Αφηρημένο

Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από λιπώδη ιστό (ADSCs) είναι μια σημαντική πηγή των κυττάρων για την αναγεννητική ιατρική. Η θεραπευτική επίδραση του πολιτισμού-επεκτάθηκε προέρχονται λιπώδη βλαστικά κύτταρα έχει αποδειχθεί? Ωστόσο, η βέλτιστη ξενο-ελεύθερη συνθήκες καλλιέργειας μένει να καθοριστεί. Οι ασθενείς με καρκίνο, ειδικά εκείνων που υποβάλλονται σε επεμβατική χειρουργική, αποτελούν μια υποομάδα των ασθενών που θα μπορούσαν να ωφεληθούν από αυτόλογη μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων. Αν και αναγεννητική δυναμικό των ADSCs τους θα μπορούσε να επηρεαστεί από την ασθένεια ή /και τη θεραπεία, δεν είμαστε ενήμεροι για κάθε μελέτη που αξιολόγησε το θεραπευτικό δυναμικό του ADSCs που απομονώθηκε από ασθενείς με καρκίνο σε σχέση με εκείνη του ADSCs προέρχονται από υγιή άτομα. Εδώ αναφέρουμε ότι ADSCs απομονωθεί από subabdominal λιπώδη ιστό των ασθενών με ουρολογικά νεοπλάσματα απέδωσε παρόμοια κινητική ανάπτυξη, παρουσίασε ισοδύναμο δείκτες μεσεγχυματικών επιφάνεια και έδειξε παρόμοια δυναμικό διαφοροποίησης σε διακριτές γραμμώσεις μεσοδέρματος κυττάρων: λιποκύτταρα, χονδροβλαστών και οστεοβλαστών από ADSCs απομονωθεί από τον λιπώδη ιστό του ηλικία συμφωνημένα μη ογκογόνους συμμετέχοντες, όλα κάτω από συνθήκες καλλιέργειας ανάπτυξης ξενο-free. Μοριακή καρυότυπο των γονιδιωμάτων ADSCs ασθενή επεκτάθηκε δεν έδειξαν αλλοιώσεις σχετίζονται με την ασθένεια που δείχνει την ασφάλειά τους. Επιπλέον, κυστίδια & lt? 100 nm προσδιορίζονται ως εξωσώματα (EXOs), η οποία μπορεί να είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για τις αποδίδονται θεραπευτικές επιδράσεις παρακρινή των ADSCs ήταν ουσιαστικά απομονώνονται από ADSCs και έδειξε ισοδύναμη περιεκτικότητα miRNA ανεξάρτητα προήλθαν από ασθενείς με καρκίνο ή μη ογκογόνο συμμετέχοντες δείχνει ότι οι δυνατότητες επισκευής των ξενο-free επεκταθεί ADSCs δεν επηρεάζεται από την κατάσταση του ασθενούς και, ως εκ τούτου ξενο-ελεύθερου πολιτισμού τους επεκτάθηκε ADSCs πρέπει να είναι κατάλληλο για μεταμόσχευση αυτόλογων βλαστοκυττάρων σε ένα κλινικό περιβάλλον

Παράθεση:. García -Contreras Μ, Βέρα-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, García-Verdugo JM, Oltra Ε (2014) θεραπευτικές δυνατότητες του Ανθρώπου λιπώδης βλαστικά κύτταρα προερχόμενα (ADSCs) από Καρκινοπαθών: μια πιλοτική μελέτη. PLoS ONE 9 (11): e113288. doi: 10.1371 /journal.pone.0113288

Επιμέλεια: Carlos Eduardo Ambrosio, Τμήμα Ζωικής Επιστημών και Μηχανικής Τροφίμων, Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, Pirassununga, SP, Βραζιλία, Βραζιλία

Ελήφθη: Απρίλιος 11, 2014? Αποδεκτές: 21 Οκτ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Νοέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 García-Κοντρέρας et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Generalitat Valenciana (χορηγεί AP-014-10 και AP-222-11 με JMHA), Universidad Catolica de Valencia » San Vicente Mártir «(επιχορήγηση 2012-006-010 να JMHA) (επιχορηγήσεις 2011-011-02, 2011-011-04 και 2012-011-008 να ΕΟ), και το AITEX Ινστιτούτο Τεχνολογίας (επιχορήγηση 2011-011-015 να ΕΟ). MGC έλαβε υποτροφία από το Universidad Catolica de Valencia «San Vicente Mártir». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς έχουν δηλώσει δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ανθρώπινο λιπώδης ιστός είναι ένα άφθονο και προσβάσιμη πηγή πολυδύναμων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs), που κατέχουν μεγάλες δυνατότητες για θεραπευτικές εφαρμογές της αναγεννητικής ιατρικής και της μηχανικής ιστών [1] – [3]. έχουν MSCs έχουν δειχθεί ότι είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε πολλούς τύπους κυττάρων από τη γενεαλογία μεσοδέρματος (οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα και λιποκύτταρα), αλλά και σε μη μεσοδέρματος κύτταρα γράμμωσης (νευρώνες, καρδιομυοκύτταρα και εξωδερματική δέρμα) [4] – [7], τη μείωση της φλεγμονής σε κατεστραμμένους ιστούς, διεγείρουν την αγγειογένεση και να μειώσει την απόπτωση [8] – [11]. MSCs ρόλο στην διαμόρφωση της επισκευής ιστού και ανοσορύθμιση έχει αποδοθεί σε παρακρινής δυναμικό έκκριση παράγοντα τους, μιτοχονδριακή μεταφορά και εξωσωμάτων (εξω) ικανότητα έκκρισης [12] – [14]. Οι EXOs εκκρίνονται bilipid κυστίδια μεμβράνης ~50-100 nm με ένα σύμπλοκο φορτίο που εύκολα εσωτερικεύονται από τα κύτταρα-στόχους επαγωγής ποικίλες φυσιολογικές επιδράσεις [15] – [17]

Μέχρι σήμερα διάφορες μεθόδους απομόνωσης και επέκτασης. του MSCs έχουν εφαρμοστεί. Τα περισσότερα περιλαμβάνουν παράγωγα ζωικών προϊόντων, όπως ορό εμβρύου μόσχου που είναι μια πηγή των μολυσματικών ιών, βακτηρίων, μυκοπλάσματα, prions και άλλους παθογόνους ή τοξικούς παράγοντες, και ξενογενών αντιγόνα τα οποία θα μπορούσαν να καροτσες ανεπιθύμητες ανοσοαποκρίσεις [18], [19]. Xeno-ελεύθερου πολιτισμού θα μπορούσε να ενισχύσει την ασφάλεια και την ποιότητα των μεταμοσχευμένων

in vitro

-επεκταθούν βλαστικών κυττάρων [20], [21] και θα επιτρέψει την καθιέρωση τυποποιημένων μεθόδων επέκτασης, αποφεύγοντας παρτίδα σε παρτίδα παραλλαγές. Ωστόσο νεωτερισμού τους και η μεγάλη διαφορά στην τιμή να περιορίσει τον αριθμό των μελετών που έχουν χρησιμοποιηθεί ξενο-ελεύθερο μέσο μέχρι τώρα.

Ακόμα κι αν αλλογενή έγχυση

in vitro

επεκτάθηκε MSCs φαίνεται σαν μια πολλά υποσχόμενη επιλογή για ορισμένους σκοπούς [22] – [25] οι περισσότερες από τις εν εξελίξει ή ολοκληρωμένες κλινικές δοκιμές μέχρι σήμερα βασίζονται σε αυτόλογες θεραπείες [26]. Με αυτή την έννοια, η προχωρημένη ηλικία και η κατάσταση της νόσου θα μπορούσε να περιορίσει τις επιλογές των ατόμων, ιδίως δεδομένου ότι ο αριθμός και η αναγεννητική δυναμικό των MSCs φαίνεται να συσχετίζονται αρνητικά με την ηλικία [27], [28] και της γήρανσης του πληθυσμού βρίσκεται σε αύξηση.

Ουρολογική ασθενείς με καρκίνο είναι καλοί υποψήφιοι για θεραπευτικά βλαστοκυττάρων που βασίζεται. Βλαστικών κυτταρικές θεραπείες κατευθύνονται προς την προώθηση της επούλωσης μετά από τις επεμβατικές διαδικασίες χειρουργική επέμβαση που συχνά υφίστανται ή έχουν σχεδιαστεί για να μειώσει την ακράτεια ούρων, ένα κοινό δευτερεύον πρόβλημα που συνδέεται με προστατεκτομή θα μπορούσε να οδηγήσει προς όφελος τους. Επίσης,

in vitro

επεκταθεί αυτόλογη MSCs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την προγραμματισμένη χειρουργικές επεμβάσεις αναδιαμόρφωση όργανο ή ακόμη και πλήρης μηχανική οργάνων για μεταμόσχευση. Ωστόσο, δεν είμαστε γνωρίζει καμία μελέτη επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση της θεραπευτικής δυναμικού και της ασφάλειας των ουρολογικών MSCs καρκίνου για αυτόλογη μεταμόσχευση.

Εδώ, θα πραγματοποιηθεί μια συγκριτική ανάλυση των MSC που λαμβάνονται από το κοιλιακό λίπος των ασθενών με καρκίνο ουρολογικών και μη-ογκογόνο συμμετέχοντες επεκταθεί

in vitro

υπό ξένο χωρίς όρους, σε μια προσπάθεια να προσδιορισθεί η καταλληλότητά τους για την αυτόλογη θεραπείες που βασίζονται σε κύτταρα, χρησιμοποιώντας τις βέλτιστες συνθήκες για την κλινική. Χαρακτηρισμός περιλαμβάνονται σύμπλεγμα διαφοροποίησης πρότυπα (CD) της έκφρασης και της μορφολογίας, κινητική ανάπτυξη, την πλαστικότητα, την απελευθέρωση EXOs ως μέτρο των MSCs παρακρινούς θεραπευτικές δυνατότητες και την ασφάλεια.

Υλικά και Μέθοδοι

συλλογή δειγμάτων και ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη ξεκίνησε μετά από έγκριση από την τοπική Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Universitario y Politecnico La Fe (Βαλένθια, Ισπανία). Φρέσκο ​​αποκόπηκε το κοιλιακό λίπος ιστού συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε νεοπλασματικών ουρολογικές χειρουργική θεραπεία ή από μη ογκογόνους συμμετέχοντες μετά την αντίστοιχη συγκατάθεση υπεγράφη.

