Abstract

Το άγχος έχει προταθεί να είναι ένας όγκος παράγοντα προαγωγής μέσω της έκκρισης των συγκεκριμένων νευροδιαβιβαστών, όπως Urocortin2 και 3 (Ucn2 /3), ωστόσο ο ρόλος του στην ορθοκολικό καρκίνο (CRC) παραμένει αόριστη. Παρατηρήσαμε ότι Ucn2 /3 και του υποδοχέα τους, το κορτικοτροπίνης Releasing υποδοχέα παράγοντα 2 (CRF2) ήταν πάνω ρυθμισμένα σε υψηλής ποιότητας και κακώς διαφοροποιημένο CRC. Αυτό υποδηλώνει ένα ρόλο για CRF2 στην απώλεια της κυτταρικής οργάνωσης και εξέλιξης του όγκου. Χρησιμοποιώντας ΗΤ-29 και SW620 κύτταρα, δύο κυτταρικές σειρές CRC διαφέρει ως προς τις ικανότητές τους να εκτελέσουν τις επαφές κυττάρου-κυττάρου, βρήκαμε ότι CRF2 σήματα μέσω Src μονοπάτι /ERK να επάγει την αλλοίωση του κυττάρου-κυττάρου κόμβων και το λεωφορείο του p120ctn και Kaiso σε ο πυρήνας. Σε κύτταρα ΗΤ-29, αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι οδηγεί επίσης στην αναδιαμόρφωση της κυτταρικής προσκόλλησης από i) την φωσφορυλίωση της κινάσης εστιακής συγκόλλησης και ii) μία τροποποίηση της ακτίνης του κυτταροσκελετού και σύμπλοκα εστιακής προσκόλλησης. Αυτά τα γεγονότα διεγείρουν την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή. Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι CRF2 σηματοδότησης έλεγχοι κυτταρική οργάνωση και μπορεί να προωθήσει μεταστατικό δυναμικό των ανθρώπινων κυττάρων CRC μέσω επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση σαν διαδικασία. Αυτό συμβάλλει στην κατανόηση των επιπτώσεων του όγκου-προώθηση των μορίων άγχος και ορίζει Ucn2 /3-CRF2 παράλληλα ως στόχο την πρόληψη CRC πρόοδο και την επιθετικότητα

Παράθεση:. Ducarouge Β, Pélissier-Rota Μ, Lainé Μ , Cristina Ν, Vachez Υ, Scoazec JY, et al. (2013) CRF2 Σηματοδοσίας είναι ένα μυθιστόρημα ρυθμιστής της κυτταρικής πρόσφυσης και Μετανάστευσης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (11): e79335. doi: 10.1371 /journal.pone.0079335

Επιμέλεια: Alice Γ W. Τσανγκ, Memorial Hospital Kaohsiung Chang Gung, Ταϊβάν

Ελήφθη: 1 Ιουλ 2013? Αποδεκτές: 30 του Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18, Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Ducarouge et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (www.arc-cancer.net), Ligue Nationale contre le Καρκίνο (www.ligue-cancer.net), Σύνδεσμος François Aupetit (www.afa.asso.fr), GEFLUC (www.gefluc.org) και Espoir Isère Καρκίνο (www.espoir-isere-cancer.com). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις δυτικές χώρες. Η ιστολογική βαθμός είναι σημαντικός προγνωστικός δείκτης, όπως υψηλής ποιότητας, χαμηλής διαφοροποίησης όγκοι είναι συνήθως πιο επιθετική και επεμβατική από χαμηλού βαθμού τους, καλά διαφοροποιημένο ομολόγους. Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του CRC είναι η απώλεια της κυτταρικής οργάνωσης. Κολλητική αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και εξωκυτταρικού πλέγματος (ECM) είναι καθοριστικοί παράγοντες της οργάνωσης ιστού και διαμορφώσεις τους να συμμετέχουν σε μετανάστευση κυττάρων και τη μετάσταση του όγκου.

επιθηλιακά κύτταρα, προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου διατηρείται μέσω διαφόρων πρωτεϊνικών συμπλόκων όπως adherens κόμβους (AJ). Καντερίνες είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που πυρήνες AJ με τη διαμόρφωση ομοτυπικό ασβεστίου εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις με καντερίνες από γειτονικά κύτταρα. Η χειραγώγηση της λειτουργίας Ε-καδερίνης στο εντερικό επιθήλιο έχει αποκαλύψει ένα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση ή κυτταρική πρόσφυση /μήτρας [1]. E-cadherin μειώνεται στην επεμβατική CRC μαζί με την απόκτηση ενός φαινοτύπου μεσεγχυματικών [2]. Η ενδοκυτταρική περιοχή της Ε-καδερίνης αλληλεπιδρά άμεσα με β- και ρ120 κατενίνες (CTN). Ρυθμίζουν AJ ελέγχοντας καντερίνη ομαδοποίηση, ενδοκύτωση ή τη σταθερότητα και την ακτίνη του κυτταροσκελετού αγκυροβόλιο (αναθεωρηθούν [3]). Στο E-cadherin ανεπάρκεια κύτταρα p120ctn λεωφορεία στο κυτταρόπλασμα και /ή στον πυρήνα όπου ασκεί διαφορετικές λειτουργίες ανάλογα με τους συνεργάτες του [4], [5]. Στο πυρήνα, p120ctn μπορεί να αλληλεπιδρά με τον παράγοντα μεταγραφής Kaiso και ανακουφίζει γονίδιο καταστολής δραστηριότητα της [6], [7]. Ανώμαλη πυρηνικό εντοπισμό των p120ctn και Kaiso είναι προγνωστική για την επιθετικότητα στο CRC [8].

μικρο-περιβάλλον ελέγχει την πρόοδο του καρκίνου μέσω κυττάρων επαφές ή σήματα μεσολαβητή [9]. Ο παράγοντας απελευθέρωσης κορτικοτροπίνης (CRF) και αναλόγων όπως urocortins (Ucns) [10] εκκρίνονται πεπτίδια που σχετίζονται με το στρες. Δρουν μέσω δύο πρωτεΐνη υποδοχείς G, CRF1 και CRF2, με διαφορετικές συγγένειες [11]. CRF και Ucn1 δεσμεύουν και τους δύο υποδοχείς, ενώ Ucn2 /3 είναι επιλεκτικές για CRF2. Οι CRF υποδοχείς συζευγμένα πρωτίστως να Οαδ και να προκαλέσει το σχηματισμό cAMP μέσω ενεργοποίησης αδενυλικής κυκλάσης [12]. Εάν το σύστημα CRF είναι καλά τεκμηριωμένη στη γαστρεντερική οδό για την έκφραση και τη ρύθμιση του από το στρες και φλεγμονή, τη συμμετοχή του σε CRC είναι ανεπαρκώς διερευνάται [13], [14]. Τα προσδέματα και υποδοχείς που εκφράζονται και εκκρίνονται από διάφορα φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, το σύστημα CRF θα μπορούσε να ρυθμίζουν τον όγκο μικρο-περιβάλλον από αυτοκρινείς /ενεργοποιήσεις παρακρινής για καρκίνο ή στρωματικά κύτταρα [9], [15], [16]. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η έκφραση του CRF2 και συνδετήρων του στην CRC και πώς σηματοδότηση τους θα μπορούσε να συμμετέχει στην εξέλιξη του όγκου. Τα αποτελέσματά μας περιγράφεται ανώμαλη έκφραση των CRF2 και συνδετήρων και στις δύο όγκους CRC και κυτταρικές σειρές, ανάλογα με τον βαθμό τους και /ή την κατάσταση διαφοροποίησης. Χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και SW620, ανακαλύψαμε ότι CRF2 σηματοδότησης τροποποιεί την κυτταρική προσκόλληση και δημιούργησε ένα μηχανισμό με τον οποίο τονίζουν τα μόρια μπορούν να συμμετέχουν στην εξέλιξη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού

το ανθρώπινο παχύ έντερο αδενοκαρκινώματος κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και SW620 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) καλλιεργήθηκαν σε 37 ° C σε ατμόσφαιρα CO2 5% σε ϋΜΕΜ που περιέχει 25 mM γλυκόζη (Invitrogen , Cergy Pontoise, France) και συμπληρωμένο με 10% FCS, 5% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. Το κατασκεύασμα ανθρώπινο CRF2-GFP κλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pBabe. λοιμώξεις από ρετροϊούς του ΗΤ-29 κύτταρα έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17] και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 2 μg /ml πουρομυκίνη (BD Biosciences), ακολουθώντας στην επιλογή FACS των κυττάρων μολυσμένων από ιούς.

Αντισώματα και αντιδραστήριο

Πολυκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον CRF2 ήταν από Abcam (12964, Παρίσι, Γαλλία). Το ανοσοποιητικό πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το αντίσωμα CRF2 σχεδιάστηκε στο διατηρημένη αλληλουχία των ισομορφών α, β και γ. Αυτό το αντίσωμα τότε θα αναγνωρίσει όλες τις ισομορφές του υποδοχέα. Ε-καδερίνη (HECD1) μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπου ελήφθη από την Takara Biochemicals (Cambrex Bio Science, Παρίσι, Γαλλία). Το μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι p120ctn (κλώνος 98) αγοράστηκε από την BD Transduction Laboratories (Pont de Claix, Γαλλία). Αντι-ακτίνη, αντι-ΜΜΡ3 πολύκλωνα αντισώματα, και αντι-Kaiso, αντι-βινκουλίνης μονοκλωνικά αντισώματα ελήφθησαν από την Sigma Aldrich (L’Isle d’Abeau, France). Πολυκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον της Src-P

Tyr418 αγοράστηκαν από MBL Calbiochem (Fontenay-sous-Bois, Γαλλία), μονοκλωνικά αντι-Src και αντι-ΜΜΡ7 ήταν από την Millipore (Molsheim, France). Τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι ERK και ERK-P

Tyr204 ήταν από BD μεταγωγή εργαστήρια και Σάντα Κρουζ από Tebu (Le Perray en Yvelines, Γαλλία), αντίστοιχα. Πολυκλωνικά αντι-ΡΑΚ-P

antobodies Ser910 ελήφθησαν από την Invitrogen (Cergy Pontoise, France). δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού Alexa-συζευγμένο κατσίκας ελήφθη από την Molecular Probes (Eugene, OR). δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού αλόγου ραπανάκι υπεροξειδάση-συζευγμένο κατσίκας λήφθηκε από την Bio-Rad (Marnes-la-Coquette, France), αντισώματα αντι-κουνελιού γαϊδάρου ελήφθησαν από Jackson Immunoresearch (Immunotech, Marseille, France). Topro3 αγοράστηκε από την Invitrogen. Urocortins, CRF και astressin 2β αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich.

ομάδα των ασθενών, ιστών Micro συστοιχίες και ανοσοϊστοχημεία

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σε cDNA από μία ομάδα 30 ασθενών CRC. Τα δείγματα από κατεψυγμένα όγκου και περιογκική ιστοί ελήφθησαν από τον όγκο ιστών Τράπεζα της Hospices Civils de Lyon, που υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (INCA) και Γαλλικά υπουργείο Υγείας. Η τράπεζα ιστών συμμορφώνεται με τη γαλλική νομοθεσία. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των δειγμάτων ιστού για ερευνητικούς σκοπούς? σε περίπτωση απουσίας του εν επιγνώσει συναίνεση, τα δείγματα ιστών από ασθενείς που είναι γνωστό ότι απεβίωσε θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί για ερευνητικούς σκοπούς, σύμφωνα με τη γαλλική νομοθεσία. Οι διαδικασίες για τη συλλογή, την αποθήκευση και την απελευθέρωση των δειγμάτων ιστού είναι σύμφωνα με τις εθνικές και διεθνείς συστάσεις και ένα πρόγραμμα διαχείρισης της ποιότητας έχει αναπτυχθεί. Όλα τα έργα υποβάλλονται στην τράπεζα ιστών ελεγχθεί και εγκριθεί από την επιστημονική επιτροπή, η οποία ελέγχει επίσης τη συμμόρφωσή τους στις ηθικές κανονισμούς. Για να διατηρηθεί η ανωνυμία, μια συγκεκριμένη ταυτότητα αποδόθηκε σε κάθε ασθενή. Για κάθε δείγμα, το cDNA από όγκων ιστού σε συνδυασμό με το cDNA του γειτονικού φυσιολογικού ιστού. Τα στάδια του όγκου ορίστηκαν σύμφωνα με την κατάσταση ΤΝΜ των όγκων (American μεικτής επιτροπής σχετικά με το σύστημα σταδιοποίηση του καρκίνου). Ιστών Micro συστοιχίες (TMA) CDA3 αγοράστηκαν στο SUPER BIO CHIPS (Κορέα). Η πλάκα μπλοκαρίστηκε σε TBS /BSA 3% /Tween-20 0,1% και επωάζεται όλη τη νύχτα στους 4 ° C με αντι-CRF2 σε 1:100. Η περαιτέρω IHC πραγματοποιήθηκε με Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, Courtaboeuf, Γαλλία), αντίθετα με 1 λεπτό επώαση σε Αιματοξυλίνη, αφυδατωμένα και τοποθετείται με DPX. Κάθε εξαγορές μικροσκόπιο ήταν κάτω στο «TRIBUN» και ποσοτικά με Image J. Η IHC ποσοτικοί προσδιορισμοί έγιναν σε ImageJ WCIF με τη λειτουργία CIE Lab του χρώματος με βάση κατωφλίου τμηματοποίησης για να διαχωρίσει τη χρώση CRF2 από τον πάγκο-χρώση αιματοξυλίνη. Έξι διαφορετικά πεδία του κάθε δείγματος κατά διαστήματα και η μέση γκρίζα αξία υπολογίστηκε για τον CRF2 και αιματοξυλίνη. Η CRF2 ένταση για κάθε δείγμα είναι η μέση τιμή του λόγου CRF2 /αιματοξυλίνης υπολογίζεται επί των έξι διαφορετικά πεδία.

Κυττάρων κλασματοποίηση

Για την πυρηνική κλασματοποίηση, κυττάρων λύθηκαν σε 10 mM HEPES /MgCl2 1.5 mM /ΚΟΙ 10 mM /0,5 mM DTT /ΝΡ40 0,05% /ρΗ 7,9. Μετά από 10 λεπτά φυγοκέντρηση στις 3000 rpm και 4 ° C, τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε HEPES 5 mM /ΜαΟΙ2 1,5 mM /ΕϋΤΑ 0.2 mM /DTT 0,5 mm /γλυκερόλης 26% (ν /ν) /ρΗ 7,9, και ομογενοποιήθηκαν με 20 πλήρη εγκεφαλικά επεισόδια σε Dounce. Μετά από 30 λεπτά επώαση επί πάγου, τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν 20 λεπτά σε 24.000 g και 4 ° C. Τα υπερκείμενα που περιέχουν πυρηνικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωμα.

Ανοσοστύπωμα και Ανοσοκαταβύθιση

Σύνολο λύματα ή υποκυτταρικά κλάσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοστυπώματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

χρώση ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και στη συνέχεια κατεργάζεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Μετά από στερέωση με PFA 4% σακχαρόζη, μη ειδικές θέσεις αποκλείστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C με 3% BSA 0,5% Tween20. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C με ειδικά αντισώματα τα οποία αραιώθηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού στην 1:100 για την πρωτογενή και δευτερογενή 1:500 για αντισώματα. μικροφωτογραφίες φθορισμού ελήφθησαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο στο στόχο × 100 (Leica TCS SPE) ή ένα μικροσκόπιο επιφθορισμού στο × 100 αντικειμενική (Zeiss, AvioVert 200M).

RT και qPCR

Σύνολο RNA εκχυλίσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ΤπζοΙ

αντιδραστήριο TM και 1 μg του ολικού RNA denaturized και στη συνέχεια σε επεξεργασία για αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τα M-MLV (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. qRT-PCR έγιναν με ένα ελαφρύ ανακυκλωτή 480 και τη βιβλιοθήκη καθολική ανιχνευτή (Roche). Οι αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

προετοιμασία ECM και κυτταρικής προσκόλλησης

πιάτα καλλιέργειας ιστών επικαλύφθηκαν με LM-332 χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες μεθόδους: Α431 επιδερμοειδούς κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συρροή σε διάφορες επιφάνειες στους 37 ° C για να επιτρέψει για την κατάθεση του LM-332, τότε τα κύτταρα απομακρύνθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20]. Εν συντομία, συρρέοντα μονοστρώματα διαδοχικά εκχυλίζεται με 1% (ν /ν) Triton Χ-100 σε PBS, που ακολουθείται από 2Μ ουρία σε 1Μ NaCl. Οι πλάκες πλύθηκαν σε PBS, επωάστηκαν με 1% BSA, και αποθηκευμένο στους -20 ° C. Ανθρώπινο κολλαγόνο τύπου IV από πλακούντα ελήφθη από την Sigma Aldrich. Επίστρωση πλαστικούς δίσκους Petri (πλάκες μικροτίτλου 96 φρεατίων, Nunclone? Nunc, Roskilde, Denmark) πραγματοποιήθηκε με ολονύκτια επώαση με πρωτεΐνες ECM (10 μg /mL) στους 4 ° C. Οι πλάκες κορέστηκαν με 3% (β /ο) BSA σε PBS για 2 ώρες στους 37 ° C. κύτταρα ΗΤ-29 CRF2-GFP προκατεργάστηκαν ή όχι με 100 ηΜ Ucn3 για 30 λεπτά πριν να επιστρώνονται (5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) εις τριπλούν σε επικαλυμμένες πλάκες μικροτίτλου των 96 φρεατίων και επωάζονται από 0 έως 60 λεπτά στους 37 ° C. Μη κύτταρα προσκολλημένα απομακρύνθηκαν με έκπλυση τρεις φορές με PBS, και προσκόλληση κυττάρου εκτιμήθηκε με δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού CellTiter 96 AQ

ueous μη ραδιενεργά κυττάρων? Promega)

Κυττάρων μετανάστευση και εισβολή. κύτταρα

ΗΤ-29 CRF2-GFP σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων transwells (μέγεθος πόρων 8 μm) (Becton Dickinson). Μετά κύτταρο συρροή, το μέσο καλλιέργειας ορού συγκομίζεται όλη τη νύχτα σε πάνω και κάτω θαλάμους. Transmigration κατόπιν ξεκίνησε με δημιουργία μιας βαθμίδας ορού με 10% FCS στον κάτω θάλαμο, με ή χωρίς 100 ηΜ Ucn3 σε κάθε θάλαμο. 72 ώρες μετά την έναρξη της μετεμψύχωσης, μπατονέτες χρησιμοποιήθηκαν για να απομακρυνθούν τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας του transwells. Μετά από στερέωση με PFA 4%, μεταναστευτικά κύτταρα βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και χειροκίνητα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. Οι μέσες τιμές +/- SEM υπολογίστηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμή Student.

ΗΤ-29 CRF2-GFP κύτταρα (2.5 10

-5 /mL) τοποθετήθηκαν στο επάνω διαμέρισμα του 24-πολλαπλών βοθρίων τοποθετήστε ένθετη πλάκα (BD Falcon) που διαχωρίζεται από το διαμέρισμα πυθμένα με μεμβράνη BD-Matrigel Matrix, με μέγεθος πόρων 0,4 μπι. RPMI χωρίς ορό με ή χωρίς Ucn3 (1 μΜ) προστέθηκαν στο επάνω διαμέρισμα και 10% FCS μέσα στο διαμέρισμα πυθμένα. Μετά από 48 ώρες στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2, τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσα από την Matrigel, αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως για τη δοκιμασία μετανάστευση.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με την CellTiter 96 Kit (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

αποικοδόμησης ζελατίνης δοκιμασία

Περίπου 40 μL (πρωτεΐνη 20-30 μg κύτταρο) συγκομίζονται μέσο καλλιέργειας ηλεκτροφορήθηκαν υπό μη αναγωγικές συνθήκες σε ένα πήκτωμα ακρυλαμίδης 10% που περιέχει 1 mg /mL ζελατίνη (Sigma-Aldrich), σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Werb και al., [21]. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πηκτές πλύθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 3 χ 30 λεπτά σε 2% Triton Χ-100 και όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,7) και 5 mM ΟαΟ

2.Thereafter , πηκτώματα βάφτηκαν με 0,1% (β /ο) Coomassie Brillant Blue R-250 σε 50% (ο /ο) ισοπροπυλική αλκοόλη /10% (νοί /νοί) κρυσταλλικού οξικού οξέος επί 60 λεπτά και αποχρωματίζονται σε 20% (ο /vol) ισοπροπυλική αλκοόλη /5% (νοί /νοί) κρυσταλλικού οξικού οξέος.

Η πυκνομετρική ανάλυση και στατιστική

ανοσοστυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Όλα τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης μετρήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση σε λογισμικό «Image J» (ΝΙΗ). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA ή πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν ως ακολούθως: η έκφραση επίπεδο κάθε μεταγραφής ή πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε έως θ) γονίδιο οικοκυρική τους σε qPCR ή RT-PCR? ii) να ακτίνης σε ολόκληρη westernblots λύμα ή ιστόνες σε westernblots πυρηνικού εκχυλίσματος. Σε μερικά πειράματα, και προκειμένου να εμφανιστεί μια φορές αύξηση έναντι του ελέγχου, η σχετική έκφραση των μεταγραφημάτων ή πρωτεϊνών σε συνθήκες ελέγχου ορίστηκε σε 1. Οι στατιστικές είναι ζευγαρωμένο t-test και η στατιστική σημαντικότητα δίνεται από τον αριθμό των αστερίσκων (* Ρ & lt? 0,05 ? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001)

Αποτελέσματα

Έκφραση των CRF2 και συνδετήρων της αυξάνεται με την διοργάνωση σε ιστούς CRC και κυτταρικές σειρές

έχουν εκτελέσει πρώτη qPCR για CRF2α (το μεγαλύτερο CRF2 ισομορφή του παχέος επιθηλίου), [22] και Ucn2 /3 σε κανονικές και CRC ιστούς των 30 ασθενών, να κατανοήσουν καλύτερα τη ρύθμισή τους κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου (Εικόνα 1Α). Τα κλινικοπαθολογοανατομικών ευρήματα των όγκων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη φαίνονται στον Πίνακα 2. Οι όγκοι συγκεντρωμένα σε χαμηλές (n = 19, που αντιστοιχεί σε στάδια 1-2) και υψηλές (n = 11, που αντιστοιχεί σε στάδια 3-4) ποιότητες και τυποποιημένων να φυσιολογικούς ιστούς τους. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση της έκφρασης CRF2α και Ucn3 mRNA σε όγκους σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς, ανάλογα με το βαθμό του όγκου. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές Ucn2 μεταγραφές σε αυτές τις συνθήκες. Ωστόσο, όταν η ανάλυση έγινε μόνο σε όγκους ιστούς, ένα μοτίβο αποκαλύφθηκε σχετικά με την έκφραση του mRNA Ucn2: επίπεδα μεταγραφής Ucn2 αυξήθηκαν σύμφωνα με την κατάσταση PNM, την εισβολή των λεμφαδένων και αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI). Τέλος, CRF2α, Ucn2 και τα επίπεδα μεταγραφής Ucn3 δεν συσχετίζονται με μεταλλάξεις του

K-ras ή B-raf

. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα βρέθηκε με κυτταρικές σειρές CRC (συμπληρωματική Εικόνα S1). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η έκφραση CRF2 πρωτεΐνη υποδοχέα σε ορθοκολικό τμήματα που αντιστοιχούν στους φυσιολογικούς ιστούς (n = 9), χαμηλής ποιότητας (n = 24) και υψηλού βαθμού (n = 18) όγκους (Σχήμα 1Β). Η αναλογία των δειγμάτων μεγαλύτερη από την μέση των φυσιολογικών ιστών αυξήθηκε από 22% σε φυσιολογικό σε 33% και 72% σε χαμηλής και υψηλής ποιότητας όγκους αντιστοίχως (Σχήμα 1 C, αριστερό πάνελ). Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης CRF2 αυξηθεί ανάλογα με την ποιότητα του όγκου (ANOVA p = 0,047) (δεξιά πλευρά). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια σχέση μεταξύ CRF2 έκφραση της πρωτεΐνης και υψηλότερες ποιότητες των όγκων. Έχουμε εκτεταμένη ανάλυση μας από qPCR σε 17 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (συμπληρωματική Εικόνα S1). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η έκφραση του CRF2 συνδέτες συσχετίζεται αντίστροφα σε επιθηλιακό δείκτες διαφοροποίησης όπως E-cadherin (

Cdh1

), αλλά συσχετίζεται με κατασκευαστές μεσεγχυματικά όπως vimentin (

Vim

), γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο του CRF2 στην κυτταρική αποδιοργάνωση που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Επελέγησαν δύο κυτταρικές σειρές CRC ήταν: i) ΗΤ-29 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν υψηλό επίπεδο Ε-καδερίνης αλλά χαμηλό επίπεδο Ucn2 και καμία βιμεντίνης? ii) τα κύτταρα SW620, ελάχιστα διαφοροποιημένα μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά επίπεδα του Ucn2 και βιμεντίνης σε σύγκριση με ένα ασθενές επίπεδο Ε-καδερίνης (Εικόνα 2Α). Η έκφραση του CRF2 και Ε-καδερίνης στο επίπεδο πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωση (σχήμα 2Β). Χρησιμοποιώντας ΗΤ-29 κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά το CRF2 συζευγμένο με πρωτεΐνη GFP (κύτταρα ΗΤ -29 CRF2-GFP) παρατηρήσαμε ότι CRF2-GFP ήταν κυρίως εντοπισμένη στην μεμβράνη, σε διακυτταρικών επαφών (Σχήμα 2C). Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται περαιτέρω από συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση δείχνει ένα συν-εντοπισμό των CRF2-GFP πρωτεΐνη με Ε-καδερίνης σε κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 2D). Με Ucn3 (τον πλέον αποδοτικό CRF2 αγωνιστή σε κύτταρα ΗΤ-29, βλέπε συμπληρωματικό σχήμα S2), κύτταρα επαφές άλλαξαν και CRF2-GFP μετατοπίστηκε στην κυτταροπλασματική κυστίδια (Σχήμα 2C).

(Α) ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν CRF2α, Ucn2 και Ucn3 έκφραση μεταγραφή ομαλοποιούνται στη PGK γονίδιο καθαριότητας (φωσφογλυκερική κινάση) στο ανθρώπινο φυσιολογικούς ιστούς ή CRC (χαμηλή και υψηλή βαθμολογία). (Β) Εκπρόσωπος CRF2 ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε ιστούς CRC από χαμηλό σε υψηλό βαθμό. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (Γ) Τα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν CRF2 έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται από ανοσοϊστοχημεία. Κάθε δείγμα αντιπροσωπεύεται ως σκοτεινές ράβδοι +/- SD (αριστερά) και τη μέση τιμή της κάθε ομάδας +/- SD (δεξιά). Υψηλής ποιότητας είναι στατιστικά διαφορετική από την κανονική σε *, p & lt?. 0.05

Η

(Α) Χαρακτηρισμός των ΗΤ-29 και SW620 κυτταρικών σειρών από την έκφραση του mRNA της Ucn2, βιμεντίνη (Vim) και Ε-καδερίνη ( Cdh1) ρυθμίζεται σύμφωνα με την HPRT γονίδιο καθαριότητας (ανθρώπινη φωσφοριβοσυλτρανσφεράση). (Β) Ε-καδερίνης /ακτίνης και η έκφραση πρωτεΐνης CRF2 /ακτίνης ποσοστώθηκε με ανοσοκηλίδα στο SW620 και κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29. (Γ) συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση της κατανομής του CRF2-GFP σε Ucn3 επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ-29. μπαρ κλίμακα, 15 μm. (D) συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση των CRF2-GFP και διανομή Ε-καδερίνης σε κύτταρα ΗΤ-29. Ράβδος κλίμακας, 20 μm.

Η

Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CRF2 και συνδετήρες της εκφράζονται σε ανθρώπινες σειρές CRC και κύτταρο σύμφωνα με την τάξη του όγκου και /ή την κατάσταση διαφοροποίησης. κύτταρα CRC θα μπορούσε να ενεργοποιήσει CRF2 τους μέσω ενός αυτοκρινούς παραγωγής συνδέτες, ειδικά σε αδιαφοροποίητα κυτταρικές σειρές.

