Abstract

Helicobacter pylori

, ένα Gram-αρνητικό, μικροαεροφιλικό βακτήριο που βρίσκονται στο στομάχι, υποτίθεται ότι σχετίζεται με την καρκινογένεση, εισβολή και μετάσταση σε παθήσεις του πεπτικού συστήματος. Κυτταροτοξίνης σχετιζόμενη γονίδιο Α (CagA) είναι μια ογκογόνος πρωτεΐνη του

H. pylori

που κωδικοποιείται από ένα Cag παθογένειας νησί που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι το κύριο βιολογικό γεγονός σε εισβολή ή μετάσταση των επιθηλιακών κυττάρων.

Η. pylori

μπορεί να προωθήσει EMT στην ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, αλλά οι ειδικοί μηχανισμοί είναι ακόμα ασαφείς. Διερευνήσαμε την υποκείμενη μοριακό μηχανισμό της EMT που προκαλείται από το

H. pylori

CagA σε καρκίνο του στομάχου. Στο άρθρο μας, εντοπίσαμε γαστρικό δειγμάτων καρκίνου και των παρακείμενων μη-καρκινικές δείγματα με ανοσοϊστοχημεία και βρέθηκε αυξημένη έκφραση του ΕΜΤ σχετίζεται ρυθμιστικής πρωτεΐνης TWIST1 και μεσεγχυματικών βιμεντίνης δείκτη σε καρκινικούς ιστούς, ενώ παράγοντας προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) και η επιθηλιακή δείκτη έκφραση Ε-καδερίνης μειώθηκε σε δείγματα καρκίνου. Αυτές οι αλλαγές συσχετίστηκαν με το βαθμό κακοήθειας του ιστού. Επιπλέον, τα επίπεδα PDCD4 και TWIST1 είχαν σχέση. Σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με πλασμίδιο έκφρασης CagA, CagA ενεργοποιημένα TWIST1 και έκφραση βιμεντίνη, και ανέστειλε την έκφραση Ε-καδερίνης με προς τα κάτω ρύθμιση PDCD4. CagA προώθησε επίσης την κινητικότητα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων με τη ρύθμιση PDCD4. Έτσι,

H. pylori

CagA που προκαλείται EMT στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, τα οποία αποκαλύπτει ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι της EMT σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου

Παράθεση:. Yu Η Zeng J, Liang Χ, Wang W, Zhou Υ, Ηλιόλουστη Y, et al. (2014)

Helicobacter pylori

Προωθεί Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβαση στο γαστρικό καρκίνο με προς τα κάτω ρύθμιση Προγραμματισμένη κυτταρικής πρωτεΐνης Death 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 21 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 21, Αυγούστου του 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (όχι 973 Πρόγραμμα 2012CB911202.), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (nos: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 και 81170514), η Ιατρική Επιστήμη και το Πρόγραμμα Ανάπτυξης Τεχνολογίας της Shandong (δεν . 2013WS0209) και το Ίδρυμα Καινοτομίας Ανεξάρτητα από το Πανεπιστήμιο Shandong (αρ. 2012TS106). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) είναι μια έλικα σχήμα, Gram-αρνητικό βακτήριο που σχετίζονται με παθήσεις του πεπτικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας γαστρίτιδας, πεπτικό έλκος, γαστρικό καρκίνο, και του βλεννογόνου που σχετίζεται με λεμφοειδή λέμφωμα ιστό.

Η. pylori

έχει χαρακτηριστεί ως καρκινογόνος από την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας και του Διεθνούς Οργανισμού Ερευνών για τον Καρκίνο (WHO /IARC) το 1994 [1], [2].

H. pylori

γονίδια έχουν μια κυτταροτοξίνη που σχετίζεται με το γονίδιο Α (CagA) παθογένεια νησί που κωδικοποιεί την κύρια CagA πρωτεΐνη τοξικότητα και ένα σύστημα έκκρισης τύπου IV (T4SS). CagA παραδίδεται σε κύτταρα ξενιστές με T4SS και επάγει το σχηματισμό του καρκίνου και την εξέλιξη της [3].

Η. pylori

μπορεί απορρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, να επηρεάσει την κανονική αποπτωτικό μονοπάτι, το σχήμα των κυττάρων επιρροή, καταργούν συνδετική δραστικότητα και να διευκολύνουν την επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαινοτύπου μετά μετατοπίζεται μέσα στο κύτταρο ξενιστή [4], [5]. Η

H. pylori

πρωτεΐνη τελεστή CagA επηρεάζει περισσότερες από αυτές τις οδούς.

