Αφηρημένο

περιεκτικότητα σε χοληστερόλη μπορεί να διαφέρουν αισθητά μεταξύ της κανονικής και του καρκίνου κύτταρα, με αυξημένα επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα. Εδώ, ερευνήσαμε την παγίδευση της χοληστερόλης με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (MCD) και σχηματισμού πόρων με την ostreolysin A /B pleurotolysin σύμπλοκο πρωτεΐνης (Olya /PlyB) που δεσμεύεται με domains μεμβράνη χοληστερόλης /σφιγγομυελίνη πλούσια. Αξιολογήσαμε τις επιπτώσεις στη βιωσιμότητα των Τ24 επεμβατικές και μη επεμβατικές RT4 ανθρώπινα καρκινικά ουροθηλιακά κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα χοίρου ουροφόρων (NPU). περιεκτικότητα σε χοληστερόλη συσχετίζεται έντονα με καρκινικό μετασχηματισμό, όπως υψηλότερη στις T24 υψηλής ποιότητας επεμβατική ουροφόρων καρκινικά κύτταρα, και χαμηλότερα στα κύτταρα NPU. θεραπεία MCD επάγεται εξέχοντα κυτταρικό θάνατο των κυττάρων Τ24, ενώ θεραπεία Olya /PlyB οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων μη επεμβατικής καρκινώματος χαμηλού βαθμού RT4. αναλύσεις Βιοχημικές και ηλεκτρονική μικροσκοπία διάδοσης αποκάλυψε ότι MCD και Olya /PlyB επάγουν νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα, ενώ η βιωσιμότητα των κυττάρων NPU δεν επηρεάστηκε σημαντικά από οποιαδήποτε θεραπεία. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η MCD είναι πιο τοξική για Τ24 υψηλής ποιότητας επεμβατική ουροφόρων καρκινικά κύτταρα, και Όλια /PlyB για RT4 χαμηλού βαθμού μη επεμβατική καρκίνο ουροθηλιακά κύτταρα, και δεν είναι τοξικό για τα κύτταρα NPU. Η χοληστερόλη και /domains μεμβράνη σφιγγομυελίνη πλούσια σε χοληστερόλη σε ουροφόρων καρκινικά κύτταρα αποτελούν έτσι μια επιλεκτική θεραπευτικό στόχο για την εξάλειψη των ουροφόρων καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Resnik Ν, Repnik U, Kreft ME, Sepčić Κ, Macek P, turk B, et al. (2015) άκρως επιλεκτική Αντικαρκινική Δραστηριότητα της χοληστερόλης που αλληλεπιδρούν Πράκτορες μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη και Ostreolysin Α /Pleurotolysin Β Protein Complex σε καρκινικά κύτταρα ουροθηλιακά. PLoS ONE 10 (9): e0137878. doi: 10.1371 /journal.pone.0137878

Επιμέλεια: Marie-Claude Potier, Institut du Cerveau et de la Moelle, Γαλλία

Ελήφθη: 2 Δεκέμβρη, 2014? Αποδεκτές: 24 του Αύγ 2015? Δημοσιεύθηκε: 11η Σεπτεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Resnik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από τον Οργανισμό της Σλοβενίας Έρευνας (https://www.arrs.gov.si/en/agencija), επιχορηγήσεις P3-0108, P1-0207, P1- 0140, και J1-4305. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στις περισσότερες ευκαρυωτικά κύτταρα, η περιεκτικότητα της χοληστερόλης στο πλάσμα μεμβράνης αντιπροσωπεύει όσο το 90% της ολικής χοληστερόλης κυττάρου [1,2]. Η χοληστερόλη είναι μια συνιστώσα κρίσιμη μεμβράνη, και επηρεάζει δομή και λειτουργία της μεμβράνης, συμπεριλαμβανομένων ρευστότητα της μεμβράνης και της δραστηριότητας της πρωτεΐνης της μεμβράνης [3,4,5]. Μαζί με σφιγγομυελίνη, χοληστερόλη συσσωρεύεται σε τομείς μεμβράνη που είναι γνωστές ως σχεδίες μεμβράνη. Οι ειδικές συνθέσεις των λιπιδίων και πρωτεϊνών αυτών των τομέων μεμβράνης χοληστερόλης /σφιγγομυελίνη πλούσια εμπλέκεται σε πολλές βασικές οδούς σηματοδότησης που σχετίζεται με την κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την απόπτωση [6,7].

μεταβολισμό της χοληστερόλης ρυθμίζεται αυστηρά, για να διατηρηθεί η κατάλληλη περιεκτικότητα σε χοληστερόλη σε υγιή κύτταρα. Κλινική και πειραματική απόδειξη προτείνει ότι οι διαταραχές στο μεταβολισμό της χοληστερόλης μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεσης και του όγκου ανάπτυξης (που επισκοπείται στο [8,9]). Τέτοιες διαταραχές έχει αποδειχθεί σε πολλές κακοήθειες [10,11,12], και οι μεταβολίτες της χοληστερόλης μπορεί να προωθήσει ή να καταστείλει καρκίνων [13]. Αυξημένα επίπεδα χοληστερόλης έχουν παρατηρηθεί σε μη επεμβατική [10,14,15] και επεμβατική [16] τα καρκινικά κύτταρα, και αυτές οι αυξήσεις της χοληστερόλης μπορούν να διαμορφώσουν δυναμική μεμβράνη σχεδιών και σχεδία που σχετίζονται με τον συντονισμό των διαφόρων οδών σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα [17].

Η περιεκτικότητα σε χοληστερόλη των καρκινικών κυττάρων αυξάνεται συνήθως μέσω αυξητική ρύθμιση του 3-υδροξυ-3-μεθυλογλουταρυλο (HMG) -CoA ρεδουκτάσης, ένα ρυθμιστικό ένζυμο στην σύνθεση της χοληστερόλης, η οποία οδηγεί σε σύμφυση των σχεδιών μεμβράνης, και μπορεί τόνωση της καρκινογένεσης οδών [18]. Ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα καταστέλλουν HMG-CoA αναγωγάσης και έχουν αντικαρκινική ιδιότητες μέσω της επαγωγής κυτταρικής νέκρωσης ή απόπτωσης [19,20]. Άλλες γνωστές αντικαρκινική λιπίδια που παρεμβαίνουν με λειτουργίες μεμβράνη σχεδία μέσω ομοιόσταση της χοληστερόλης είναι οι alkylphospholipids, όπως εδελφοσίνη [21]. George και Wu πρότεινε ότι η σημασία της σύνθεσης μεμβράνης σχεδιών και ακεραιότητα για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό είναι κυτταρικό τύπο, λόγω μικρορύθμιση των οδών σηματοδότησης που μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο ή κυτταρική επιβίωση [22]. Ως εκ τούτου, οι τομείς της μεμβράνης της χοληστερόλης εμπλουτισμένο είναι πιθανοί στόχοι για παράγοντες σχεδία οχληρές, να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η βιωσιμότητα. Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα τέτοιων παραγόντων μπορεί να οδηγήσει σε τουλάχιστον τρεις μορφές κυτταρικού θανάτου: απόπτωση, αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο, και νέκρωση [18,23,24]. εξάντληση Χοληστερόλη με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (MCD), η οποία απομονώνει χοληστερόλης στο πλάσμα-μεμβράνη, καθιστά τα κύτταρα μελανώματος ευπαθή σε απόπτωση [25] και προκαλεί απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του μαστού και του προστάτη, οι οποίες έχουν άφθονη σχεδίες μεμβράνη [18].

στην τεχνητή και βιολογικές μεμβράνες, χοληστερόλη /domains μεμβράνη σφιγγομυελίνη-πλούσιοι μπορούν να επισημαίνονται με το συγκρότημα ostreolysin Α /pleurotolysin πρωτεΐνη Β (Όλια /PlyB) τόσο πολύ επιλεκτικά και με υψηλή συγγένεια [26,27]. Olya και PlyB παράγονται από το μανιτάρι

Pleurotus ostreatus

, και συναρμολογούνται σε ένα σύμπλοκο που σχηματίζει πόρους όπου κάθε μία από τις πρωτεΐνες έχει ένα συγκεκριμένο ρόλο. Olya χρησιμεύει ως το συστατικό μεμβράνη δέσμευσης, και δεσμεύεται αποκλειστικά σε περιοχές της μεμβράνης που είναι εμπλουτισμένα σε στερόλες και σφιγγομυελίνη [26,27,28,29]. Αυτή η σύνδεση μπορεί να προσλάβει PlyB στην επιφάνεια της μεμβράνης, που οδηγεί στο σχηματισμό του 13-πλάσια διαμεμβρανική πόρου, όπου κάθε υπομονάδα αποτελείται από ένα μόριο PlyB τοποθετημένο σε μια δεσμευμένη σε μεμβράνη Olya διμερές [26,30].

Η αλληλεπίδραση των Olya με μεμβράνες χοληστερόλης /σφιγγομυελίνης είναι ιδιαίτερα συνεργατική σχέση με τα επίπεδα της χοληστερόλης μεμβράνη πάνω από ένα ~ 30 mol% κατώφλι [28]. Μόλις Olya προσλαμβάνεται σε αυτές τις μεμβράνες, και εάν η συγκέντρωση του Olya /PlyB είναι αρκετά υψηλή, PlyB έχει δραστικότητα σχηματισμού πόρων [31]. Η προ-επεξεργασία των κυττάρων είτε με MCD ή σφιγγομυελινάσης καταργεί δραματικά τη δέσμευση του Olya [27] (και του Olya /PlyB [3,32]) στις μεμβράνες διαφορετικών κυττάρων.

Σύμφωνα με όσα μας γνώση, δεν υπήρξαν αναφορές για το ρόλο της χοληστερόλης μεμβράνης ως ένας πιθανός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε αν urothelial κύτταρα σε διάφορα στάδια των καρκινικών μετασχηματισμού, και επίσης μη μετασχηματισμένα κύτταρα κανονική χοίρου urothelial (NPU), διαφέρουν ως προς τις ευαισθησίες τους σε παράγοντες που αλληλεπιδρούν χοληστερόλης σύμφωνα με τις διαφορές στα επίπεδα χοληστερόλης τους. Για την επαλήθευση της επιρροής του δυνητικού μεταξύ των ειδών μεταβλητότητα της περιεκτικότητας σε χοληστερόλη, μετρήθηκε η περιεκτικότητα σε χοληστερόλη και σε επεμβατικών και μη επεμβατικών κυτταρικές σειρές ουροθηλιακό ποντικού. Συγκρίναμε την ευαισθησία σε MCD και Όλια /PlyB των Τ24 ανθρώπινης ουροφόρων καρκινικά κύτταρα (ως μοντέλο καρκινώματος επεμβατική ουροφόρων υψηλής ποιότητας), RT4 ανθρώπινα urothelial καρκινικά κύτταρα (ως μοντέλο καρκινώματος μη επεμβατική θηλώδη χαμηλού βαθμού), και τα κύτταρα NPU, το οποίο μορφολογικά και φυσιολογικά μοιάζουν πολύ με το φυσιολογικό ανθρώπινο ουροθήλιο [33,34,35]. Πήραμε πλεονέκτημα της μοναδικό μηχανισμό συμπλόκου πρωτεΐνης Olya /PlyB να επιτρέψουν, από τη μια πλευρά, αποτελεσματική ανοσοσήμανση του /domains μεμβράνης σφιγγομυελίνη εμπλουτισμένο χοληστερόλης [3,32,36], και από την άλλη πλευρά, ελεγχόμενων πόρων σχηματισμού σε αυτές οι περιοχές [28,29,32]. Η μελέτη μας δείχνει ότι αυτά τα Τ24 και RT4 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου ουροφόρων έχουν σημαντικά μεγαλύτερη ευαισθησία τόσο για τη χοληστερόλη παγίδευση από MCD και σχηματισμού πόρων από Olya /PlyB, σε σύγκριση με τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα NPU. Επιπλέον, τα δεδομένα αυτά προσφέρουν μια νέα και εξαιρετικά επιλεκτική προσέγγιση για τη θεραπεία των ουροφόρων μεταστατικών κυττάρων απειλητική για τη ζωή και τις πιο συχνές μη επεμβατική καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

Το ανθρώπινο ουροδόχου Τ24 κύστη και RT4 καρκινικές κυτταρικές σειρές (ΑΤΤΟ, Manassas, VA, USA) και το ποντίκι ουροδόχου κύστης, NUC-1 και g κυττάρων /g (ένα ευγενές δώρο από Prof de Boer, του Πανεπιστημίου του Leiden Medical Center, The Ολλανδία [37]) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο προχωρημένη κατά Dulbecco Eagle (Α-ϋΜΕΜ) /F12 (1: 1), 5% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (μέσο ελέγχου για τον καρκίνο ουροφόρων κύτταρα) στους 37 ° C, σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

Δευτερογενής καλλιέργειες κυττάρων NPU από την πέμπτη έως δωδέκατη περάσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33,38, 39]. Τα κύτταρα NPU καλλιεργήθηκαν σε MCDB153 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) /A-DMEM (1: 1), 2,5% FCS, 0,1 mM φωσφοαιθανολαμίνη (Sigma), 0.5 μg /ml υδροκορτιζόνη, 5 μg /ml ινσουλίνη (Sigma ), 4 mM glutamax, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (μέσο ελέγχου για την κανονική ουροθηλιακό κύτταρα). Τα μέσα καλλιέργειας και τα συμπληρώματα αγοράστηκαν από την Invitrogen (Βιέννη, Αυστρία), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη και Όλια /θεραπείες PlyB

μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (MCD) είχε διαλυμένο σε μέσο ελέγχου (για τον καρκίνο ή φυσιολογικό ουροφόρων κύτταρα) χρησιμοποιώντας τη χοληστερόλη χωρίς FCS (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) αντί για FCS με τη χοληστερόλη.

Ένα μείγμα Όλια /PlyB (μοριακή αναλογία 9 : 1) παρασκευάζεται από φρέσκα καρποφόρα σώματα του

P

.

ostreatus

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26,40]. Πριν από την θεραπεία των κυττάρων, ο Olya /PlyB αραιώθηκε στο μέσο ελέγχου χωρίς χοληστερόλη (για καρκίνο ή φυσιολογικό ουροθηλιακό κύτταρα). Για την επισήμανση μεμβράνη-σχεδία, ένα μη λυτικό συγκέντρωση Olya /PlyB (2,5 μg /ml) εφαρμόσθηκε σε ουροφόρων κύτταρα για 1 ώρα και 3 ώρες στους 37 ° C. Για τις μελέτες του κυτταροτοξικότητα, Olya /PlyB χρησιμοποιήθηκε σε 30 μg /ml για 1 ώρα και 3 ώρες στους 37 ° C.

Σύνολο κύτταρο χοληστερόλη περιεχόμενο

Το Τ24, RT4, NUC-1 και g κύτταρα /g σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /cm

2, και τα κύτταρα NPU σε 1 × 10

5 κύτταρα /cm

2, και αναπτύχθηκαν σε μέσο ελέγχου για να 100% συρροή. Τα κύτταρα Τ24, RT4 και NPU υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με 7 mM MCD για 6 ώρες, και 250 μλ εναιωρήματα κυττάρων παρασκευάστηκαν. Τα λιπίδια εκχυλίστηκαν από 200 μΙ από αυτά τα κυτταρικά αιωρήματα, ακολουθώντας τη μέθοδο του Bligh και Dyer [41]. Αυτά τα λιπιδικά εκχυλίσματα ξηραίνονται με Ν

2, και τα λιπίδια διαλύθηκαν σε 50 μΐ ισοπροπυλικής αλκοόλης. Ποσοτικοποίηση της ελεύθερης χοληστερόλης σε αυτούς τους λιπίδιο εκχυλίσματα που βασίζονται στη χρήση οξειδάσης χοληστερόλης και τη σύζευξη του υπεροξειδίου του υδρογόνου που παράγεται με 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ και 4-αμινοπυριδίνη με την αντίδραση της υπεροξειδάσης. Η χρωστική κινονιμίνης που σχηματίστηκε ως αποτέλεσμα της υπεροξειδάσης ποσοτικοποιείται στα 560 nm (Konelab κιτ χοληστερόλη, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Οι ολικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν από 50 μΙ υποπολλαπλάσια κυτταρικού εναιωρήματος χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford [42]. Η συνολική περιεκτικότητα των κυττάρων χοληστερόλη δίνεται σαν μα χοληστερόλης /mg πρωτεΐνης κυττάρου.

Όλια και HMG-CoA αναγωγάσης immunolabelings και οι μετρήσεις της έντασης φθορισμού

Τα κύτταρα Τ24 και RT4 καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες και την NPU κύτταρα επί 0,4 μm-πορώδεις μεμβράνες (BD Falcon, Pharmingen, San Diego, CA, USA). Για Olya ανοσοσήμανση, τα κύτταρα επωάστηκαν με 2,5 μg /ml Όλια /PlyB για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη (FA) για 10 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από 30 λεπτά αποκλεισμός με 2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) στους 37 ° C, τα κύτταρα επωάστηκαν με πολυκλωνικά κουνελιού αντι- αντισώματα Olya (1: 2500) για 1 ώρα στους 37 ° C, μετά πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor 488-συζευγμένο αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα (1: 600, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Για HMG-CoA αναγωγάσης ανοσοσήμανση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% FA για 10 λεπτά στους 4 ° C, και να θέσει σε αποκλεισμό του 2% BSA στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-κουνελιού HMG-CoA αναγωγάσης πολυκλωνικά αντισώματα (1: 200, Merck Millipore 09-356) για 1 ώρα στους 37 ° C, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού για 30 λεπτά στους 37 ° C

Τα κύτταρα τοποθετούνται σε Vectashield που περιείχε 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης. (DAPI? Vector Laboratories, Burlingamme, CA, USA) και αναλύθηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού (AxioImager Z1) χρησιμοποιώντας ένα ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό (63 × πετρελαίου /NA 1.40), και με μια συσκευή ApoTome για την παραγωγή οπτικών ενότητα. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση του προγράμματος AxioVision (Carl Zeiss, Γερμανία).

Αναλύσαμε 13-20 εικόνες ανά συνθήκη πολιτισμό και μετρήθηκε η μέση ένταση πράσινου φθορισμού ανά οπτικό πεδίο (πρόγραμμα AxioVision). Οι εικόνες ελήφθησαν ταυτόχρονα έκθεσης (469 ms) για κάθε συνθήκη καλλιέργειας κυττάρων.

ανάλυση ανοσοκηλίδωσης

Μετά την επεξεργασία MCD, τα κύτταρα λύθηκαν με 2 mM EDTA, 150 mM NaCl , 100 mM Tris, 1% Triton Χ-100, 1 mM απρωτινίνη, 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο, και 1 mM Να

3νο

4, για 30 λεπτά στους 4 ° C. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (20 μg) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικά αντισώματα αντι-LC3 κουνελιού (1: 1000? MBL? PM036), πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού αντι-ΡΑΚΡ (1: 1000? Roche Life Science? 11835238001), και πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού αντι-β-ακτίνης (1: 1000? Sigma? A2066). δευτερογενή αντισώματα ραφανίδας συζευγμένη με υπεροξειδάση αντι-κουνελιού πολυκλωνικό (1: 1000? Sigma) ανιχνεύθηκαν με τη χρήση της ενισχυμένης τεχνική χημειοφωταύγειας (Pierce ECL Western blotting υπόστρωμα, Thermo Scientific)

Μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης

Η δραστικότητα κασπάσης προσδιορίστηκε με μέτρηση διάσπασης της ακετυλο-Asp-Glu-Val-Asp-7-αμινο-4-τριφθορομεθυλοκουμαρίνη (Ac-DEVD-AFC? Bachem, Bubendorf, Switzerland) σε μη επεξεργασμένο (μάρτυρας) και MCD κατεργασμένα Τ24, RT4 και κύτταρα NPU όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Για το θετικό μάρτυρα της ενεργοποίησης της κασπάσης, τα κύτταρα RT4 εκτέθηκαν σε υπεριώδη ακτινοβολία για 30 s για να επάγει απόπτωση, και στη συνέχεια επωάστηκαν για επιπλέον 6 ώρες. Η δραστηριότητα DEVD-ase μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Safire? Tecan, Μάνερντορφ, Ελβετία). Οι αρχικές ταχύτητες των αντιδράσεων υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται ως σχετικές μονάδες φθορισμού ανά δευτερόλεπτο (RFU /s).

Η κυτταρομετρία ροής

Τα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένο ουροθηλίου κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων (1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και αναπτύσσονται προς συρροή για το MCD και θεραπείες Olya /PlyB. Τα συλλεγμένα κύτταρα επωάστηκαν με το αντιδραστήριο V-ΡΕ αννεξίνης (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, USA) και με 0,2 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ? Sigma) .Τα κύτταρα αναλύθηκαν για αννεξίνη V-ΡΕ και ΡΙ φθορισμός με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και το λογισμικό CellQuest (Becton Dickinson τόσο San Jose, CA, USA). Εμείς διακρίσεις των κλασμάτων των βιώσιμων (αννεξίνη V αρνητική και PI αρνητική), πρώιμων αποπτωτικών (Αννεξίνη V θετική, PI αρνητικό), και τα νεκρά κυτταρικών πληθυσμών (θετική PI). Τρία ανεξάρτητα πειράματα, με κάθε διεξάγονται εις διπλούν.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα κύτταρα επεξεργασμένα με MCD και Olya /PlyB και τα μη επεξεργασμένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 2,5% γλουταραλδεΰδη σε ρυθμιστικό κακοδυλικού για 3 ώρες στους 4 ° C. Μετά την πλύση, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1% ΟΣΟ

4 και 3% K

4Fe (CN)

6, που παρασκευάζεται σε ρυθμιστικό κακοδυλικού, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, 0,3% thiocarbohydrozide σε ρυθμιστικό κακοδυλικού προστέθηκε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο, 1% ΟΣΟ

4 προστέθηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφυδατώθηκαν και εγκλείστηκαν σε Εροη (Serva, Heidelberg, Germany). Εξαιρετικά λεπτές τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο (αμφότερα από την Merck, Darmstadt, Germany). Αυτές οι τομές εξετάστηκαν υπό μικροσκοπία ηλεκτρονίων μετάδοσης (ΤΕΜ) με τη χρήση ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου Phillips CM100.

Στατιστικά

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± τυπικό σφάλμα από δύο ή τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελείται σε διπλό ή τριπλό, και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ί-τεστ σπουδαστών και μονόδρομη ANOVA Kruskal ή-Wallis μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης. Όπου απαιτείται κατά ζεύγη πολλαπλές συγκρίσεις, η μέθοδος Holm-Sidak ή η μέθοδος του Dunn χρησιμοποιήθηκαν (Sigma λογισμικού Οικόπεδο, Systat Software Inc, CA, USA). P-τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικά σημαντική. συντελεστή συσχέτισης του Pearson μεταξύ περιεκτικότητας σε χοληστερόλη και η έκφραση πρωτεΐνης HMG-CoA αναγωγάσης υπολογίσθηκε (Microsoft Office Excel).

Αποτελέσματα

περιεκτικότητα σε χοληστερόλη είναι υψηλότερη σε επεμβατική urothelial καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με μη επεμβατική ουροθηλιακό κύτταρα του ανθρώπου και ποντικού προέλευσης

για το ανθρώπινο ουροθηλιακό κυττάρων, η ανάλυση του περιεχομένου χοληστερόλης αποκάλυψε τα υψηλότερα επίπεδα σε Τ24 επεμβατικές ουροθηλιακό καρκινικά κύτταρα, τα οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε καρκινικά κύτταρα RT4 μη επεμβατική ουροθηλιακό, και χαμηλότερες σε κύτταρα NPU ( 28,0 ± 0,51? 22.9 ± 1.3? χοληστερόλης /πρωτεΐνη 16,6 ± 1,9 μg mg κύτταρο, αντίστοιχα? Σχήμα 1Α). Υπήρχε θετική συσχέτιση μεταξύ του περιεχομένου της χοληστερόλης και η έκφραση πρωτεΐνης αναγωγάσης HMG CoA, που υπολογίζεται ως συντελεστής συσχέτισης κατά Pearson είναι r = 0.945 μετράται από την μέση ένταση του ανοσοφθορισμού (Σχήμα 1Β). Αυτό ανοσοφθορισμού ήταν η υψηλότερη στα κύτταρα Τ24 και το χαμηλότερο στα κύτταρα NPU.

Α. Ποσοτικοποίηση της περιεκτικότητας σε χοληστερόλη σε επεμβατικές Τ24 ανθρώπινο και NUC-1 κύτταρα ποντικού, σε μη επεμβατική ανθρώπινη και g RT4 /κύτταρα ποντικού G, και σε κύτταρα NPU. Β Εκπρόσωπος οπτικά τμήματα του ανοσοσήμανση αναγωγάσης HMG-CoA (πράσινο) σε κύτταρα Τ24, RT4 και NPU. πυρηνική χρώση ϋΑΡΙ θεωρείται επίσης (μπλε). Ράβδοι κλίμακας 20 μm. C. Ποσοτικός προσδιορισμός της μέσης έντασης του HMG-CoA ανοσοφθορισμού των ανθρώπινων κυττάρων Τ24, RT4 και κυττάρων NPU, όπως απεικονίζεται στο (Β). Α, Γ Τα δεδομένα είναι μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. NS, μη σημαντικό? * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.005

Η

Δεδομένου ότι αυτά τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα NPU είναι χοίρειας προέλευσης, προκειμένου να αξιολογήσει τα διαφορές μεταξύ ειδών στην περιεκτικότητα σε χοληστερόλη, αναλύσαμε περιεκτικότητα σε χοληστερόλη των επεμβατικών και μη επεμβατικών ουροθηλιακών κύτταρα προέλευσης ποντικού. Εδώ, θα δοκιμαστεί NUC-1 και g /ουροθηλιακά κύτταρα G, που αντικατοπτρίζει τις ξεχωριστές φάσεις ουροφόρων καρκινογένεσης σε ποντίκια [37]. κύτταρα NUC-1 είναι ογκογόνα και επεμβατικές, και ως εκ τούτου, παρέχουν μια στενή σχέση με το Τ24 των ανθρώπινων κυττάρων, και g /ουροθηλίου κύτταρα G ποντικού είναι μη επεμβατική, και μπορούν συνεπώς να συγκριθούν με ανθρώπινα κύτταρα RT4. Η περιεκτικότητα σε χοληστερόλη στα κύτταρα επεμβατική NUC-1 ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στο μη επεμβατική g /κύτταρα G (26,3 ± 1,5? Χοληστερόλης /πρωτεΐνη mg κύτταρο 21,8 ± 1,4 μg, αντίστοιχα? Σχήμα 1Α). Από την άλλη πλευρά, η περιεκτικότητα σε χοληστερόλη του διηθητικού ουροθηλιακά κύτταρα Τ24 ανθρώπινο και NUC-1 ποντικού δεν διέφεραν σημαντικά, όπως επίσης παρατηρείται για το περιεχόμενο της χοληστερόλης στο ανθρώπινο RT4 και g /g ποντικού μη επεμβατική ουροθηλιακό κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η περιεκτικότητα της χοληστερόλης έχει μια αντίστροφη συσχέτιση με το επίπεδο των ουροφόρων μετασχηματισμού καρκίνου (Σχήμα 1Α).

MCD επάγει εξαρτώμενη από το χρόνο και εξαρτάται από τη δόση θάνατο των καρκινικών κυττάρων ουροθηλιακά

Η επίδραση της θεραπείας MCD στη βιωσιμότητα των κυττάρων διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V και χρώση ΡΙ σε συνδυασμό με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Οι αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών στο σχήμα 2Α δείχνουν Τ24, τα δείγματα κυττάρων RT4 και NPU κατεργάζεται με 7 mM MCD για 6 ώρες, και αυτά συνοδεύονται από ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του MCD (3, 5, 7 mM) που εφαρμόζονται για την αύξηση επώαση φορές (1, 3, 6 h). Στα 3 mm MCD, καθόλου ή μόνο ελάχιστη επίδραση στις βιωσιμότητες παρατηρήθηκαν σε όλους τους τρεις τύπους κυττάρων, ανεξάρτητα από το χρόνο επώασης (σχήμα 2Α).

A. Αριστερά: Εκπρόσωπος dot οικόπεδα από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του Τ24, RT4 και NPU κύτταρα αναπτύσσονται σε μέσα ελέγχου και μετά από 7 θεραπείας mM MCD για 6 ώρες. Αννεξίνη V-ΡΕ και ΡΙ χρησιμοποιήθηκαν για τη διάκριση μεταξύ βιώσιμων (διπλό αρνητικό), πρώιμων αποπτωτικών (μόνο Αννεξίνη V θετική) και νεκρά (θετικά PI) κύτταρα. Δεξιά: Ποσοτικοποίηση της κυτταρικής βιωσιμότητας από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων Τ24, RT4 και NPU μετά από 3 mM, 5 mM, και 7 θεραπείες mM MCD για 1 ώρα, 3 ώρες και 6 ώρες. B. Η ποσοτικοποίηση της εξάντλησης των κυττάρων χοληστερόλης στα κύτταρα Τ24, RT4 και NPU μετά από 7 θεραπείας mM MCD για 6 ώρες. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα των διπλών μετρήσεων από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.005, *** p & lt? 0.001

Η

Στα κύτταρα Τ24, η οποία ήταν η πιο ευαίσθητη σε MCD από αυτούς τους τρεις τύπους κυττάρων, η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν. μειώνεται σημαντικά μετά από 5 mM και 7 θεραπεία mM MCD για 3 ώρες, σε 92% και 89%, αντίστοιχα. Έξι ώρες μετά την βιωσιμότητα θεραπεία μειώθηκε περαιτέρω σε 77% στα 5 mM MCD και μόνο το 47% σε 7 mM MCD (Σχήμα 2Α). Σε κύτταρα RT4, η μόνη σημαντική μείωση της βιωσιμότητας σε ένα εύρος συγκεντρώσεων MCD και χρόνους επώασης ήταν μετά από 6 ώρες με 7 mM MCD (σε 82%? Σχήμα 2Α). Μια ακόμα μικρότερη επίδραση παρατηρήθηκε για τα κύτταρα NPU, όπου μόνο η επεξεργασία με 7 mM MCD για 6 ώρες έδειξαν μια μικρή μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας (έως 92%? Σχήμα 2Α). Σε σύγκριση με τα κύτταρα Τ24 και RT4, η επίδραση της θεραπείας 6 ώρες με 7 mM MCD στη βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν στατιστικά μικρότερη σε κύτταρα NPU (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε ότι πεθαίνει, PI θετικά κύτταρα ήταν αννεξίνη V αρνητικά ή θετικά, ενώ ο πληθυσμός του ενιαίου αννεξίνη V θετικών κυττάρων δεν ήταν ποτέ εμφανή, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο κυτταρικός θάνατος είναι νεκρωτικό όχι αποπτωτικών (Σχήμα 2Α).

Είναι ενδιαφέρον ότι, μετά από 7 θεραπείας mM MCD για 6 ώρες, η συνολική περιεκτικότητα σε χοληστερόλη του Τ24, RT4 και κύτταρα NPU μειώθηκε σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη επεξεργασμένα κύτταρα, κατά 86%, 57%, και 29%, αντίστοιχα ( Σχήμα 2Β).

η ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων έτσι έδειξαν ότι η έκταση της κυτταροτοξικότητας της MCD αυξήθηκε με τη συγκέντρωση και τη διάρκεια της θεραπείας. Για να οριστεί περαιτέρω αυτές τις διαφορετικές ευαισθησίες σε θεραπεία MCD από αυτούς τους τρεις τύπους κυττάρων ουροθηλιακά, κυτταρική μορφολογία αναλύθηκε μετά από 7 θεραπείας mM MCD, όπου μειώνει σημαντικά στη βιωσιμότητα κυττάρου παρατηρήθηκαν. Τ24 κύτταρα που κατεργάζονται με 7 mM MCD για 3 ώρες, και τα κύτταρα RT4 σε επεξεργασία με 7 mM MCD για 6 ώρες, έγινε στρογγυλεμένες και ήταν ασθενώς επισυνάπτεται (Σχήμα 3). κύτταρα Τ24 αποσπαστούν μετά από 7 θεραπείας mM MCD για 6 ώρες (Σχήμα 3). Η έκταση της κυτταρικής στρογγυλοποίησης ήταν πιο έντονη στα κύτταρα Τ24, και λιγότερο έντονη στην RT4 και NPU κύτταρα, όπου παρατηρήθηκαν μόνο σε ελάχιστες μορφολογικές επιδράσεις. Αυτά τα δεδομένα συσχετίζονται καλά με την ανάλυση κυτταρικού θανάτου.

Τ24, RT4 και NPU κυττάρων (όπως αναφέρεται) δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (έλεγχος) ή επεξεργασία με 7 mM MCD για 3 ώρες και 6 ώρες, και στη συνέχεια εξετάστηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Κυτταρική στρογγυλοποίηση ήταν τύπου κυττάρου εξαρτάται (T24 & gt? RT4 & gt? NPU) και ο χρόνος εξαρτάται από (έλεγχος & lt? 3 ώρες & lt? 6 ώρες). Τ24 και RT4 κύτταρα άλλαξαν σχήμα από επίπεδες και πολυγωνικό (έλεγχος) σε σφαιρικές (κύτταρα Τ24, 3 ώρες, 6 ώρες θεραπεία? Κύτταρα RT4, 6 Η θεραπεία? Αιχμές βελών). Ράβδος κλίμακας, 20 μm.

Η

Σε όλες τις περιπτώσεις, με τη χρώση ΡΙ-θετικά υποδεικνύοντας ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε λόγω νέκρωση, υπερδομικές ανάλυση με ΤΕΜ παρέχεται περαιτέρω απόδειξη της νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχήμα 4) . Οι μεμβράνες των κυττάρων Τ24 και RT4 πλάσμα μετά από 7 θεραπείας mM MCD για 6 ώρες είχαν διαρρηχθεί και το κυτταρόπλασμα απελευθερώθηκε, αν και το πυρηνικό φάκελο παρέμεινε άθικτο (Σχήμα 4). Ωστόσο, τα κύτταρα NPU δεν έδειξαν χαρακτηριστικά νέκρωσης μετά από αυτή τη θεραπεία MCD (Σχήμα 4).

Τ24, RT4 και NPU κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή επεξεργασία με 7 mM MCD για 6 ώρες, και στη συνέχεια σε επεξεργασία για ΤΕΜ . Νεκρωτικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα Τ24 (αστέρι) και τα κύτταρα RT4, συμπεριλαμβανομένης της διάσπασης του πλάσματος-μεμβράνης (αιχμές βελών) και την απελευθέρωση των περιεχομένων κυττάρων. κύτταρα NPU παρέμεινε άθικτο μετά την επεξεργασία αυτή MCD, με γλυκοκάλιξης εξακολουθεί να υπάρχει (ανοιχτό αιχμές βελών). n, πυρήνα. Κλίμακα μπαρ, 1 μm.

Η

Για να διερευνήσει πιο συγκεκριμένα συμμετοχή της απόπτωσης μετά τη θεραπεία MCD, η ενεργοποίηση των κασπασών αναλύθηκε. Με την παρακολούθηση της διάσπασης του φθορισμογόνου υποστρώματος Ac-DEVD-AFC καμία σημαντική ενεργοποίηση της κασπάσης παρατηρήθηκε μετά από 6 ώρες επώασης με 3 mM, 5 mM ή 7 mM MCD είτε σε Τ24, RT4 ή κύτταρα NPU. (Σχήμα 5Α). Θα ήταν επίσης σε θέση να ανιχνεύσει την ενεργοποίηση της κασπάσης σε κύτταρα επωάζονται με 5 και 7mM MCD για 6 ώρες με ανοσοκηλίδωση του θραύσματος PARP ρ85 (Σχήμα 5Β), το οποίο παράγεται από ενεργοποιημένα κασπάσες [44]. Για λόγους σύγκρισης, η υπεριώδης ακτινοβολία προκάλεσε την διάσπαση τόσο του πεπτιδίου DEVD και της πρωτεΐνης ΡΑΚΡ σε κύτταρα Τ24 και RT4. Η έλλειψη ενεργοποίηση της κασπάσης σε συνδυασμό με την απουσία του σήματος αννεξίνης V και υπερδομικές αλλαγές χαρακτηριστικές της νέκρωσης συλλογικά πρότεινε ότι η θεραπεία MCD των ουροφόρων κυττάρων ενεργοποιείται νεκρωτικό αντί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Τ24, RT4 και NPU κύτταρα κατεργάστηκαν με 3 mM (Α), 5 mM (Α) ή 7 mM (AC) MCD για 6 ώρες. A. Caspase μετρήσεις δραστικότητας με διάσπαση Ac-DEVD-AFC δεν παρουσίασαν καμία αύξηση στην δραστικότητα της κασπάσης. Οι θετικοί έλεγχοι (30s UV) έδειξε δραστηριότητες κασπάση απόπτωση που σχετίζονται επάγεται σε κύτταρα Τ24 και RT4 σε 6 ώρες. ανάλυση B. Ανοσοκηλίδωση δεν έδειξαν διάσπαση του πλήρους μήκους PARP (120 kDa) σε ένα θραύσμα 85-kDa. ανάλυση Γ Ανοσοαποτύπωσης δεν έδειξαν μετατροπή της LC3-Ι (18 kDa) σε LC3-II (16 kDa). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι ± τυπικό σφάλμα των μετρήσεων τριπλούν.

Η

Δυτική κηλίδωση του Τ24, RT4 και NPU κυττάρων μετά από θεραπεία με 7 mM MCD για 6 ώρες δεν αποκάλυψε καμία μετατροπή LC3-Ι LC3-II (Σχήμα 5C). Αυτό έδειξε ότι MCD δεν προκάλεσε αυτοφαγία. Επιπλέον, η παρατήρηση του Τ24, RT4 και NPU κύτταρα με TEM δεν αποκαλύπτουν κανένα τυπικό αυτοφαγικά δομές, όπως η διπλή μεμβράνη κυστίδια ή αυτοφαγοσώματα (Σχήμα 4).

Όλια /PlyB-θεραπεία προκαλεί νέκρωση των ουροφόρων καρκινικά κύτταρα

Όλια /PlyB χρησιμοποιήθηκε για δύο διαφορετικές εφαρμογές. Ένα μη λυτικό συγκέντρωση Olya /PlyB (2,5 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε για να χοληστερόλης ετικέτας /σφιγγομυελίνη πλούσια περιοχές των μεμβρανών πλάσματος (Σχήμα 6C), και μια λυτική συγκέντρωση (30 μg /ml) εφαρμόσθηκε σε διαπερατά μεμβράνες πλάσματος. Το πιο σημαντικό ανοσοσήμανση Όλια (αντισώματα εγέρθηκαν εναντίον Όλια αντίστοιχα) παρατηρήθηκε για τα κύτταρα RT4 και αποκαλύφθηκε από την ποσοτικοποίηση των Όλια φθορισμού (Σχήμα 6C). Η επισήμανση αυτή Olya ήταν πιο ομοιόμορφη πάνω από τη μεμβράνη του πλάσματος στα κύτταρα RT4. Σε αντίθεση, η κατανομή Olya σε κύτταρα Τ24 ήταν λιγότερο ακόμη, και η κατανομή της ήταν ασυνεχής. Σήμανση των κυττάρων NPU παρουσίασαν λιγότερες Όλια-θετικών κυττάρων που διαφέρει σημαντικά από Τ24 και RT4 κύτταρα (Σχήμα 6C).

Α. Αντιπροσωπευτική κατανομή της χρώσης ΡΙ του Τ24, RT4 και τα κύτταρα NPU αντιμετωπίζονται με 30 μg /ml Όλυ /PlyB για 1 ώρα. Ανοικτό ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, ενώ γεμάτο ιστογράμματα υποδηλώσει Όλια /PlyB-επεξεργασμένα κύτταρα. Τα ποσοστά των ζωντανών και νεκρών κυττάρων που φαίνεται στο αριστερό και στο δεξί τμήμα των ιστογραμμάτων, αντίστοιχα. B. Η βιωσιμότητα των Τ24, RT4 και NPU κύτταρα μετά από 1-h και 3-h θεραπείες με 30 μg /ml Olya /PlyB, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι ± SE των διπλών μετρήσεων από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Γ Ανοσοεπισήμανση της πλούσιας χοληστερόλης /σφιγγομυελίνης τομείς της μεμβράνης στα ουροθηλιακά κύτταρα με Όλια. Η επάνω εικόνα των οπτικών τμημάτων μέσω ολόκληρου κύτταρα αντιπροσωπεύουν την έκταση και την κατανομή των Όλια ανοσοσημασμένων χοληστερόλης /σφιγγομυελίνη πλούσιες περιοχές της μεμβράνης στα κύτταρα Τ24, RT4 και NPU. Πράσινο, Όλια σήμανση? μπλε, DAPI χρώση των πυρήνων. Ράβδοι κλίμακας, 20 μm. ΝΤΟ. Η ποσοτικοποίηση των Όλια ανοσοσήμανση παρουσιάζεται ως η μέση ένταση φθορισμού ανά οπτικό πεδίο (σε αυθαίρετες μονάδες? Α.υ.). * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.005, *** p & lt? 0.001

Η

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 1 ώρα και 3-h θεραπείες με 30 μg /ml Όλια /PlyB ήταν. αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι βιωσιμότητες κυττάρου μετά από 30 θεραπείες μg /ml Olya /PlyB για 1 ώρα και 3 ώρες προσδιορίστηκαν όπως παραπάνω, με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Καθώς η επισήμανση αννεξίνης-ν ήταν αρνητικό σε όλα τα κύτταρα, τα κλάσματα των ΡΙ θετικών (δηλαδή νεκρά) και ΡΙ-αρνητικά κύτταρα προσδιορίστηκαν όπως υποδεικνύεται από τις αντιπροσωπευτικές ιστογράμματα φαίνεται στο Σχ 6Α. Μετά από 30 θεραπεία μg /ml Olya /PlyB για 1 ώρα, το κύτταρο βιωσιμότητα των κυττάρων Τ24 ήταν σημαντικά μειωμένη στο 75% (ρ & lt? 0.005), και μετά από 3-Η, σε 65% (ρ & lt? 0.001). Ομοίως, η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων RT4 μειώθηκε στο 58% (ρ & lt? 0.001) μετά από 1 ώρα, αν και αυτό δεν άλλαξε ακόμη για τη θεραπεία 3-h. Σε αντίθεση, η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων NPU δεν επηρεάστηκε σημαντικά από την 30 μg /ml Olya /θεραπείες PlyB είτε για 1 ώρα ή 3 ώρες (Εικόνα 6Β). Σε όλους από αυτούς τους τρεις τύπους κυττάρων που εξετάστηκαν, οι διαφορές στις κυτταρικές βιωσιμότητες μεταξύ 30 μg /ml Olya θεραπείες /PlyB για 1 ώρα και 3 ώρες δεν έφθασε σημασία. Τα αποτελέσματα της ανοσοσήμανση της χοληστερόλης /σφιγγομυελίνης περιοχές πλούσιες μεμβράνης με Όλια ήταν, σύμφωνα με την ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων.

νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο των κυττάρων Τ24 και RT4 μετά από 30 μg /ml Όλια /PlyB θεραπεία για 1 ώρα ήταν υποδεικνύονται από τα ΡΙ-θετικά κύτταρα (Σχήμα 6Α) και χαρακτηριστικές υπερδομικές μεταβολές τους (Σχήμα 7). Για αυτά τα κύτταρα, οι πιο σημαντικές αλλαγές παρατηρήθηκαν ως αυξημένη πλάσματος μεμβράνη διαπερατότητας και διαρροές του κυτταροπλάσματος, μαζί με οργανίδιο πρήξιμο (Σχήμα 7). Η υπερδομή των κυττάρων NPU δεν επηρεάστηκε από 30 μg /ml Όλια /θεραπεία PlyB για 1 ώρα, με αυτά του ελέγχου και τα επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν παρόμοια μορφολογία και με άθικτη μεμβράνη πλάσματος (Σχήμα 7).

Τ24, RT4 και κύτταρα NPU υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 μg /ml Olya /PlyB για 1 ώρα και στη συνέχεια σε επεξεργασία για ΤΕΜ. RT4 και T24 κύτταρα παρουσιάζουν απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης (αιχμές βελών), η απελευθέρωση των κυτταρόπλασμα, και οργανιδίων οίδημα (αστέρων), που δείχνουν νέκρωση των κυττάρων. Η υπερδομή των επεξεργασμένων NPU κυττάρων μοιάζει με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων NPU, με άφθονη γλυκοκάλιξης (ανοιχτά βέλη). n, πυρήνα. Κλίμακα μπαρ, 1 μm.

Η

Συζήτηση

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη πιο κοινή διάγνωση του καρκίνου σε άνδρες [45]. Ωστόσο, λόγω του υψηλού ποσοστού υποτροπής και την ανάγκη για συνεχή επεμβατικό έλεγχο, έχει το υψηλότερο κόστος θεραπείας διάρκεια ζωής ανά ασθενή όλων των καρκίνων [46]. Πράγματι, έως και το 70% των ασθενών έχουν τοπικές υποτροπές μετά ενδοκυστική χημειοθεραπεία ή ανοσοθεραπεία [47]. Είναι πιθανό ότι το χαμηλό ποσοστό θεραπείας οφείλεται σε μικρομεταστατική ασθένεια που μπορεί να προκληθεί κατά τη στιγμή της διουρηθρική εκτομή ή κυστεκτομή, η οποία οδηγεί σε υποτροπή των ουροφόρων όγκων ή στις μεταστάσεις στους λεμφαδένες, τα οστά, τους πνεύμονες, το δέρμα και το ήπαρ [48]. Επιπλέον, η θνησιμότητα προκαλείται κυρίως από επεμβατικές, μεταστατικά καρκινώματα urothelial που γίνονται ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία.