Αφηρημένο

Στόχος

Η τετραμερής α

2-μακροσφαιρίνη (α

2Μ), ένας αναστολέας panproteinase πλάσμα, ενεργοποιείται κατά την αλληλεπίδραση με μια πρωτεϊνάση, και υποβάλλεται σε μια σημαντική διαμορφωτική αλλαγή εκθέτοντας μια θέση αναγνώρισης του υποδοχέα σε κάθε μία από τις υπομονάδες της. Τα ενεργοποιημένα α

2Μ (α

2Μ *) δεσμεύεται σε επιφάνεια GRP78 καρκινικού κυττάρου και προκαλεί πολλαπλασιαστική και αντιαποπτωτικά σηματοδότηση. Μελετήσαμε το ρόλο του α

2Μ * στη ρύθμιση της mTORC1 και TORC2 σηματοδότησης στην ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Μέθοδοι

τεχνικές χρησιμοποιώντας ανοσοκαταβύθιση και κηλίδωση Western, καθώς και ως δοκιμασίες κινάσης, η ενεργοποίηση του mTORC1 και σύμπλοκα mTORC2, καθώς και προς τα κάτω στόχοι ρεύμα μελετήθηκαν. RNAi χρησιμοποιήθηκε επίσης για να φιμώσουν την έκφραση του Raptor, Rictor, ή GRP78 σε παράλληλες μελέτες.

Αποτελέσματα

Η διέγερση των κυττάρων με α

2Μ * προωθεί φωσφορυλίωση της mTOR, TSC2, S6- κινάσης, 4ΕΒΡ, Akt

T308, και Akt

S473 σε συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Rheb, Raptor, και Rictor αυξήθηκε επίσης. α

2Μ * θεραπεία των κυττάρων ανυψωμένη δραστικότητα κινάσης mTORC1 όπως καθορίζεται από δοκιμασίες κινάσης του mTOR ή Raptor ανοσοκαταβύθισης. δραστηριότητα mTORC1 ήταν ευαίσθητη σε LY294002 και ραπαμυκίνη ή επιμόλυνση των κυττάρων με dsRNA GRP78. Κάτω ρύθμιση της έκφρασης Raptor με RNAi σημαντικά μειωμένη α

2Μ * επαγόμενη φωσφορυλίωση S6 κινάσης σε T389 και τη δραστηριότητα κινάσης σε Raptor ανοσοκαταβύθισης. α

2Μ * κύτταρα κατεργασμένα αποδεικνύει για μια διπλή αύξηση της δραστηριότητας της κινάσης mTORC2 όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία κινάσης της Akt

φωσφορυλίωση και τα επίπεδα της p-Akt

S473 στην mTOR και Rictor ανοσοκαταβύθισης S473. δραστηριότητα mTORC2 ήταν ευαίσθητη σε LY294002 και επιμόλυνση των κυττάρων με dsRNA GRP78, αλλά επηρεάζεται από ραπαμυκίνη. Κάτω ρύθμιση της έκφρασης Rictor από RNAi μειώνει σημαντικά α

2Μ * επαγόμενη φωσφορυλίωση της Akt

φωσφορυλίωση S473 στην Rictor ανοσοκαταβυθίσματα.

Συμπέρασμα

Η σύνδεση του α

2Μ * να προστάτη επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων GRP78 απορυθμίζει την ενεργοποίηση mTORC1 και mTORC2 και ενισχύει τη σύνθεση πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Παράθεση:. Misra Ηνωμένο Βασίλειο, Pizzo SV (2012) Receptor-αναγνωρισμένο α

2-μακροσφαιρίνης Συνδέεται στο κελί επιφάνεια-Associated GRP78 και ενεργοποιεί mTORC1 και mTORC2 Σηματοδοσίας σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (12): e51735. doi: 10.1371 /journal.pone.0051735

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 19 Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 5, Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Misra, Pizzo. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να ευδοκιμήσουν

in vivo

εξαρτάται από πολλούς παράγοντες μεταξύ των οποίων είναι το ρεπερτόριο των πρωτεϊνών ρύθμισης περιβάλλον τους. Ενώ το ήπαρ παράγει μεγάλες ποσότητες του αναστολέα πρωτεϊνάσης α

2-μακροσφαιρίνη (α

2Μ) παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα και συνδέεται με την ανάπτυξη του όγκου [1]. α