In vivo

πειράματα έδειξαν ότι η διαγονιδιακή έκφραση του CagA θα μπορούσε να προκαλέσει πολλαπλές κακοήθειες σε ποντίκια, συμπεριλαμβανομένων γαστρική επιθηλιακή υπερπλασία, μυελοειδή λευχαιμία και λεμφώματα Β-κυττάρων, ή γαστρική πολύποδες και αδενοκαρκινώματα του στομάχου και του λεπτού εντέρου [6]. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του

H. pylori

CagA αλληλεπιδρούν σε κύτταρα-ξενιστές είναι ακόμα ασαφής.

Η EMT αρχικά αναγνωρίζεται ως ένα χαρακτηριστικό της εμβρυογένεσης, μια ζωτικής σημασίας διαδικασία για την μορφογένεση κατά την εμβρυϊκή και την καρδιά της ανάπτυξης. Ωστόσο, συμβάλλει επίσης στην ίνωση ιστού, εισβολή και μετάσταση όγκου. EMT χαρακτηρίζεται από αρκετά διακριτά χαρακτηριστικά, όπως η απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης, αυξημένη κινητικότητα κυττάρου, αντίσταση στην απόπτωση, και ορισμένες ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων. Με EMT, επιθηλιακά δείκτες όπως το E-cadherin δείχνουν μειωμένη δείκτες έκφρασης και μεσεγχυματικά όπως vimentin δείχνουν αυξημένη έκφραση. Άλλα ρυθμιστικά μόρια, όπως σαλιγκαριών, TWIST και γυμνοσάλιαγκα show άλλαξε έκφραση [7], [8], [9]. Οι ογκογόνοι οδούς που μπορεί να επάγει την EMT περιλαμβάνουν αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (ΤΟΡ-β), Src, Ets, Ras, Wnt /β-κατενίνης, Notch, πυρηνικός παράγοντας-κΒ και ιντεγκρίνης [10], [11], [12].

η μόλυνση με τον ανθρώπινο παθογόνος παράγοντας

H. pylori

υποτίθεται ότι οδηγεί σε EMT, εισβολή ή μετάσταση του καρκίνου του στομάχου. Για παράδειγμα, προς τα πάνω ρύθμιση του μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 7 από παθογόνους

H. pylori

εξαρτάται εν μέρει από τη γαστρίνη και μπορεί να έχει μια λειτουργία στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου, ενδεχομένως μέσω της ΕΜΤ, με έμμεση επαγωγή επίπεδα διαλυτών ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα σύνδεσης ηπαρίνης [13].

Η. pylori

CagA εμπλέκεται στην εισβολή των κυττάρων του όγκου με την απορύθμιση c-met υποδοχέα σηματοδότησης [14]. Όπως επίσης, CagA μπορούσε να αυξήσει την ενεργοποίηση της /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt διαταράσσοντας τη σταθεροποίηση του συμπλόκου Ε-καδερίνης-β-κατενίνης. Έτσι, CagA παίζει ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη της εντερικής μεταπλασίας [15]. Επιπλέον, η ανάλυση μικροσυστοιχιών πρότεινε ότι η κατάσταση φωσφορυλίωσης του CagA μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση του ΕΜΤ-σχετικών γονιδίων στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα [16]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που διέπουν την EMT που προκαλείται από CagA.

Προγραμματισμένη πρωτεΐνη κυτταρικού θανάτου 4 (PDCD4) εντοπίζεται στον πυρήνα στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [17]. Ως ένα σημαντικό μετα-μεταγραφική στόχος του microRNA (MIR) miR-21, PDCD4 σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου και την πρόγνωση σε ανθρώπινο πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του μαστού και του γαστρικού καρκίνου [18], [19]. Το ογκοκατασταλτικό PDCD4 μπορούν να δεσμευθούν με eIF4A ή eIF4G και αναστέλλουν μετάφραση. PDCD4 μπορεί να ρυθμίσει ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση 4 1 ή ουροκινάσης υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου (uPAR) έκφραση για την αναστολή της εισβολής και καρκίνωμα ενδαγγείωση [20], [21]. PDCD4 θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει τη μεταγραφή των γονιδίων. Αλληλεπιδρά με τον τομέα δέσμευσης DNA του TWIST1 και αναστέλλει τη δέσμευση Υ-box πρωτεΐνη 1 έκφραση [22]. Όπως επίσης, η απώλεια της έκφρασης PDCD4 σχετίζεται με κακοήθη μετασχηματισμό σε γαστρικό καρκίνο [23], [24]. Προς τα κάτω ρύθμιση του PDCD4 σχετίζεται με τη διαφοροποίηση του όγκου σε καρκίνους του πεπτικού συστήματος [25]. Ωστόσο, αν PDCD4 εμπλέκεται στην ΕΜΤ που προκαλείται από CagA σε καρκίνο του στομάχου και του ειδικού μηχανισμού ακόμη χρειάζονται περαιτέρω διευκρίνιση.

