Αφηρημένο

Οι λειχήνες είναι συμβιωτική οργανισμοί που παράγουν διακριτά δευτερογενή προϊόντα του μεταβολισμού. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την κυτταροτοξική δραστικότητα του 17 είδη λειχήνων έναντι διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων και περαιτέρω ερευνήθηκε των μοριακών μηχανισμών που διέπουν αντικαρκινική δράση τους. Βρήκαμε ότι μεταξύ 17 λειχήνες ειδών,

F. cucullata

εμφάνισε την πλέον ισχυρή κυτταροτοξικότητα σε πολλά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Υψηλή απόδοση ανάλυση υγρής χρωματογραφίας έδειξε ότι το εκχύλισμα ακετόνης του

F. cucullata

περιέχει usnic οξύ, salazinic οξύ, Squamatic οξύ, Baeomycesic οξύ, d-protolichesterinic οξύ, και lichesterinic οξύ ως δευτερεύοντα. ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι καρκινικές κυτταρικές σειρές ήταν πιο ευάλωτα στα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του εκχυλίσματος από κυτταρικές γραμμές μη-καρκίνου. Επιπλέον, μεταξύ των προσδιορισμένων υποσυνιστώσες, θεραπεία usnic οξύ είχε παρόμοια κυτταροτοξική δράση επί καρκινικών κυτταρικών γραμμών, αλλά με χαμηλότερη δραστικότητα από το εκχύλισμα. Σε μια θανατηφόρα δόση, η θεραπεία με το εκχύλισμα ή με usnic οξύ αύξησε σημαντικά τον πληθυσμό αποπτωτικό κυτταρικό και ειδικώς ενεργοποιημένα το αποπτωτικό μονοπάτι σηματοδότησης? Ωστόσο, με τη χρήση υπο-θανατηφόρες δόσεις, εκχύλισμα και θεραπεία usnic οξέος μειώθηκε καρκινικών κυττάρων κινητικότητα και ανέστειλε

στο

vitro

και

στο

vivo

ογκογόνο δυναμικό . Σε αυτά τα κύτταρα, παρατηρήσαμε σημαντικά μειωμένα επίπεδα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) δείκτες και φωσφόρου Akt, ενώ τα επίπεδα φωσφόρου-c-Jun και φωσφόρου ERK1 /2 επηρεάστηκαν μόνο οριακά. Συνολικά, η αντικαρκινική δράση του εκχυλίσματος είναι περισσότερο ισχυρή από εκείνη της μόνη της usnic οξέος. Στο σύνολό τους,

F. cucullata

και δευτερεύον του, usnic οξύ μαζί με πρόσθετο συστατικό, ασκούν τη δράση κατά του καρκίνου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και της αναστολής της EMT

Παράθεση:. Nguyen TT, Yoon S, Γιανγκ Y, Lee ΗΒ, Ω S, Jeong ΜΗ, et al. (2014) λειχήνα δευτερογενείς μεταβολίτες

Flavocetraria cucullata

Έκθεμα αντικαρκινικές επιδράσεις σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου μέσω της επαγωγής της απόπτωσης και καταστολή καρκινογένεσης Δυνατότητες. PLoS ONE 9 (10): e111575. doi: 10.1371 /journal.pone.0111575

Επιμέλεια: Chengfeng Yang, το Michigan State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Ιούλ του 2014? Αποδεκτές: 26 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτωβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Nguyen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα βασική επιστημονική έρευνα, μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609) και από το Κορέα Εθνικό Πρόγραμμα Κέντρο Ερευνών πόρων (NRF-2012M3A9B8021726). Αυτή η μελέτη έλαβε επίσης την υποστήριξη από την επιχορήγηση της έρευνας που χρηματοδοτείται από το Ερευνητικό Κέντρο Sunchon Φυσικών Ιατρικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια σημαντική αιτία θανάτου παγκοσμίως. Ως ομάδα, οι καρκίνοι αποτελούν περίπου το 13% του συνόλου των θανάτων ετησίως με τον καρκίνο πιο κοινά είναι του πνεύμονα (1,37 εκατομμύρια θάνατοι), ο καρκίνος του στομάχου (736.000 θάνατοι), καρκίνο του ήπατος (695.000 θάνατοι), ορθοκολικό καρκίνο (608.000 θάνατοι), και τον καρκίνο του μαστού (458.000 θάνατοι) [1]. Διηθητικός καρκίνος είναι η κύρια αιτία θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου στον αναπτυσσόμενο κόσμο [2], έτσι για τους λόγους αυτούς, διάφορες θεραπείες του καρκίνου έχουν αναπτυχθεί, συμπεριλαμβανομένου ενός ευρέος φάσματος αντικαρκινικών παραγόντων με γνωστά κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί καρκινικών κυττάρων.

λειχήνες είναι συμβιωτικά οργανισμούς, συνήθως αποτελείται από ένα μυκητιακό εταίρου (mycobiont) και ένα ή περισσότερα φωτοσυνθετικά εταίρων (photobiont), η οποία είναι τις περισσότερες φορές είτε ένα πράσινο φύκι ή ένα κυανοβακτήριο [3] . Παρά το γεγονός ότι η διττή φύση του πιο λειχήνες αναγνωρίζεται πλέον ευρέως, είναι λιγότερο γνωστό ότι μερικοί λειχήνες είναι συμβιώσεις περιλαμβάνει τρεις (τριμερείς λειχήνες) ή περισσότερους εταίρους. Σε γενικές γραμμές, λειχήνες υπάρχουν ως διακριτές thalli και εμμέσως αντιμετωπίζονται ως άτομα σε πολλές μελέτες, ακόμα κι αν μπορεί να είναι μια συμβιωτική οντότητα που περιλαμβάνει είδη από τα τρία βασίλεια. Από γενετική και εξελικτική σκοπιά, λειχήνες δεν μπορεί να θεωρηθεί ως άτομα, αλλά ως σύνθετα, και αυτό έχει σημαντικές επιπτώσεις για πολλούς τομείς της έρευνας, όπως η ανάπτυξη και η αναπαραγωγή.

Πολλά λειχήνες δευτερογενή προϊόντα είναι δυσάρεστη και μπορεί να χρησιμεύσει ως αμυντική ενώσεις των φυτοφάγων ζώων, καθώς και αποικοδομητές. Για το λόγο αυτό, αυτά τα δευτερεύοντα προϊόντα που χρησιμοποιούνται συχνά από τη φαρμακευτική βιομηχανία ως αντιβακτηριακά και αντι-ιικές ενώσεις [4], [5]. Επιπλέον, λειχήνες και δευτερογενείς μεταβολίτες τους έχουν από καιρό μελετηθεί για αντικαρκινική θεραπεία [6] – [15]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την κυτταροτοξική δραστικότητα του 17 είδη λειχήνων που συλλέγονται από τα βουνά Ρουμανική Καρπάθια έναντι διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων και περαιτέρω ερευνήθηκε των μοριακών μηχανισμών στους οποίους βασίζεται αντικαρκινική δράση τους για τον εντοπισμό πιθανών ενώσεων για νέους αντικαρκινικούς παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

Παρασκευή εκχυλισμάτων λειχήνες

thalli του

F. cucullata

συλλέχθηκαν από τη Ρουμανία το 2011, κατά τη διάρκεια της εκδρομής στο Εθνικό Πάρκο Calimani και το Φυσικό Πάρκο Bucegi οργανώθηκε από τον Δρ Crişan στο Πανεπιστήμιο Babeş-Bolyai, Cluj-Napoca, Ρουμανία. Η άδεια για τη συλλογή λειχήνες δείγματα από αυτές τις θέσεις εκδόθηκε από τη Διοίκηση του Εθνικού Πάρκου Calimani και τη Διοίκηση του Φυσικού Πάρκου Bucegi, με την έγκριση της Επιτροπής για την Προστασία των Φυσικών Μνημείων (Ρουμανική Ακαδημία). Οι μελέτες πεδίο δεν συνεπάγεται καμία απειλούμενα ή προστατευόμενα είδη. Τα αντίγραφα αυτά κατατίθενται στην κορεατική λειχήνα Research Institute (KoLRI), Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Sunchon, την Κορέα. Ψιλοκομμένο αποξηραμένα έδαφος thalli του λειχήνα (150 g) εξήχθησαν χρησιμοποιώντας ακετόνη στη συσκευή Soxhlet. Τα εκχυλίσματα διηθήθηκαν και στη συνέχεια συμπυκνώθηκαν κάτω από ελαττωμένη πίεση σε περιστροφικό εξατμιστήρα. Τα ξηρά εκχυλίσματα αποθηκεύθηκαν στους -25 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης. Τα εκχυλίσματα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για όλα τα πειράματα.

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) ανάλυση των υλικών λειχήνα

ξηρά εκχυλίσματα λειχήνα επαναδιαλύθηκαν σε 2 mL ακετόνης και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε HPLC (SHIMADZU, LC-20Α). HPLC αναλύσεις διεξήχθησαν επί YMC-Pack Οϋδ-Α (150 χ 3,9 mm ΙΌ) ανάστροφης φάσης στήλη πλήρως καταληκτικό C18 υλικό (μέγεθος σωματιδίου, 5 μm? Μέγεθος πόρου, 12 nm). Η έκλουση διεξήχθη με ρυθμό ροής 1 mL /min υπό τις ακόλουθες συνθήκες: θερμοκρασία στήλης, 40 ° C? σύστημα διαλύτη, μεθανόλη: νερό: φωσφορικό οξύ (80:20:1, ν /ν /ν) πριν από την επακόλουθη ένεση. Η ανάλυση παρακολουθήθηκε με έναν ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (SPD-M20A) με μια σειρά από 190 έως 800 nm κατά τη διάρκεια του όλου πειράματος HPLC. Οι παρατηρούμενες κορυφές σαρώθηκαν μεταξύ 190 και 400 nm. Ο όγκος έγχυσης δείγματος ήταν 10 μί. Τα πρότυπα που χρησιμοποιούνται ελήφθησαν από τις ακόλουθες πηγές: salazinic οξύ (t

R = 2,27 ± 0,2 λεπτά) που απομονώνεται από λειχήνα

Lobaria pulmonaria,

usnic οξύ (t

R = 11.3 ± 0.3 min) από

Usnea longissima

και protolichesterinic οξύ (t

R = 22.3 ± 0.2 min) και lichesterinic οξύ (t

R = 26,5 ± 0,2 λεπτά) από λειχήνα

Cetraria islandica

.

Κυτταροκαλλιέργεια

Ο ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ΗΤ29 (καρκίνος του παχέος εντέρου), AGS (γαστρικό καρκίνο), Α549 (καρκίνος του πνεύμονα), και CWR22Rv-1 (καρκίνος του προστάτη) διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gen Depot, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Γεν Depot, USA) και 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (RPMI πλήρες μέσο) (Γεν Depot, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). κύτταρα HaCaT (ανθρώπινα κερατινοκύτταρα), ΝΙΗ 3Τ3 (εμβρυϊκά κύτταρα ινοβλαστών ποντικού), ΗΕΚ293Τ (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά), κύτταρα RIE (αρουραίος εντερικά επιθηλιακά) κύτταρα, και Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK) διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM ) (Gen Depot, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Οι κυτταρικές σειρές που είχαν αγοραστεί από την κορεατική γραμμή κυττάρων Τράπεζα (https://cellbank.snu.ac.kr), Κορέα.

δοκιμασίας ΜΤΤ

εκχυλίσματα λειχήνα διαλύθηκαν σε DMSO (Sigma-Aldrich , St. Louis, USA) και σειριακά αραιώνονται με DMEM ή RPMI 1640 για να ληφθούν συγκεντρώσεις 6,125, 12,5, 25, 50, 100 μg /mL. Τα κύτταρα (2 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα, αναπτύσσονται όλη τη νύκτα, και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το εκχύλισμα ακετόνης ή κύρια ενώσεις του

F. cucullata

σε συγκεντρώσεις 100 μg /mL ή μΜ έως 10 μg /mL ή μΜ για 48 ώρες. Μόλις ολοκληρώθηκε θεραπεία, οι καλλιέργειες συμπληρώθηκαν με ΜΤΤ. Μετά την επώαση με ΜΤΤ στους 37 ° C, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιείχε 50% DMSO και 20% SDS, και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 570 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (VERSAmax, Molecular Devices, Minnesota, USA). Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: βιωσιμότητα ποσοστό κυττάρων = (οπτική πυκνότητα (OD) των δειγμάτων του πειράματος /OD του ελέγχου) χ 100. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο για τις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS) λογισμικού.

φθορισμού μικροσκόπιο της αποπτωτική μορφολογία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου σε πυκνότητα 4 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα, ακολουθούμενο από επεξεργασία με το

F. cucullata

εκχύλισμα ακετόνης ή usnic οξέος για 24 ώρες ή 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και επωάστηκαν με διάλυμα επισήμανση αννεξίνης V FITC για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Ιαπωνία) μικροσκόπιο φθορισμού.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες κατεργασίας με το

F. cucullata

εκχύλισμα ακετόνης ή usnic οξύ, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια επωάζονται σε 0.1% Triton Χ-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) για 30 λεπτά . Ακολούθως, τα δείγματα βάφτηκαν με Hoechst 33257 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) σε θερμοκρασία δωματίου μετά από πλύση τρεις φορές σε στερεωτικό διάλυμα σε PBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και τοποθετήθηκαν πάνω σε ένα γυάλινο πλακίδιο. Τα πλακίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Ιαπωνία) μικροσκόπιο φθορισμού και αξιολογήθηκαν ως το ποσοστό των κυττάρων με συμπυκνωμένο ή αποσπασματική πυρήνες από ένα συνολικό αριθμό 300 κυττάρων.

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για τον κυτταρικό κύκλο

Μετά από 24 ώρες επώασης, χωρίς θεραπεία και ακετόνη extract- ή usnic κατεργασμένα με οξύ MDCK, ΗΕΚ293Τ, ΗΤ29, AGS, Α549, και τα κύτταρα CWR22Rv-1 τρυψινοποιήθηκαν. Στη συνέχεια, ένας αναστολέας ΚΝάσης προστέθηκε και επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθεί το υπερκείμενο, και τα κύτταρα σφαιρίδιο αραιώθηκαν σε 100 μL ιωδιούχο προπίδιο (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) και επωάστηκαν για άλλα 30 λεπτά στους 4 ° C. Η κυτταρομετρία ροής εκτελέστηκε με FACS Caliber (BD Biosciences, San Diego, USA).

επούλωση της πληγής δοκιμασία

AGS και τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 2,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων καλλιέργειας ιστού (Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα για συρροή. κύτταρα μονόφυλλο ήταν γδαρμένο με ένα ρύγχος πιπέτας για να δημιουργήσετε μια πληγή. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με RPMI 1640 χωρίς ορό για να απομακρυνθεί επιπλέοντα κύτταρα και επωάστηκαν σε μέσο με 5 μg /mL του

F. cucullata

εξάγει ή 10 μΜ usnic οξύ. Οι φωτογραφίες των κυττάρων πάρθηκαν στα 0, 24, 48, και 72 ώρες μετά τον τραυματισμό για να μετρηθεί το πλάτος του τραύματος. Η απόσταση μετανάστευσαν από τα κύτταρα υπολογίστηκε ως η διαφορά μεταξύ των ακμών του τραύματος σε χρονικό σημείο 1 και στο χρονικό σημείο 2. Για κάθε κυτταρική σειρά, ελήφθη ο μέσος όρος των οκτώ δοκιμασίες τραύματος για να καθορίσει το μέσο ποσοστό της μετανάστευσης σε μια δεδομένη συγκέντρωση του εκχυλίσματος ακετόνη ή usnic οξύ. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

δοκιμασία Invasion

εισβολή καρκινικών κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο transwell (Corning Coster, Corning, ΝΥ, USA) δοκιμασία με μία topchamber 8 μm pore- μέγεθος πολυανθρακικό μεμβράνη επικαλυμμένη με 1% ζελατίνη. AGS και Α549 κύτταρα απλώθηκαν σε 2.5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 0.2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) στο άνω διαμέρισμα του θαλάμου. Το κάτω διαμέρισμα γεμίστηκε με μέσο καλλιέργειας που περιέχει 0.2% BSA και 1 μg /mL ινωδονεκτίνης ως χημειο-προσελκυστικό. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εν απουσία ή παρουσία του εκχυλίσματος ακετόνης /mL 5 μg ή 10 μΜ usnic οξέος για 24 ώρες. Οι άνω θάλαμοι μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Diff Quick kit (Sysmex, Kobe, Japan). Τα εισέβαλαν κύτταρα αναλύθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός σε πέντε τυχαία επιλεγμένα πεδία. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος αριθμός κυττάρων που μεταναστεύουν ανά πεδίο υψηλής ισχύος.

κλωνογονική δοκιμασία

Α549 και AGS κύτταρα πλύθηκαν, επεξεργασία με θρυψίνη, και επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640. Τα κύτταρα (500 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 2.5 κ.εκ. RPMI 1640 ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για προσκόλληση. Μετά 48 ώρες κατεργασίας, μέσα που περιέχουν το εκχύλισμα της ακετόνης ή usnic οξύ αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο για 12 ημέρες. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό στερεομικροσκόπιο. Η επιμετάλλωση απόδοση (ΡΕ) των μη επεξεργασμένων κυττάρων και το κλάσμα επιβίωσης (SF) των επεξεργασμένων κυττάρων προσδιορίζεται στη συνέχεια (n = 3) [16].

μαλακό άγαρ αποικίας σχηματισμός δοκιμασία

AGS (1 × 10

4) και Α549 (1 × 10

4) κύτταρα αιωρήθηκαν σε 1,5 ml μαλακό άγαρ (0,35% αγαρόζη σε RPMI πλήρες μέσο), επιστρώθηκαν επί 1,5 ml στερεοποιημένου άγαρ (0.6% αγαρόζη σε RPMI πλήρες μέσο) σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 3 εβδομάδες. Τα κύτταρα τρέφονται δυο φορές την εβδομάδα με μέσο καλλιέργειας κυττάρων που περιέχουν το εκχύλισμα ακετόνης (1 μg /mL ή 5 μg /mL), usnic οξύ (5 μΜ ή 10 μΜ), lichesterinic οξύ (10 μΜ), ή DMSO (0.01%) . έντασης πίξελ του τομέα αποικίας μετρήθηκε από το λογισμικό ΙΜΤ iSolution (ΙΜΤ i-Solution Inc., Northampton, NJ, USA) σε τυχαία επιλεγμένα πεδία μικροσκοπίου σε κάθε πλάκα. Για να μετρήσετε το ποσοστό περιοχή της αποικίας, το ποσό pixel της περιοχής αποικίας ήταν κανονικοποιούνται σε pixel × τετραγωνικά pixel. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τριών πειραμάτων.

Ανίχνευση πρωτεϊνών σε κυτταρικά λύματα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν

Κύτταρα κατεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος ακετόνης ή υποσυνιστώσες για 48 ώρες με κηλίδα western όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (PARP, κασπάση-3, Bax, Bcl_xL, α-τουμπουλίνης), και BD Biosciences (Ε-καδερίνης). Όλα τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Για την ανάλυση του επιπέδου των φωσφοπρωτεϊνών, με βάση σφαιρίδια multiplex δοκιμασία (δοκιμασία φωσφοπρωτεΐνη Bio-Plex, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [18], [19]. Εν συντομία, η δοκιμασία αυτή μετράται πολλαπλά σήματα φωσφοπρωτεΐνη από ένα ενιαίο λύμα [20].

qRT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA (1 μ§) από κάθε ομάδα κατεργασμένων κυττάρων μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα M-MLV αντίστροφη κιτ μεταγραφάσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και SYBR πράσινο (Enzynomics, Σεούλ, Κορέα). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για PCR πραγματικού χρόνου ήταν Ε-καδερίνης (προς τα εμπρός) 5′-cagaaagttttccaccaaag-3 ‘και (ανάστροφη) 5′-aaatgtgagcaattctgctt-3′? Ν-cadherin (προς τα εμπρός) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ‘και (ανάστροφη) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′? Σαλιγκάρι (προς τα εμπρός) 5’-gaggcggtggcagactag-3 ‘και (ανάστροφη) 5′-gacacatcggtcagaccag-3′? Twist (προς τα εμπρός) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ‘και (ανάστροφη) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′? GAPDH (προς τα εμπρός) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ‘και (ανάστροφη) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. αντίδρασης και ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

In vivo ογκογενετικότητας

δοκιμασία

Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Chonnam Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ιατρικής Σχολής έρευνα Θεσμική Φροντίδα & amp ζώων? Επιτροπή χρήση. Συντήρηση των ζώων και όλα τα in vivo πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες αρχές για τη φροντίδα και χρήση των ζώων (δημοσίευση DHEW, ΝΙΗ 80-23). Κύτταρα Α549 παρασκευάστηκαν σε RPMI 1640 (1 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) και τα αιωρούμενα κύτταρα προκατεργάστηκαν με το ένα δέκατο της θανατηφόρου συγκέντρωση

F. cucullata

εκχύλισμα ακετόνης, usnic οξύ, lichesterinic οξύ, ή DMSO (Όχημα) ακριβώς πριν από την ένεση. Τα κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως στην περιοχή του πλευρού του Balb /c γυμνό ποντίκι και του όγκου μετρήθηκε μετά από δύο εβδομάδες.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα δοκιμάσθηκαν εις τριπλούν (n = 3). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο ± τυπική απόκλιση. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση SPSS 17. Τα αποτελέσματα της αγωγής προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA post-hoc ανάλυση. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά

Αποτελέσματα

Flavocetraria cucullata

εκχύλισμα ακετόνης έχει ισχυρή κυτταροτοξική αποτελέσματα σε καρκινικά κύτταρα

Για να. προσδιορίσει την κυτταροτοξική ουσία από τα ρουμανικά λειχήνες, μετρήσαμε το IC

50 τιμές των εκχυλισμάτων ακετόνης από 17 είδη λειχήνων σε ΗΤ29 (ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα) και AGS (γαστρικό καρκινικών κυττάρων) κύτταρα. Ανάμεσα στα είδη λειχήνων,

F. cucullata

εξασκείται τα πιο ισχυρά κυτταροτοξικά αποτελέσματα τόσο ΗΤ29 (IC

50 = 10,9 μg /mL) και AGS (IC

50 = 11,6 μg /mL) σε σύγκριση με άλλα είδη λειχήνα (IC

50 οι τιμές κυμαίνονταν γύρω από 25-100 μg /mL, Πίνακας S1 στο αρχείο S1). Να ελέγξει αν η κυτταροτοξικότητα του

F. cucullata

εκχύλισμα ήταν ειδική για τα καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω δοκιμές σε πρόσθετα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων Α549 (καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων) και CWR22Rv-1 (καρκινικά κύτταρα του προστάτη) και σε μη-καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων MDCK (Madin-Darby νεφρού σκύλου ) και RIE (εντερικών επιθηλιακών κυττάρων αρουραίου), ΝΙΗ 3Τ3 (ποντικός εμβρυϊκών ινοβλαστών), HaCaT (κύτταρα ανθρώπινου κερατινοκυττάρων). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

F. cucullata

εκχύλισμα ακετόνης επηρεάζονται ειδικά τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων ενώ τα μη καρκινικά κύτταρα δεν είχαν καταστραφεί σοβαρά (Εικ. 1Α).

(Α) Ποσοστό βιωσιμότητα των κυττάρων σε επεξεργασία με το εκχύλισμα ακετόνης του

ΦΆ. cucullata

. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με το

F. cucullata

εκχύλισμα σε μια συγκέντρωση που κυμαίνεται από 10-50 μg /mL για 48 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. (Β) Υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία χρωματογραφήματα του

F. cucullata

εκχύλισμα. Η ταυτότητα της κάθε δευτερεύον σημειώνεται στην αντίστοιχη κορυφή. (C-D) Η επί τοις εκατό βιωσιμότητα των κυττάρων σε επεξεργασία με είτε usnic οξύ (C) ή lichesterinic οξύ (D). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη υποσυνιστώσα του

F. cucullata

σε μία συγκέντρωση που κυμαίνεται από 12.5-50 μΜ για 48 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές ± S.E.M. (Τυπικό σφάλμα του μέσου όρου), n = 3.

Η

Για να προσδιορίσει τις επιμέρους συνιστώσες του

F. cucullata

, HPLC πραγματοποιήθηκε στο εκχύλισμα ακετόνης του

F. cucullata

? τα προκύπτοντα χρωματογραφήματα και φασματομετρίας μάζας αναλύσεις κάθε κορυφής που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 Β και Πίνακας S2 σε S1 αρχείου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, salazinic οξύ (Tr = 2.268 min), squamatic οξύ (Tr = 2,855), baeomycesic οξύ (Tr = 4,646), usnic οξύ (Tr = 11.327), d-protolichesterinic οξύ (Tr = 22.315), και lichesterinic οξύ (Tr = 26.595) ανιχνεύθηκαν στο εκχύλισμα ακετόνης του

F. cucullata

. Μεταξύ των επιμέρους συστατικών, usnic οξύ είχε την υψηλότερη κορυφή (ένταση% = 91.49 ± 0,0025), ενώ d-protolichesterinic οξύ και lichesterinic οξύ έδειξαν χαμηλότερες κορυφές (% ένταση = 2.27 ± 0.1, 2.22 ± 0.1, αντίστοιχα) (Πίνακας S2 στο αρχείο S1 ). Μετά τον εντοπισμό των επιμέρους συστατικών λειχήνες, δύο κύριους μεταβολίτες, usnic οξύ (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) και lichesterinic οξύ (απομονωθεί από το

F. Cucullata

εκχύλισμα που μοιράζονται τη χημική τους δομή με d-protolichesterinic οξύ εκτός έναν ακόρεστο δεσμό άνθρακα) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα. Για να καθοριστεί ποια υποσυνιστώσα ήταν υπεύθυνη για την κυτταροτοξικότητα του λειχήνα, μετρήσαμε την κυτταροτοξικότητα της usnic οξέος και lichesterinic οξύ και διαπίστωσε ότι usnic οξύ έδειξε παρόμοια κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε μη καρκινικά και καρκινικά κύτταρα ενώ lichesterinic οξύ δεν επέδειξαν κανένα εμφανές κυτταροτοξική επίδραση σε οποιαδήποτε από τις δοκιμάστηκαν κύτταρα (Σχ. 1C και 1D). Στον Πίνακα S3 στο αρχείο S1, το IC

50 τιμές εκχύλισμα ακετόνης, usnic οξύ, και lichesterinic οξέος σε διάφορα κύτταρα παρουσιάζονται. Είναι ενδιαφέρον ότι, δεδομένης της μοριακό βάρος (ΜΒ = 344) και η ένταση% των usnic οξέος στο εκχύλισμα ακετόνης του

F. cucullata

, IC

50 τιμές του usnic οξέος σε ΗΕΚ293Τ, ΗΤ29 και κύτταρα Α549 ήταν πιθανόν υψηλότερες από εκείνες των υπολογιζόμενη συγκέντρωση usnic οξύ στο εκχύλισμα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αγνώστων στοιχείων δευτερεύοντα στοιχεία του

F. cucullata

εξαγάγετε πιθανό να ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα της usnic οξέος. Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι IC

50 τιμές του usnic οξύ, ειδικά σε μη καρκινικά κύτταρα, όπως MDCK, RIE, ΝΙΗ 3Τ3 και κύτταρα HaCaT, ήταν πολύ χαμηλότερες από εκείνες της συγκέντρωσης usnic οξέος στο

ΦΆ. cucullata

εκχύλισμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχει ένας ανθεκτικός μηχανισμός που υπογραμμίζει την κυτταροτοξικότητα του usnic οξέος σε κύτταρα ή ότι άλλο υποσυστατικό (ες) μπορεί να ελαττώσει την κυτταροτοξικότητα του usnic οξέος στα κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα ακετόνης του

F. cucullata

έχει εκλεκτική κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα και ότι usnic οξύ μπορεί να δράσει ως ένα σημαντικό τελεστή αυτών των επιδράσεων.

θανατηφόρες συγκεντρώσεις

του Flavocetraria cucullata

και usnic οξύ επάγουν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

Για να καθοριστεί αν η κυτταροτοξικότητα του

F. cucullata

και usnic οξύ οφειλόταν στην επαγωγή της απόπτωσης, τα κύτταρα σε επεξεργασία με ένα θανατηφόρο συγκέντρωση

F. cucullata

παρατηρήθηκε (50 μg /mL) ή usnic οξύ (100 μΜ) βάφτηκαν με Hoechst 33258 και πυρηνική μορφολογία τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, συμπυκνωμένο πυρηνική μορφολογία παρατηρήθηκε σε AGS κύτταρα κατεργασμένα με είτε

F. cucullata

εξάγει ή usnic οξύ. Στο Σχήμα 2Β, οι ποσοτικοποιήσεις του αριθμού των κυττάρων σε διάφορες κυτταρικές σειρές που φαίνεται. Είναι ενδιαφέρον ότι, η επαγωγή πυρηνικής συμπύκνωσης ήταν σημαντικά αυξημένη σε αγωγή καρκινικά κύτταρα αλλά δεν παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά μη καρκινικών MDCK, υποδηλώνοντας ότι η

F. cucullata

και usnic οξέος είναι επιλεκτικά κυτταροτοξική για τα καρκινικά κύτταρα μέσω της επαγωγής της απόπτωσης.

(Α) Hoechst 33258 χρώση AGS (ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή) κύτταρα επεξεργασμένα με το

F. cucullata

εξάγει ή τα δευτερεύοντα στοιχεία του, usnic οξύ και lichesterinic οξύ. Τα βέλη δείχνουν κύτταρα παρουσιάζουν συμπυκνωμένη ή κατακερματισμένη πυρηνική μορφολογία. Αντιπροσωπευτικά εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Quantificational ανάλυση συνοπτικών ή κατακερματισμένη πυρηνική μορφολογία σε διάφορα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

F. cucullata

εξαγάγετε ή τα δευτερεύοντα στοιχεία του. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± S.E.M. (Τυπικό σφάλμα του μέσου), η = 3. ** ρ & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? NS, καμία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα διμεθυλοσουλφοξείδιο-αγωγή.

Η

Για να επιβεβαιωθεί αυτό, χρώση των κυττάρων με FITC-Annexin V για την ανίχνευση της έκθεσης φωσφατιδυλοσερίνης επί της εξωτερικής μεμβράνης του πλάσματος, η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό βρίσκοντας σε κύτταρα που υφίστανται απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, τα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με είτε

F. cucullata

εξάγει ή usnic οξύ έδειξε FITC θετικότητα. Για να προσδιοριστεί το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο πραγματοποιήθηκε. Όπως φαίνεται στις Εικόνες 3Β και 3C, ο πληθυσμός των κυττάρων στην υπο G1 φάση αυξήθηκε μετά από 24 ώρες κατεργασίας σε καρκινικά κύτταρα. Αυτή η ποσοτική ανάλυση αποκάλυψε ότι η επαγωγή απόπτωσης από το

F. cucullata

εκχύλισμα ήταν δοσοεξαρτώμενη εκτός σε κύτταρα MDCK, με σημαντικές αυξήσεις παρατηρήθηκαν σε AGS, ΗΤ29, και Α549 κύτταρα (Σχ. 3Β). Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η αποτελεσματικότητα της usnic οξύ στην αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του

F. cucullata

εκχύλισμα. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι και πάλι αγνώστων δευτερεύον (ες) του

F. cucullata

μπορεί να ενισχύσει τις επιδράσεις του usnic οξύ αν και usnic οξύ παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης σε διάφορους καρκινικά κύτταρα.

(Α) FITC-αννεξίνης V χρώση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με το

F. cucullata

εξάγει ή usnic οξύ. Τα βέλη δείχνουν κύτταρα δείχνει FITC θετικότητα. (Β-Ο) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κατανομών του κυτταρικού κύκλου μετά

F. cucullata

εκχύλισμα (Β) ή usnic οξύ (C) κατεργασία και γραφική αναπαράσταση των αποτελεσμάτων. Αντιπροσωπευτικά εικόνες ή τα αποτελέσματα φαίνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αλλαγές στο επίπεδο των αποπτωτικών πρωτεϊνών, πραγματοποιήσαμε ανάλυση Western Blot για την πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), caspase- 3, Βαχ και Bcl-xL. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Α και 4D, εκχύλισμα και θεραπεία usnic οξύ αύξησε τα επίπεδα της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση-3 σε CWR22Rv-1, AGS, ΗΤ29 και κύτταρα Α549. Επιπλέον, το επίπεδο της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bax, ήταν σημαντικά αυξημένη σε αυτά τα επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά όχι σε MDCK κύτταρα και ΗΕΚ293Τ (Σχ. 4Β και 4Ε). Αντιθέτως, το επίπεδο της αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bcl-xL, ήταν σημαντικά μειωμένη μόνο σε κατεργασμένα καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4C και 4F). Σταθερά,

F. cucullata

ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης από usnic οξύ και ήταν πιο αποτελεσματική σε καρκινικά κύτταρα από μη καρκινικό κύτταρο. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι θανατηφόρες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος ακετόνης του

F. cucullata

και η υποσυνιστώσα του usnic οξύ επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων.

(Α και D) Ανάλυση Western blot του πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και κασπάσης-3 σε κύτταρα κατεργασμένα με την

F. cucullata

(Α) ή usnic οξύ (D). Αιχμές βελών υποδεικνύουν διασπασμένων τεμαχίων κάθε πρωτεΐνης. (Β-Γ και Ε-Ρ) Quantificational ανάλυση του Βαχ (Β και Ε) και Bcl-xL (C και F) επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα κατεργασμένα με την cucullata F. ή usnic οξύ, αντίστοιχα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± S.E.M. (Τυπικό σφάλμα του μέσου όρου). * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? NS, καμία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα διμεθυλοσουλφοξείδιο-θεραπεία.

Η

Υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις

Flavocetraria cucullata

και usnic οξύ αναστέλλει την ογκογονικότητα και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η αντικαρκινική δράση του

F. cucullata

εξάγει και usnic οξύ, χρησιμοποιήσαμε ένα δέκατο των θανατηφόρων συγκεντρώσεις αυτών των ενώσεων, οι οποίες δεν δείχνουν την κυτταροτοξικότητα (υπο-θανατηφόρου συγκέντρωσης) και δοκιμάστηκε η

στο

vitro

ογκογονικότητα και την κινητικότητα των Α549 και AGS κύτταρα. Ένα κλωνογονική δοκιμασία αυτών των κυττάρων σε υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος (5 μg /mL) ή usnic οξύ (10 μΜ) έδειξαν μια σημαντική μείωση του αριθμού των αποικιών, υποδεικνύοντας ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναστάλθηκε σε αυτές τις συγκεντρώσεις (Σχ. 5Α και 5Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η επεξεργασία με 10 μg εκχυλίσματος /mL ή 15 μΜ usnic οξύ ανέστειλε πλήρως το σχηματισμό αποικιών στους δύο τύπους κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίθετα, lichesterinic οξύ δεν έδειξε καμία ανασταλτική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Μια δοκιμασία μαλακού αποικίας σχηματισμός άγαρ διεξήχθη για να ελεγχθεί αν υπο-θανατηφόρες συγκεντρώσεις του

F. cucullata

και usnic οξύ ανέστειλε την αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των Α549 και AGS κύτταρα. Όπως φαίνεται στα σχήματα 5C και 5D, σχηματισμό αποικιών Α549 και κύτταρα AGS σε μαλακό άγαρ μειώθηκε σημαντικά με κατεργασία με το

F. cucullata

εξάγει ή usnic οξύ σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ lichesterinic οξύ δεν επηρέασε ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τόσο το

F. cucullata

εξάγει και usnic οξέος έχουν αντι-ογκογόνο δράση σε συγκεντρώσεις υπο-θανατηφόρες. Μια δοκιμασία προσδιορισμού και της εισβολής επούλωση πληγών περαιτέρω εκτελείται για να ελεγχθεί εάν

F. cucullata

και usnic οξύ επηρεάζουν τη μετανάστευση και την εισβολή, αντίστοιχα, των καρκινικών κυττάρων σε συγκεντρώσεις υπο-θανατηφόρα. Στα Σχήματα 6Α-C,

F

.

cucullata

εκχύλισμα και θεραπεία usnic οξύ ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των Α549 και AGS κύτταρα. Όπως φαίνεται στα σχήματα 6Δ-Ε, το

F. cucullata

εξάγει και usnic οξύ ανέστειλε επίσης την εισβολή των Α549 και AGS κύτταρα, ενώ δεν υπάρχει τέτοια αναστολή της εισβολής ανιχνεύθηκε σε lichesterinic οξύ κατεργασμένα κύτταρα καρκίνου. Τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι

F. cucullata

και usnic αναστέλλουν οξύ κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και να μειώσει ογκογονικότητα των καρκινικών κυττάρων σε συγκεντρώσεις υπο-θανατηφόρος.

(Α-Β) κλωνογονική δοκιμασία των Α549 κυττάρων και AGS επεξεργασία με το

F. cucullata

εκχύλισμα, usnic οξύ, ή lichesterinic οξύ (Α) και quantificational ανάλυση του αριθμού των αποικιών σε κάθε ομάδα (Β). (C-D) δοκιμασία μαλακού άγαρ αποικίας σχηματισμό Α549 και AGS κύτταρα επεξεργασμένα με

F. cucullata

εκχύλισμα, usnic οξύ, ή lichesterinic οξύ (C) και quantificational ανάλυση τοις εκατό περιοχής αποικίας σε κάθε ομάδα (D). Αντιπροσωπευτικά εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± S.E.M. (Τυπικό σφάλμα του μέσου), η = 3. * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? NS, καμία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα διμεθυλοσουλφοξείδιο-θεραπεία.

Η

(Α-Γ) προσδιορισμός της μετανάστευσης των Α549 (Α) και τα κύτταρα AGS (Β) που έλαβαν θεραπεία με το

F. cucullata

εκχύλισμα ή usnic οξύ, και quantificational ανάλυση του μήκους του τραύματος σε κάθε ομάδα (C). (Δ-Ε) δοκιμασία Εισβολή των Α549 και AGS κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το

F. cucullata

εκχύλισμα, usnic οξύ, ή lichesterinic οξύ (D), και quantificational ανάλυση εισέβαλαν αριθμούς κυττάρων σε κάθε ομάδα (Ε). Αντιπροσωπευτικά εικόνες παρουσιάζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± S.E.M. (Τυπικό σφάλμα του μέσου), η = 3. ** ρ & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? NS, καμία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την διμεθυλοσουλφοξείδιο-αγωγή ομάδας σε κάθε κυτταρικές σειρές. @@ P & lt? 0,01? @@@ P & lt? 0.001 σε σύγκριση με την υποδεικνυόμενη ομάδα

Η

Όπως

F.. cucullata

και usnic οξύ βρέθηκαν να μειώσει σημαντικά την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και ογκογενετικότητας, τότε να διερευνηθεί κατά πόσον επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) παίζει ένα ρόλο στη διαμεσολάβηση αυτά τα αποτελέσματα. Το επίπεδο έκφρασης της Ε-καδερίνης αναλύθηκε σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με ένα υπο-θανατηφόρος συγκέντρωση

F. cucullata

, usnic οξύ, ή lichesterinic οξύ. Τα δεδομένα έδειξαν ότι το εκχύλισμα ακετόνης του

F. cucullata

και usnic οξύ αύξησε σημαντικά το επίπεδο της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης (Εικ. 7Α). Πίνακας S1. Πίνακας S2. Πίνακας S3.