Αφηρημένο

λέιζερ εκρόφηση /ιονισμού φασματομετρίας μάζας απεικόνιση της μήτρας με τη βοήθεια υψηλής ανάλυσης (HR-MALDI-IMS) είναι μια αναδυόμενη αίτηση για την ολοκληρωμένη και λεπτομερή ανάλυση της χωρικής κατανομής των ιονισμένα μόρια in situ για διαφάνειες ιστού. HR-MALDI-IMS σε αρνητικό τρόπο σε ένα εύρος μάζας m /z 500-1000 διεξήχθη σε βέλτιστη θερμοκρασία κοπής (OCT) δείγματα ένωση-embedded ανθρώπινου προστάτη ιστών που λαμβάνονται από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη κατά τη στιγμή της ριζικής προστατεκτομής. HR-MALDI-IMS ανάλυση των 14 δείγματα στο σετ ανακάλυψη εντόπισαν 26 μόρια ως υψηλής έκφρασης στον προστάτη. Διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (MS /MS) έδειξε ότι τα μόρια αυτά περιλαμβάνονται 14 φωσφατιδυλινοσιτόλες (αναστολείς πρωτεάσης), 3 φωσφατιδυλαιθανολαμίνες (PES) και 3 φωσφατιδικά οξέα (ΡΑ). Μεταξύ των αναστολέων πρωτεάσης, την έκφραση των PI (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) και PI (18: 0/20: 2) ήταν σημαντικά υψηλότερα σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με καλοήθη επιθήλιο. Ένας αλγόριθμος βιοδείκτη για τον καρκίνο του προστάτη διατυπώθηκε από την ανάλυση των προφίλ έκφρασης των αναστολέων πρωτεάσης σε καρκινικό ιστό και καλοήθεις επιθήλιο της ανακάλυψης που χρησιμοποιούν ορθογώνιες μερική ελαχίστων τετραγώνων διακριτική ανάλυση (OPLS-DA). Η ευαισθησία και η ειδικότητα αυτού του αλγορίθμου για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη στα σετ δειγμάτων επικύρωσης 24 ήταν 87,5 και 91,7%, αντίστοιχα. Εν κατακλείδι, HR-MALDI-IMS εντόπισε αρκετές αναστολείς πρωτεάσης ως πιο υψηλή έκφραση σε καρκίνο του προστάτη από καλοήθεις επιθήλιο του προστάτη. Αυτές οι διαφορές στα προφίλ έκφρασης ΡΙ μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο διαγνωστικό εργαλείο για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Goto Τ, Terada Ν, Inoue Τ, Nakayama Κ, Okada Υ, Yoshikawa Τ, et al. (2014) Η έκφραση Προφίλ φωσφατιδυλινοϊσιτόλης σε υψηλή χωρική ανάλυση απεικόνισης Φασματομετρίας Μάζας ως πιθανή βιοδεικτών για καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (2): e90242. doi: 10.1371 /journal.pone.0090242

Επιμέλεια: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 26 Νοεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 27η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 28 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Goto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) μέσω του «Προγράμματος χρηματοδότησης για το World-Leading Καινοτόμες R &? D για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (πρώτο πρόγραμμα),» ξεκίνησε από το Συμβούλιο Επιστημονικής και Τεχνολογικής Πολιτικής ( CSTP) (https://www.first-ms3d.jp/english/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους και η κύρια αιτία θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με άνδρες [1]. Λόγω των κλινικών και ιστολογικών ετερογένεια της, οι μηχανισμοί που υπόκεινται στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί. μεταβολισμός των λιπιδίων μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη καρκινογένεση επηρεάζοντας πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και την κινητικότητα [2] – [4]. Τα πρότυπα έκφρασης αρκετών φωσφολιπιδίων έχουν αναφερθεί να διαφέρουν σε καρκίνο του προστάτη και της καλοήθους ιστού του προστάτη [5]. Φωσφατιδυλινοσιτόλες (PIs), μια σημαντική κατηγορία των φωσφολιπιδίων, εμπλέκονται στην ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος [6], [7]. Ειδικότερα, η ΡΙ3-κινάσης, η οποία ρυθμίζει πολλές κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού των λιπιδίων, συχνά μεταλλάσσεται ή ενεργοποιείται σε καρκίνο του προστάτη [8], [9]. Σε αντίθεση με άλλα φωσφολιπίδια, τα προφίλ ΡΙ δείχνουν συγκεκριμένα μοτίβα σε κύτταρα θηλαστικών, που επηρεάζεται από διάφορους ακυλοτρανσφεράσες στην οδό αναδιαμόρφωσης (μονοπάτι Lands ‘) [10], [11]. Τα προφίλ ΡΙ ιστών ανθρώπινου καρκίνου του μαστού έχει δειχθεί ότι διαφέρουν από εκείνες των φυσιολογικών μαστικών αδένων [12]. Μέχρι σήμερα, όμως, τα προφίλ PI δεν έχουν αναλυθεί σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη.

εκρόφησης Matrix βοήθεια λέιζερ /ιονισμού απεικόνισης φασματομετρίας μάζας (MALDI-IMS) είναι μια νέα μορφή που διευκολύνει την απόκτηση ολοκληρωμένης φάσματα μάζας απευθείας από δείγματα ιστού και παρέχει χάρτες ανακατασκευάστηκε πυκνότητα ανιχνεύονται ιόντα [13]. Ο καρκίνος του προστάτη, ωστόσο, είναι πολυεστιακή και περιβάλλεται από καλοήθη επιθήλιο του προστάτη ή στρώμα, γεγονός που καθιστά δύσκολο να εντοπίσει τον καρκίνο συγκεκριμένες αλλοιώσεις με συμβατικές MALDI-IMS. Η χωρική ανάλυση αυτής της τεχνικής πρόσφατα βελτιώθηκε, σε λιγότερο από 10 μm, διευκολύνοντας μια λεπτομερής δισδιάστατη ανάλυση των φωσφολιπιδίων [12], [14] – [18]. Δεδομένου ότι οι περισσότερες μορφές καρκίνου του προστάτη αδένες και τη διάμετρο ενός μόνο αδένα δεν είναι μικρότερο από 50 μm, το βήμα της υποβοηθούμενης από μήτρα εκρόφησης φασματομετρία μάζας με λέιζερ απεικόνισης υψηλής ανάλυσης /ιονισμού 10 μm (HR-MALDI-IMS) είναι επαρκής για να απεικονίσει με σαφήνεια καρκίνο του προστάτη βλάβες.

τα κατεψυγμένα δείγματα ιστών ενσωματωμένα στην ένωση βέλτιστη θερμοκρασία κοπής (OCT) σώζεται σε πολλά κλινικά εργαστήρια και χρησιμοποιούνται συχνά στην έρευνα για τον καρκίνο. Ως αποτέλεσμα της πρόβλημα μόλυνσης, εντούτοις, κατεψυγμένα δείγματα χωρίς OCT ένωση έχουν χρησιμοποιηθεί σε IMS λιπίδιο έρευνα [19], [20]. Η χρήση των δειγμάτων που αποθηκεύονται χωρίς ένωση OCT είναι περιορισμένη, λόγω του σχηματισμού των κρυστάλλων πάγου και τη δυσκολία που κάνει τομές ιστών.

Σε αυτή τη μελέτη, ιδρύσαμε ένα in situ σύστημα χρησιμοποιώντας HR-MALDI-IMS για την ανάλυση φωσφολιπιδίων έκφρασης πρότυπα δείγματα ιστού του προστάτη ενσωματωμένες σε σύνθετες Οκτώβριο Αυτή η μέθοδος προσδιορίσει διάφορες φωσφολιπίδια ως περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνο προστάτη σε σχέση με το παρακείμενο καλοήθη επιθήλιο. Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στο προφίλ έκφρασης των αναστολέων πρωτεάσης και αξιολογείται το δυναμικό τους να διακρίνουν τον καρκίνο του προστάτη από καλοήθεις επιθήλιο. Για τις γνώσεις μας, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που χρησιμοποιεί HR-MALDI-IMS για τη διερεύνηση φωσφολιπιδίων πρότυπα έκφρασης σε δείγματα ιστού του προστάτη ενσωματωμένα σε OCT ένωση, και να προσδιορίσουν με επιτυχία τις διαφορές στο προφίλ έκφρασης PI στον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα πειράματα με πειραματόζωα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τα πειράματα σε ζώα του Πανεπιστημίου του Κιότο. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου του Κιότο (Αριθμός Άδειας: 13331).

Κλινική υλικά χρησιμοποιήθηκαν μετά από γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Κιότο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο.

Παρασκευή ένωσης Οκτώβριο ενσωματωμένα δείγματα ιστού

Έχουμε ήδη δημιουργήσει ένα νέο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού των ανθρωπίνων καρκίνο του προστάτη, που ονομάζεται KUCaP-2 [21]. Αυτές οι ξενομοσχεύματος ιστοί χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των συνθηκών κατάλληλων για την HR-MALDI-IMS σύστημα για την ανάλυση δειγμάτων ιστού ανθρώπινου προστάτη ενσωματωμένα σε ένωση OCT. Ξενομοσχεύματος όγκοι κάθε χωρίζεται σε δύο κομμάτια, με το ένα ενσωματωμένο ολόκληρο σε ένωση OCT (Tissue-Tek®? Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), χωρίς θεραπεία σακχαρόζη για να αποφευχθεί η επίδραση της στερέωσης, και η άλλη αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο να αποφευχθεί η υποβάθμιση των βιομορίων. Αμφότερα τα δείγματα αποθηκεύονται στους -80 ° C.

Η ομάδα ασθενών αποτελούνταν από 38 Ιάπωνες ασθενείς με κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Κιότο από το 2005 έως το 2008. προστάτη φέτες ιστού πάχους 5 χιλιοστών συλλέχθηκαν αμέσως μετά την απομάκρυνση και των ενσωματωμένων σε OCT ένωση, χωρίς θεραπεία σακχαρόζη και καταψύχθηκαν στους -80 ° C. Όλα τα κατεψυγμένα μπλοκ απέδωσαν τμήματα που περιέχουν ιστό καρκίνου και καλοήθεις επιθήλιο.

Η ιστολογική αξιολόγηση και την επικάλυψη της μήτρας των δειγμάτων ιστών προστάτη

Μετά την μέγιστη απομάκρυνση της OCT ένωση, τα δείγματα ιστού υποβλήθηκαν σε κρυοτομή σε κρυοστάτη (CM1850UV, ? Leica, Wetzler, Germany) στους -20 ° C. Κατεψυγμένες τομές πάχους 5 μm τοποθετήθηκαν πάνω σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες (MAS παλτό? Matsunami, Osaka, Japan) για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση. Όλα τα πλακίδια αξιολογήθηκαν από ένα μόνο παθολόγο (S.S.) για να προσδιοριστεί μορφολογία ιστού και ως οδηγός για την ανάλυση HR-MALDI-IMS. Πρόσθετες σειριακές τομές στα 10 μm τοποθετήθηκαν πάνω ινδίου-κασσιτέρου επικαλυμμένη με οξείδιο (ΙΤΟ) γυάλινες πλάκες (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση HR-MALDI-IMS. ΟΟΤ-ένωσις σε παραφίνη και φρέσκα κατεψυγμένα δείγματα ξενομοσχεύματος στερεώθηκαν επάνω στο ίδιο πλακίδιο, ενώ κάθε δείγμα κλινική προστατικό ιστό από περίπου 7,5 χ 7,5 mm τοποθετήθηκε πάνω σε μία μόνο διαφάνεια. Κάθε τμήμα επενδύεται με ημι-υδρίτες 9-αμινοακριδίνη (9-AA) (Acros Organics, Geel, Βέλγιο), η οποία χρησίμευσε ως μήτρα για MALDI-MS. Κάθε διαφάνεια ήταν αγκυροβολημένο σε εξοπλισμό εναπόθεση κενού (SVC-700τμ /700-2? Sanyu Electron, Tokyo, Japan) και επικαλύπτονται με ένα στρώμα πλέγματος 9-AA που λαμβάνεται με εξάχνωση στους 220 ° C. Ο χρόνος που απαιτείται για τη διαδικασία εναπόθεσης ατμών ήταν 8 λεπτά? το πάχος του στρώματος 9-AA εναποτίθεται στο slide δεν εκτιμήθηκε. Τα τμήματα αξιολογούνται από HR-MALDI-IMS επίσης χρωματίστηκαν με Η & amp? Ε και αξιολογούνται από τον παθολογοανατόμο. Για την H & amp? Ε χρώση μετά από ανάλυση HR-MALDI-IMS, 9-AA αφαιρέθηκε από τις διαφάνειες με εμβάπτιση τους σε μεθανόλη για 30 s

HR-MALDI-IMS και MS /MS ανάλυση

HR-MALDI-IMS πραγματοποιήθηκε σε ένα φασματογράφο μάζας μικροσκοπικής απεικόνισης υψηλής ανάλυσης (RK27-4050C? Shimadzu, Kyoto, Japan? το πρωτότυπο μοντέλο του iMScope) εφοδιασμένο με 355-nm Nd: YAG laser. Δεδομένα φασματομετρίας μάζης αποκτήθηκαν με αρνητικό τρόπο στο φάσμα μάζας m /z 500-1000 χρησιμοποιώντας μια μέθοδο εξωτερική βαθμονόμηση με μάζα επίλυση δύναμη 10.000 σε m /z 1000. Μια περιοχή ενδιαφέροντος (ROI), περίπου 2000 × 2000 μm σε μέγεθος και περιέχουν ιστό καρκίνου, καλοήθους επιθήλιο και στρώμα, ήταν τυχαία προσδιορίστηκε από τη μικροσκοπική όψη του κάθε διαφάνεια και τα φάσματα μάζας λήφθηκαν σε χωρική ανάλυση 10 μm. Το ROI επιβεβαιώθηκε από το πάχος του δείγματος 10 μm χρωματίστηκαν με Η & amp? Ε μετά από μέτρηση HR-MADLI-IMS. Το ίδιο όργανο χρησιμοποιήθηκε για την διαδοχική φασματομετρία μάζας (MS /MS) ανάλυση? Η λιπιδική σύνθεση τάξη και λιπαρό οξύ των παρατηρούμενων κορυφών βασίστηκαν στα φασματικά πρότυπα των κορυφών ιόντων των προϊόντων. Η Ανθρώπινη μεταβολιτών Database (https://www.hmdb.ca/) και Φύση Lipidomics πύλη (https://www.lipidmaps.org/) χρησιμοποιήθηκαν για την αναφορά. Από τα 38 δείγματα, 14 επιλέχθηκαν τυχαία ως ένα σύνολο ανακάλυψη και να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό μορίων υψηλής έκφρασης σε ιστούς του προστάτη και εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο προστάτη και καλοήθη επιθήλιο. Τα άλλα 24 δείγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ένα σύνολο επικύρωσης και τα προφίλ έκφρασης των μορίων προσδιορίζονται αναλύθηκαν στατιστικά και η χρησιμότητά τους ως μοριακών δεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη αξιολογήθηκε.

επεξεργασία δεδομένων και στατιστική ανάλυση των HR-MALDI- αποτελέσματα IMS

Χρησιμοποιώντας SIMtools λογισμικού (in-house λογισμικού? Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan), τα προφίλ μάζας κανονικοποιούνται σε σχέση με το συνολικό ρεύμα ιόντων για την εξάλειψη των διακυμάνσεων στην απόδοση ιονισμού, και χρησιμοποιείται για όλες απεικόνιση και στατιστικά αναλύσεις. εικόνες Ion οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Biomap λογισμικού (Novartis, Basel, Switzerland). Mann-Whitney (Μ-W) δοκιμασίες U χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση παραγόντων μεταξύ του νωπού κατεψυγμένου ιστού και OCT ενσωματωμένα ιστού ή μεταξύ του καρκίνου και καλοήθεις επιθήλιο. Για την αξιολόγηση της έκφρασης των PI, τα κανονικοποιημένα δεδομένα εισήχθησαν SIMCA λογισμικού 13.0.3 (Umetrics ΑΒ, Umeå, Σουηδία). Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) χρησιμοποιήθηκε για ανεξέλεγκτους πολυμεταβλητή αναλύσεις και ορθογώνια μερική ελαχίστων τετραγώνων διακριτική ανάλυση (OPLS-DA) χρησιμοποιήθηκε για τις αναλύσεις εποπτευόμενων πολυπαραγοντική. Οι PCA και OPLS-DA μοντέλα απεικονίζονται ως οικόπεδα βαθμολογίας (κύριο συστατικό [PC1, PC2]), οι οποίες εμφανίζουν καμία εγγενή ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση την φασματική μεταβολή. Στην ανάλυση OPLS-DA, επιλεγμένα πιθανούς βιοδείκτες βασίστηκαν στο S-οικόπεδο. Η γραφική παράσταση της συνδιακύμανσης έναντι της συσχέτισης σε συνδυασμό με τα μεταβλητά οικόπεδα τάση οδήγησε σε ευκολότερη απεικόνιση των δεδομένων. Οι μεταβλητές που άλλαξε πλέον χαράχθηκαν στο επάνω ή στο κάτω μέρος του «S» σε σχήμα πλοκή, και εκείνων που δεν διαφέρουν σημαντικά χαράχθηκαν στη μέση. Ο αλγόριθμος για τη διαφοροποίηση του καρκίνου από καλοήθεις επιθήλιο ιδρύθηκε επίσης από OPLS-DA, με ένα βέλτιστο σημείο αποκοπής ορίζεται ως 0,5. Η προβλεπτική ικανότητα του αλγορίθμου δοκιμάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας το εμβαδόν κάτω από την καμπύλη χαρακτηριστική χειριστής δέκτη (ROC). Η ευαισθησία ορίζεται ως η αναλογία της πραγματικής περιοχών του καρκίνου έχουν αναγνωριστεί σωστά ως τέτοιες, και ειδικότητα ορίστηκε ως η αναλογία της πραγματικής περιοχών καλοήθους επιθήλιο αναγνωριστεί σωστά ως τέτοια. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SIMCA 13.0.3 ή SPSS έκδοση 11.0, με p & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

ιστοί Ο καρκίνος του προστάτη ενσωματωμένα σε OCT ένωση είναι κατάλληλα για HR-MALDI -IMS

για να αξιολογηθεί η καταλληλότητα των δειγμάτων ιστού καρκίνου του προστάτη ενσωματωμένα σε ένωση OCT για HR-MALDI-IMS, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη (KUCaP-2). Τα φάσματα μάζας για Οκτ χωρίς ιστούς όγκων έδειξαν τις ίδιες κορυφές όπως τα φάσματα μάζας επί της μήτρας 9-ΑΑ και μόνο, υποδεικνύοντας ότι οι ΥΧΕ δεν παρεμβαίνει στην ανάλυση HR-MALDI-IMS σε αρνητικό τρόπο (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, στην περιοχή μάζας m /z 500-1000, υπήρχαν σχεδόν καθόλου σημαντικές διαφορές στα φασματικά πρότυπα δείγματα ένωσης ενσωματωμένων ΥΧΕ και φρέσκο ​​κατεψυγμένο δείγματα (Σχήμα 1Β, Πίνακας S1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιστοί του καρκίνου του προστάτη ενσωματώνονται σε ένωση OCT είναι κατάλληλα για αναλύσεις HR-MALDI-IMS σε αρνητικό τρόπο.

Matrix επικαλυμμένο ιστός υποβλήθηκε σε λειτουργία αρνητικών ιόντων HR-MALDI-IMS. Ένα αποτέλεσμα μέσο όρο φάσματα μάζας κάθε περιοχής (άνω πάνελ, μήτρα? Μεσαίο πάνελ, ΟΚΤ + μήτρα? Κατώτερο πάνελ, όγκος + μήτρα) στο εύρος μάζας m /z 500-2000. Οι άξονες χ δείχνουν m /z, και y άξονες δείχνουν την ένταση του σήματος των φασμάτων μάζας. Οι αντίστοιχες οπτικές εικόνες παρουσιάζονται επίσης. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 200 ​​μm. B, H & amp? Ε εικόνες του φρέσκου κατεψυγμένου (άνω τμήμα) και OCT ένωση ενσωματωμένα (κάτω πίνακας) δείγματα ξενομοσχεύματος όγκου. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 200 ​​μm. Τα προκύπτοντα κατά μέσο όρο φάσματα μάζας του κάθε ιστού ξενομοσχεύματος όγκου (άνω κατεψυγμένα? Χαμηλότερα, ΟΚΤ ένωση ενσωματωμένα). Στο εύρος μάζας m /z 500-1000

Η

Είκοσι φωσφολιπίδια προσδιορίστηκαν ως εντόνως εκφρασμένο σε ανθρώπινων ιστών του προστάτη

δειγμάτων ιστών ανθρώπινο προστάτη ενσωματωμένα σε ένωση OCT αναλύθηκαν με HR-MALDI-IMS σε αρνητικό τρόπο στο εύρος μάζας m /z 500-1000 (Σχήμα 2Α, Β). Τα χαρακτηριστικά των 38 περιελάμβανε ασθενείς παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Από τα 38 δείγματα, 14 χρησιμοποιήθηκαν στο σύνολο ανακάλυψη και 24 στο σύνολο επικύρωσης. ROIs που περιλάμβανε τόσο τον καρκίνο και καλοήθη επιθήλιο επιλέχθηκαν τυχαία στο σύνολο των δειγμάτων 14 ανακάλυψης. Οι πρώτοι 100 κορυφές των φασμάτων μάζας αναλύθηκαν σε κάθε δείγμα. Εξαιρουμένων μήτρας και ισοτοπική κορυφές, 26 κορυφές ανιχνεύθηκαν με συνέπεια σε 12 ή περισσότερα από τα 14 δείγματα (Πίνακας S2). Οι εικόνες ιόν ήταν σαφώς ορατή επί του καρκίνου του προστάτη και της καλοήθους επιθήλιο χρησιμοποιώντας HR-MALDI-IMS επίκεντρο αυτών των 26 ειδών m /z (Σχήμα 2C). ανάλυση MS /MS μπορεί να προσδιορίσει την δομή αυτών των μορίων με την ανάλυση των κορυφών των πρόδρομων ιόντων τους (Σχήμα S1). Από τις 26 κορυφές, 20 ταυτοποιήθηκαν ως φωσφολιπίδια (Πίνακας S3), με 14 να είναι λυζοφωσφατιδυλινοσιτόλη (LPI) και PIs (m /z 599.3, 809.5, 833.5, 835.5, 837.5, 857.5, 859.5, 861.5, 863.5, 883.5, 885.5, 887.5, 889.5 και 909.5), τρεις είναι φωσφατιδυλαιθανολαμίνες (PES: m /z 716.5, 742.5 και 744.5) και τρεις είναι φωσφατιδικά οξέα (ΡΑ: m /z 673,4, 699,5 και 701,5). Οι παρατηρούμενες κορεσμένα λιπαρά οξέα που περιέχονται σε αυτά τα φωσφολιπίδια ήταν C16: 0 και C18: 0, και το ακόρεστο λιπαρό οξέα ήταν C18: 1, C18: 2, C20: 2, C20: 3, C20: 4, C22:. 6

Matrix επικαλυμμένο ιστό αξιολογήθηκε με τη λειτουργία αρνητικών ιόντων HR-MALDI-IMS στο εύρος μάζας m /z 500-1000. Α, Η &? Ε χρώση δείγμα ανθρώπινου ιστού προστάτου που περιέχουν καθορισμένες περιοχές της καλοήθους επιθηλίου (μπλε) και του καρκίνου του προστάτη (κόκκινο). Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 200 ​​μm. Β, περιοχές ενδιαφέροντος και προκύπτει κατά μέσο όρο μάζες της καλοήθους επιθηλίου (άνω τμήμα) και του καρκίνου του προστάτη (κάτω πίνακας). Το x και y άξονες δείχνει m /z και την ένταση του σήματος ρυθμίζεται σύμφωνα με συνολικό ρεύμα ιόντων, αντίστοιχα. C, Mass φασματοσκοπία εικόνα που δείχνει την κατανομή των ειδών /z 26 κοινά μ.

Η

προφίλ έκφρασης PI διαφέρουν στον καρκίνο του προστάτη και της καλοήθους επιθηλίου

Τα φωσφολιπίδια ανιχνεύονται πιο συχνά από HR-MALDI-IMS αναλύσεις σε δείγματα ιστού του προστάτη ήταν PIs. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στα προφίλ έκφρασης PI στον καρκίνο του προστάτη και της καλοήθους επιθηλίου. Μια σύγκριση της έντασης του σήματος από αυτά τα 14 PIs στον καρκίνο και καλοήθη επιθηλίου στο σύνολο των δειγμάτων ανακάλυψη έδειξε ότι η έκφραση του PI (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) και PI (18 : 0/20: 2) ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκίνο σε σχέση με καλοήθη επιθήλιο (Πίνακας 2). . Εκπρόσωπος απεικονίσεις της κατανομής αυτών των αναστολέων πρωτεάσης στο HR-MALDI-IMS αναλύσεις έδειξαν ότι τα επίπεδα της έκφρασης ήταν παρόμοια υψηλότερα στον καρκίνο από ό, τι σε καλοήθεις επιθήλιο (Εικόνα 3)

H & amp? Ε βάφονται και εικόνες φασματομετρία μάζας δειγμάτων από 5 περιπτώσεις στο σύνολο ανακάλυψη. H & amp? Ε βάφονται εικόνες δείχνουν καθορισμένες περιοχές της καλοήθους επιθηλίου (μπλε) και του καρκίνου του προστάτη (κόκκινο). Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 200 ​​μm. Μάζα εικόνες φασματομετρίας δείχνουν την αντιπροσωπευτική κατανομή των m /z 863,5 (PI [18: 0/18: 1]), 887.5 (PI [18: 0/20: 3]) και 889.5 (PI [18: 0/20: 2 ]), η οποία ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνο σε σχέση με καλοήθη επιθήλιο στο σύνολο ανακάλυψη.

η

Για την εκτίμηση της παγκόσμιας διαφορές στα προφίλ έκφρασης PI του καρκίνου του προστάτη και της καλοήθους επιθηλίου, PCA ανάλυση των το 14 PIs πραγματοποιήθηκε στα σετ ανακάλυψη δειγμάτων. Τα οικόπεδα βαθμολογία PCA στο PC1 (R

2 = 0.562) και PC2 (R

2 = 0,204) έδειξε ασαφείς συστάδες σε καρκινικό ιστό και καλοήθεις επιθήλιο (R

2X: 0,903 [cum] και Q

2: 0.624 [cum]? Σχήμα 4Α). Σε αντίθεση, OPLS-DA διακρίνεται σαφώς ο καρκίνος του προστάτη από καλοήθεις επιθήλιο (R

2X: 0,874 [cum], R

2Y: 0,735 [cum] και Q

2: 0.583 [cum]? Εικόνα 4Β) . Η επικύρωση της μερικής τουλάχιστον ανάλυση τετραγώνων διακρίνουσας (PLS-DA) ήταν υποδηλώνουν ένα εξαιρετικό μοντέλο (Εικόνα S2). Ένα OPLS S-πλοκή σε σχέση με το ποσοστό των PIs στον καρκίνο και καλοήθη επιθήλιο φαίνεται στην Εικόνα 4C. Η ένταση του σήματος του m /z 863,5 (PI [18: 0/18: 1]) και 889,5 (PI [18: 0/20: 2]) απομονώθηκαν από το S-πλοκή ως μεταβλητές που διακρίνουν σημαντικά μεταξύ καρκίνου του προστάτη και καλοήθης επιθήλιο. Το προφίλ έκφρασης των 14 PIs η OPLS-DA χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ενός αλγορίθμου διαφοροποιώντας ακρίβεια καρκίνου από καλοήθεις επιθήλιο (Πίνακας S4). Χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο με τον βέλτιστο σημείο αποκοπής ορίζεται ως 0,5, η ευαισθησία και η ειδικότητα για τη διάγνωση του καρκίνου ήταν 85,7 και 92,9%, αντίστοιχα.

Ένα οικόπεδο βαθμολογία PCA που δείχνει τη διάκριση μεταξύ του καρκίνου και καλοήθεις επιθηλίου στο σύνολο ανακάλυψη . Β, OPLS-DA οικόπεδο βαθμολογίας δείχνει μια σαφή διάκριση μεταξύ του καρκίνου και καλοήθεις επιθηλίου στο σύνολο ανακάλυψη. C, OPLS-DA S-οικοπέδου που αντιστοιχεί στο οικόπεδο βαθμολογία που φαίνεται στο (Β). Ο αριθμός δίπλα σε κάθε PI δείχνει m /z αξία του. Α, καμπύλη ROC που δείχνει την ικανότητα του αλγορίθμου βιοδείκτη για τη διάκριση καρκίνου του προστάτη από καλοήθεις επιθήλιο στο σύνολο επικύρωσης.

Η

Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον αυτός ο αλγόριθμος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, τα προφίλ έκφρασης του PIs αξιολογήθηκαν στο σύνολο επικύρωσης δείγματα. Μια καμπύλη ROC υπολογίζεται από αυτή αλγόριθμος παρουσιάζεται στο Σχήμα 4D, με μια περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) του 0.964. Το σημείο αποκοπής του 0,5 είχε ευαισθησία 87,5% και ειδικότητα 91,7% για τη διάκριση του καρκίνου του προστάτη από καλοήθεις επιθήλιο.

Συζήτηση

Τα λιπίδια αποτελούν διαφορετικές κατηγορίες μορίων με κρίσιμες λειτουργίες σε κυτταρική ενέργεια την αποθήκευση, τη δομή και τη σηματοδότηση. Ο κίνδυνος του καρκίνου του προστάτη έδειξε να αυξάνει όταν ήταν αυξημένα ιδίως στο πλάσμα λιπαρά οξέα, συμπεριλαμβανομένων των μυριστικό οξύ, α-λινολενικό οξύ, και το εικοσιπεντανοϊκό οξύ [22], [23]. Πολλοί μεμονωμένοι πολικά λιπίδια [24] – [27] και της χοληστερόλης μόρια που μοιάζουν με [28], [29] έχουν συσχετισθεί με την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, ήταν δύσκολο να εκτιμηθεί αυτά τα μόρια άμεσα σε ιστό προστάτη, επειδή οι περισσότερες διαδικασίες ανάλυση λιπιδίων, συμπεριλαμβανομένων των συμβατικών MS, απαιτούν λιπιδίων εκχύλιση. Μια αναδυόμενη εργαλείο, MALDI-IMS, μπορούν να παρέχουν «επί τόπου απεικόνισης», χωρίς να καταστρέφει τις ιστολογικές δομές των βιολογικών υλικών, και οι χαρτογραφήθηκαν εικόνες μπορούν να συγκρίνονται με τις αντίστοιχες ιστολογικές εικόνες [30] – [32].

Αν και OCT ένωση χρησιμοποιείται συνήθως για να ενσωματώσετε και να διατηρήσει δείγματα ιστού, δείγματα ενσωματωμένα εξ ολοκλήρου σε ένωση OCT έχουν θεωρηθεί ως ακατάλληλα για την έρευνα IMS λιπιδίων, επειδή η μόλυνση από τον Οκτώβριο ανιχνεύεται εύκολα με φασματομετρία μάζας και μειώνει σημαντικά την ανίχνευση άλλων συστατικών [19 ], [20]. Σε αυτή τη μελέτη, HR-MALDI-IMS χρησιμοποιώντας 9-ΑΑ ως μία μήτρα έδειξε συνεπή φάσματα από OCT ένωση ενσωματωμένα δείγματα σε ένα εύρος μάζας m /z 500-1000 σε αρνητικό τρόπο λειτουργίας. Η φασματική πρότυπο και η ποιότητα αυτών των ΥΧΕ-ενσωματωμένα δείγματα βρέθηκαν ισοδύναμες με εκείνες των φρέσκων κατεψυγμένων δειγμάτων. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να είναι σημαντικό, δεδομένου ότι τα κατεψυγμένα δείγματα διατηρούνται σε OCT ένωση σε πολλά κλινικά εργαστήρια, επιτρέποντας τη χρήση τους για την έρευνα των λιπιδίων με τη χρήση MALDI-IMS.

Δείξαμε ότι HR-MALDI-IMS είχε αρκετές μεθοδολογικές πλεονεκτήματα σε σύγκριση με το συμβατικές lipidomic μελέτες σε καρκινικούς ιστούς. πρώιμο στάδιο καρκίνου του προστάτη είναι συχνά πολυεστιακή και περιβάλλονται από καλοήθη επιθήλιο του προστάτη ή /και στρώμα, χωρίς το σχηματισμό μιας μάζας όγκου. Επιπλέον, δεδομένου ότι ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί αδένες και η διάμετρος του ενός ενιαίου αδένα μπορεί να είναι τόσο μικρή όσο 50 μm, συμβατικά IMS, με ανάλυση μεγαλύτερη από 50 μm, μπορεί μόνο κατά προσέγγιση διάκριση μεταξύ καρκινικών και άλλους ιστούς. Έτσι, οι προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν χαμηλότερης ανάλυσης IMS απέτυχε να διακρίνει με ακρίβεια τον καρκίνο του προστάτη συγκεκριμένες περιοχές από καλοήθεις επιθήλιο ακόμη και αν απέδωσε πιθανών υποψηφίων [33] – [39]. Υψηλής ανάλυσης IMS μπορεί ξεπεραστεί αυτό το μειονέκτημα και μπορεί να είναι χρήσιμα για την ανάλυση των ετερογενών ιστών, όπως καρκίνοι του προστάτη.

Βρήκαμε ότι η σύνθεση του PIs διέφεραν αισθητά στον καρκίνο του προστάτη και της καλοήθους επιθήλιο, υποδηλώνοντας ότι οι διαφορές στην PI προφίλ έκφρασης μπορεί να προκύψουν από τις διαφορές στις δραστηριότητες των διαφόρων ακυλοτρανσφεράσες. Αυτές οι αλλαγές στο προφίλ έκφρασης ΡΙ μπορεί να επηρεάσει όχι μόνο ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης, αλλά επίσης και η δραστηριότητα της οδού σηματοδότησης της ΡΙ3Κ [40] – [43]. Αν και ο ακριβής ρόλος των συγκεκριμένων αναστολέων πρωτεάσης στη σηματοδότηση ΡΙ3Κ παραμένει άγνωστος, τα επίπεδα έκφρασης των αναστολέων πρωτεάσης που περιέχουν πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν αναφερθεί ότι συσχετίζονται με εκείνες των ΡΙ3-φωσφορικής [42]. Η μελέτη μας ήταν προκαταρκτική και περιελάμβανε έναν σχετικά περιορισμένο αριθμό δειγμάτων. Έτσι, απομένει να καθοριστεί αν οι αλλαγές στο προφίλ έκφρασης PI και δραστηριοτήτων ακυλτρανσφεράσης συσχετίζονται και αν σχετίζονται άμεσα με την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη

Πολλά PIs, συμπεριλαμβανομένης της PI. (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) και PI (18: 0/20: 2) ταυτοποιήθηκαν ως πιθανούς βιοδείκτες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Είμαστε ιδιαίτερα επικεντρώθηκε στην αναδιανεμητική αλλαγή αυτής της κατηγορίας μορίων, όχι σε ενιαίο PIs, επειδή η λειτουργία των αναστολέων πρωτεάσης ελέγχεται από συνολική κατανομή τους. Πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση, όπως PCA ή OPLS-DA, θεωρείται ως ένα ισχυρό εργαλείο για την ολιστική αξιολόγηση των πολύπλοκων μεταβολικών καταστάσεων από ομαδοποίηση κάθε δείγμα, υποθέτοντας αποκτήσει φάσματα ως πολυπαραγοντικό δεδομένων [44] – [46]. αλγόριθμος βιοδείκτη μας για τον καρκίνο του προστάτη χρησιμοποιώντας OPLS-DA ήταν σε θέση να διακρίνει τις περιοχές του καρκίνου του προστάτη, ακόμη και στο σύνολο επικύρωσης, υποδεικνύοντας ότι τα προφίλ έκφρασης του PIs στην ανάλυση HR-MALDI-IMS είναι δυνητικοί βιοδείκτες για τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη.

Τα προφίλ έκφρασης των αναστολέων πρωτεάσης σε καρκινικούς ιστούς δεν συσχετίστηκαν με προεγχειρητική τιμή τους PSA, σκορ Gleason, ή παθολογική στάδιο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο αριθμός των ασθενών ήταν μικρός και τα περισσότερα από τα δείγματα ιστού ελήφθησαν από ασθενείς με εντοπισμένο και καλά ή μετρίως διαφοροποιημένα καρκίνων. Ο αλγόριθμος ταξινόμησης πρέπει να επαληθεύεται σε μια μεγαλύτερη ομάδα, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικών μαρτύρων και ασθενών με πιο επιθετική νόσο. Επιπλέον, οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης των PI και τα κλινικά αποτελέσματα μένει να καθοριστεί.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HR-MALDI-IMS μπορεί να είναι ένα ισχυρό εργαλείο ανακάλυψης βιοδεικτών. Το προφίλ έκφρασης των αναστολέων πρωτεάσης μπορεί να είναι ένας υποψήφιος βιοδείκτης για τον καρκίνο του προστάτη, αν και το εύρημα αυτό απαιτεί επαλήθευση σε μια μεγαλύτερη ομάδα ασθενών και συσχέτιση με κλινικά αποτελέσματα. Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η χρήση του HR-MALDI-IMS να εντοπίσει συγκεκριμένες ασθένειες μοριακές αλλαγές σε δείγματα ιστού του προστάτη θα βελτιώσει την κρίσιμη διαδικασία λήψης αποφάσεων παθολογία στη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

MS /MS φάσματα των κοινών ειδών m /z σε αυτή τη μελέτη. Οι κορυφές ιόντων προϊόν αντιστοιχούν στις ομάδες αλυσίδας λιπαρού ακυλίου και πολικές ομάδες κεφαλής που περιγράφεται στον Πίνακα S3. Ο άξονας χ δείχνει m /z. Ο άξονας γ δείχνει την ένταση του σήματος των φασμάτων μάζας. Συντομογραφίες: LPI, λυζοφωσφατιδυλινοσιτόλη. PA, φωσφατιδικό οξύ. PE, φωσφατιδυλαιθανολαμίνη. PI, φωσφατιδυλινοσιτόλης. Ins, ινοσιτόλη. SN1, λιπαρό οξύ στη sn-1 θέση. . SN2, λιπαρό οξύ στη θέση sn-2

doi: 10.1371 /journal.pone.0090242.s001

(PPTX)

Εικόνα S2.

επικύρωση βασίζεται σε ένα μοντέλο PLS-DA βαθμονομηθεί με ανάλυση μετάθεση. Οι παράμετροι του μοντέλου για το εξήγησε διακύμανσης (R

2) και η προβλεπτική ικανότητα (Q

2) ήταν σημαντική (Ρ

2X [cum] = 0,874? Q

2 [cum] = 0,535) . Οι τιμές τομής για την Ε

2 και Q

2 γραμμές ήταν 0.305 και -0.444 αντίστοιχα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s002

(DOCX)

Πίνακας S1 . Ένταση

Σήμα normarized στο συνολικό ρεύμα ιόντων στο top 50 ενώσεις ανιχνεύθηκε σε κατεψυγμένα και OCT δείγματα ένωση-ενσωματωμένο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s003

(DOCX)

Πίνακας S2.

κοινά είδη /z m ανιχνεύεται μεταξύ των κορυφαίων 100 ενώσεις σε τουλάχιστον 12 ασθενείς στο σύνολο ανακάλυψη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s004

(DOCX)

Πίνακα S3.

Ανάθεση σε λιπίδια μοριακό είδος στο MS /MS λειτουργία αρνητικών ιόντων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s005

(DOCX)

Πίνακας S4. αλγόριθμο

βιοδεικτών για καρκίνο του προστάτη, που ιδρύθηκε με τη χρήση του σετ ανακάλυψη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s006

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Koichi Tanaka, Τάκα-Aki Sato, και Noriko Iwamoto για βοήθεια στην εκτέλεση των πειραμάτων HR-MALDI-IMS και Miyuki Ono για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια.