Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο πρωταρχικός στόχος αυτού του έργου είναι η δημιουργία ενός καρκίνου της ουροδόχου κύστης που λαμβάνονται από ασθενή ξενομόσχευμα (PDX) πλατφόρμα, σχολιασμένη με βαθιά αλληλουχίας και τον ασθενή κλινικές πληροφορίες, να επιταχύνει την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών επιλογών για τους ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Στο παρόν, περιγράφουμε τη δημιουργία, αρχικό χαρακτηρισμό και τη χρήση της πλατφόρμας για το σκοπό αυτό.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Είκοσι δύο PDXs με σχολιασμένη κλινικές πληροφορίες καθιερώθηκαν από αμόρφωτος μη επιλεγμένα δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης κλινική σε ανοσοανεπάρκεια NSG ποντίκια. Η μορφολογική πιστότητα διατηρήθηκε σε PDXs. Ολόκληρο αλληλουχίας exome αποκάλυψε ότι PDXs και γονικής καρκίνους του ασθενούς μοιράζονται 92-97% των γενετικών ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών druggable στόχους. Για αναπροσανατολισμό φάρμακο, ένα EGFR /HER2 διπλή lapatinib αναστολέας ήταν αποτελεσματική στην PDX BL0440 (επιβίωση χωρίς εξέλιξη ή PFS από 25,4 ημέρες έναντι 18,4 ημέρες στο ελέγχου, ρ = 0.007), αλλά όχι σε PDX BL0269 (12 ημέρες έναντι 13 ημερών για ο έλεγχος, p = 0.16), αν και οι δύο εξέφρασαν

HER2

. Στην οθόνη για την πιο αποτελεσματική ΜΤΤ, αξιολογήσαμε τρία φάρμακα (λαπατινίμπη, ponatinib και BEZ235) συνδυάζεται με ανωμαλίες στην PDX BL0269? αλλά μόνο ένα BEZ235 αναστολέας PIK3CA ήταν αποτελεσματική (p & lt? 0,0001). Για τη μελέτη των μηχανισμών της δευτερογενούς αντίστασης, ενός υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 3 αναστολέας BGJ398 παρατεταμένη PFS του PDX BL0293 από 9,5 ημέρες από τον έλεγχο στο 18,5 ημέρες (ρ & lt? 0,0001), και το σειριακό βιοψίες αποκάλυψαν ότι η ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και PIK3CA-ΑΚΤ οδών ενεργοποιήθηκαν κατά την αντίσταση. Η αναστολή αυτών των οδών παρέτεινε σημαντικά PFS από 12 ημέρα του ελέγχου σε 22 ημέρες (ρ = 0.001). Για να γίνει διαλογή για την αποτελεσματική χημειοθεραπευτικά φάρμακα, τέσσερις από τους έξι πρώτους PDXs ήταν ευαίσθητα στο συνδυασμό σισπλατίνης /γεμσιταβίνη, και χημειοαντίσταση σε ένα φάρμακο θα μπορούσε να ξεπεραστεί με την άλλη φαρμακευτική.

Συμπέρασμα

Ο PDX μοντέλα που περιγράφονται εδώ δείχνουν καλή συσχέτιση με τον ασθενή στο επίπεδο του γονιδιώματος και είναι γνωστό ανταπόκριση του ασθενούς στη θεραπεία. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω αξιολόγηση των PDXs για την ικανότητά τους να προβλέψουν με ακρίβεια ανταπόκριση του ασθενούς σε νέες στοχευμένες και στρατηγικές συνδυασμού για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Παν Cx, Zhang Η, Tepper CG, Lin Ty, Davis RR, Keck J, et al. (2015) Ανάπτυξη και Χαρακτηρισμός του καρκίνου της ουροδόχου κύστης από ασθενείς με Ξενομοσχεύματα για μοριακά Προτεινόμενος Στοχευμένη Θεραπεία. PLoS ONE 10 (8): e0134346. doi: 10.1371 /journal.pone.0134346

Επιμέλεια: Chandan Kumar-Sinha, το Πανεπιστήμιο του Michigan, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 20 Ιαν, 2015? Αποδεκτές: 8 του Ιουλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 13, Αυγούστου του 2015

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 δημόσιο τομέα αφοσίωση

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Πληροφορίες για όλα τα μοντέλα καρκίνου της ουροδόχου κύστης PDX είναι διαθέσιμα από την ιστοσελίδα JAX PDX φιλοξενείται από το ποντίκι όγκου Βιολογίας (MTB) της βάσης δεδομένων (http : //tumor.informatics.jax.org/mtbwi/pdxSearch.do)

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από: Βετεράνων Διοίκηση Βραβείο Career Development (PI:. Παν)? Ο βετεράνος Merit Διοίκησης (PI: Pan? Grant #: 1I01BA001784)? NCI Κέντρο Καρκίνου Grant Υποστήριξης (PI: De Vere Λευκό? Grant #: 2 Ρ30 CA 0933730)? Το Laney Ίδρυμα (PI: De Vere Λευκό). Δεν φορείς χρηματοδότησης είχε οποιοδήποτε ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι μεταξύ των δέκα πιο κοινά [1], αλλά το πιο μελετημένο και υποχρηματοδοτείται, καρκίνους [2]. Υπάρχουν δύο μεγάλες ομάδες του καρκίνου της ουροδόχου κύστης: μη myoinvasive και προχωρημένο καρκίνο. Μη myoinvasive του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (NMIBC) αντιπροσωπεύει το 80% των περιπτώσεων κατά τη διάγνωση. Είναι συνήθως αντιμετωπίζονται με διουρηθρική εκτομή και, στις περισσότερες περιπτώσεις, ενδοκυστική θεραπεία. Ωστόσο, περίπου το 60% των ασθενών επαναληφθεί σε δύο χρόνια, και το 25% της προόδου σε προχωρημένα στάδια [3-5]. Είναι αυτά τα 20% των περιπτώσεων με προχωρημένα στάδια κατά τη διάγνωση και το 25% των περιπτώσεων NMIBC που προχώρησαν σε προχωρημένα στάδια που ευθύνονται για την υψηλή θνησιμότητα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ιδιαίτερα τοξικό βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου της ουροδόχου κύστης με ένα ποσοστό ανταπόκρισης της τάξης του 50% [6]. Ακόμη και αν οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται συνήθως για προκλινικές μελέτες, η συσχέτιση της ευαισθησίας φαρμάκου μεταξύ των κυτταρικών σειρών και κλινικές δοκιμές είναι, σε γενικές γραμμές, η κακή [7]. Μέχρι στιγμής, κανένα τεστ είναι διαθέσιμο για τον εντοπισμό αποτελεσματική χημειοθεραπεία πριν από τη χορήγηση της θεραπείας. Εάν οι ασθενείς διαγιγνώσκονται με τοπικά προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης χωρίς μετάσταση, ριζική κυστεκτομή εκτελείται συνήθως και συνδέονται με τη χειρότερη ποιότητα ζωής σχετιζόμενης με την υγεία, λόγω της χειρουργικής επέμβασης και η ίδια συνδέεται μετεγχειρητικές επιπλοκές [8,9]. Σε περίπτωση υποτροπής της νόσου ή πρόγνωση, δεν υπάρχει πρότυπο χημειοθεραπεία δεύτερης γραμμής. Δεν υπάρχει στοχευμένη θεραπεία που εγκρίθηκε από την αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), ακόμη και αν έχουν υποτροπιάζουσες γενετικές ανωμαλίες έχουν ταυτοποιηθεί. Δεν υπάρχει σημαντική βελτίωση στη συνολική επιβίωση και την πρόγνωση κατά τα τελευταία τριάντα χρόνια [10]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια κρίσιμη ακάλυπτη ανάγκη για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης για να επιλέξετε την αποτελεσματική πρώτης γραμμής και να διασώσουν τη χημειοθεραπεία, και την ανάπτυξη της στοχευμένης θεραπείας.

Αυτό το έργο είναι η ανάπτυξη των ασθενών που προέρχονται από ξενομοσχεύματα (PDXs) να βελτιώσει τα αποτελέσματα της θεραπείας της ουροδόχου κύστης Καρκίνος. Πολλά ζωικά μοντέλα χρησιμοποιούνται σήμερα στην έρευνα για τον καρκίνο, όπως ξενομοσχεύματα ποντικού που αναπτύχθηκε από καρκινικές κυτταρικές γραμμές και γενετικά μοντέλα ποντικών (GEMM). Ακόμα κι αν αυτά τα μοντέλα έχουν σημειώσει τεράστια συμβολή στην έρευνα για τον καρκίνο, που υπολείπονται στην εκπλήρωση των κάθε ασθενή ειδικές ανάγκες στην εποχή της ιατρικής ακρίβεια. Οι πρόσφατες εξελίξεις και τη σύγκλιση της βιολογίας του καρκίνου, «-ωματικής» τεχνολογίες, υπολογιστικής βιολογίας και της ανάπτυξης φαρμάκων είναι επανάσταση στοχευμένη θεραπεία και οδηγεί σε ένα νέο επίπεδο «μοριακά καθοδηγείται στοχευμένη θεραπεία (ΜΤΤ)», που σημαίνει ταιριάζουν στοχευμένη θεραπεία με ασθενή συγκεκριμένη γενετική εκτροπές στον καρκίνο. Ωστόσο, δύο πρόσφατες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι ταιριάζουν ΜΤΤ κατά γενετικών ανωμαλιών ειδικά για τον ασθενή συνδέθηκε με απογοητευτικά ποσοστά ανταπόκρισης 12% και 9%, αντίστοιχα [11,12]. Το χαμηλό ποσοστό ανταπόκρισης των ΜΤΤ είναι εν μέρει οφείλεται στο γεγονός ότι οι περισσότεροι καρκίνοι λιμάνι πολλαπλών γενετικών ανωμαλιών [13-16], και ότι οι τρέχουσες υπολογιστικές τεχνολογίες βιολογίας δεν είναι σε θέση να διακρίνουν σθεναρά μεταλλάξεις οδηγού (αυτούς τους κρίσιμους για τις λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων) από μεταλλάξεις των επιβατών (αυτοί που έχουν μικρή λειτουργική συνέπεια για τα καρκινικά κύτταρα). Προτείναμε ότι η πλατφόρμα PDX ειδικά για τον ασθενή που αναπτύχθηκε εδώ δεν μπορεί μόνο δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για την οθόνη για την πιο αποτελεσματική ΜΤΤ για τη στόχευση των μοριακών οδηγούς και αποτελεσματική πρώτης γραμμής και να διασώσουν τη χημειοθεραπεία, αλλά και για αναπροσανατολισμό των ναρκωτικών και τη μελέτη των μηχανισμών δευτερογενούς αντίστασης να καθοδηγήσει περαιτέρω εξατομικευμένη θεραπεία και ανάπτυξης φαρμάκων.

Μέθοδοι

ανάπτυξη της ουροδόχου κύστης καρκίνο ξένων μοσχευμάτων που λαμβάνονται από ασθενή

Το πρωτόκολλο για τη συλλογή κλινικών δειγμάτων των πληροφοριών και του καρκίνου από ασθενείς εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Διοικητικού κριτική Davis Θεσμική (πρωτόκολλο Νο 218204). Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από τη συμμετοχή στη μελέτη αυτή και πριν από οποιαδήποτε δείγματα ή κλινικές πληροφορίες συλλέχθηκαν. Το πρωτόκολλο ζώων εγκρίθηκε από το Εργαστήριο Jackson (JAX) Θεσμική Φροντίδα Ζώων και Επιτροπή Χρήσης (IACUC, Πρωτοκόλλου Αρ 12027) και το UC Davis IACUC (Πρωτόκολλο Νο 17794).

Φρέσκα κλινικά δείγματα καρκίνου (3 -5 χιλιοστά

3) εμφυτεύθηκαν υποδορίως στα πλευρά των ηλικίας 4-5 εβδομάδων NOD.Cg-

Prkdc

SCID

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ (aka, NSG) ποντίκια. Για κάθε δείγμα ασθενούς, πέντε NSG ποντίκια εμφυτεύθηκαν και παρακολουθούνται για την ανάπτυξη του όγκου για μέχρι και πέντε μήνες. Ένα πρότυπο ορθοτοπικής PDX δημιουργήθηκε μέσω ένεσης του ενιαίου κυτταρικό εναιώρημα από την υποδόρια PDXs μέσα στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης του ποντικιού.

απομόνωση RNA

αιματοξυλίνη και ηωσίνης εκτελέστηκε και οι διαφάνειες εξετάστηκαν για να εξασφαλιστεί ότι σε τουλάχιστον 85-90% των κυττάρων ήταν κύτταρα καρκίνου πριν από τη συλλογή δείγματος. Ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από είτε νωπό κατεψυγμένο τεμάχια ξενομοσχεύματος όγκου χρησιμοποιώντας το ΤΚΙζοΙ Plus RNA Purification Kit (Life Technologies) ή από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα (FFPE) (8 τμήματα x 12-μΜ) χρησιμοποιώντας το miRNeasy FFPE Kit (Qiagen), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Ολικό RNA εκλούστηκε από τις στήλες σε ύδατος άνευ νουκλεάσης και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα αξιολογήθηκαν με NanoDrop 2000 Φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific) και αξιολόγηση της ποιότητας (

e

.

g

., η ακεραιότητα του RNA) έγιναν χρησιμοποιώντας μια Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) . Για miRNA προφίλ έκφρασης, ολικό κυτταρικό RNA (συμπεριλαμβανομένου του μικρό κλάσμα RNA) απομονώνεται από FFPE δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης με χρήση του miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

DNA απομόνωση

DNA απομονώθηκε από δείγματα φρέσκου κατεψυγμένου ή FFPE όγκου του ασθενούς και του ξενομοσχεύματος (5 χ 20-μΜ τμήματα) με τη χρήση τυποποιημένων QIAamp DNA ή κιτ Tissue QIAamp DNA FFPE (Qiagen).

μεταγραφικό προφίλ από την RNA-Sequencing (RNA -SEQ)

RNA-Seq παρασκεύασμα βιβλιοθήκη και αλληλούχιση.

μεταγραφικό προφίλ του P0 (πέρασμα 0) όγκους ξενομοσχεύματος καρκίνου της ουροδόχου κύστης διεξήχθη με ανάλυση RNA-Seq. RNA-Sequencing (RNA-Seq) βιβλιοθήκες παρασκευάσθηκαν από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας το TruSeq RNA δείγματος Προετοιμασία Kit v2 (Illumina, San Diego, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το mRNA πολυ-αδενυλιωμένα καθαρίστηκε από ολικό RNA και ριβοσωμικό RNA απομακρύνθηκε με δύο γύρους πρόσδεσης στα μαγνητικά σφαιρίδια ολιγο-άΤ που ακολουθείται από κατακερματισμό RNA, έκλουση, και το αστάρωμα με επώαση στους 94 ° C για 8 λεπτά. Το δίκλωνο cDNA στη συνέχεια δημιουργούνται από τυχαία-εναρχθέν πρώτου κλώνου σύνθεση με αντίστροφη μεταγραφάση Superscript II και την επακόλουθη σύνθεση του δεύτερου κλώνου με RNase Η και DNA πολυμεράσης Ι Το cDNA αμβλέα άκρα με Τ4 και ϋΝΑ πολυμεράσες Klenow για να απομακρυνθεί το 3 ‘ -overhangs και συμπληρώστε 5′-προεξοχές, φωσφορυλιωμένη με Τ4 ΡΝΚ, και στη συνέχεια, 3’-Α ουρά από επώαση με Klenow θραύσμα (3’→ 5’εξω-) και dATP. Illumina ζευγαρωμένα-άκρο (ΡΕ), με ευρετήριο προσαρμογείς στη συνέχεια συνδέθηκαν, ακολουθούμενη από καθαρισμό με χάντρες AMPure XP. Η βιβλιοθήκη στη συνέχεια εμπλουτίζεται με υψηλής πιστότητας PCR ενίσχυση (15 κύκλοι) και τον προσαρμογέα-ειδικών εκκινητών. Η μοριακή συγκέντρωση των βιβλιοθηκών προσδιορίστηκε με μέτρηση της συγκέντρωσης με ένα φθορόμετρο qubit (Invitrogen), τον προσδιορισμό του μήκους ένθετο με ένα Agilent 2100 Bioanalyzer, και στη συνέχεια ποσοτικοποίηση qPCR-based (ΚΑΠΑ Βιβλιοθήκη Ποσοτικοποίηση Kit). Οι βιβλιοθήκες υποβλήθηκαν στην Γονιδιώματος Κέντρο της Νέας Υόρκης για το 100-bp ζεύγη τέλος, multiplex αλληλουχίας σε ένα σύστημα HiSeq 2000 αλληλουχίας (8 βιβλιοθήκες ανά λωρίδα? 2 λωρίδες).

RNA-Seq ανάλυση των δεδομένων

.

επεξεργασία εικόνας, βάση calling, η ποιότητα βαθμολόγησης (Phred), και αποπολυπλεξία δείγμα εκτελέστηκαν από HiSeq λογισμικό ελέγχου με Πραγματική Ανάλυση Ώρα (HCS 1.5 /RTA 1.13) και CASAVA 1.8 του λογισμικού (Illumina? San Diego, CA). Η ανάλυση των δεδομένων RNA-Seq πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο ΤΟΡΗΑΤ C-Μανικετόκουμπα ροή εργασίας [17]. Ακολουθία έχει ως εξής (σε μορφή FASTQ) ταξινομήθηκαν ως ανθρώπινα (μόσχευμα) ή το ποντίκι (host), χρησιμοποιώντας Xenome [18] και στη συνέχεια ευθυγραμμίζονται με το συγκρότημα αναφοράς ανθρώπινο γονιδίωμα (Φεβρουάριος του 2009, GRCh37 /hg19) με ΤΟΡΗΑΤ C, επιτρέποντας για μέγιστο χρονικό διάστημα δύο αναντιστοιχίες? ΤΟΡΗΑΤ C χρησιμοποιεί το ευθυγραμμιστής Bowtie [19] και περιλαμβάνει ένα εργαλείο για τις διασταυρώσεις ματίσματος χαρτογράφησης [20] για την RNA-Seq διαβάσει ευθυγράμμιση με την ακολουθία αναφοράς ανθρώπινου γονιδιώματος (GRCh37 /hg19). Γονίδια και έκφραση μεταγραφή επιπέδου ήταν συνολικά ποσοτικά με το λογισμικό Μανικετόκουμπα [21] για

1)

μεταγραφή συναρμολόγηση,

2)

ταυτοποίηση των παραλλαγών ματίσματος, και 3) την ποσοτικοποίηση των κανονικοποιημένων έκφρασης όπως FPKM (τεμάχια ανά kilobase της μεταγραφής ανά εκατομμύριο χαρτογραφηθεί διαβάζει) τιμές.

αλληλούχιση ολόκληρου-exome (WES)

Προετοιμασία ολόκληρων βιβλιοθηκών αλληλουχίας exome-σύλληψη και αλληλούχιση.

DNA δείγματα παρασκευάστηκαν για ανάλυση αλληλουχίας ολόκληρου exome στην πλατφόρμα Illumina χρησιμοποιώντας την SureSelect

XT Target Εμπλουτισμός System (Agilent) σε συνδυασμό με το SureSelect

XT Ανθρώπινα Όλα εξόνιο V4 + UTRs βιβλιοθήκη σύλληψης. Αυτό διεξήχθη σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και προχώρησε σε 3 γενικά βήματα αρχίζουν με κατάτμηση DNA, που ακολουθείται από παρασκευή της βιβλιοθήκης, και στοχευμένη εμπλουτισμού για όλους τους εξώνια και αμετάφραστες περιοχές (UTRs). Υψηλού μοριακού βάρους DNA (3 μg) ήταν ψαλιδισμένα σε θραύσματα μέση μέγιστη μεγέθους 150-200 bp χρησιμοποιώντας ένα Covaris S220 επικεντρώθηκε-υπερήχων και στη συνέχεια να καθαριστεί χρησιμοποιώντας Agencourt AMPure XP μαγνητικά σφαιρίδια. Τυποποιημένα πρωτόκολλα χρησιμοποιήθηκαν για σύνδεση προσαρμογέα, ευρετηρίαση, υψηλής πιστότητας ενίσχυση PCR. Στη συνέχεια, ο εμπλουτισμός exome πραγματοποιήθηκε με υβριδική σύλληψη με όλες τις εξόνιο v4 βιβλιοθήκη σύλληψης + UTRs (789.141 βιοτινυλιωμένο, εξαιρετικά μακρύ δολώματα ολιγομερή RNA) για να συλλάβει τις στοχευμένες σειρές που εκτείνονται 71Mb του γονιδιώματος και περιλαμβάνει από 20.965 γονίδια και 334.378 εξώνια. βιβλιοθήκες σύλληψη ενισχύθηκαν, συγκεντρώθηκαν, και υποβάλλονται στην Γονιδιώματος Κέντρο της Νέας Υόρκης για το 100-bp ζεύγη τέλος, multiplex αλληλουχίας σε ένα σύστημα αλληλουχίας HiSeq 2000 (4 βιβλιοθήκες ανά λωρίδα).

ανάλυση δεδομένων WES.

Δευτερογενής ανάλυση των δεδομένων WES αποτελούνταν από ευθυγράμμιση ανάγνωσης με την αλληλουχία του γονιδιώματος αναφοράς (GRCh37 /hg19) χρησιμοποιώντας το Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [22] και εφαρμόζοντας το γονιδίωμα ανάλυση Toolkit (GATK) [23] για τη βάση ποιότητα βαθμολογία επαναβαθμονόμηση, Indel επανευθυγράμμιση, εις διπλούν αφαίρεσης, και την εκτέλεση SNV και INDEL ανακάλυψη και γονοτυπική σε όλα τα δείγματα ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας πρότυπες παραμέτρους σκληρό φιλτράρισμα ή βαθμολογία ποιότητας παραλλαγή εκ νέου βαθμονόμηση [24]. Πριν από την ευθυγράμμιση, διαβάζει ήταν λάθος-στολισμένα πριν από την εμφάνιση μιας βάσης χαμηλής ποιότητας (Phred σκοράρει ≤20). Επιπλέον, για την ανάλυση των δεδομένων που προέρχονται από WES ξενομοσχεύματος ιστούς, καθώς και τα δεδομένα του όγκου του ασθενούς που χρησιμοποιούνται σε συγκρίσεις, Xenome χρησιμοποιήθηκε για ανθρώπου /ποντικού διαβάσει ταξινόμηση και προσδιορισμό των επιπέδων των γονιδιωματικών μόλυνσης ποντικού [18]. στατιστικά στοιχεία απόδοσης για αλληλούχιση επόμενης γενιάς και μετέπειτα αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των συνολικών αριθμών διαβάζει, το ποσοστό χαρτογράφηση και την ανθρώπινη /ποντίκι διαβάσετε ταξινόμησης, περιλαμβάνονται στον πίνακα S1 και S2 πίνακα.

Μετά την εφαρμογή του GATK, παραλλαγές διηθούνται για εκείνους που έχουν επιβεβαιωθεί κατάσταση σωματική μετάλλαξη και /ή έχουν χαρακτηριστεί ως σωματική μετάλλαξη σε τουλάχιστον ένα όγκου χρησιμοποιώντας το πλήρες Κατάλογος σωματικά Μεταλλάξεις σε Καρκίνο (COSMIC) και το The Cancer Genome Atlas (TCGA) βάσεις δεδομένων. Προκειμένου να καθορίσει περαιτέρω την πιθανότητα μιας προηγουμένως επιβεβαιωθεί σωματική παραλλαγή ως μια σωματική ανωμαλία σε αυτούς τους όγκους PDX, ένα πρόσθετο φίλτρο επιβλήθηκε για να επιλέξετε για τα κλάσματα παραλλαγή αλληλόμορφου στο εύρος 10-40% ή 60-90%, γεγονός που υποδεικνύει η παρουσία της ετερογένειας των όγκων και ότι η παραλλαγή προήλθε από έναν όγκο υποπληθυσμό. Κατά μήκος αυτών των γραμμών, διάφορες παραλλαγές με «σωματικές τεκμαιρόμενη» κατάσταση ικανοποίησε τα κριτήρια αυτά και επίσης περιλαμβάνονται στα αποτελέσματα. Παρά το γεγονός ότι αυτές δεν αντιστοιχούν σε μια ακριβή αντιστοιχία στην κοσμική ή TCGA, φιλτράρισμα διεξήχθη με Ingenuity Ανάλυση Variant (Qiagen, Inc.) για να

1)

αποκλείουν παραλλαγές που συνδέονται με την κανονική ανθρώπινη γενετική παραλλαγή που προσδιορίζονται από μεγάλης έργα αλληλουχίας κλίμακας, συμπεριλαμβανομένου του Έργου 1.000 γονιδιώματος, Complete Genomics Δημόσια γονιδιώματος, NHLBI GO exome αλληλουχίας Έργου (ESP), και dbSNP, και 2) να εντοπίσει «μη-dbSNP» παραλλαγές με ενδιάμεσες συχνότητες αλληλόμορφο που θα ήταν το χαρακτηριστικό των παραλλαγών παρουσιάσει στο μια ετερογενής όγκου και όχι στην βλαστική.

μελέτη αποτελεσματικότητας

Αυτό το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το UC Davis Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC, πρωτόκολλο # 17794) πριν από την έναρξη της μελέτης. Όλες οι μελέτες σε πειραματόζωα ακολούθησαν τις κατευθυντήριες γραμμές IACUC. Γυναίκα NSG ποντίκια στην ηλικία των 4-5 εβδομάδων παραγγέλθηκαν από JAX, και είχαν τουλάχιστον μία εβδομάδα για να εγκλιματιστεί στο νέο περιβάλλον πριν από την είσοδο στη μελέτη. Για τη δημιουργία πολλαπλών PDXs να επιτρέψουν μελέτες αποτελεσματικότητας με πολλαπλά φάρμακα, PDXs από Πέρασμα 2-4 τεμαχίστηκαν σε 3-5 mm

3 και εγχύθηκε σε πολλαπλές ποντικούς είτε υποδορίως στο πλευρό ή ορθοτοπικά στον μυϊκό στρώμα του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης. Όταν υποδόρια μεγέθη του όγκου έφθασε ~ 200 mm

3, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με στοχευμένους θεραπευτικούς παράγοντες συσχετίζονται με τα γενετικές αλλοιώσεις εντοπίζονται μέσω βαθιάς αλληλούχιση όπως περιγράφηκε παραπάνω (S1 Εικ). Τα ακόλουθα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: sEphB4-HSA αναπτύχθηκε μέσω σύζευξης του διαλυτού EphB4 προς αλβουμίνη ανθρώπινου ορού. Ήταν παρέχονται από Parkash Gill, MD, στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας. Άλλα φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων BGJ398 και BEZ235, αγοράστηκαν από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX). Για κάθε ομάδα αγωγής, 8-10 ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για να επιτρέψει στατιστική ανάλυση. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη όγκου και μεταβολές στις κλινικές παραμέτρους, όπως μεταβολές βάρους, εξάλειψη των αποβλήτων, παλτό υφή, το χρώμα, λεκέδες ούρων, μετά την αποξήρανση γύρω από τα μάτια, τα επίπεδα δραστηριότητας, και τη στάση του σώματος. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν το μέγεθος του όγκου έφθασε πέντε φορές το μέγεθος βασικής γραμμής (περίπου 1.000 mm

3). Αρκετοί ποντικοί θυσιάστηκαν πριν από την έναρξη της θεραπείας ή κατά τη διάρκεια της θεραπείας για τον προσδιορισμό των κατάντη δραστηριότητες μονοπάτι σηματοδότησης χρησιμοποιώντας κηλίδα western, ανοσοϊστοχημική χρώση ή χρώση ανοσοφθορισμού. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν μέσω υπερδοσολογίας πεντοβαρβιτάλης (180 mg /kg) ή υπερβολική δόση πεντοβαρβιτάλης (60 mg /kg), ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση.

Στατιστική ανάλυση

Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον εις τριπλούν. Διεξήχθη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad InStatTM (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) και ANOVA (analysis of variance) διεξήχθη για να συγκριθούν οι διαφορές από τις τρεις ομάδες θεραπείας. Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα, εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά. Μια τιμή του ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Ίδρυση ξενομοσχευμάτων προέρχονται ασθενή (PDX) από ουροφόρων καρκίνωμα

Μέχρι σήμερα, έχουμε δημιουργήσει 22 PDXs από. ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, που αντιπροσωπεύουν το 41% ​​των όγκων που εμφυτεύονται. Μεταξύ αυτών των 22 PDXs, 13 PDXs προήλθαν από προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και 9 PDXs από NMIBC. Τα κλινικά χαρακτηριστικά που φαίνονται στον Πίνακα 1. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 74 δότη ετών (εύρος: 54-83). Πέντε από τα 13 PDXs προέρχεται από προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης λάβει προηγούμενη εισαγωγική χημειοθεραπεία πριν από την εμφύτευση, ενώ κανένας από τους NMIBC έπραξε.

Είκοσι δύο PDXs αναπτύχθηκαν, μεταξύ των οποίων 13 από προχωρημένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και 9 από μη myoinvasive καρκίνο της ουροδόχου κύστης .

η

Μορφολογικά πιστότητα μεταξύ των όγκων των ασθενών και των αντίστοιχων ξένων μοσχευμάτων

σύγκριση της μορφολογίας των όγκων των ασθενών της ουροδόχου κύστης και των αντίστοιχων PDXs σε διάφορα περάσματα. Η μορφολογική πιστότητα διατηρήθηκε από δείγματα όγκου ασθενών μέσω της διόδου 6 (Σχήμα 1Α). Η μορφολογία της υποδόριας και ορθοτοπική PDXs καρκίνου της ουροδόχου κύστης διατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 1Α δεξιά πάνελ). Τα καρκινικά κύτταρα σε PDXs βάφτηκαν θετικά με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Ki67, επιβεβαιώνοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα σε PDXs ήταν πράγματι ανθρώπινης προέλευσης. Πάνω από το 90% του καρκίνου της ουροδόχου κύστης PDX κύτταρα εξέφρασαν Ki67, έναν δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1Β). Συνεπής με αυτή τη διαπίστωση, ο όγκος του όγκου PDX χρόνος διπλασιασμού ήταν μεταξύ 10-20 ημέρες. Ακόμη και αν έχουν αναπτυχθεί PDXs από τον εμβολιασμό κλινικών δειγμάτων που περιλάμβαναν την υποστήριξη ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα, δεν στρωματικά κύτταρα σε PDXs βάφτηκαν θετικά με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα βιμεντίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα στρωματικά κύτταρα σε PDXs ήταν προελεύσεως ποντικού (Σχήμα 1 C). Αυτό περαιτέρω επικυρωθεί από την παρατήρηση των διαφορετικών επιπέδων αλληλουχίας προερχόμενα από ποντικό διαβάζει παρούσα στο αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) δεδομένων (S2 πίνακα). Ορισμένα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστεως και στρωματικά κύτταρα στα κλινικά δείγματα καρκίνου, όπως επίσης και τα καρκινικά κύτταρα σε PDXs, βάφτηκαν θετικά για ανθρώπινη βιμεντίνη. Δεδομένου ότι αυτές οι NSG ποντίκια δεν έχουν οποιαδήποτε killer φύση κύτταρα (ΝΚ), Τ και Β λεμφοκύτταρα, όχι λεμφοκυττάρων, με μορφολογία, παρατηρήθηκε σε PDXs.

(Α) Σύγκριση της μορφολογίας μεταξύ δειγμάτων και PDXs ασθενούς, υποδόρια και ορθοτοπική PDXs, της PDX BL0293 και BL0440. Χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η &? Ε χρώση) έδειξε ότι η μορφολογία των κυττάρων διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια εγκατάστασης του PDX και κατά τη διάρκεια ανακαλλιέργειας σε ποντίκια, τόσο σε υποδόρια θέση (SC, στο πέρασμα 6) και κατά την ορθοτοπική τοίχωμα της ουροδόχου κύστης (στο πέρασμα 4) . Ωστόσο, πιο μιτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε PDXs, ειδικά σε πέρασμα έξι. (Β) χρώση ανθρώπινων Κί67. Αμφότερες PDXs βάφτηκαν θετικά με αντι-ανθρώπινο Κί67, υποστηρίζοντας ότι αυτά τα κύτταρα ήταν πράγματι PDX ανθρώπινης προέλευσης. Σε PDX BL0440, περισσότερα κύτταρα βάφτηκαν θετικά με Κί67 στο πέρασμα έξι PDX σε σύγκριση με τα ανθρώπινα δείγμα καρκίνο της ουροδόχου κύστης, γεγονός που υποδηλώνει περισσότερα κύτταρα ήταν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και αυτό το εύρημα ήταν συνεπές με την παρατήρηση των περισσότερων μιτωτικών κυττάρων στον Πίνακα Α του Η &? Ε χρώση. (Γ) Χρώση ανθρώπινων βιμεντίνης. Ορισμένα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστης (αριστερό πάνελ) και στρωματικά κύτταρα (μεσαίο πάνελ) βάφτηκαν θετικοί για ανθρώπινη βιμεντίνη στα δείγματα ασθενών. Στο δείγμα PDX στο πέρασμα 0, μόνο μερικά καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα χρωματίστηκαν θετικά για ανθρώπινη βιμεντίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα στρωματικά PDX δεν προέρχονται από ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα.

Η

Διατήρηση γονιδιωματικών παραλλαγών P0 PDX όγκους

Περιεκτική προφίλ της γονιδιωματικής εκτροπές στα PDXs από τις πρώτες 8 ασθενείς έγινε από όλη την αλληλούχιση exome ανάλυση (WES) του 20965 γονιδίου τόπους, καλύπτοντας 334.378 εξώνια και εκτείνεται 71Mb του γονιδιώματος (Agilent Όλα Exon V4 + UTRs βιβλιοθήκη σύλληψης). Για να προσδιορίσετε αν PDXs διατήρησε τις γενετικές ανωμαλίες της γονικής καρκίνων του ασθενούς, τα αποτελέσματα WES συγκρίθηκαν σε δύο μοντέλα PDX, BL0429 και BL0440, στο πέρασμα 0 (P0). Παραλλαγές διηθούνται για όσους έχουν ένα βάθος ανάγνωσης των & gt? 20 και εμφανίζονται σε συχνότητα αλληλόμορφου του ≥0.5. Από το συνολικό αριθμό των παραλλαγών που προσδιορίζονται στο BL0429 (n = 15.653) και BL0440 (n = 16.916) όγκους ασθενών, 91,8% και 97,6% από αυτές που διατηρούνται στην P0 όγκου (Σχήμα 2). Για τεκμαίρεται σωματικές μεταλλάξεις (

e

g

, nonsynonymous και indels, δεν βρέθηκε σε dbSNP..), Ένα παρόμοιο υψηλό επίπεδο της μοριακής διατήρησης παρατηρήθηκε: 92,7% (101 από 109) και 94,4% (135 από 143) των παραλλαγών σε BL0429 και BL0440, αντίστοιχα (Σχήμα 2). Συνοπτικά, οι γονιδιωματικές παραλλαγές υπάρχουν σε όγκους ασθενών καρκίνου της ουροδόχου κύστης εντόνως διατηρημένες στις PDXs. Ανάλυση

WES διεξήχθη επί γονιδιωματικού δείγματα DNA που απομονώθηκε από τη γονική όγκους των ασθενών και μεταμοσχευμένα PDX P0 όγκους. δεδομένα WES διηθήθηκε για τις παραλλαγές που συμβαίνουν σε μία συχνότητα & gt? 0,5 ​​και στη συνέχεια συγκρίνονται μεταξύ δειγμάτων με βάση τους τύπους παραλλαγής. Ο αριθμός και το είδος των παραλλαγών που εμφανίζονται σε κάθε γονική όγκου και στον όγκο P0 PDX ήταν ποσοτικά και απεικονίζεται ως ποσοστό διατήρησης στο γράφημα. Για όλες τις παραλλαγές, 91,8% και 97,6% ήταν συντηρημένα σε BL0429 και BL0440, αντίστοιχα.

Η

Ανάλυση των γνωστών λειτουργικά ενεργά γονίδια και σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια

Είμαστε δίπλα αξιολόγησε την κατάσταση της μετάλλαξης του γνωστά λειτουργικά ενεργά γονίδια και σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως από μεγάλης κλίμακας, πολυκεντρική αναλύσεις των καρκίνων της ουροδόχου κύστης [15,25-27], πολλές από τις οποίες έχουν αποδείξει ρόλους στην καταστολή των όγκων, χρωματίνης /δυναμική χρωμόσωμα, μεταγραφική ρύθμιση, και το σήμα μεταγωγή. Από συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς δεν συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη, οι αναλύσεις που κατευθύνονται κυρίως στην αναγνώριση των παραλλαγών που έχουν επιβεβαιωθεί προηγουμένως σωματικά κατάστασης σε έναν ή περισσότερους καρκίνους, σύμφωνα με το κοσμικό ή /και βάσεων δεδομένων TCGA. Για τους 236 γονίδια θεωρείται, συνολικά 71 μη συνώνυμες παραλλαγές μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNVs) που οδηγεί σε παρανοηματικές ή ανοησία μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε 51 διαφορετικά γονίδια, με ποικίλες εναλλακτική αλληλόμορφο κλάσματα που κυμαίνονται από 0,160 έως 0,982 (Σχήμα 3, S3 Πίνακα και S4 Τραπέζι). Ενώ βρέθηκαν 15 γονίδια που πρόκειται να μεταβληθεί σε δύο ή περισσότερους όγκους, μόνο 5 μεταλλάξεις εμφανίστηκαν σε περισσότερα από ένα μοντέλο όγκου (

ADCY2

p.V147L,

ΕΚΒΒ2

p.I655V,

NCF2

p.H308Q,

SYNE1

p.L885V, και

ZNF814

p.158V). Οι περισσότεροι PDXs περιείχε 3-10 σωματικές μεταλλάξεις (σε 3-10 γονίδια), εκτός από PDXs BL0269 και BL0293 που είχε 13 μεταλλάξεις καθένα σε 11 και 13 διαφορετικά γονίδια, αντίστοιχα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μεταλλάξεις σε λειτουργικά ενεργά γονίδια εντοπίστηκαν σε κάθε PDX, συμπεριλαμβανομένων των

ARID1A

,

ATM

,

CASP8

,

Cdh1

,

KALRN

,

KMT2C

,

NCF2

,

mTOR

,

PIK3CA

,

TSC1

, και

TP53

? 6-10 μεταλλάξεις σε γονίδια οδηγός καρκίνου της ουροδόχου κύστης βρέθηκαν σε 5 από 8 μοντέλα (S4 πίνακα). Ενσωμάτωση του RNA-Seq δεδομένων με αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι από τις 71 μεταλλάξεις που βρέθηκαν, υπήρχαν περίπου 29 «εκφράζεται» μεταλλάξεις σε 20 γονίδια (

e

.

g

.,

ARID1A

,

CASP8

,

KLF5

,

MLH1

,

Notch1

,

PIK3CA

, και

SYNE2

) που υπερέβη το cut-off της χαμηλής /μέτριας αφθονίας μεταγραφή (

i

.

e

., ≥10 FPKM ή θραύσματα ανά kilobase του εξονίου ανά εκατομμύριο τεμάχια χαρτογραφηθεί) (S5 Πίνακας).

WES πραγματοποιήθηκε σε όγκους P0 από κάθε μοντέλο PDX. Στη συνέχεια, η GATK χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της παραλλαγής και λειτουργική σχολιασμό. Τα αποτελέσματα φιλτράρονται για σωματικές μεταλλάξεις που συμβαίνουν σε ένα ενοποιημένο κατάλογο των 130 γνωστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης λειτουργικά ενεργά γονίδια [27], καθώς και σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια [15,25,26]? Οι περιπτώσεις αυτές αναφέρονται στη δεξιά πλευρά του πίνακα, όπως

BLCA Driver (IntOGen)

,

TCGA Σημαντικά Μεταλλαγμένα

, ή

BGI Σημαντικά Μεταλλαγμένα

. Σωματικές μεταλλάξεις βρέθηκαν σε 51 διαφορετικά γονίδια (υποδεικνύεται κατά μήκος της πλευράς του πίνακα) (S3 Πίνακας S4 και πίνακα). Ο αριθμός μοντέλου PDX υποδεικνύεται πέρα ​​από την κορυφή του πλέγματος. Οι συχνότητες (0,3-1,0) για κάθε μεταλλαγμένο αλληλόμορφο που αναφέρονται για κάθε παραλλαγή και εκπροσωπείται από την αύξηση χρώμα εντάσεις.

Η

Μεταλλακτική ανάλυση των οδών ογκοκατασταλτικών

Τα τρία τέταρτα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης PDXs περιέχονται εκτροπές σε ένα ή περισσότερα από τα γονίδια καταστολείς όγκων

ΤΡ53

,

RB1 ​​

, και

CDKN2A

(Σχήμα 4). Συγκεκριμένα, αυτές περιλαμβάνονται σωματικές μεταλλάξεις του

TP53

(R248Q, R280T, E177 *, και E285K) και

RB1 ​​

(R358X), και τον αριθμό αντιτύπου παραλλαγές

RB1 ​​

( σε BL0293, BL0429, και BL0479) και

CDKN2A

(σε BL0269, BL0382, BL0429, και BL0479). Οι περισσότεροι από τους σωματικών μεταλλάξεων ΤΡ53 ήταν ετερόζυγα (συχνότητα αλληλόμορφου = 0,5) με την εξαίρεση του R280T σε BL0479 και E177X περικοπή μετάλλαξη στο BL0382, τα τελευταία των οποίων επίσης συνοδεύεται από σημαντικά μειωμένη

ΤΡ53

επίπεδα μεταγραφής (Σχ 4Α και 4Β). Μια αντίστοιχη μείωση του

MDM2

έκφραση παρατηρήθηκε σε όγκους BL0293 και BL0479 που περιέχουν R248Q και R280T μεταλλάξεις στο

TP53

, αντίστοιχα. Αντιγραφή απώλειες αριθμό ή διαγραφές, που συμβαίνουν στο

RB1 ​​

και

CDKN2A

τόπους, επικυρώθηκαν από τη σύγκριση με τα δεδομένα του RNA-Seq επιδεικνύοντας μια σχεδόν πλήρη απουσία της έκφρασης στις περισσότερες περιπτώσεις.

(Α) Ολοκληρωμένη ανάλυση των

η έκφραση mRNA

,

Οι μεταλλάξεις

, και

Αντιγραφή αριθμού

έγινε για τα γονίδια στο

TP53

και

RB1 ​​

μονοπάτια ογκοκατασταλτικό. Οι γονιδιακή έκφραση επιπέδου (FPKM) τιμές για τα γονίδια μέλος μονοπάτι που παρουσιάζονται και σχετική έκφραση γονιδίων για κάθε γονίδιο σε όλον τον πίνακα των μοντέλων PDX υποδεικνύεται από το heatmap (πράσινο = χαμηλότερη από τη μέση, κόκκινο = μεγαλύτερο από το διάμεσο). Μεταλλάξεις (αλλαγές αμινοξέων) στο

TP53

και

RB1 ​​

υποδεικνύονται. Οι αριθμοί αντίγραφο του γονιδίου που παρουσιάζονται, και παραλλαγών που υποδεικνύονται ως απώλειες (

i

e

, & lt?.. 2) ή κέρδη (

i

e

, & gt?. 2) φαίνεται από πιο σκούρες αποχρώσεις του κόκκινου και του πράσινου, αντίστοιχα. Τα (Β) Τα επίπεδα έκφρασης (FPKM) των γονιδίων της οδού καταστολέα όγκου σε κάθε PDX φαίνεται στο γράφημα μπαρ.

Η

μεταγραφικό προφίλ των όγκων PDX

Πέρα από τα 20 μεταλλαγμένα γονίδια που ήταν βρέθηκαν να έχουν τουλάχιστον ένα ελάχιστο επίπεδο έκφρασης (

πάνω

), περαιτέρω αξιολόγηση της έκφρασης του γονιδίου-επίπεδο για ολόκληρο το ενοποιημένο κατάλογο των 236 καρκίνου της ουροδόχου κύστης λειτουργικά ενεργό και σημαντικά μεταλλαγμένα γονίδια έδειξαν ότι 85-104 από αυτά είχαν μέτριο έως πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης (FPKM = 15-2,417) σε τουλάχιστον ένα PDX (εικόνα Α S2 σχήμα, S6 πίνακα). Επιπλέον, πολλές παρουσίασαν καθολικά υψηλή έκφραση στα μοντέλα PDX, συμπεριλαμβανομένων των

AHNAK

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CTNNB1

,

HRAS

,

RhoA

, και

YWHAZ

. Παρομοίως, η αξιολόγηση του οδηγού 291 υψηλής αξιοπιστίας (HCD) γονιδίων που ταυτοποιούνται μέσω ανάλυσης παν-καρκίνος των συνόλων δεδομένων TCGA [27], και χρησιμοποιώντας τα ίδια κριτήρια για ανάλυση όπως περιγράφεται παραπάνω, έδειξε ότι 199 HCD γονίδια εκφράστηκαν στον πίνακα (Εικόνα Β S2 σχήμα, S7 πίνακα). Ως μια προσέγγιση για τον καθορισμό μονοπάτια οδηγούν τη βιολογία του PDX όγκων, λειτουργική σχολιασμό ομαδοποίηση των πιο υψηλής έκφρασης γονιδίων (≥50 FPKM) σε όλη την ομάδα PDXs πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής DAVID πόρων [28]. Αυτό αποκάλυψε τη συμμετοχή πολλών θεμελιωδών κυτταρικών οδών και μοριακά συστατικά τους, συμπεριλαμβανομένης της ουβικιτίνης-πρωτεασώματος, μετάφραση παράγοντες, και τα μεταβολικά ένζυμα (γλυκόλυση, γλυκονεογένεση, οξειδωτική φωσφορυλίωση). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα γονίδια που ρυθμίζουν αρνητικά την απόπτωση ήταν επίσης σημαντικά εμπλουτισμένη (25 γονίδια,

σ

= 3,95 Χ 10

-06), όπως

DAD1

,

MCL1

,

SOD1

,

TPT1

, και YWHAZ, εμπλέκοντας την παρουσία μιας γενικευμένης πλεονέκτημα επιβίωσης.

πλατφόρμα PDX να καθοδηγήσει μοριακά στοχευμένη θεραπεία

Ένας σημαντικός στόχος οδηγούν στην ανάπτυξη αυτών των μοντέλων PDX ήταν να δημιουργήσει μια πλατφόρμα για να βοηθήσει στον εντοπισμό της σωστής μετάλλαξη του οδηγού και να συνδυαστούν στοχευμένη θεραπεία του. Με βάση τα δεδομένα αλληλούχισης ολόκληρο exome και μεταγραφικό, υπάρχουν πολλοί στόχοι druggable με αναστολείς που είναι εγκεκριμένη από την FDA ή σε κλινικές δοκιμές (Σχήμα 5Α) (S7 Πίνακα, S8 Πίνακα και S9 Πίνακα). Έχουμε επιλέξει ένα υποσύνολο αυτών των στόχων για την ενημέρωση συμφωνημένα δοκιμές θεραπείας (S1 σχήμα): υποδοχέα του παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών 3 (

FGFR3

), υποδοχέα τύπου εφρίνης Β 4 (

EphB4

), πρωτο-ογκογονίδιο κινάσης τυροσίνης-πρωτεΐνης

Src

, υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα -2 και 3 (

HER2 /3

) και φωσφατιδυλινοσιτόλη-4,5-διφωσφορικής 3-κινάσης, καταλυτική υπομονάδα άλφα (

PIK3CA

).