Κανονισμός επαφών κυττάρου-κυττάρου από CRF2 σηματοδότησης

CRF2 σηματοδότηση έχει πρόσφατα επεκταθεί και σε μη κανονική G συνδεόμενοι με πρωτεΐνη μονοπάτια υποδοχέα, και περιλαμβάνει Src κινάση που αλληλεπιδρά άμεσα με τα ενδοκυτταρώνεται υποδοχείς CRF και παίρνει μέρος στην ενεργοποίηση της ERK [23], [24]. Src-P

Tyr418 έκφραση αυξήθηκε σταδιακά από 5 έως 30 λεπτά, ενώ η συνολική Src παρέμεινε αμετάβλητη (Σχήμα 3Α). Η φωσφορυλιωμένη μορφή της Src έχει συν-ανοσοκατακρημνίστηκαν με CRF2 κατά τη διάρκεια του πρώιμου σταδίου της κινητικής (συμπληρωματικό σχήμα S3). Σε CRC, η ενεργοποίηση της κινάσης Src συσχετίζεται με διαταραχή E-cadherin, ιστολογική διαβάθμιση και φτωχή πρόγνωση [25]. έτσι Ερευνήσαμε την εμπλοκή της δράσεως της Src σε Ucn3 μεσολάβηση διαστάσεως κυττάρων. Σε κύτταρα ΗΤ-29, συνεστιακή ανάλυση μικροσκοπία έδειξε ότι χρώση Ε-καδερίνης παρήγαγε ένα κηρήθρα σαν πρότυπο στο φλοιό πλευρική μεμβράνη (Εικόνα 3Β). Η ενεργοποίηση των CRF2 από Ucn3 αλλάξει γρήγορα αυτό το μοτίβο. Μόνο μια χρώση γραμμική μεμβράνη πήξει και να διαταράσσεται συνεχίστηκε, ενώ πολλές κυτταροπλασματική συσσώρευση εμφανίστηκε, υποδεικνύοντας μια ενδοκυττάρωση της E-cadherin που σχετίζονται με διαταραχή AJ. Κυκλοεξιμίδιο χρησιμοποιήθηκε για να αποτρέψει τη συσσώρευση neosynthesized Ε-καδερίνης. αναλύσεις εσωτερίκευση χρησιμοποιώντας αντισώματα HECD-1 έγιναν για την επιβεβαίωση της Ucn3 που προκαλείται από ενδοκυττάρωση E-cadherin (Σχήμα συμπληρωματικό S4). Διαχωρισμού κυττάρων και ενδοκυττάρωση του Ε-καδερίνης, κατά την έκθεση Ucn3 εμποδίστηκε με προ-επεξεργασία με το ΡΡ2 οικογένεια Src αναστολέα, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση Src ήταν απαραίτητη για την Ucn3 μεσολάβηση επαφές κυττάρου-κυττάρου διάσπαση (Σχήμα 3C). Σε κύτταρα SW620, τα οποία εκφράζουν χαμηλό επίπεδο Ε-καδερίνης και να εκτελέσει μερικές AJ, αποκλεισμός της σηματοδότησης CRF2 από συγκεκριμένες astressin2b αγωνιστή του (A2b) για 24 ώρες ήταν υπεύθυνος μιας αυξημένης έκφρασης της Ε-καδερίνης (Εικόνα 3D). Ανάλυση ανοσοφθορισμού της κατανομής Ε-καδερίνης σε κύτταρα SW620 έδειξαν ασθενή έκφραση μεμβράνης και κυττάρου-κυττάρου επαφή με ή χωρίς Ucn3 (Σχήμα 3Ε). Σε παρουσία του A2b, κύτταρα SW620 σχηματίζονται συμπλέγματα και Ε-καδερίνης ήταν εντοπισμένη στις επαφές κυττάρου-κυττάρου. Ucn3 αντιστραφεί ελαφρώς Α2β επαγόμενη κυτταρική ομαδοποίηση. Διαμόρφωση της κόλλας proprieties των κυττάρων SW620 επίσης αποδεικνύεται σε δοκιμασίες συσσωμάτωσης, δείχνοντας ότι και τα δύο προσκολλημένα και μη προσκολλημένα κύτταρα ήταν σε θέση να συσσωματώνονται παρουσία A2b (συμπληρωματική Εικόνα S5).

(Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος του SRC- Ρ

Tyr418 και Src συνολικά έκφραση σε κύτταρα ΗΤ-29 μετά την χρονική πορεία της θεραπείας Ucn3. (Β) Ομοεστιακή ανάλυση της κατανομής του Ε-καδερίνης σε κύτταρα ΗΤ-29 προκατεργάστηκαν με κυκλοεξιμίδιο πριν από τη θεραπεία Ucn3. μπαρ κλίμακα, 15 μm. (C) Επίδραση ΡΡ2 (10 μΜ, 1 ώρα) για τη διανομή Ε-καδερίνης σε ΗΤ-29 κύτταρα κατεργασμένα ή μη με Ucn3, αναλύθηκαν με μικροσκοπία επιφθορισμού. μπαρ κλίμακα, 20 μΜ. (D) Επίδραση του ανταγωνιστή CRF2 (A2b, 8 ηΜ, 24 ώρες) επί της έκφρασης Ε-καδερίνης σε κύτταρα SW620. Η ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε από ανοσοκηλίδων και ομαλοποιήθηκε ως προς ακτίνη. (Ε) διανομή Ε-καδερίνης σε κύτταρα SW620 προεπεξεργασμένα ή μη με A2b και περαιτέρω επεξεργασία ή όχι με Ucn3. Αναλύονται έγιναν με μικροσκοπία επιφθορισμού. μπαρ κλίμακα, 10 μΜ.

Η

E-cadherin συσχετίζεται με κατενίνες στο AJ συγκροτήματα. Η διακοπή των επαφών κυττάρου-κυττάρου οδηγεί σε AJ πρωτεΐνες διάστασης και κυτταροπλασματική και /ή πυρηνικό εντοπισμό του κατενίνες, οι οποίες προωθούν την κυτταρική διείσδυση σε CRC [26]. Σε ΗΤ-29 κύτταρα κατεργασμένα με Ucn3, p120ctn συσσωρεύτηκε στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα (Σχήμα 4Α). Στο πυρήνα, p120ctn έχει περιγραφεί για τη ρύθμιση της δραστηριότητας του παράγοντα μεταγραφής Kaiso. Ucn3 αυξήθηκαν σημαντικά p120ctn και Kaiso πυρηνική έκφραση όπως παρατηρείται με ανοσοκηλίδωση μετά πυρηνική κλασματοποίηση (Σχήμα 4Β). Για τον προσδιορισμό των μορίων σηματοδότησης που εμπλέκονται σε αυτήν την πυρηνική παλινδρόμηση, εξετάσαμε την επίδραση της Src (ΡΡ2) και αναστολείς (U0126) ΜΕΚ. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4C, βρήκαμε ότι αυτοί οι αναστολείς ανέστρεψε την Ucn3 επαγόμενη πυρηνική συσσώρευση αυτών των πρωτεϊνών. Μπορούν επίσης προκάλεσε μια αύξηση της βασικής πυρηνική έκφραση του p120ctn και Kaiso, πιθανώς λόγω τοξικών τους αποτέλεσμα. Η πυρηνική διανομή των Kaiso αναλύθηκε περαιτέρω με συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 4D). Το ποσοστό των πυρήνων θετικών για Kaiso αυξήθηκε περίπου κατά 40% σε ΗΤ-29 κύτταρα κατεργασμένα με Ucn3. Είναι ενδιαφέρον ότι, στα κύτταρα ελέγχου, τα κύτταρα που αντιστοιχούν σε πυρήνες θετικά για παρατηρήθηκαν Kaiso στην περιφέρεια του συμπλέγματος, το οποίο αντιστοιχεί σε κύτταρα με λιγότερα μεσοκυττάρια επαφές. Υπό Ucn3, τα κύτταρα στο κέντρο του συμπλέγματος έγινε θετική για πυρήνες επισήμανση των Kaiso.

(Α) Ομοεστιακή ανάλυση της θέσης p120ctn σε κύτταρα ΗΤ-29 προκατεργάστηκαν με κυκλοεξιμίδιο πριν από τη θεραπεία Ucn3. μπαρ κλίμακα, 10 μm. (Β) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του p120ctn και η έκφραση πρωτεΐνης Kaiso σε πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα ΗΤ-29 αγωγή ή όχι με Ucn3 (έκφραση κανονικοποιήθηκε προς ιστόνες). (C) Επίδραση των αναστολέων Src και ΜΕΚ (ΔΜ2 και U0126: 10 μΜ, 1 ώρα) για p120ctn και την έκφραση της πρωτεΐνης Kaiso σε πυρηνικά εκχυλίσματα από ΗΤ-29 έλαβαν ή όχι με Ucn3. Έκφραση ομαλοποιήθηκε με ιστόνες. (D) Ομοεστιακή ανάλυση κυτταρική κατανομή των Kaiso σε ΗΤ-29 κύτταρα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με Topro3. Κύτταρα αρνητικά για πυρήνες επισήμανση των Kaiso ήταν οριοθετείται από μια λευκή διακεκομμένη γραμμή. μπαρ κλίμακα, 60 μm.

Η

Όλα μαζί τα δεδομένα μας δείχνουν ότι CRF2 σήματα μέσω ενός μονοπατιού Src να προκαλέσει AJ αναστάτωση από την E-cadherin ενδοκύτωση. Αυτό ακολουθείται από p120ctn και Kaiso πυρηνικής μετατόπισης. Μέσα από αυτή τη διαδρομή, CRF2 μπορούν να συμμετέχουν στην κυτταρική αποδιαφοροποίηση και τη μετανάστευση.

CRF2 σηματοδότησης αναδιοργανώνει τις επαφές κυττάρου-μήτρας υπέρ της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής

μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου απαιτείται για μετάσταση και τα αποτελέσματα από την αναδιοργάνωση του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας επαφές. Ucn3 επαγόμενη διαχωρισμού κυττάρων συσχετίστηκε επίσης με κυτταρικό σχήμα αναδιαμόρφωση όπως παρατηρείται από την ακτίνη κυτταροσκελετό χρώση με φαλλοειδίνη-TRITC στο βασικό πόλο των κυττάρων ΗΤ-29 (Σχήμα 5Α). Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, ακτίνη διανεμήθηκε στην περιφέρεια του κυττάρου και οργανώνεται ως ίνες στρες εξαπλωθεί σε όλη κυττάρων. Με Ucn3, η χρώση ακτίνης ήταν λιγότερο έντονη στην περιφέρεια κελί όπου διασπώνται επαφές. Υπήρχαν επίσης λιγότερες ίνες στρες, η οποία εμφανίστηκε συντομότερη και πιο κατακερματισμένη. Η αναδιαμόρφωση του σχήματος των κυττάρων οδηγείται από ενδο-κυτταρικές κινάσες σηματοδότησης. Σε αυτή τη γραμμή, η οδός ΕΚΚ έχει επίσης συχνά έχουν ενεργοποιηθεί σε απόκριση προς CRF2 ενεργοποίηση. Στα κύτταρα HT-29 CRF2-GFP, δείξαμε ότι ERK φωσφορυλιώθηκε σε Tyr

204 σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά την έκθεση Ucn3 (Εικόνα 5Β). Η αναλογία του φωσφορυλιωμένου /ολική ΕΚΚ αυξήθηκε κατά 2,5 φορές μεταξύ 5 και 15 λεπτά και επέστρεψαν στα βασικά επίπεδα της σε 30 και 60 λεπτά. ΡΡ2, ανέτρεψε την ενεργοποίηση της ERK που επάγεται από Ucn3 χωρίς να αλλάζει το βασικό επίπεδο του (χαμηλή πλευρά). Ο αναστολέας ΜΕΚ, U0126, προκάλεσε την απώλεια των φωσφορυλιωμένων μορφών ERK υπό βασικές συνθήκες και μετά τη θεραπεία Ucn3. Κυτταρική ανάπλαση προσκόλληση και μετανάστευση περιλαμβάνει το εστιακό πρόσφυσης (FA) κινάση (ΡΑΚ). Αυτή η κινάση θα μπορούσε να φωσφορυλιωθούν σε Ser

910 από την κινάση ERK Ser /Thr. έτσι έχουμε καθορίσει το επίπεδο της φωσφορυλίωσης της FAK στα κύτταρα ΗΤ-29 CRF2-GFP που εκτίθενται σε Ucn3 (Σχήμα 5C). ΡΑΚ Ρ

Ser910 ήταν παροδικά αυξημένη με μέγιστο στα 30 λεπτά. Αυτή η φωσφορυλίωση ελαφρώς αναστέλλεται από ΔΜ2 και U0126 υπό βασικές συνθήκες και καταργούνται υπό θεραπεία Ucn3. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Ucn3 ενεργοποιεί ένα Src /ΕΚΚ /FAK καταρράκτη φωσφορυλίωσης μέσω του υποδοχέα CRF2.

(Α) φθορισμός Phaloidin-TRITC αναλύεται με συνεστιακή μικροσκοπία στο βασικό πόλο των κυττάρων ΗΤ-29 CRF2-GFP εξής Ucn3 θεραπεία. μπαρ κλίμακα, 5 μm. (Β) ERK-P

Tyr204 /ΕΚΚ συνολικό δείκτη ποσοτικοποιείται από ανοσοστύπωμα σε ΗΤ-29 κύτταρα κατεργασμένα με Ucn3 (0 έως 60 λεπτά) (άνω πάνελ). Επιπτώσεις της Src (ΡΡ2: 10 μΜ, 1 ώρα) ή ΜΕΚ (U0126: 10 μΜ, 1 ώρα) αναστολείς για Ucn3 που προκαλείται ERK-P

Tyr204 (κάτω πίνακας). (C) Ucn3 μεσολάβηση φωσφορυλίωση του FAK- P

Ser910 σε ΗΤ-29. Ποσοτικοποιήσεις διεξήχθησαν από ανοσοστυπώματα και ομαλοποιήθηκε ως προς ακτίνη (άνω πάνελ). Επιδράσεις της Src (ΡΡ2, 10 μΜ, 1 ώρα) και ERK (U0126, 10 μΜ, 1 ώρα) αναστολείς επί Ucn3 επαγόμενη ΡΑΚ-P

Ser910 (κάτω πίνακας). (D) Ομοεστιακή ανάλυση της κατανομής βινκουλίνης στο βασικό πόλο των ΗΤ-29 μετά τη θεραπεία Ucn3. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Ε) Ποσοτικοποίηση του αριθμού μπάλωμα από το μέγεθος σε 30 λεπτά της θεραπείας Ucn3.

Η

Focal δομές προσκόλλησης, τα οποία ρυθμίζονται από ΡΑΚ, συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις κυττάρου-ECM. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις που προκαλούνται από διάφορους διαμεμβρανικών υποδοχέων όπως ιντεγκρίνες, που συνδέεται με τα συστατικά του κυτταροσκελετού και τα μόρια ικρίωμα σαν βινκουλίνης [27]. Αναλύσαμε την επίδραση της Ucn3 στο FA μέσω της διανομής των βινκουλίνης (Σχήμα 5D). Χωρίς Ucn3, βινκουλίνης εκφράστηκε σε ισχυρή μπαλώματα διανέμονται κυρίως στην περιφέρεια του κυττάρου. Με Ucn3, μικρότερα Διακοπτόμενης νύχια εμφανίστηκε σε χρώση βινκουλίνης που ομοιογενώς κατανεμημένα σε όλο το κύτταρο και ακόμα δεν περιορίζεται στην περιφέρεια, ιδιαίτερα σε 30 λεπτά. Η ποσοτικοποίηση αυτών των patches από το μέγεθος αποκάλυψε ότι οι μικρές κηλίδες αυξημένη ενώ οι μεγάλες παραμένουν αμετάβλητες (Σχήμα 5Ε). Αυτή η ετικέτα υποδηλώνει τον σχηματισμό τω γεννάσθαι εστιακές επαφές, οι οποίες έχουν περιγραφεί προηγουμένως να συμμετάσχουν στην κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση [28]. Έχουμε εκτελέσει πειράματα προσκόλλησης κυττάρου ώστε να ελέγξετε εάν η Ucn3 που προκαλείται από την αναδιοργάνωση βινκουλίνης θα μπορούσε να αλλάξει την κυτταρική προσκόλληση στο κολλαγόνο IV (CoIV) και λαμινίνη 332 (LM-332) (δύο κύριες πρωτεΐνες ECM του βασικού υμένα του παχέος εντέρου του) (Εικόνα 6Α). Ucn3 μειώνει ΗΤ-29 κυτταρικής πρόσφυσης σε αυτά τα δύο συστατικά μήτρας στα 20 και 60 λεπτά των ελασμάτων. Για να καθοριστεί εάν αυτή η επίδραση σχετίζεται με τη μετανάστευση ή /και στην εισβολή ελέγξαμε την επίδραση του Ucn3 επί ΗΤ-29 κινητικότητα κυττάρου με Transwell μετανάστευση και προσδιορισμούς εισβολής Matrigel (Σχήματα 6Β και C). θεραπεία Ucn3 αύξησε σημαντικά το επίπεδο της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσμα δεν υποστηρίχθηκε από τροποποίηση της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα 6D), αλλά θα μπορούσαν να ρυθμιστούν με έκκριση μεταλλοπρωτεασών μήτρας (MMPs). Εμείς, ως εκ τούτου, εξέτασαν την έκφραση και τη δραστικότητα των ΜΜΡ. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 6Ε, τα επίπεδα mRNA για ΜΜΡ3 και ΜΜΡ7 βρέθηκαν να αυξηθεί παροδικά με Ucn3. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαμόρφωση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 μεταγραφές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).