Θέματα

Όλα τα δείγματα αποβλήτων υλικών που συλλέγονται ως μια πλευρά -προϊόν της χειρουργικής επέμβασης, από ασθενείς με καρκίνο (n = 5) που υποβάλλονται σε εκλεκτική χειρουργική επέμβαση κοιλιοπλαστικής στο Τμήμα Ουρολογίας, Νοσοκομείο Universitario y Politecnico La Fe, (Βαλένθια, Ισπανία) ή μη-ογκογόνο ίδιας ηλικίας (± 5 y) συμμετέχοντες ( n = 2) με ένα παρόμοιο εθνικό υπόβαθρο (Πίνακας 1). Μη-ογκογόνο συμμετέχοντες αντιστοιχούσαν σε πολυοργανική δωρητές. Για όλες τις διαδικασίες που περιγράφονται ADSCs τόσο από ογκολογικών και μη ογκολογικών ασθενών, όπως, αντίστοιχα, ελήφθησαν και αναλύθηκαν τα δείγματα δοκιμής και ελέγχου, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Η

Απομόνωση ADSCs

Απομόνωση ADSCs διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα μηχανικό και ενζυματική μέθοδο. Ο λιπώδης ιστός μεταφέρθηκε και πλύθηκε με αλατούχο διάλυμα NaCl 0,9% (Β Braun, cat. 12606097), κατακερματισμένη με μία χειρουργική λεπίδα και πέψη με 1 mg /ml τύπου Ι κολλαγενάση (τεχνολογίες Ζωή, cat. 17100-017), για 2 ώρες στους 37 ° C με ανακίνηση. Η πέψη ιστός διηθείται μέσω γάζας ώστε να διαχωρίζονται από το άπεπτο ιστό και φυγοκεντρήθηκε στα 500 g για 7 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Το υπερκείμενο (επιπλέοντα λιποκύτταρα) απορρίφθηκε. Το σφαιρίδιο (ADSC κλάσμα) επαναιωρήθηκε σε ισορροπημένο διάλυμα άλατος του Hank (HBSS + Ca + Mg) (Gibco, cat. 14025092) + 1% BSA (Sigma, cat. A2153), διηθήθηκε μέσω ενός νάιλον πλέγματος 140 μm και φυγοκεντρήθηκαν στα 500 g για 7 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ερυθροκυττάρων σε πάγο κατά τη διάρκεια 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν πάλι στα 500 g για 7 λεπτά στους 4 ° C. Τα απομονωμένα κύτταρα μετά απλώθηκαν και επεκτάθηκαν σε μέσο καλλιέργειας. Το μέσο καλλιέργειας ήταν MesenCult-XF Medium (τεχνολογίες StemCell, cat. 05420) συμπληρωμένο με 1% (ν /ν) πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (10,000 U /ml πενικιλίνη, 10000 μg /ml στρεπτομυκίνη, Gibco cat.15140-122), και 2 mM Ε-γλουταμίνη (Gibco, cat. 25030-081).

In vitro

επέκταση και δειγματοληψία του ADSCs

ADSCs καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5

2 ατμόσφαιρα αέρα με μέσο% CO αλλάζει κάθε 3 ημέρες. Όταν τα κύτταρα έφθασαν περίπου 80% συρροή, υποκαλλιέργειας (διέλευση) πραγματοποιήθηκε με επιμερισμός χρησιμοποιώντας MesenCult-ACF διαστάσεως Kit (τεχνολογίες StemCell, κατ. 05426) (6 ml /φιάλη) για 5 λεπτά, μετά από ένα πλύσιμο σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS ). Τα κύτταρα μετρήθηκαν και επανα-επιστρώθηκαν σε καλλιέργεια Τ-75 φιάλη σε μια πυκνότητα 250.000 κυττάρων. Το διάλυμα διαστάσεως εξουδετερώθηκε χρησιμοποιώντας τον ίδιο όγκο του MesenCult-ACF Enzyme Inhibition Solution (τεχνολογίες StemCell, κατ. 05428). εναιωρήματα κυττάρων φυγοκεντρήθηκαν (500 g, 7 λεπτά) και τα υπερκείμενα απορρίπτονται. Τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο σε πυκνότητα ενδεικνυόμενη. Υπολογίζονται έγινε στο θάλαμο ενός Neubauer χρησιμοποιώντας δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου για τα ζωντανά κύτταρα (Sigma Aldrich, γάτα. Τ8154). Πριν από κάθε πέρασμα, οι καλλιέργειες φωτογραφία τεκμηριωμένες. διπλασιασμούς πληθυσμού (PD) υπολογίστηκαν με τη χρήση του τύπου

x

= [log

10 (NH) – log

10 (NI)] /log

10 (2), όπου ΝΗ είναι ο αριθμός των κυττάρων και συγκομιδής NI εμβολιάστηκαν αριθμό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Για να αποκτήσετε την αθροιστική διπλασιασμό του πληθυσμού, ο πληθυσμός διπλασιάζεται για κάθε διέλευση υπολογίστηκε και στη συνέχεια προστέθηκε στο προηγούμενο αριθμό πληθυσμού πέρασμα διπλασιασμού. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των εξαιρετικά μορφολογία, το δυναμικό διαφοροποίησης, γήρανση και ανάλυση επιτόπου. Μερικά δείγματα σφαιροποιήθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε -80 ° C για την απομόνωση του RNA.

Η κυτταρομετρία ροής

Περίπου 0,5-1 × 10

6 κύτταρα σημάνθηκαν με την ακόλουθη φθοριζόντως επισημασμένο αντι -ανθρώπινη αντισώματα: CD73, CD90, CD105, CD34, CD11b, HLA ABC και HLA-DR (Πίνακας 2) και αναλύθηκαν σε διαφορετικούς συνδυασμούς. Συνοπτικά τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και προστατεύεται από το φως, πλύθηκε (3Χ) με PBS φυγοκέντρηση στα 500 g στους 4 ° C για 7 λεπτά. Τα πλυμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml PBS. Τα επισημασμένα δείγματα αναλύθηκαν με διαχωρισμό κυττάρου που ενεργοποιείται ανάλυση φθορισμού ροής (FACS) (Beckman Coulter Cytomics, FC 500) στα συγκεκριμένα κανάλια φθορισμού για κάθε φθοριοχρώμιο. Αγροτεμάχια δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης CXP (Beckman Coulter).

Η

αδιπογενική διαφοροποίηση

Για αδιπογονική διαφοροποίησης, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων που περιέχει 2 ml Mesencult-XF βασική μέσο συμπληρωμένο με αδιπογονική συμπληρώματα διεγερτική (MesenCult Αδιπονενικής διεγερτική Συμπληρώματα (Άνθρωπος), cat. 05403) για 15 ημέρες, κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας (37 ° C, 5% CO

2). μέσα καλλιέργειας δεν άλλαξε εκτός μέσο έγινε κίτρινο /πορτοκαλί χρώμα, οπότε έγινε μισή μέσο αλλαγής. Μετά την περίοδο επώασης των 15 ημερών, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS. Σταθεροποίηση με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) για 30 λεπτά ακολουθήθηκε από δύο πλύσεις σε απεσταγμένο νερό και ένα από τα 60% ισοπροπανόλης, το καθένα για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αδιπογενική διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε με χρώση Οίΐ Red Ο (Sigma, cat. O0625) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με βαφή Oil Red Ο σε RT για 10 λεπτά σε 2 ml. Dye απομακρύνθηκε προσεκτικά και η πλάκα πλύθηκε τέσσερις φορές με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο (Nikon Eclipse TE2000-U φως ανεστραμμένο μικροσκόπιο, Nikon Inc, Melville, ΝΥ, USA) και φωτογραφήθηκαν. Λιποκύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως κύτταρα με κόκκινο-βάφονται κυστίδια λιπιδίων [4], [20], [30].

Οστεογονική διαφοροποίηση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε έξι φρεατίων που περιέχει 2 ml MesenCult MSC Basal Medium (Άνθρωπος) (StemCell τεχνολογίες, cat. 05401) συμπληρωμένο με Οστεογονικό διεγερτική συμπλήρωμα (τεχνολογίες StemCell, cat. 05405), β-γλυκεροφωσφορική 1Μ (τεχνολογίες StemCell, cat. 05406), δεξαμεθαζόνη (τεχνολογίες StemCell, cat. 05407) και ασκορβικό οξύ (τεχνολογίες StemCell, cat. 07157) για 15 ημέρες (Οστεογενής μέσο). Οι πλάκες διατηρούνται σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2 και το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε τρεις ημέρες. Μετά την περίοδο των 15 ημερών, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS. Μετά την σταθεροποίηση των κυττάρων με PFA 4%, για 30 λεπτά τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με αποσταγμένο νερό. Ερυθρό της αλιζαρίνης S χρώση (Sigma, cat. A5533) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί οστεογονική διαφοροποίηση χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 2 ml διαλύματος αλιζαρίνης νατρίου σε RT για 30 λεπτά. Η βαφή απομακρύνθηκε προσεκτικά και εκτεταμένη πλύση με απεσταγμένο νερό που ακολουθείται. Τα σταθερά και βαμμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν με τη χρήση οπτικού μικροσκοπίου (Nikon Eclipse TE2000-U ανεστραμμένο μικροσκόπιο, Nikon Inc, Melville, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και φωτογραφήθηκαν [20], [30].

Χονδρογόνα διαφοροποίησης

για χονδρογονική διαφοροποίηση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε έξι φρεατίων που περιείχε 2 ml πλήρους μέσου που έχει συμπληρωθεί με StemPro χονδρονένεση διαφοροποίηση Kit (Gibco, cat. A10071-01) για 15 ημέρες. Οι πλάκες διατηρούνται σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2 και μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε τρεις ημέρες. Μετά την περίοδο των 15 ημερών, το μέσο διαφοροποίησης απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS. Στη συνέχεια, σταθεροποιήθηκαν με 2% γλουταραλδεϋδη για 20 λεπτά και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε μπλε της Αλσατίας διάλυμα 8GX (Acros οργανικά, cat. 400460100) όλη τη νύκτα σε RT. Η βαφή απομακρύνθηκε προσεκτικά και η πλάκα πλύθηκε τρεις φορές με 0.1 Μ HCl και δύο φορές με PBS. Μετά τη στερέωση και χρώση, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο (Nikon Eclipse TE2000-U ανεστραμμένο μικροσκόπιο, Nikon Inc, Melville, ΝΥ, USA) και φωτογραφήθηκαν [4], [20], [30].

γήρανση σχετίζεται β-γαλακτοσιδάσης χρώση

εξαρτώμενη από το ρΗ γήρανση σχετίζονται με την δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης SA-β-gal (Cell Signaling Technology, cat. 9860) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα κυανού γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάσης κηλίδα (X-gal) όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Σε παρατηρήθηκαν οι ακόλουθες πρωί κύτταρα και εικόνες που λαμβάνονται στο πλαίσιο ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Inc, Melville, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ).

RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα με το mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, cat. AM1560) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. RNA αποδόσεις και η καθαρότητα προσδιορίστηκαν από τις nm αναλογίες 260/280 και 260/230 με ένα Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας 100-200 ng του συνολικού RNA και M-MuLV αντίστροφη μεταγραφάση (New England Biolabs, cat. EP0352) με ολιγο-άΤ πλήρωσης. Το cDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τους ΑΒΙ GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Boston, ΜΑ) και οι ακόλουθες συνθήκες κύκλων: 94 ° C για 30 s, 54-60 ° C (ανάλογα με το αστάρι Tm) 30 s και 72 ° C για 30 s (35 κύκλοι), μετά από μία μόνο αρχική κύκλο μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά. Τα σύνολα εκκινητών PCR παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν επί πηκτής αγαρόζης 2% και απεικονίστηκαν με realsafe λεκέ.

Η

qRT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από ADSCs και εξωσώματα με την mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, cat. AM1560) χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας miScript II RT Kit (Qiagen, cat. 218161) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA που χρησιμοποιήθηκαν για πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας κιτ miScript SYBR Green ΡΟΚ (Qiagen, κατ. 218073). Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται εμπρός φαίνονται στον Πίνακα 4.

Η

απομόνωση εξωσωμάτων

EXOs καθαρίστηκαν από ξενο-δωρεάν υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας των παραγώγων λιπώδους βλαστοκυττάρων με υπερφυγοκέντρηση. Κλάσματα υπερκειμένου συλλέχθηκαν από καλλιέργειες ADSC φυγοκεντρήθηκαν στα 300 g για 10 λεπτά, 2000 g για 20 λεπτά και 10.000 g για 20 λεπτά για την εξάλειψη των μεγάλων νεκρά κύτταρα και υπολείμματα. Μετά, διήθηση μέσω φίλτρων 0.22 μm-για την εξάλειψη ακαθαρσιών, το τελικό υπερκείμενο υπερφυγοκεντρήθηκε σε 110.000 g για 70 λεπτά για να σφαιροποιηθούν EXOs. Τα ανακτημένα EXOs πλύθηκαν με PBS και φυγοκεντρήθηκαν πάλι στα 110000 g για 70 λεπτά. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 50 μΐ PBS για να ληφθεί ένα συμπυκνωμένο κλάσμα ΕΞΩ.

Western ανάλυση κηλίδος

ADSCs και EXOs λύθηκαν σε Αντιδραστήριο Tissue Protein Extraction (Τ-PER) (Thermo Scientific, γάτα. 78510) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με τη μέθοδο Bradford (Thermo Scientific Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay, cat. ΡΙ-23200). Τα δείγματα αναμίχθηκαν με μη αναγωγικό τρις-γλυκίνης ρυθμιστικού διαλύματος SDS δείγμα, στη συνέχεια θερμάνθηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά και φορτώνεται σε πήκτωμα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου. Η πηκτή έτρεξε κάτω από συνθήκες μετουσίωσης σε 80 V για 2 ώρες, στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (GE Healthcare Life Sciences, κατ. 0485288). Μετά τη μεταφορά, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 3% άπαχο γάλα PBS για 2 ώρες και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες με κουνελιού αντι-CD63 (Abgent, cat. AP5333b). Μετά την πλύση σε PBS-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού HRP-συνδεδεμένη δευτερεύον αντίσωμα (Santacruz, cat. Sc-2004) και αναπτύχθηκε με υπόστρωμα Luminata Forte Western HRP (Millipore, cat. WBLUF0500) χρησιμοποιώντας ένα ImageQuant LAS 4000 σύστημα ανίχνευσης chemiluminesce.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

για την λεπτήν ανάλυση, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες permanox (8 και διαφάνειες θάλαμο) με πυκνότητα 3,5 × 10

3 κύτταρα /θάλαμος. Οι θάλαμοι διατηρούνται σε ένα υγροποιημένο επωαστή (37 ° C, 5% CO

2) και το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες έως ότου υπο συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με πρόσφατα παρασκευασμένο μέσο, ​​μία φορά με PBS και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 3.5% γλουταραλδεϋδη για 30 λεπτά στους 37 ° C. Το διάλυμα στερεωτικό απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 2% ΟΣΟ

4 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και χρωματίζονται σε 2% οξικό ουρανύλιο στο σκοτάδι για 1 ώρα στους 4 ° C. Τέλος, τα κύτταρα αφυδατώθηκαν σε αιθανόλη, ξεπλύθηκε με οξείδιο του προπυλενίου (Lab Baker, Deventry, Ολλανδία) και τα ενσωματωμένα όλη τη νύκτα σε Araldite (Durcupan, Fluka, Buchs SG, Ελβετία). Μετά τον πολυμερισμό, ενσωματωμένο καλλιέργειες αποσπάστηκαν από το κλείστρο θάλαμο και κολλημένα (Σούπερ κόλλα, Loctite) για Araldite μπλοκ. Ημι-λεπτές τομές (1,5 μm) κόπηκαν με ένα υπερμικροτόμο (Ultracut UC-6, Leica, Heidelberg, Germany) συναρμολογείται επί slides και βάφτηκαν με 1% toloudine μπλε. Υπέρλεπτες τομές (70 nm) παρασκευάσθηκαν με την υπερμικροτόμο και χρωματίζονται με κιτρικό μόλυβδο. Εικόνες ελήφθησαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (FEI Tecnai Πνεύμα G2, Αϊντχόβεν, Ολλανδία), χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Morada, Soft Imaging System, η Olympus).

Τα καθαρισμένα EXOs μονιμοποιήθηκαν με 1% γλουταραλδεΰδη σε PBS . Μετά την έκπλυση, μία σταγόνα 20 μι του εναιωρήματος φορτώθηκαν επάνω σε ένα Formvar /πλέγμα καλυμμένο με άνθρακα, αρνητικά βάφονται με 3% (β /ο) υδατικού φωσφοβολφραμικό οξύ για 1 λεπτό, και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ) σε ένα Tecnai πνεύμα G-2 συσκευές? (FEI, Eindhoven, Ολλανδία).

Μοριακός καρυότυπος

συστοιχίες Affymetrix CytoScan750 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του αριθμού αντιγράφων κέρδη και οι ζημίες της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) σε δείγματα ADSCs των ασθενών και των μη ογκογόνων συμμετέχοντες . Αυτοί οι πίνακες περιέχουν περισσότερα από 2,6 εκατομμύρια αριθμό αντιγράφων δείκτες των οποίων 750.000 είναι «γονότυπο-θέση» SNPs και 1,9 εκατομμύρια είναι μη-πολυμορφικοί ανιχνευτές. DNA εκχυλίστηκε από ADSCs για καθένα από τα δύο ογκολογικών ανάλυση των δειγμάτων ασθενών, με τη χρήση ενός QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, cat. 51306), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. την ποσότητα και την ποιότητα του DNA μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) με αναλογίες απορρόφηση στα 260/280 nm. Η ακεραιότητα του συνολικού DNA μετρήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 0,8%. αριθμό αντιγράφων και γονοτυπική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Affymetrix χρωμόσωμα Analysis Suite (ΠΟΔ) λογισμικού στην Υπηρεσία Array, Γονιδιωματική Μονάδα IIS La Fe.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν από το μη συζευγμένο 2-tailed

t

δοκιμών ή πολλαπλών t-test του Student, όπως υποδεικνύεται. Η μέθοδος διόρθωσης Holm-Sidak χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών σε πολλαπλές συγκρίσεις. Δεδομένα αντιστοιχούσε στο μέσο ± SD από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA)? αξιών με

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Πληθυσμός και κυτταρικές αποδόσεις

Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 60, κυμαίνονται μεταξύ 38 και 72 χρόνια, (n = 5), και μη-ογκογόνο συμμετέχοντες μέση ηλικία ήταν 59, σειρά 41 έως 77, η (n = 2) (Πίνακας 1). Οι ασθενείς έπασχαν από νεφρική, της ουροδόχου κύστης ή του προστάτη και υγιή ιστό προήλθε από δότες που υπέστησαν τυχαία τραυματική θάνατο.

Μέση λιπώδη ιστό που προέρχεται απόδοση βλαστικών κυττάρων μετά την αρχική επέκταση ήταν (2,28 ± 4,62) × 10

5 και (3,10 ± 5,4) × 10

5 κύτταρα ανά γραμμάριο ιστού είτε από ασθενή ή μη-ογκογόνο συμμετεχόντων, αντίστοιχα. Οι αποδόσεις ήταν εξαιρετικά μεταβλητή με μια τάση να λάβουν χαμηλότερες αποδόσεις από μεγαλύτερα κομμάτια του ιστού (Πίνακας 1).

δυνητική ανάπτυξη και γήρανση

Για να διερευνήσουν το δυναμικό ανάπτυξης των κυττάρων των κυττάρων είτε από ομάδα συμμετεχόντων, διπλασιασμούς πληθυσμού (PD) του κάθε δείγματος προσδιορίστηκε σε κάθε πέρασμα έως δίοδος 6, που ισοδυναμεί με 58 ημέρες σε καλλιέργεια, κατά μέσο όρο (Σχήμα 1). Η διαφορά μεταξύ των ασθενών (6.292 ± 1.394) και του δότη (4.869 ± 1.801) PD, δεν ήταν σημαντική (p & gt? 0,5), όπως καθορίζεται από αταίριαστο ανάλυση t-test των δεδομένων. Ημι-συρροή σε χωρίο 1 κυμαινόταν περίπου 3,6 ± 1,2 PD για τους ασθενείς και 2.02 ± 1.7 PD για τους μη ογκογόνους συμμετεχόντων (Εικόνα 1), η οποία συμπίπτει με προηγούμενες εκθέσεις [31] -. Τα [33]

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως αθροιστική διπλασιασμούς πληθυσμιακή της ADSCs προέρχεται από πέντε διαφορετικές ασθενείς με καρκίνο και δύο μη ογκογόνων συμμετεχόντων (δότες) υπό συνθήκες καλλιέργειας ξενο-free. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν στο τέλος της κάθε διόδου και σωρευτικών διπλασιασμούς πληθυσμού υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Αν και δεν παρατηρήθηκε μη φυσιολογική συμπεριφορά ανάπτυξης των καρκινικών ADSCs ασθενούς, ήταν σημαντικό να προσδιοριστεί εάν αυτά τα κύτταρα θα μπορούσαν να παρουσιάζουν πλεονεκτήματα ανάπτυξης για μεγαλύτερες περιόδους του πολιτισμού. Προκειμένου να αξιολογηθεί επέκταση χρόνου που σχετίζονται με κυτταρική γήρανση, δύο από τα δείγματα που αναλύθηκαν, που αντιστοιχεί σε ασθενείς 1 και 2 είχαν περαιτέρω αναπτύχθηκαν σε αργά περάσματα, ειδικά μέχρι δίοδο 10 και 8 αντίστοιχα. Η ανάπτυξη μετά από διέλευση σε καλλιέργεια 10 πια εκθετική ήταν (Σχήμα 1) υποδεικνύει περιορισμένο δυναμικό διαστολής κάτω από τις συνθήκες ανάπτυξης που χρησιμοποιούνται. Γήρανση προσδιορίσθηκε από τις αλλαγές στην δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης από νωρίς

vs

αργά περάσματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης αυξήθηκε με το πέρασμα. Τα περισσότερα από τα κύτταρα στα πρώτα περάσματα δεν παρουσίασαν ενδείξεις για την επεξεργασία του χρωμογόνου υποστρώματος X-gal ως κύτταρα από αργότερα διόδους έκανε. Αυτή η αύξηση στην χρώση β-gal μεταξύ πρώιμων και όψιμων περάσματα (0,0390 ± 0,0046 έναντι 0,1717 ± 0,0181) ήταν σημαντική (ρ & lt? 0.005). Αυτό υποδηλώνει ότι η αντιγραφική γήρανση των MSC είναι μια συνεχής χρονο-εξαρτώμενη διαδικασία, όπως προτείνεται προηγουμένως [31], και για ADSCs που λαμβάνονται από ασθενείς με καρκίνο.

Επιπλέον, αξιολογήσαμε τη διαδικασία γήρανση που σχετίζεται των autophagy με RT -PCR ανάλυση των γονιδίων που σχετίζονται με αυτοφαγία. Στο αργά περάσματα (περάσματα 8-10) τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της Atg5 εμφανίστηκε ρυθμίζεται προς τα πάνω (1,61 ± 0,04 φορές), ενώ ATG7 ελαφρά αναστέλλεται (-1,10 ± 0,03 φορές) και τα επίπεδα Beclin1 έδειξε αξιοσημείωτη αρνητική ρύθμιση (-10,80 ± 0,03) (Σχήμα S1 ΝΤΟ). Η παρατηρούμενη μεγάλη συσσώρευση αυτοφαγοσώματα, σε αυτά τα αργά περάσματα, αποδεικνύεται από ultraestructural ανάλυση κυτταροπλάσματα τους (Σχήμα S1 D, E) συνέπεσε με τη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης που υποδηλώνει ότι η αύξηση της autophagy διόδους σε όψιμους συνδέεται με την κυτταρική γήρανση, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [34] – [36]. Το γεγονός ότι ADSCs από ασθενείς γηράσκουν κατά την καλλιέργεια δείχνει ότι δεν είναι ογκογόνο.

Μορφολογία

Για να εξεταστεί η πιθανή μορφολογικές αλλαγές μεταξύ μη ογκογόνους συμμετεχόντων και των νεοπλασματικών ADSCs ασθενή σε διαφορετικά περάσματα, αξιολογήσαμε τους μορφολογικές και υπερ-δομικά χαρακτηριστικά με αντίθετης φάσης μικροσκοπία και ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (ΤΕΜ) σε κάθε πέρασμα έως δίοδος 4, που είναι η συνιστώμενη πέρασμα για θεραπεία [37]. Εικόνες αποκάλυψε όλα τα κύτταρα είχαν άτρακτο και πολυπολική μορφολογία σχήμα. Δεν μορφολογική διαφορά μεταξύ των κυττάρων είτε ομάδα συμμετεχόντων παρατηρήθηκε (Σχήμα 2 Α, Β).

εικόνες Εκπρόσωπος αντίθεσης φάσης του

in vitro

επεκταθεί ADSCs από ασθενείς με καρκίνο (Α) και μη -tumorigenic συμμετέχοντες (δότες) (Β) στο πέρασμα 4, και τολουϊδίνης μπλε χρώση ημίλεπτες τομές των ίδιων κυττάρων (Γ και Δ, αντίστοιχα) (μεγέθυνση 20Χ).

Η

Ημι-λεπτές τομές έκανε δεν παρουσιάζουν σημαντικές μορφολογικές διαφορές, είτε, με τα περισσότερα κύτταρα που παρουσιάζουν ένα μόνο πυρήνα (Εικόνα 2 C, D). Οι πυρήνες περιείχαν ένα ή δύο πυρηνίσκοι και άφθονη νουκλεόπλασμα. Τα κύτταρα είχαν ανέπαφες μεμβράνες με δομές ψευδοπόδια στην επιφάνεια και ανέπαφη δομές οργανιδίων. Αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο (RE) και τα μιτοχόνδρια ανιχνεύθηκαν τόσο στο εσωτερικό και το περιφερικό ενδοπλασματικό ζώνες. Περιφερειακές ζώνες παρουσίασαν απουσία οργανιδίων, αλλά περιείχε κενοτόπια και κυστίδια.

Για να αυξήσετε την ανάλυση λάβαμε εκπομπής ηλεκτρονίων μικροσκοπική εικόνες είτε ομάδα ADSCs. Τα κύτταρα σε δίοδο 2 έδειξε άφθονο και διευρυμένη τραχύ RE, πολυάριθμες Golgi cisternae και ένα μεγάλο αριθμό dictyosomes κατανεμημένα κατά μήκος του κυτταροπλάσματος που περιείχε επίσης μιτοχόνδρια, σταγόνες λιπιδίων και άφθονη δέσμες νημάτων (Σχήμα 3 Α, Β). Electrodense σώματα βρέθηκαν επίσης δίπλα στο dictyosomes.

ADSCs από ασθενείς με καρκίνο στο χωρίο 2 (Α) και το πέρασμα 4 (C) δείχνουν κυτταροπλάσματα εμπλουτισμένο με οργανίδια και μεγάλο πυρήνα (Ν) με χαλαρά χρωματίνης. Μια λεπτομέρεια της ADSC από δίοδο 2 (Β) δείχνει εμπλουτισμό οργανίδιο, τραχύ ενδοπλασματικό δικτύωμα (βέλη) και μεγάλων Golgi cisternae (αστερίσκος) με κάποια λιπίδιο σταγόνες (Li). ADSCs στο πέρασμα 4 (C) δείχνουν εξέχοντα πυρηνική προεκβολές (βέλη) και διευρυμένη πυρηνίσκοι (Nu). Σε χαμηλές μεγέθυνση δείχνει επίσης άφθονα ηλεκτρο-πυκνά οργανίδια. Σε υψηλότερη μεγέθυνση άφθονο τραχύ ενδοπλασματικό δίκτυο cisternae, οι λιπιδίων σταγόνες (Li) και άφθονη μεμβρανώδης δομές ή αυτοφαγοσώματα εκτιμηθεί (D). Κλίμακα ράβδου 10 μm (Α-Ο)? 1 μm (Β-Δ).

Η

Οι πυρήνες περιείχαν ένα ή δύο πυρηνίσκοι και παρουσιάζονται χαλαρά χρωματίνης, μερικές φορές δείχνει βαθιά εγκολπώσεις και άφθονη νουκλεόπλασμα. Στο πέρασμα 4, κύτταρα έδειξαν κάποιες μικρές διαφορές σε σχέση με το πέρασμα 2 συμπεριλαμβανομένου ενός υψηλότερου τάση να εγκολεασμένο πυρήνες, μεγαλύτερες πυρηνίσκος και μια αύξηση στον αριθμό των δεσμίδων των ινών και του αριθμού των electrodense μεμβρανώδης δομών ή autofagosomes σώμα που μοιάζει (Σχήμα 3 C, D). Ωστόσο, δεν υπάρχουν ποιοτικές διαφορές θα μπορούσαν να εκτιμηθεί μεταξύ των ομάδων, που μας επιτρέπει να συμπεράνουμε ότι ADSCs από ασθενείς με καρκίνο είναι πανομοιότυπες με εκείνες των μη ογκογόνων συμμετέχοντες στο μορφολογικό επίπεδο.

Immunophenotype

Για να επιβεβαιώνουν ότι επεκτάθηκε ADSCs μας συμμορφώθηκε με τα ελάχιστα κριτήρια μεσεγχυματικά καθιερωθεί από τη Διεθνή Εταιρεία Κυτταρικής θεραπείας [38] πραγματοποιήσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των ADSCs από ασθενείς και μη-ογκογόνο συμμετέχοντες στο πέρασμα 4 (Σχήμα 4 Α-G και Σχήμα S4 Α- F).

Αντιπροσωπευτικά ροής φθορισμού ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) και ανάλυση RT-PCR του

in vitro

επεκτάθηκε ADSCs από ασθενείς με καρκίνο στο πέρασμα 4. Τα κύτταρα ήταν θετικά για CD105 (Α), CD73 (Β), CD90 (C), CD29 (Η-6), CD44 (Η-7) και HLA ABC (F), αλλά δεν εκφράζουν CD11b (D), κομβικών (Η-3), UTF1 (Η-4 ), ABCG2 (Η-5), ή HLA DR (G)? ενώ CD34 ήταν μερικώς θετικό (Ε), όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Lanes Η-1 και Η-2 δείχνουν RT-PCR ενίσχυση του σπιτιού κρατώντας γονιδίων GAPDH και β-ακτίνη, αντίστοιχα.

Η

Όπως αναμενόταν, τα κύτταρα ήταν θετικά για το CD73 μεσεγχυματικών, CD90 και CD105 δείκτες και αρνητικό για το δείκτη αιμοποιητικών CD11b. Επιπλέον, ήταν θετικά για το αντιγόνο histocompability τάξης Ι HLA-ABC, αλλά δεν εκφράζουν επιφανειακά μόρια HLA-DR υπό μη διεγερμένη κατάσταση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Απροσδόκητα, CD34, ένας δείκτης για αιμοποιητικά και ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα [39], ήταν θετική σε 3-12% των κυττάρων.

Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση RT-PCR για επιπλέον δείκτες μεσεγχυματικών και πλειοδυναμίας. Τα μεσεγχυματικά CD44 και CD29 δείκτες ήταν σαφώς θετική, ενώ δεν επιτεύχθηκε ενίσχυση του pluripotency κομβικών και UTF 1 δείκτες. Απέτυχε επίσης να ενισχυθεί το αντοχή πολυφαρμάκου πρωτεΐνη μεταφοράς ABCG2 η οποία είναι ένα πολυδύναμο σημειωτή προηγουμένως συνδέονται με ένα υποπληθυσμό των MSCs με νευρογενή δυναμικό [40], υποδηλώνοντας μια πιθανή περιορισμός αυτών των κυττάρων για την θεραπεία του νευρικού ιστού. Τα προφίλ επιφανειακό αντιγόνο που περιγράφεται ήταν παρόμοια για MSCs από ασθενείς και μη-ογκογόνο συμμετεχόντων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Κυττάρων πλαστικότητα

Η πλαστικότητα των διογκωμένων ADSCs προσδιορίστηκε με δυναμικό διαφοροποίησης τους. Τα κύτταρα σε δίοδο 4 από είτε ασθενείς ή μάρτυρες καλλιεργήθηκαν σε συγκεκριμένες μέσων διαφοροποίησης, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Κύτταρα σε αδιπογονική μέσα περιείχαν άφθονα κενοτόπια κατανέμονται κατά μήκος κυτταροπλάσματα τους, όπως φαίνεται με χρώση Οίΐ Red Ο (Σχήμα 5 Α, D), υποδεικνύοντας ότι είχε λάβει χώρα η διαφοροποίηση προς λιποκύτταρα. Οστεογένεση αποδείχθηκε από την παρουσία συσσωματωμάτων με οζίδιο-όπως δομές που βάφτηκαν με Ερυθρό της αλιζαρίνης ανίχνευση εναπόθεσης ορυκτών (Σχήμα 5 C, F). Χονδρογονική διαφοροποίηση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας βαφή Alcian Blue που αποκάλυψε υψηλή περιεκτικότητα του χόνδρου ειδικών πρωτεογλυκανών στις καλλιέργειες (Σχήμα 5 Β, Ε). ADSCs από τους δύο ασθενείς (Σχήμα 5 Α-Ο), και μη-ογκογόνο συμμετεχόντων (Εικόνα 5 D-F), ήταν εξίσου ικανές αποτελεσματικά να διαφοροποιηθούν σε αδιπογονική, χονδρογονική και οστεογονικές γραμμώσεις υποδεικνύοντας ότι ADSCs προέρχονται από ασθενείς με καρκίνο μας διαθέτει παρόμοια πλαστικότητα κύτταρο