2Μ επίσης παράγεται τοπικά στο στρωματικών όγκων του ιστού όπως σχετίζεται με τον καρκίνο του προστάτη [2]. Είναι ένας αναστολέας παν-πρωτεϊνάσης η οποία αντιδρά με μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας που προέρχονται από όγκους και ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA). Ενώ το PSA είναι πιο στενά ταυτίζεται με τον καρκίνο του προστάτη, είναι επίσης παράγονται από άλλους όγκους, συμπεριλαμβανομένων του μαστού [3]. Όταν πρωτεϊνάσες επιτίθενται στο «περιοχή δόλωμα» σε καθένα από τα τέσσερα α

υπομονάδες 2Μ, θειόλη εστέρες ρήξη και η πρωτεΐνη υποβάλλεται σε πολύ μεγάλο διαμορφωτική μεταβολή εκθέτοντας θέσεις αναγνώρισης υποδοχέα σε κάθε υπομονάδα [4]. Εκτός από πρωτεϊνάσες, η έκθεση των α

2Μ σε μικρές πρωτοταγείς αμίνες ή αμμωνία, με άμεση επίθεση κατά των εστέρων θειόλης, προκαλεί επίσης μια μεγάλη διαμορφωτική αλλαγή εκθέτοντας αυτές τις περιοχές αναγνώρισης υποδοχέα [4]. Αυτές οι ενεργοποιημένες μορφές που ορίζονται α

2Μ *. Αν και GRP78 (γλυκόζη ρυθμίζεται πρωτεΐνη του κ ~78000) είναι κυρίως γνωστή ως κάτοικος ενδοπλασματικό δίκτυο chaperone, φαίνεται στην κυτταρική επιφάνεια πολλών τύπων κακοηθών κυττάρων [5] – [10]. Η δέσμευση του α

2Μ * σε όγκο επιφάνεια του κυττάρου GRP78 προκαλεί αυτοφωσφορυλίωση του [11], [12] ενεργοποίηση κάτω από το ρεύμα προ-πολλαπλασιαστική και αντι-αποπτωτικών καταρρακτών συμπεριλαμβανομένης RAS /ΜΑΡΚ και σηματοδότηση ΡΙ 3-κινάση /Akt [5] – [10]. Έχει, ως εκ τούτου, έχει προταθεί ότι προς τα πάνω ρύθμιση του κυτταρικής επιφάνειας GRP78 αποτελεί μέρος της επιθετικής φαινοτύπου σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του προστάτη και μελάνωμα [8]. Συνεπής με αυτή την υπόθεση, αυτοαντισώματα έναντι του NH

2-τερματικό πεδίο του GPR78 εμφανίζονται στους ορούς του καρκίνου του προστάτη και ασθενείς με μελάνωμα όπου είναι ένας βιοδείκτης της επιθετικής συμπεριφοράς [13], [14]. Αυτά τα αντισώματα είναι αγωνιστές που δεσμεύονται με την ίδια περιοχή του GRP78 όπου α

2Μ * δεσμεύεται [15]. Αντίθετα, μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον του καρβοξυ-τερματικό πεδίο της GRP78 είναι ανταγωνιστές του α

2Μ * και αντι-GRP78-ΝΗ αντισώματα

2-τερματικό τομέα σε κυτταρική καλλιέργεια και τα ποντίκια [10], [12], [16] – [20]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις και άλλες, υποθέτουμε ότι η ενεργοποιημένη α

2Μ λειτουργεί σαν ένα παράγοντα ανάπτυξης και κυτταρικής επιφανείας σχετιζόμενη GRP78 ως υποδοχέας αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με [5] – [10].

Πίνακας Α . α

2Μ * πρωτεϊνικής σύνθεσης εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση. Πίνακας Β Διαμόρφωση του α

2Μ * σύνθεσης επαγόμενη από πρωτεΐνη στα κύτταρα 1-LN. Οι μπάρες είναι: (1) buffer? (2) α

2Μ * (50 μΜ)? (3) γουορτμανίνη 30 ηΜ /20 λεπτά και στη συνέχεια α

2Μ * (50 ρΜ)? (4) LY294002 (20 μΜ /20 min) και στη συνέχεια α

2Μ *? (5) Η ραπαμυκίνη (100 nm /20 min), τότε α

2Μ *? (6) ακτινομυκίνη D (5 μg /ml /15 min) και στη συνέχεια α

2Μ *. Οι τιμές στον Πίνακα Α και Β είναι η μέση ± SE από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές διαφέρουν σημαντικά σε επίπεδο 5% για το α

2Μ * κύτταρα κατεργασμένα που σημειώνονται με αστερίσκο (*).

Η

Akt είναι Ser /Thr κινάσης εκφράζεται ως ισομορφές, Akt1, Akt2, και Akt3, που κωδικοποιούνται από τρία διαφορετικά γονίδια [21]. Αυτές οι ισομορφές είναι σχεδόν ταυτόσημα σε αλληλουχία αμινοξέων? Ωστόσο, η σχετική έκφραση τους διαφέρει σε διάφορους ιστούς θηλαστικών [21]. Akt είναι ο κύριος καθοδικός τελεστής του ΡΙ μονοπάτι 3-κινάσης και ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και μεταβολισμό. ΡΙ 3-κινάση φωσφορυλιώνει ΡΙΡ2 να δημιουργήσει ΡΙΡ3 που δεσμεύεται με Akt προωθώντας έτσι τη μετατόπιση της προς την μεμβράνη πλάσματος όπου φωσφορυλιώνεται στο Thr308 στον καταλυτικό τομέα με ΡϋΚ1 και Ser473 στο πεδίο υδρόφοβο μοτίβο με mTORC2 [21] – [24]. Η φωσφορυλίωση τόσο σε αυτές τις θέσεις είναι απαραίτητη για την πλήρη ενεργοποίηση της Akt1. Akt1 είναι επίσης φωσφορυλιωμένο συν-translocationally στο Thr450 στο μοτίβο «στροφή» από mTORC2 [25] – [27]. Η στροφή μοτίβο φωσφορυλίωσης της Akt είναι απαραίτητη για την νεοσυντιθέμενη Akt να αναλάβει κατάλληλη αναδίπλωση και τη σταθερότητα της. Μεταλλάξεις του RAS που ενεργοποιούν Akt, εμφανίζονται σε ~ 30% των επιθηλιακών όγκων και ενίσχυση γονιδίου Akt παρουσιάζεται επίσης σε ένα υποσύνολο ανθρώπινων καρκίνων. Παράλληλα, η μερική εκτομή του Akt είναι επαρκής για να αναστείλει την ανάπτυξη όγκων σε ποντικούς ΡΤΕΝ +/- [28], [29]. Σε κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη η υπερέκφραση και ενεργοποίηση των Akt1 συνδέεται με υψηλή προεγχειρητική επίπεδα PSA, υψηλότερους βαθμούς Gleason, και μικρότερους χρόνους υποτροπή της νόσου [29] – [32]. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες δείχνουν μια πολύ βελτιωμένη χρώση των ρ-Ακί

S473 σε φτωχά διαφοροποιημένο καρκίνο του προστάτη [29], [32].

Στο πλαίσιο Α δείχνεται η επίδραση του χρόνου επώασης των κυττάρων με α

2Μ * (50 ρΜ) και πάνελ Β απεικονίζεται η επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων του α

2Μ * για 25 λεπτά επί της εκφράσεως του: ρ-mTOR

T2481 (O)? Raptor (▵)? Rictor (▴)? GβL (□)? p-TSC (•)? και Rheb (▪) όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western. Μια αντιπροσωπευτική ανοσοκηλίδα από τρία σε πέντε πειράματα παρουσιάζεται για κάθε πρωτεΐνη σε Ομάδα Α και Ομάδα Β Η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών φαίνεται σε αυθαίρετες μονάδες φθορισμού και εκφράζεται ως μέσος όρος ± SE από τρία σε πέντε ανεξάρτητα πειράματα. έλεγχοι Protein φόρτωση, είτε μη φωσφορυλιωμένα πρωτεΐνες-στόχους ή ακτίνη, εκτελέσθηκαν τόσο για Ομάδα Α και Ομάδα Β δείχνονται κάτω από τις αντίστοιχες ανοσοκηλίδων.

Η

θηλαστικών στόχος ραπαμυκίνης (mTOR), μια εξελικτικά συντηρημένη Ser /Thr κινάση, είναι ένας βασικός ρυθμιστής της φωσφορυλίωσης Akt (βλέπε αναφορές [33] – [37], και παραπομπές εκεί). Υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη στόχευση mTOR στη θεραπεία των καρκίνων όπως του προστάτη [28], [33], [34], [36], [37]. Αυτός ο στόχος μπορεί να περιπλέκεται από το γεγονός ότι mTOR είναι παρούσα σε δύο φυσικά και λειτουργικά διακριτές πρωτεϊνικά σύμπλοκα που χαρακτηρίζονται ως mTORC1 και mTORC2, αντιστοίχως (βλέπε σχόλια 33-37, και παραπομπές εκεί). Αυτά τα δύο συγκροτήματα διαφέρουν στη ρύθμισή τους, προς τα κάτω τους στόχους, και την ευαισθησία στην ραπαμυκίνη αναστολέα. mTORC1 είναι ένα ομοδιμερές που περιέχει mTOR Raptor, και GβL? είναι ευαίσθητη στην ραπαμυκίνη. Ενεργοποιημένος mTORC1 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων εν μέρει από φωσφορυλίωση άμεσα την μεταφραστική ρυθμιστές S6-κινάσης και eIF4E πρωτεΐνη (4ΕΒΡ) (35) σύνδεση. Akt-επαγόμενη φωσφορυλίωση του PRAS40 και Οφειλέτη προκαλεί διαχωρισμό τους από Raptor και προάγει την πρόσληψη του κατάντη υποστρωμάτων του S6-Kinase1 και 2, 4EBP1 και 4EBP2 (βλέπε αναφορές [33] – [37] και παραπομπές εκεί). Η δέσμευση του Rheb • GTP να mTORC1 οδηγεί σε ενεργοποίηση mTORC1, ενώ σύνδεση με Rheb • ΑΕΠ στην αναστολή της. Η φωσφορυλίωση του TSC2 από Akt1 αναστέλλει ΘΤΡάσης δραστηριότητα της οδηγεί σε αυξημένη φόρτιση GTP για Rheb και την επακόλουθη αύξηση της δραστηριότητας mTORC1 (δείτε τα σχόλια [33] – [37] και εκεί παραπομπές). S6 κινάση ρυθμίζει mTORC1 μέσω αρνητικής ανάδρασης μονοπάτι σηματοδότησης που φωσφορυλιώνει IRS και αναστέλλει ΡΙ 3-κινάση και ενεργοποίηση Akt. Το συγκρότημα mTORC2, εκτός από την mTOR, περιέχει Rictor, GβL, Οφειλέτη, Protor, και mSIN1 και δεν είναι ευαίσθητη σε οξεία παρεμπόδιση ραπαμυκίνη (βλέπε [33] – [37] και παραπομπές εκεί). Ωστόσο, η παρατεταμένη έκθεση mTORC2 να ραπαμυκίνη αναστέλλει mTORC2 σε ορισμένους τύπους κυττάρων [24], [33] – [35]. Protor δεσμεύεται στενά με Rictor, αλλά δεν απαιτείται για δραστικότητα mTORC2 [33] – [35]. Τόσο mTORC1 και mTORC2 ενεργοποιούνται από παράγοντες ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένης της ινσουλίνης και η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα [33] – [35]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους οι αυξητικοί παράγοντες ενεργοποιούν mTORC2 δεν έχουν ακόμη κατανοηθεί πλήρως [33] – [37]. mTORC2 συνεργάτες με ριβοσώματα και αυτό μπορεί να χρησιμεύσει ως μία ανάντι ρυθμιστικός μηχανισμός [38], [39]. Η ινσουλίνη διέγερση φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων προωθεί mTORC2 σύνδεση προς ριβοσώματα και ΡΙ 3-κινάσης σηματοδότησης [38], [39]. GβL δεσμεύει mTORC1 και mTORC2 κοντά στην περιοχή της κινάσης και είναι απαραίτητη για την ακεραιότητα mTORC2. Οφειλέτη συνδέεται επίσης με δύο mTORC1 και mTORC2 κοντά στην περιοχή της κινάσης και αρνητικά ρυθμίζει τόσο mTORC1 και τη δραστηριότητα mTORC2 [33] – [37].

Σε προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι α

2Μ * ΝΗ

2 σύνδεση προς κυτταρική επιφάνεια που σχετίζεται GRP78 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη προκαλεί πολλαπλασιασμό και αντι-αποπτωτική σηματοδότηση. Προκατεργασία των κυττάρων με αναστολείς αυτών των οδών σηματοδότησης, προθεραπεία με αντισώματα έναντι της καρβοξυ-τερματικό πεδίο της GRP78, ή επιμόλυνση των κυττάρων με dsGRP78 RNA, αναστέλλει ριζικά αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης [10], [12], [16] – [20] . Η διέγερση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με α

2Μ * επάγει επίσης σύνθεση GRP78 οποία εν μέρει προκαλείται από τον παράγοντα μεταγραφής TFII-I από το κύτταρο επιμόλυνση με dsTFII-Ι RNA καταστέλλει σημαντικά GRP78 αυξορρύθμιση [40]. Αυτή η επεξεργασία αναστέλλει επίσης κυτταρικής επιφάνειας μετατόπιση του TFII-I, προωθούνται εισόδου ασβεστίου, και αποπτωτικά σηματοδότηση [40]. Η διέγερση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με α

2Μ * προκαλεί επίσης μεταγραφικές και μεταφραστικές αυξορρύθμιση της σύνθεσης PSA [10], η οποία εκκρίνεται και σύμπλοκα με α

2Μ. Η επεξεργασία των κυττάρων με α

συμπλόκου 2Μ-PSA προάγει σύνθεση DNA και πρωτεϊνών και ρυθμίζει αυξητικά RAS /ΜΑΡΚ και /Akt οδοί παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται σε α σηματοδότηση

2Μ-ΝΗ

2 διεγερμένων κυττάρων ΡΙ 3 κινάσης [10 ]. Όπως α

2Μ-ΝΗ

2, α

2Μ-PSA, προκαλεί μία αυξημένη έκφραση του ρ-S6 κινάση, ρ-Akt

T308 και ρ-Ακί

S473, το τελεστή συστατικά των ενεργοποιημένων mTORC1 και mTORC2 [10] σηματοδότησης. Λόγω του κρίσιμου ρόλου του mTOR σηματοδότησης στην ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση, και τις παρατηρήσεις μας επί α

2Μ * επαγόμενη ανάπτυξη του προστάτη καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αυξορρύθμιση της ΡΙ 3-κινάσης /Akt σηματοδότηση [6], [7 ], [9], [10], [12], [16], [17], [18], έχουμε αξιολογήσει το ρόλο της mTORC1 και mTORC2 οδών σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη που διεγείρεται με α σηματοδότησης

2Μ *. Για να εκτιμηθεί η εξειδίκευση της κυτταρικής επιφάνειας GRP78 σε α

2Μ * επαγόμενης γεγονότα σηματοδότησης, έχουμε σιγήσει την έκφραση της GRP78 με RNAi καθώς και προεπεξεργασία των κυττάρων με αντισώματα εναντίον του καρβοξυ-τερματικό πεδίο της GRP78. Για τον προσδιορισμό της ειδικότητας της mTORC1 στην ενεργοποίηση κατάντη υπόστρωμα του S6 κινάσης και του mTORC2 σε φωσφορυλίωσης Akt

S473, έχουμε απασχολούνται Raptor και Rictor RNAi θεραπεία, αντίστοιχα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι α

2Μ * ενεργοποιεί την κινάση mTORC1 όπως καθορίζεται από S6-κινάσης και φωσφορυλίωση 4EBP1 και mTORC2 κινάσης όπως καθορίζεται από Akt

S473 φωσφορυλίωση. Σίγαση έκφραση γονιδίων GRP78 με RNAi ή θεραπεία με αντισώματα GRP78 σημαντικά κατέστειλε α

2Μ * επαγόμενη ενεργοποίηση mTORC1 και mTORC2 σε αυτά τα κύτταρα. Αυτές οι μελέτες αποδεικνύουν περαιτέρω το ρόλο των κυκλοφορούντων α

2Μ, ένα τηγάνι αναστολέα πρωτεϊνάσης, ως αυξητικός παράγοντας και του συνοδού GRP78 ως υποδοχέας αυξητικού παράγοντα σημαντικό για την κυτταρική ανάπτυξη σε παθοφυσιολογικές περιβάλλοντα.

Ένα αντιπροσωπευτικό ανοσοστύπωμα ρ-S6 κινάση (O) και ρ-4EBP1 (•) από τρία σε πέντε πειράματα παρουσιάζεται για κάθε πρωτεΐνη σε Πάνελ Α και Β ρ-S6 κινάση (O) και ρ-4EBP1 (•) εκφράζονται σε αυθαίρετες μονάδες φθορισμού ως το μέσον ± SE από τρεις σε τέσσερις ανεξάρτητα πειράματα. Ο έλεγχος της πρωτεΐνης φόρτωσης για Ομάδα Α και Ομάδα Β εμφανίζονται κάτω από τις αντίστοιχες ανοσοκηλίδων.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά