) για κάθε επέλεξαν εικόνα και μεμονωμένη περίπτωση. Οι μετρήσεις για τη διάμετρο και την αγγειακή πυκνότητα έγιναν ανεξάρτητα από δύο διαφορετικούς φορείς οι οποίοι δεν γνώριζαν τα ευρήματα του άλλου και στην έκθεση παθολογίας. Τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως ο μέσος όρος των δύο μετρήσεων

Στον κανονικό βλεννογόνο, τα σκάφη οργανώνονται σε μια εξαγωνική δίκτυο (Α).? η αντίστοιχη περιοχή στον όγκο δείχνει πιο διεσταλμένες, ακανόνιστου σχήματος σκάφη, με ποικίλες διαμέτρους κατά το μήκος τους (Β)? οι ίδιες οπτικές τομές εμφανίζονται με προστιθέμενη χρώμα επικάλυψης (C, D). * Μπαρ Κλίμακα είναι 50 μm.

Η

Συμβατικά ανοσοϊστοχημική χρώση

δείγματα βιοψίας Ανταποκριτής από όγκους παχέος εντέρου τοποθετήθηκαν σε 4% ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης για τη στερέωση και την εμβάπτιση σε παραφίνη. Συμβατικά διάγνωση παθολογία βασίστηκε στην Η &? Χρώση Ε, ενώ ανοσοϊστοχημική χρώση τομών για CD31 έγινε σύμφωνα με τις ενδείξεις του κατασκευαστή (Dako, Glostrup, Δανία). Εν συντομία, μετά κιτρικό ρυθμιστικό μεσολάβηση ανάκτηση αντιγόνου, οι τομές ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε 1% υπεροξείδιο υδρογόνου. Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS, που ακολουθείται από ένα στάδιο μπλοκαρίσματος 30 λεπτά σε 1% αποβουτυρωμένο γάλα. Το πρωτεύον αντίσωμα αντι-CD31 (IgG1, κλώνος JC70A, αντι-ανθρώπινο ποντικού, Dako, Glostrup, Denmark) προστέθηκε αραιωμένο ως 1:100, και οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα, τα πλακίδια πλύθηκαν, το σήμα ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα υπεροξειδάση-EnVision βάση πολυμερές συγκεκριμένα είδη δευτερεύον σύστημα ανίχνευσης (Dako, Glostrup, Denmark), και στη συνέχεια να ανιχνεύεται με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB, Dako, Glostrup , Δανία). Όλα τα στάδια έκπλυσης έγιναν σε 0.1 Μ PBS, ρΗ 7.2, και το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε PBS με 1% BSA. Όλοι οι χρόνοι επώασης διατηρήθηκαν σταθερές για όλες τις διαφάνειες που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη. Τέλος, τα πλακίδια coversliped μετά την χρώση αιματοξυλίνης.

μικροαγγείων Πυκνότητα (MVD)

Μέτρηση

Όλοι μικροσκοπική ανάλυση εικόνας διεξήχθη με ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse 55I συζευγμένο με ένα MP κάμερα 5 χρώμα CCD ( Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία) και ένα σταθμό ανάλυσης εικόνας με βάση την εικόνα του λογισμικού ProPlus AMS7 (Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA). Προκειμένου να αξιολογηθούν οι MVDs στο CD-31 χρωματισμένο όγκου και ανταποκριτής τμήματα μη καρκινικό ιστό, η μέθοδος hotspot χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Στον ιστό του όγκου, ο χειριστής χρησιμοποίησε τα 10x και 20x στόχους για τον εντοπισμό των «θερμών σημείων», δηλαδή τις περιοχές με την υψηλότερη πυκνότητα αγγειακή. Σε αυτές τις περιοχές τέσσερις παρα τρία τυχαίες εικόνες συλλήφθηκαν υπό την 40x στόχου. Στο φυσιολογικό ιστό τέσσερις παρα τρία τυχαίες εικόνες συλλήφθηκαν υπό την 40x στόχο, εκτός των περιοχών αφθονούν σε μη-βλεννογόνου /φλεγμονωδών κυττάρων.

Οι περιοχές χρώση CD31 αγγειακή που σχετίζονται με (περιοχή ενδιαφέροντος, ROI) σημαδεύτηκαν απ ‘ευθείας πάνω από τις εικόνες από δύο ανεξάρτητους φορείς και να συμπεριληφθούν σκάφη με αναγνωρίσιμα αυλό, καθώς και εφάπαξ ή συστάδες των μη αυλού ενδοθηλιακών κυττάρων. Φλεγμονώδη κύτταρα ανάληψη της ενεργού περιοχής (δηλ πλασμοκύτταρα) και των ερυθρών αιμοσφαιρίων χωρίς χρώση γύρω τους εξαιρέθηκαν. Μια μακροεντολή εντολή στην Εικόνα ProPlus αναπτύχθηκε για να μετρήσει τον αριθμό και τη μέτρηση περιοχές ROI σε κάθε εικόνα, και τα δεδομένα αναφέρθηκε σε ένα αρχείο Excel ως MVD και η αγγειακή περιοχή, αντίστοιχα. Για σύγκριση με άλλα δημοσιευμένα στοιχεία, τόσο για την πυκνότητα των αγγείων CLE και η MVD προσδιορίζεται από την ανοσοϊστοχημεία ήταν κανονικοποιημένα σε mm

2 περιοχή.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε στο Microsoft Office Excel® (Microsoft, Redmond, Washington, USA). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσοι όροι ± SE της μέσης τιμής. Για την μορφομετρική εκτίμηση, έγινε σύγκριση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών αγγείων. Για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών μεταξύ των αγγειακές μετρήσεις, μια two-tailed t-test έγινε με στατιστική σημαντικότητα επιτεύχθηκε σε αξία AP & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η μικροαγγειακή CLE Μοτίβα

Ένα ειδικό σήμα φθορισμού ταυτίστηκε με το πεδίο εφαρμογής CLE σε όλες τις βιοψίες σε φυσιολογικά και νεοπλασματικά δείγματα ιστού. Τα σκάφη σε κανονικές βιοψίες σχημάτισε εξαγωνικό σχήμα με ομοιογενή κατανομή των διαμέτρων χαρακτηριστικό ενός φυσιολογικού βλεννογόνου όπως αυτό περιγράφεται από την επιλεκτική χρώση CD31 (Σχήμα 1Α και 1C). Σε δείγματα όγκων τα σκάφη εμφανίστηκε διεσταλμένες και ακανόνιστο σχήμα σε σύγκριση με το κανονικό βλεννογόνο, με μεταβλητό διαμέτρους κατά το μήκος τους (Εικόνα 1Β και 1 D).

μορφομετρική ανάλυση μικροαγγείων

Τα σκάφη μετρήθηκαν και διαμέτρων τους μετρούμενη μεταξύ δύο αγγειακή διασταυρώσεις, για το σύνολο του οπτικού πεδίου (Σχήμα 2). Η μέση διάμετρος σκάφος σε δείγματα όγκων ήταν 13,5 ± 0,7 μm, σημαντικά υψηλότερη από τη διάμετρο του αγγείου σε κανονικές του παχέως βλεννογόνο (8,5 ± 0,9 μm, p = 0,0049). Η αγγειακή πυκνότητα ήταν 242,4 ± 16,1 σκάφη /mm

2 σε δείγματα καρκινικού ιστού και 188,7 ± 24,9 σκάφη /mm

2 στο φυσιολογικό ιστό (p = 0,1201).

Ένα σκάφος μετρήθηκε και διάμετρος του μετρήθηκε για κάθε αγγειακή τμήμα μεταξύ δύο σημείων διακλάδωσης ή ενός σημείου διακλάδωσης και ένα χαλαρό άκρο. Αγγειακή πυκνότητα αναφέρθηκε ανά mm

2. Τόσο διάμετρο του αγγείου και αγγειακού πυκνότητα αυξήθηκαν στον ιστό του όγκου (Β) σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο (Α). * Μπαρ Κλίμακα είναι 50 μm.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι αντίστοιχες βιοψίες από παρακείμενο ιστό σε βιοψίες CLE ήταν προετοιμασμένοι για την ανοσοϊστοχημική μελέτη με ένα αντίσωμα αντι-CD31 τόσο στα φυσιολογικά όσο και του παχέος δείγματα καρκίνου . Στο κανονικό βλεννογόνο, η MVD ήταν 211,2 ± 42,9, ενώ στην κακοήθη ιστό ήταν 351,3 ± 39,6 /mm

2 (p = 0,0637). Η αγγειακή περιοχή, η οποία υπολογίζεται ως το ποσοστό του ROI σε ολόκληρη την περιοχή της εικόνας, ήταν υψηλότερη στα δείγματα όγκου (8,5 ± 2,1%) σε σύγκριση με την κανονική ορθοκολικό ιστό (2.9 ± 0.5%), p = 0,0735 (Σχήμα 3). Η σύνοψη των αγγειακών παραμέτρων που μετρώνται στα πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο και το αντίστοιχο κανονικό βλεννογόνο, από δείγματα ανοσοϊστοχημεία και CLE, παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.

φωτεινές εικόνες πεδίου του φορμαλίνη και εμβαπτισμένο σε παραφίνη βιοψίες των κανονικών και πρωτοβάθμια παχέος καρκίνο χρώση για CD31 δείχνει: τα αιμοφόρα αγγεία που διανέμονται τακτικά μεταξύ των εντερικών αδένων στο φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου (Α)? πολλαπλές ακανόνιστη σκάφη στην εντός του όγκου στρώμα, σε κακοήθη δείγματα (Β)? οι ίδιες εικόνες με αγγειακές περιοχές που σημειώνονται για την αυτοματοποιημένη μέτρηση (C, D). * μπαρ Κλίμακα είναι 50 μm.

Η

Συζήτηση

Από την αρχική υπόθεση του ρόλου της αγγειογένεση στην πρόοδο του όγκου διατυπώθηκε από τον Ιούδα Folkman πριν από τέσσερις δεκαετίες [18], τα θεμελιώδη κατανόηση της διαδικασίας αυτής έχει προχωρήσει και διάφορα αντι-αγγειογενετική φάρμακα είτε σε κλινική χρήση ή υπό κλινική έρευνα [4]. Παρ ‘όλα αυτά, εξακολουθούν να υπάρχουν πολλά προβλήματα που σχετίζονται με την επιλογή της βέλτιστης δοσολογίας και χρονισμού, πρόβλεψη και παρακολούθηση της ανταπόκρισης των ασθενών που περιορίζουν την χρήση του αντι-αγγειογόνου θεραπείας για τους ασθενείς ογκολογίας. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα CLE ενδοσκόπιο για την εικόνα του αγγειακού μοτίβο από φρέσκα βιοψίες των φυσιολογικών και κακοήθων ορθοκολικού ιστού και συνέκριναν τα αποτελέσματα με τις παραδοσιακές τεχνικές ιστοπαθολογικές.

Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με ιστολογική απεικόνιση των αιμοφόρων λαμβάνονται με CLE εφαρμόζοντας σημασμένο με φθορισμό αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον ενός ενδοθηλιακού δείκτη (CD31). Αυτή η μέθοδος παράγει παρόμοια αποτελέσματα όπως το παραδοσιακό ανοσοϊστοχημεία, αλλά σε φρέσκα μη σταθερό ιστό. Έτσι, οποιαδήποτε τεχνούργημα επεξεργασία των βιοψιών αποφεύγεται και απεικόνιση του ιστού γίνεται στη φυσική του κατάσταση σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά τη συλλογή βιοψία που επιταχύνει σημαντικά τη διαδικασία διάγνωσης. Επιλέξαμε ως μοριακός στόχος μιας παν-ενδοθηλιακό δείκτη για την επισήμανση των φυσιολογικών και καρκινικών αιμοφόρων αγγείων προκειμένου να ληφθεί μία εκτίμηση απόκλιση μορφομετρικές. Με οπτική εξέταση, οι ομοεστιακό οπτικές τομές έδειξαν διαφορές μεταξύ των αγγειακών μοτίβα των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Τα κακοήθη αιμοφόρα αγγεία φαινόταν πιο διεσταλμένες και βασανιστική σχέση με την τακτική εμφάνιση των κανονικών σκαφών. Είναι ένα γνωστό γεγονός ότι τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου είναι ανώμαλη δομή και τη λειτουργία τους. Αυτό φαίνεται επίσης από προηγούμενες ταξινομήσεις CLE νεοπλασίας μετά από ενδοφλέβια χορήγηση φλουορεσκεΐνης [7], [19]. Ωστόσο, αυτή η μη ειδική παράγοντα αντίθεσης τείνει να διαχέεται υπερβολικά εντός του διάμεσου χώρου λόγω της αυξημένης διαπερατότητας των παθολογικών αγγείων. Ως αποτέλεσμα οι αγγειακές σύνορα κρύβονται και ποσοτικές εκτιμήσεις τους γίνεται μια πρόκληση. Στην παρούσα προσέγγιση, η επιλεκτική χρώση των σκαφών με ενδοθηλιακά δείκτη έχει ξεπεραστεί αυτό το μειονέκτημα.

Με τις παραδοσιακές ανοσοϊστοχημική χρώση πρωτόκολλα ο ιστός τυπικά χωρισμένο σε 4 μm πάχους φέτες, οι οποίες σύλληψη μόνο crossections των αιμοφόρων αγγείων σε διαφορετικές γωνίες. Η προτεινόμενη μέθοδος απεικόνισης CLE επιτρέπει την προβολή του συνόλου των αγγειακών τμημάτων στην ίδια εικόνα. Ήμασταν έτσι σε θέση να εκτελέσει μια μορφομετρική ανάλυση των οπτικών τμημάτων ομοεστιακό που ήρθε να επικυρώσει τις ποιοτικές διαφορές που έχουν ήδη σημειωθεί μεταξύ των δύο αγγειακά στρώματα. Βρήκαμε ότι τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου έχουν μια σημαντικά μεγαλύτερη μέση διάμετρο από φυσιολογικά αγγεία (13,5 μm

vs.

8,5 μm, p = 0,0049). Σε δείγματα ιστού από τις περιοχές παχέος καρκίνος, υπήρξε μια αύξηση 28,5% στην αγγειακή πυκνότητα σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο (242,4

vs

. 188.7 δοχεία /mm

2). Μόνο μία παράμετρο (διάμετρος πλοίου) πέτυχε στατιστική σημαντικότητα στη μελέτη μας. Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από το μικρό αριθμό δειγμάτων περιλαμβάνονται στην ανάλυση μας. Οι μελλοντικές μελέτες σε μεγαλύτερο δείγμα ασθενών που χρειάζονται για να επιβεβαιώσουν τα ευρήματα πέρα ​​από την παρούσα απόδειξη σχεδιαστική μελέτη.

Τα αγγειακή παράμετροι που λαμβάνονται με CLE είναι συγκρίσιμες με τις παραδοσιακές μεθόδους και την βιβλιογραφία [20], [21] , [22]. Τα αποτελέσματα CLE επικυρώθηκαν από μια κλασική ανοσοϊστοχημική τεχνική η οποία αποκάλυψε ένα θετικό μήνυμα για την CD31 τόσο τον έλεγχο και κακοήθεις δείγματα. Υπήρχε μία παρόμοια τάση για αυξημένη MVD και αγγειακή περιοχή στα δείγματα από την πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο σε σύγκριση με το κανονικό βλεννογόνο. Έχουν αναφερθεί στο παρελθόν αποτελέσματα στην ανθρώπινη παχέος αγγειακή μορφομετρία διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών μελετών λόγω των διαφορών στη μεθοδολογία και τις τεχνικές επεξεργασίας [20], [21] αλλά γενικά συμφωνούν με τα αποτελέσματά μας. Σε μια μελέτη της κανονικής κολονικής μικροκυκλοφορία σε διάβρωση χύτευση διάμετρο 10 μm αναφέρθηκε για προτριχοειδείς αρτηριδίων στο βλεννώδες πλέγμα [22]. Με την ανοσοϊστοχημική χρώση για CD34, επίσης, μια παν-ενδοθηλιακού δείκτη, η μέση αγγειακής διαμέτρου για την κανονική βλεννογόνο του κόλου ήταν 7,6 ± 1,5 μm [21].

απόδειξη μας ευρήματα έννοια αποδεικνύουν τη σκοπιμότητα της τεχνικής και θα μπορούσε Προετοιμάζουν το έδαφος για περαιτέρω έρευνα. Ενώ αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ένα παν-ενδοθηλιακού δείκτη, οι μελλοντικές παρόμοιες μελέτες θα μπορούσε να στοχεύσει άλλους δείκτες για το ενδοθήλιο πολλαπλασιαζόμενα, όπως VEGFR2, που είναι σχετικές με την προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση. Το σύντομο χρονικό διάστημα (μία ώρα μεταξύ των οργανισμών συλλογικής την βιοψία και την απεικόνιση της CD31 που σημειώνονται ιστού με CLE) και τη χρήση ενός πρότυπου πρωτοκόλλου χρώσης για δείγματα νωπών βιοψίες κάνει η στοχευμένη τεχνική CLE συμβατό με το κλινικό περιβάλλον υπό την προϋπόθεση ότι ο εξοπλισμός είναι διαθέσιμα.

παρόντα αποτελέσματα μας και τις προηγούμενες αναφορές σχετικά με παρόμοιες προσεγγίσεις δείχνουν ότι CLE έχει τη δυνατότητα για νεοαγγείωση απεικόνιση

in situ

κατά τη διάρκεια της ζωντανής διαδικασίες. Δεδομένου ότι αντι-αγγειογενετική φάρμακα τείνουν να ομαλοποιήσει αγγειακό σύστημα του όγκου για ένα σύντομο χρονικό διάστημα μερικών ημερών έως μερικές εβδομάδες, είναι επιθυμητό να βρούμε έναν τρόπο για την παρακολούθηση της αγγειακής αναδιαμόρφωσης δίκτυο κατά τη διάρκεια αυτής παράθυρο ευκαιρίας, όταν ο όγκος καθίσταται επίσης να ανταποκρίνεται περισσότερο χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία [23]. CLE, μόνος του ή σε συνδυασμό με άλλα μοριακής και κυτταρικής βιοδείκτες, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για αυτό το συγκεκριμένο σκοπό, εν αναμονή για την ανακάλυψη νέων στοχευμένων παραγόντων αντίθεσης. Όπως αναφέρθηκε, οι πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν καλά προκαταρκτικά στοιχεία με επισημασμένα με φθορισμό αντισώματα που στοχεύουν EGFR ή VEGF, γεγονός που υποδηλώνει τη σκοπιμότητα τέτοιων immunoendoscopy προσεγγίσεις. Παρ ‘όλα αυτά, η ανάπτυξη του ανθρώπινου χρήση στοχευμένων παν-ενδοθηλιακά δείκτες όπως σημασμένο με φθορισμό αντι-CD31 αντισώματα θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια έγκυρη πραγματικό χρόνο εναλλακτική λύση στη συμβατική ανάλυση MVD σταθερών δειγμάτων βιοψίας.

Εν κατακλείδι, δείξαμε ότι η επιλεκτική απεικόνιση των αιμοφόρων αγγείων είναι δυνατόν με CLE χρησιμοποιώντας σημασμένο με φθορισμό αντισώματα που στοχεύουν ένα ειδικό ενδοθηλιακού δείκτη στο φρέσκο ​​βιοψίες. Offline ανάλυση μορφομετρικών των συνεστιακής εικόνες με πρόσθετο λογισμικό επεξεργασίας έδειξαν σημαντικά διαφορετικά πρότυπα μεταξύ των φυσιολογικών και κακοήθων αγγειακών δικτύων. Στο μέλλον αυτή η προσέγγιση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την καλύτερη επιλογή των ασθενών για κλινικές δοκιμές και μια πιο λογική παρακολούθηση των αγγειακές επιδράσεις της αντι-αγγειογόνου παράγοντες σε ατομικά προσαρμοσμένων θεραπείες.