Εδώ, ερευνήσαμε τη ρύθμιση της ΕΜΤ-σχετίζονται πρωτεΐνες και έκφραση PDCD4 σε γαστρικό καρκινικό ιστό και CagA ενεργοποίηση της έκφρασης TWIST1 και η αναστολή της E-cadherin και την έκφραση PDCD4 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Ηθική Επιτροπή της Shandong University School of Medicine, και όλα τα δείγματα και τις πληροφορίες που συγκεντρώθηκαν με τη γραπτή συγκατάθεση. Γαστρικών καρκινικών ιστών και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς τους συλλέχθηκαν από 30 ασθενείς κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης στο Qilu Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong (Jinan, Κίνα) από το 2010 έως το 2012. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει επικουρική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Διάγνωση των γαστρικών καρκίνων επιβεβαιώθηκε ιστοπαθολογικά με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης.

Κυτταρική καλλιέργεια και διαμόλυνση

Ανθρώπινο γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (AGS, BGC-823 και SGC-7901) ελήφθησαν από την Κίνα Academia Sinica Cell Repository (Σαγκάη). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους συνιστώμενα μέσα και μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C χωρίς αντιβιοτικά. SGC-7901 κύτταρα και BGC-823 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), και τα κύτταρα AGS καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ρ12 συμπληρωμένο με 10% FBS. Μέσα και FBS αγοράσθηκαν από την Invitrogen (USA). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια pCDNA3.1 ή pCDNA3.1-CagA (δώρο από τον Dr. Yongliang Zhu, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Κίνα) και pEGFP-C1 ή pEGFP-C1-PDCD4 (κατασκευασμένα και παρέχεται από τον Dr. Youhai Chen , Perelman της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια, Φιλαδέλφεια, ΗΠΑ) με τη χρήση X-treme GENE αντιδραστήριο επιμόλυνσης HP (Roche Diagnostics, Germany) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή.

απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και qRT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα με χρήση του αντιδραστηρίου ΤπζοΙ (Invitrogen, USA). Αντίστροφη μεταγραφή εμπλέκεται το κιτ Εκθέτης III First Strand Synthesis (Invitrogen). Η έκφραση των γονιδίων ανιχνεύθηκε με χρήση του ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara, Κίνα) και ομαλοποίηση περιελάμβανε την 2

– △△ μέθοδος ct σχέση προς β-ακτίνη. Primer αλληλουχίες ήταν για PDCD4, sense, 5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 ‘και αντινόημα, 5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3′? E-cadherin, η αίσθηση, 5’-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 ‘και αντινόημα, 5′-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3′? CagA, sense, 5’-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 ‘και αντινόημα, 5′-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3′? και TWIST1, sense, 5’-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 ‘και αντινόημα, 5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3′? βιμεντίνη, sense, 5’-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 ‘και αντινόημα, 5′-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3′? Σαλιγκαριών, sense, 5’-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 ‘και αντινόημα, 5′-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3′? β-ακτίνης, την αίσθηση, 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ‘και αντινόημα, 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’.

Western ανάλυση κηλίδος

Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τα δείγματα και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE , στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ, USA), τα οποία είχαν μπλοκαριστεί αμέσως με 5% άπαχο γάλα σε TBST που περιείχε 1% Tween-20 επί 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού πλύθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) 3 φορές, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντισώματα έναντι PDCD4 (1:500? Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), SNAIL (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadherin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), βιμεντίνη (1:1000, Cell Signaling Technology, ΗΠΑ ), και β-ακτίνη (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), ως έλεγχος κανονικοποίηση, στους 4 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια, με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από μια πλύση, ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ, USA). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε 3 φορές για κάθε δείγμα. Η πρωτεΐνη φορτώθηκε σε 20 έως 50 μg ανά λωρίδα κυκλοφορίας.

Ανοσοϊστοχημεία

δείγματα ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη από-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και αφυδατωθεί με διαβαθμισμένη σειρά του αλκοόλ. ανάκτηση αντιγόνου με θερμική επεξεργασία εκτελείται σε 0.1 Μ ρυθμιστικό κιτρικού. Και αποκλεισμό της ενδογενούς δραστικότητας της υπεροξειδάσης χρησιμοποιήθηκε κατά 3% Η

2O

2. Στη συνέχεια πλακίδια επωάστηκαν με αντισώματα έναντι PDCD4 (1:200), Twist1 (1:500), βιμεντίνη (1:100) ή Ε-καδερίνης (1:500), και την αντίστοιχη συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα και DAB για πυρήνες. Αντισώματα για ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν εκείνα που χρησιμοποιούνται για western blot. Τέλος, αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για αντικηλίδωση διαφάνειες. Tumor διαφοροποίηση των καρκινικών ιστών προσδιορίστηκε με τυφλό τρόπο. Το πρώτο αντίσωμα αντικαταστάθηκε με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ως αρνητικός έλεγχος. Τα δείγματα παρατηρήθηκαν με ένα Nikon Eclipse E800 (Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία) μικροσκόπιο.

Όλες οι τομές παρατηρήθηκαν και σκόραρε από 2 ανεξάρτητες τυφλωμένοι ερευνητές, και διαφάνειες δόθηκε ένα δείκτη συνολικής χρώση (SI) σκοράρει σύμφωνα με η ένταση χρώσης και το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου. Ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως 0, χωρίς χρώση? 1, ασθενής χρώση? 2, μέτρια χρώση? και 3, ισχυρή χρώση. ποσοστό του όγκου των κυττάρων βαθμολογήθηκε ως 0, ≤20% θετικά καρκινικά κύτταρα? 1, 20% -40% θετικών καρκινικών κυττάρων? 2, 40% -60% θετικών καρκινικών κυττάρων? 3, 60% -80% θετικών καρκινικών κυττάρων? και 4, ≥80% θετικά κύτταρα όγκου. Με την αξιολόγηση του SI, τα αποτελέσματα χρώσης τελικά καταγράφεται ως 0-4, χαμηλή έκφραση? 4-6, μέτρια έκφραση? και 6-12, υψηλή έκφραση. Αν η ερμηνεία χρώση διέφερε μεταξύ των ερευνητών, τα δεδομένα για το τμήμα απορρίφθηκαν.

Matrigel δοκιμασία εισβολής

δοκιμασία εισβολής Matrigel εμπλέκεται ένα θάλαμο φρεατίων (Costar, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 2 μg pCDNA3.1, pEGFP-C1? pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1? ή pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Μετά από 48 ώρες, 1 × 10

5 μετα-επιμολυσμένα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε επικοινωνούντα δοχεία προεπικαλυμμένα με 20 μg Matrigel. Μέσο που περιέχει 20% FBS στον κατώτερο θάλαμο χρησίμευσε ως χημειοελκυστικό, και ο άνω θάλαμος γέμισε με μέσο που περιέχει 10% FBS. Μη μετεγκατάσταση κύτταρα απομακρύνθηκαν με μπατονέτες μετά από 24 ή 48 ώρες. Τα κύτταρα μεταναστεύουν στο κάτω μέρος του φίλτρου χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν σε ένα μικροσκόπιο. Τέλος, παραμένοντα κύτταρα συλλέχθηκαν για πρωτεΐνη και απομόνωση RNA. Κάθε αγωγή επανελήφθη 3 φορές.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Φοιτητής

t

δοκιμών ή chi-square test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση 2 ομάδες. Η ανάλυση των δεδομένων που εμπλέκονται SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

P

GSC-7901 και BGC-823 κύτταρα που επιμολύνονται με ένα πλασμίδιο που υπερεκφράζουν PDCD4. PDCD4 mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης ρυθμίζεται αυξητικά σε όλες τις κυτταρικές σειρές πλασμίδιο-επιμολυσμένα (Σχ. 3Α-G). Επιπλέον, τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης TWIST1 και βιμεντίνης, αλλά δεν σαλιγκαριών, μειώθηκαν σε διάφορους βαθμούς, και τα επίπεδα Ε-καδερίνης ήταν αυξημένα (Σχ. 3Α-G). Ως εκ τούτου, TWIST1, βιμεντίνη και την έκφραση Ε-καδερίνης μπορεί να ρυθμίζεται από PDCD4 στο γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα.

Τα πλασμίδια του pEGFP-C1 και pEGFP-C1-PDCD4 αντιστοίχως επιμολύνονται σε AGS, SGC-7901 και BGC-823 κύτταρα για 48 ώρες και στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την απομόνωση ολικού κυτταρικού RNA ή πρωτεΐνης. (Α-Γ) Ανάλυση qRT-PCR του επιπέδου mRNA της TWIST1, σαλιγκαριών, PDCD4, βιμεντίνη και E-cadherin στην AGS, ΓΓΕ-7901 και BGC-823 κύτταρα. Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη mRNA στο ίδιο δείγμα. (Δ) Ανάλυση Western blot της έκφρασης πρωτεϊνών 5 στόχου σε κύτταρα ελέγχου και τα κύτταρα υπερέκφραση PDCD4. (Ε-G) τα αποτελέσματα κηλίδος Western ποσοτικοποιήθηκαν (ImageJ) και το επίπεδο της πρωτεΐνης-στόχου κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 έναντι pEGFP-C1 con

Η

4.. Η EMT ρυθμίζεται από CagA μέσω αναστολής της PDCD4 στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα

Με βάση τις ανωτέρω διαπιστώσεις, μπορούμε υποθέσεις ότι η διαδικασία EMT που προκαλείται από

H. pylori

CagA συνέβη με ρύθμιση προς τα κάτω PDCD4, εμείς συνεπιμολύνθηκαν γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα με πλασμίδιο CagA και PDCD4 πλασμίδιο υπερέκφραση. Η μειωμένη έκφραση του PDCD4 ανακτήθηκε με CagA και υπερεκφράζεται PDCD4 διαμόλυνση. Επίσης, η αυξημένη έκφραση του TWIST1 και βιμεντίνης ανεστάλη και η μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης ρυθμίζεται αυξητικά στο συν-επιμολυσμένα ομάδα. Αυτές οι αλλαγές συνέβησαν τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης (Σχ. 4Α-G). Η μετανάστευση του ανθρώπινου γαστρικού κυτταρική σειρά καρκίνου SGC-7901 επιμολυσμένα με πλασμίδια προσδιορίστηκε με δοκιμασία Matrigel εισβολή. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι προκλήθηκε με CagA πλασμίδιο. δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων αποκάλυψε επίσης ότι η υπερέκφραση PDCD4 μειωτικά CagA επαγόμενη εισβολή τους και την ικανότητά της μετάστασης (Εικ. 5Α). Σύκο. 5Β δείχνει τα μετεγκατεστημένα αριθμών των κυττάρων του SGC-7901 στην ομάδα διαμόλυνσης CagA είναι προφανώς περισσότερο από την ομάδα ελέγχου, ενώ η ποσότητα της μετανάστευσαν κυττάρου σε ομάδα συν-επιμόλυνσης είναι σημαντικά μικρότερο από ομάδα διαμόλυνσης CagA. Τα βιολογικά φαινόμενα καταδεικνύουν την προώθηση EMT από CagA ανακτήθηκε εν μέρει από αυξημένη έκφραση PDCD4. Βάσει των αποδεικτικών στοιχείων, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι PDCD4 μπορεί να απαιτούνται για

H. CagA μεσολάβηση pylori

γαστρικό καρκίνο εξέλιξης

Όλα τα πειράματα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες:. 1) pCDNA3.1 + pEGFP-C1 (έλεγχος), 2) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4. Σύμφωνα με διάφορες ομάδες, τα αντίστοιχα πλασμίδια μετήχθησαν σε AGS, ΓΓΕ-7901 και BGC-823 κύτταρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για RNA και ανάλυση στυπώματος western. (Α-Γ) Ανάλυση qRT-PCR του mRNA του επιπέδου TWIST1, σαλιγκαριών, PDCD4, βιμεντίνη και Ε-καδερίνης σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν σε β- ακτίνης mRNA στο ίδιο δείγμα. (D) ανάλυση κηλίδας Western των CagA, TWIST1, σαλιγκαριών, PDCD4, βιμεντίνη και η έκφραση πρωτεΐνης Ε-καδερίνης σε όλα τα κύτταρα. (Ε-G) τα αποτελέσματα κηλίδος Western ποσοτικοποιήθηκαν (ImageJ) και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 έναντι con,

Δ

P

& lt? 0,05,

ΔΔ

P

& lt? 0,01 έναντι pEGFP + CagA

Η

(Α) Το πείραμα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες:. 1) ρΟΟΝΑ3.1 + pEGFP-C1 (έλεγχος), 2) pCDNA3.1- CagA + pEGFP-C1, 3) pCDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4.The αντίστοιχα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε SGC-7901 κύτταρα σύμφωνα με διάφορες ομάδες. Η ικανότητα εισβολή και τη μετάσταση των κυττάρων αναλύθηκε με προσδιορισμό Matrigel εισβολή. (Β) την ποσοτική τους μετανάστευσαν αριθμούς κυττάρων της ΓΓΕ-7901 σε τρεις ομάδες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από 3 πειράματα. *

P

& lt? 0,05 έναντι con,

Δ

P

& lt?. 0,05 έναντι pEGFP + CagA

Η

Συζήτηση

Η τα κύρια ευρήματα αυτής της μελέτης συνοψίζονται ως εξής: 1)

H. pylori

CagA είναι υπεύθυνη για την επαγωγή της TWIST1 ή βιμεντίνη και η αναστολή της Ε-καδερίνης σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. 2) CagA επαγόμενη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης είναι εν μέρει εξαρτάται από τη ρύθμιση PDCD4. 3) TWIST1 και PDCD4 εμπλέκει στην ΕΜΤ του γαστρικού καρκίνου.

γαστρικό καρκίνο είναι ένα πολυ-βήμα και προοδευτική ασθένεια. Η περίσσεια πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων είναι ένα σημαντικό μέρος της αρχικής αγγειογένεσης όγκου ή της αρχικής ανάπτυξης [5]. Στη συνέχεια, η κυτταρική εισβολή, αρχικά αντικατοπτρίζεται μέσω της βασικής μεμβράνης, θεωρήθηκε ένα προγνωστικό του τελικού σταδίου του καρκίνου? τελικά οδηγεί σε μεταστατική εξάπλωση και τη θνησιμότητα [26]. Παθογόνο μόλυνση θα μπορούσαν να προκαλέσουν ογκογένεση του καρκίνου και κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων-ξενιστών. Ως ένα σημαντικό παθογόνο παράγοντα κινδύνου,

Helicobacter pylori

είχαν στενή σχέση με πεπτικό έλκος, βλεννογόνο που σχετίζεται λέμφωμα λεμφοειδούς ιστού του στομάχου, και του γαστρικού αδενοκαρκινώματος [20], [27], [28], [29] . CagA, ένας από τους πιο αρχής λοιμογόνους παράγοντες του

H. pylori

, προκαλεί εμφάνιση και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων-ξενιστών περιλαμβάνει σε regulationary δικτύου, συμπεριλαμβανομένων πολλών κυτταρικών πρωτεϊνών, μη κωδικοποίησης του RNA, και άλλα βιολογικά μόρια δραστηριότητα. Ωστόσο, ο μηχανισμός υποκείμενη επιδράσεις CagA στο γαστρικό βλεννογόνο είναι τόσο πολύπλοκη και ασαφής.

Ο ΕΜΤ είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη βιολογική διεργασία για την ανάπτυξη εμβρυϊκών οργάνων, η οποία επιτρέπει τα επιθηλιακά κύτταρα να χάνουν επιθηλιακά φαινότυπο και να λάβει μεσεγχυματικών φαινότυπο. Αυτό περιλαμβάνει απώλεια των κυτταρικών πολικότητας σε επιθηλιακά κύτταρα, απώλεια της ικανότητας να συνδέει με βασική μεμβράνη, η πρόσβαση σε μεσεγχυματικά φαινότυπο όπως υψηλότερη μετανάστευση και την εισβολή, αντι-απόπτωση, και την ικανότητα να αποδομούν την εξωκυτταρική μήτρα [8], [30] . EMT διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες, ινωτικές ασθένειες, την εξέλιξη του όγκου και τη διαδικασία ανασυγκρότησης των ιστών, ιδιαίτερα στην απόκτηση της μετανάστευσης και εισβολής ικανότητα για κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα. Ανώμαλη δραστηριότητα στην ΕΜΤ epith ενήλικων επιθηλιακών κυττάρων αναστέλλεται μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, η οποία προκαλείται μειωμένη ικανότητα προσκόλλησης κυττάρου και έτσι επέτρεψε καρκινικά κύτταρα για να εξαπλωθεί στο σώμα, τελικά προώθηση μετάσταση όγκου [31], [32], [33]. Ως εκ τούτου EMT θεωρείται η αρχή της εισβολής και της μετάστασης και είναι επίσης ένα σημάδι της ισχυρή ικανότητα εισβολής και μετάστασης των καρκινικών κυττάρων.

H.pylori

επάγει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση από TNF-α επάγει πρωτεΐνη [34]. Η τρέχουσα μελέτη υποδεικνύει CagA μπορούν να οδηγήσουν σε επιθηλιακά κύτταρα μορφολογικές αλλαγές. Έχει προταθεί ότι η έκφραση CagA δεν αρκούσε μόνο να διαταράξει κορυφής κόμβους, αλλά και μοιάζουν επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση σε κύτταρα νεφρού σκύλου Madin-Darby [35]. Επιθηλιακά κύτταρα που έχουν μολυνθεί από το βακτήριο εμφανίστηκε διάφορες γονιδιωματική αλλαγές και τις επιπτώσεις στην EMT δείκτες που προκαλείται από το

H. pylori

ήταν πιθανώς σε μια cagPaI σχετίζονται τρόπο. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τα επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT)-σχετικών γονιδίων ήταν πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται από CagA θετικά

H. pylori

στελεχών στην ΕΕΑ [36], [37]. Αξίζει να σημειωθεί ότι το κανονιστικό δίκτυο CagA που αφορούν στην EMT του καρκίνου του στομάχου είναι πρέπει ακόμη να διευκρινιστούν.

Για να διερευνήσει το συγκεκριμένο μηχανισμό EMT προωθείται από CagA στο γαστρικό καρκίνο, συγκρίναμε τα γονίδια έκφρασης των παρακείμενων μη καρκινικούς ιστούς και γαστρικό καρκίνωμα ιστούς με ανοσοϊστοχημεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση Twist1 /βιμεντίνη σε ιστούς καρκινώματος ήταν υψηλότερες από γειτονικούς ιστούς μη-όγκου, και η έκφρασή του σε μέση ιστούς /χαμηλή καρκίνωμα διαφοροποιήσεως υψηλότερη από υψηλό ιστούς διαφοροποίηση. Ωστόσο, Ε-καδερίνη και PDCD4 μειώθηκε κατά τη διαδικασία της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης σε γαστρικό καρκίνο. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπάρχει σε μια αρνητική συσχέτιση με την έκφραση της TWIST1 και PDCD4. Η μελέτη μας πρότειναν τα γονίδια ΕΜΤ που συνδέονται με τη διαδικασία του γαστρικού καρκίνου, σύμφωνα με προηγούμενες έρευνες παρατηρώντας απώλεια των επιθηλιακών πρωτεΐνης ή /και την απόκτηση της έκφρασης των μεσεγχυματικών πρωτεΐνες εμφανίστηκαν σε γαστρικό καρκίνωμα. Επιπλέον, είχαν αντίστοιχα συσχετίζεται με ελάχιστα διαφοροποιημένο ιστολογία, προχωρημένο στάδιο και η κακή έκβαση των ασθενών [38]. Επιπλέον, PDCD4 είναι ένα πρόσφατα βρέθηκε μόριο που παίζει ζωτικό ρόλο σε πολλές βιολογικές διαδικασίες που μπορεί να προκαλέσουν ασθένεια ή εμφάνιση και την ανάπτυξη του όγκου. PDCD4 αναστέλλει τη διαδικασία της μετάφρασης από την σύνδεση προς παράγοντα έναρξης της μετάφρασης eIF4A ή eIF4G. Διαφορετικές επαγωγείς της απόπτωσης διεγείρουν τα κύτταρα και ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση του PDCD4, το οποίο θα μπορούσε περαιτέρω ρυθμίζουν Ρ21, CDK4, καρβονικής ανυδράσης II και JNK /c-Jun /ΑΡ-1. PDCD4 θα μπορούσε να αναστείλει την εισβολή που σχετίζονται ουροκινάσης υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου έκφραση, εισβολή ή διήθηση των αιμοφόρων αγγείων, και μετάσταση? Ως εκ τούτου, μειωμένη έκφραση PDCD4 παίζει σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση του όγκου, την ανάπτυξη και την πρόγνωση [17], [33], [39], [40]. Έτσι, αναρωτηθήκαμε αν Twist1 και PDCD4 συμμετείχε στην CagA που προκαλείται από EMT.

Στη συνέχεια, θα ανιχνεύονται παράγοντες μεταγραφής EMT-συνδέονται και δείκτες έκφραση σε CagA-επιμολυσμένα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το

H. pylori

CagA θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση των TWIST1 και βιμεντίνης, αλλά δεν σαλιγκαριών, και προς τα κάτω ρύθμιση της E-cadherin και PDCD4 στο γαστρικό κυτταρικές σειρές (AGS, ΓΓΕ-7901 και BGC-823). Τα αποτελέσματα δεν επηρεάστηκαν από την κατάσταση διαφοροποίησης των επιμολυσμένων κυττάρων. Αν και δεν τηρεί τις μορφολογικές αλλαγές του CagA επιμολυσμένα κύτταρα, εισβολή και την ικανότητα μετάστασης του καρκίνου του στομάχου κύτταρα μπορεί να επιταχυνθεί με CagA μέσω Transwell κυτταρική ανάλυση εισβολής. Αυτό οφείλεται εν μέρει προκαλείται από την λειτουργική ετερογένεια των CagA σε διαφορετικούς ιστούς. Έτσι, το αποτέλεσμα της EMT που προκαλείται από

H. pylori

χρειάζεται ακόμη να διερευνηθεί περαιτέρω. MiR-21 προωθείται ΤΟΡ-β επαγόμενη διαδικασία διαφοροποίησης μυοϊνοβλάστη με στόχευση PDCD4. ΤΟΡ-β επαγόμενη miR-21 έκφραση σε ινοβλάστες και Mir-183 μειωτικά PDCD4 και ανέστειλαν ΤΟΡ-β επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [41], [42]. Εν τω μεταξύ, TGF-β ρυθμίζονται σαλιγκαριών, συστροφή, ή ZEB1 και επηρέασε την EMT και μετάσταση [43]. Επιπλέον, PDCD4 βρέθηκε ότι εμπλέκονται στην μεταγραφή επίσης. Πράγματι, η COOH άκρο της Twist1 περιέχουν την βασική περιοχή έλικας-βρόχου-έλικας προτάθηκε ότι μεσολαβεί την άμεση αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες PDCD4. Έτσι, PDCD4 αλληλεπιδρά με τον τομέα δέσμευσης DNA του Twist1 και αναστέλλει την ικανότητά του δέσμευσης DNA για τη στόχευση γονιδίων σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη [22] .Ως εκ τούτου, ελέγξαμε κατά πόσο περαιτέρω PDCD4 θα μπορούσε να ρυθμίσει TWIST1 σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Η μελέτη μας έδειξε ότι TWIST1 ήταν κάτω ρυθμίζονται από το πλασμίδιο υψηλή έκφραση PDCD4 με πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδωση Western, ενώ η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν αντίθετη με TWIST1 στην AGS, ΓΓΕ-7901 και BGC-823. Η έκφραση του mRNA της ΣΑΛΙΓΚΆΡΙ ήταν μειωτικά στο AGS και SGC-7901, ενώ preotein έκφραση δεν παρατηρήθηκε τις ίδιες αλλαγές. Μπορεί να οφείλεται στην πολυπλοκότητα της πρωτεϊνοσύνθεσης. Δηλαδή, η πρωτεΐνη δεν είναι μόνο ρυθμίζεται στο επίπεδο της μεταγραφής, αλλά και τη μετάφραση και να παραδώσει το επίπεδο. Φαίνεται κατά καιρούς ότι το mRNA δεν είναι μια άμεση ένδειξη του επιπέδου της πρωτεΐνης στα κύτταρα. Τέλος, θα διεξαχθεί περαιτέρω έρευνα σχετικά με το ρόλο των PDCD4 σε CagA που προκαλείται από επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης. Γαστρική επιθηλιακά κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο έκφρασης CagA και PDCD4 πλασμίδιο υπερέκφραση ταυτόχρονα. Αποκατάσταση της έκφρασης PDCD4 μπορούσε να αναστείλει TWIST1 και βιμεντίνης, και να προκαλέσει E-cadherin που ρυθμίζονται από CagA, PDCD4 επίσης πιστοποιηθεί ότι θα μπορούσε να επηρεάσει την ικανότητα εισβολή και τη μετάσταση στα γαστρικά κύτταρα με προσδιορισμό Matrigel εισβολής. Αν και πρόσθετες μελέτες είναι απαραίτητες για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ουσιαστικά CagA που προκαλείται από επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση είναι εν μέρει εξαρτάται από τη ρύθμιση PDCD4.

Εν ολίγοις, έχουμε αποδείξει ότι

H. pylori

CagA επάγουν έκφραση TWIST1 και EMT στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα με τη ρύθμιση PDCD4 (Εικ. 6). Παρέχουμε κάποια στοιχεία σχετικά με το μοριακό δίκτυο του γαστρικού καρκίνου που προκαλείται από το

H. pylori

μόλυνση, και παρέχουν μια θεωρητική βάση για PDCD4 ως βιολογικό στόχο για διάγνωση ή θεραπεία καρκίνου. Η μελλοντική έρευνα περιλαμβάνει μοντέλα ποντικών μπορεί να οδηγήσει σε μια καλύτερη κατανόηση του ρόλου της PDCD4 στο

H. pylori

επαγόμενη EMT του καρκίνου του στομάχου.

H.