Αφηρημένο

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) του DNA του όγκου χαρακτηρίζεται από χρωμοσωμική βλάβη που ονομάζεται χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) και υπερβολικά σύντομη τελομερή. Έως και το 80% των CRC είναι μικροδορυφόρων σταθερός (MSS) και είναι ιστορικά θεωρείται χρωμοσωμικώς ασταθής (CIN +). Ωστόσο, φαινοτυπική όγκου απεικονίζει κάποια MSS CRC με λίγη ή καθόλου γενετικές αλλαγές, έτσι είναι στο χρωμόσωμα σταθερό (CIN-). MSS CIN- όγκοι δεν έχουν αξιολογηθεί για τελομερών τριβή.

Πειραματικός Σχεδιασμός

MSS του ορθού από ασθενείς ≤50 ετών με το Στάδιο ΙΙ (Β2 ή νεότερη έκδοση) ή νόσο σταδίου ΙΙΙ αξιολογήθηκαν για CIN, το μήκος των τελομερών και μηχανισμό συντήρησης των τελομερών (τελομεράση ενεργοποίησης [ ,,,0],TA]? εναλλακτική επιμήκυνση των τελομερών [ALT]). Σχετική μήκος των τελομερών μετρήθηκε με qPCR σε σωματικά επιθηλιακού και του καρκίνου του DNA. TA μετρήθηκε με τη δοκιμασία τραπέζιο, και οι όγκοι εκτιμήθηκαν για την παρουσία του Ο-κύκλων ενδεικτική της ALT. κατάσταση μετάλλαξης ρ53 εκτιμήθηκε σε όλες τις διαθέσιμες δείγματα. αριθμό αντιγράφων αλλαγές του DNA αξιολογήθηκαν με Spectral Genomics aCGH.

Αποτελέσματα

Οι όγκοι ταξινομούνται ως χρωμόσωμα σταθερό (CIN-) και στο χρωμόσωμα ασταθής (CIN +) με βαθμό αριθμός αλλαγών αντιγραφής του DNA. CIN- όγκοι (35%? N = 6) είχαν αριθμό αλλαγών λιγότερες αντιγράφων (& lt? 17% των κλώνων τους με τον αριθμό αντιγράφων του DNA αλλάζει) από CIN + όγκους (65%? N = 13), που είχαν υψηλά επίπεδα αριθμό αντιγράφων αλλάζει σε 20% έως 49% των κλώνων. Τελομερούς μήκη ήταν πλέον σε CIN- σύγκριση με CIN + όγκους (ρ = 0,0066) και σε αυτά στα οποία τελομεράση δεν ενεργοποιήθηκε (p = 0.004). Οι όγκοι που παρουσιάζουν ενεργοποίηση της τελομεράσης είχαν μικρότερη τελομερή του όγκου (ρ = 0,0040)? και έτειναν να είναι CIN + (p = 0,0949).

Συμπεράσματα

καρκίνο του ορθού MSS φαίνεται να αποτελούν μια ετερογενή ομάδα των όγκων που μπορεί να κατηγοριοποιηθεί τόσο βάσει του μηχανισμού κατάσταση και τη συντήρηση των τελομερών CIN . MSS CIN- ορθού καρκίνοι εμφανίζονται να έχουν μεγαλύτερη τελομερή από εκείνες του ορθού MSS CIN + και να χρησιμοποιήσουν ALT αντί ενεργοποίηση της τελομεράσης.

Παράθεση: Boardman LA, Johnson RA, Viker KB, Hafner KA, Jenkins RB, Riegert-Johnson DL, et al. (2013) Συσχέτιση της χρωμοσωμικής αστάθειας, τελομερούς Μήκος και τελομερούς Συντήρηση σε Μικροδορυφορικοί Σταθερό ορθού: Μια Μοριακή Υποκατηγορία του καρκίνου του ορθού. PLoS ONE 8 (11): e80015. doi: 10.1371 /journal.pone.0080015

Επιμέλεια: Michel Μ Ouellette, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2013? Αποδεκτές: 27 Σεπτέμβρη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 21, Νοεμ, 2013

Copyright: © 2013 Boardman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το National Cancer Institute (R01 CA132718 και Ρ50 CA102701 Mayo Clinic SPORE σε καρκίνο του παγκρέατος)? το Εθνικό Ινστιτούτο Διαβήτη και του πεπτικού και νεφρικά νοσήματα (P30 DK084567 Mayo Clinic Center for Cell Signaling στο Gastroenterology)? το Ίδρυμα Lustgarten για καρκίνο του παγκρέατος? και από την Mayo Clinic Κέντρο για εξατομικευμένη ιατρική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) μπορεί να υποδιαιρεθεί σε όγκους που παρουσιάζουν χρωμοσωμική αστάθεια (CIN +) έναντι εκείνων με άθικτο καρυότυπος και χρωμοσωμικές σταθερότητα (CIN). Συμβατικά, οι όγκοι μόνο με ελαττωματική επισκευή ασυμφωνία DNA (dMMR), αλλιώς γνωστή ως μικροδορυφορικού ασταθή όγκους, (MSI (H)), θεωρούνταν CIN- και CIN όγκοι + θεωρήθηκαν για να έχουν άθικτο dMMR και να μικροδορυφορικού σταθερό (MSS) . Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι μέχρι 50% των όγκων MSS είναι CIN-, και μια σημαντική, αλλά μικρότερο τμήμα του MSI (H) ορθοκολικό όγκοι είναι CIN + [1,2]. Αν και οι MSI (H) του παχέος εντέρου συνδέονται με μια καλύτερη πρόγνωση από τους όγκους MSS, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το επίπεδο της χρωμοσωμικής αστάθειας, παρά την κατάσταση μικροδορυφόρου, είναι ο χρήσιμος προγνωστικός δείκτης [3]. Ειδικοί φαινότυποι που συνδέονται με τον υπότυπο MSS CIN- περιλαμβάνουν κακή διαφοροποίηση του όγκου, βλεννώδες ιστολογία και ένα χαμηλότερο ποσοστό ρ53 μεταλλάξεων [1,4]. Επιπλέον, CRC που προκύπτει σε νεαρότερη ηλικία (& lt? 50 ετών) είναι πιο πιθανό να είναι MSS διπλοειδή, με διπλοειδίας είναι ένα υποκατάστατο μέτρο της χρωμοσωμικής σταθερότητας. Χρωμόσωμα σταθερό (CIN-) μικροδορυφορικού σταθερό (MSS) CRC είναι μια σχετικά νέα ταξινόμηση των CRC που παρέχει ένα άλλο πλαίσιο για την κατανόηση των μονοπατιών που διέπουν αυτή τη μορφή καρκίνου. έχουν

Συντόμευση τελομερή έχουν συνδεθεί με χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) στη ρύθμιση των ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία που σχετίζονται με τη γενετική διαταραχή και καρκινογένεση [5]. Τα τελομερή αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες TTAGGG που προστατεύουν τα άκρα των γραμμικών χρωμοσωμάτων από το να αφεθεί ευάλωτο σε βλάβη, και δυσλειτουργικές βράχυνση των τελομερών έχει ενοχοποιηθεί ως ο πρόδρομος για χρωμοσωμική αστάθεια. Κριτικά σύντομη τελομερή εκθέσει χρωμοσωμικές άκρα, να ασκούν την απάντηση βλάβες στο DNA, και καθίζηση end-to-end συγχωνεύσεις και γεγονότα ανασυνδυασμού. Τα πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα μαστού με μικρότερα τελομερή εμπλέκονται πιο συχνά σε εκδηλώσεις mis-διαχωρισμού και παρουσιάζουν όχι μόνο χρωμοσωματικών αναδιατάξεων, αλλά και αριθμητικές χρωμοσωμικές αλλαγές [6], υποδεικνύοντας ότι βραχύτερο μήκος των τελομερών μπορεί να επιτρέψει την ανάπτυξη της CIN. το μήκος των τελομερών στο DNA από όγκους MSS CIN- δεν έχει αξιολογηθεί.

Τα τελομερή μπορεί να επιμηκυνθεί με την ενεργοποίηση της αντίστροφης μεταγραφάσης ριβονουκλεοπρωτεϊνικού ονομάζεται τελομεράση [7] .. ενεργοποίηση της τελομεράσης είναι παρούσα σε πολλές μορφές καρκίνου. Κριτικά μειωθεί τελομερή ξεκινήσει κανονικά κυτταρική γήρανση και την απόπτωση και να σταματήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που περιέχουν σημαντικά κατεστραμμένο DNA. ενεργοποίηση της τελομεράσης μπορεί να απαθανατίσει αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα αποκαθιστώντας αρκετό μήκος των τελομερών να προστατεύσει την αριθμητική /και διαρθρωτικά αλλαγμένο DNA από εξουδετερώνεται από την ανταπόκριση βλάβη του DNA και υποβάλλονται σε κυτταρική γήρανση. Μια άλλη οδός για τη συντήρηση του τελομερούς, μέσω των οποίων τα τελομερή μπορεί να αλλάξει το δρομολόγιο από γήρανση είναι μέσω εναλλακτικών επιμήκυνση των τελομερών (ALT), το οποίο είναι ένα βασισμένο μηχανισμός ομόλογου ανασυνδυασμού που χρησιμοποιεί μια μήτρα DNA για τη διατήρηση του μήκους των τελομερών [8].

επιδίωξαν να καθορίσουν εάν μονοπάτι (-ες) συντήρησης διακριτές τελομερών θα συσχετίζεται με την παρουσία ή την απουσία CIN στον καρκίνο του ορθού MSS. Για να αποσαφηνίσει περαιτέρω το φαινόμενο των MSS CIN- σε σύγκριση με CIN + καρκίνο του ορθού, χρησιμοποιήσαμε array CGH (aCGH) για την αξιολόγηση των όγκων για δομικές χρωμοσωμικές και υπο-χρωμοσωμικές γενετικές αλλοιώσεις.

Όπως προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε ότι σχεδόν το 50% των περιπτώσεων νεαρών έναρξη MSS CRC που προέκυψαν στο εγγύς παχέος εντέρου ή του ορθού ήταν διπλοειδή με κυτταρομετρία ροής [9], μελετήσαμε μόνο τους νέους περιπτώσεις ηλικία έναρξης και επικεντρώθηκε στην ορθού καρκίνους παρόμοιο στάδιο. Μετρήσαμε το μήκος των τελομερών σε αντίστοιχες λευκοκυττάρων του περιφερικού αίματος, κανονικός γειτονικός του παχέος εντέρου, και του ορθού DNA του καρκίνου και αξιολόγησε την πρωκτική DNA του καρκίνου για την ενεργοποίηση της τελομεράσης και ALT για να προσδιοριστεί εάν οποιαδήποτε από τις δύο κύριους μηχανισμούς της συντήρησης τελομερούς θα συσχετίζονται με το επίπεδο της CIN σε νεαρά εμφάνισης καρκίνου του ορθού MSS.

Μέθοδοι

επιλογή του δείγματος και την επεξεργασία

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review Mayo Clinic. Εμείς συμπεριέλαβε ασθενείς ορθού από τρεις πηγές: (1) Βιοτράπεζα για γαστρεντερικού Ερευνών Υγείας, μια προοπτική αποθήκη αποτελείται από σχολιασμένη biospecimens από άτομα με CRC που είχαν αξιολόγησης στη Mayo Clinic στο Rochester, MN από το Απρίλιο του 2000 μέχρι τον Αύγουστο του 2005 και ο οποίος συναίνεσε να είναι στο αποθετήριο? (2) του ορθού περιπτώσεις καρκίνου από μια προοπτικά συλλέγονται σειρά ασθενών CRC που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στη Mayo Clinic (Rochester, MN) από το Δεκέμβριο του 1995 μέχρι τον Απρίλιο του 1997 [10] και (3) μια προοπτική σειρά ασθενών CRC που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση από 1987 έως το 1988 [11]. Έχουμε επιλέξει 19 συμμετέχοντες με ορθού MSS με έναρξη σε ηλικία ≤50 ετών και οι οποίες ήταν είτε το στάδιο ΙΙ (Β2 ή νεότερη έκδοση) ή Στάδιο III. Επελέγησαν μόνο συμμετέχοντες με αίμα ή /και φυσιολογικό εντερικό επιθήλιο δείγματα και όγκων συλλέχθηκαν πριν από οποιαδήποτε χημειο ή ακτινοθεραπεία για τη μελέτη αυτή. DNA εκχυλίστηκε από λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος χρησιμοποιώντας το Gentra AutoPure εξαλάτωση χημεία (Gentra, Minneapolis, ΜΝ) και ποσοτικοποιήθηκε με απορρόφηση UV. ποιότητα του DNA εκτιμήθηκε με 260/280 αναλογία οπτικής πυκνότητας. κατάσταση MSI μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό της ανοσοϊστοχημείας και PCR βασίζεται ανάλυση του MSI. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για MLH1, MSH2, MSH6 και PMS2, και τις δοκιμές αστάθεια μικροδορυφόρου διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. δείκτες μικροδορυφορικού BAT26, D17S250? D5S346? ΚΑΣ, BAT40, ΒΔΤ 25, BAT 34C4, D10S197, MYCL και D18S55 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της κατάστασης MSI, και ένας όγκος ονομαζόταν MSS αν κανένας από τους δείκτες έδειξαν MSI και όλα immunostains έδειξε ανέπαφη την έκφραση των πρωτεϊνών MMR [13].

όγκου επεξεργασίας ιστού και την εκχύλιση του DNA για array CGH

τα κατεψυγμένα δείγματα όγκου χρησιμοποιήθηκαν για τις μελέτες array CGH. Πλήρους πάχους όγκου και φυσιολογικών του κόλου επιθηλιακών ιστών αποκόπηκαν από χειρουργικά δείγματα, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -70 ° C. Tissue τομής διεξήχθη σε κρυοστάτη στους -20 ° C. Όγκου ιστού ήταν μακρο-τεμαχίζεται για να εμπλουτίσουν για την πυκνότητα όγκου (& gt? Πυρήνες 70% του όγκου). Εν συντομία, ένα παχύ τμήμα κατεψυγμένων όγκων 6 micron έγινε χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και επισημαίνονται ως ένας οδηγός ολίσθησης από παθολόγο μας (TCS) για τον εντοπισμό περιοχών που περιέχουν ≥ 70% πυρήνες όγκου. Αυτή η διαφάνεια στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της περιοχής του αντίστοιχου κατεψυγμένου τεμαχίου όγκου με μόνο την περιοχή προορίζεται με 70% πυκνότητα όγκου να χωρισμένο για να χρησιμοποιηθεί ως πηγή ιστού όγκου για το DNA. Συνοδευτικά κανονικό βλεννογόνο του κόλου, ένα ελάχιστο 8 cm από το περιθώριο του όγκου, ήταν μικροδιατομή για επιθηλιακό ιστό. Οι τομές τοποθετήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης και γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από όγκο ή φυσιολογικό επιθήλιο κόλου DNA με εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο και ποσοτικά με απορρόφηση UV, και η ποιότητα του DNA εκτιμήθηκε με 260/280 αναλογία οπτικής πυκνότητας. Σε όλες τις περιπτώσεις, το DNA εκχυλίζεται από χημειοραδιοθεραπεία αφελή καρκίνου του ορθού.

array CGH

aCGH πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των φασματικών Chip ™ 2600 (Spectral Genomics, Houston, TX), το οποίο περιέχει 2600 BAC κλώνους στίγματα εις διπλούν. Αμφότερα τα εμπρός και αντίστροφη πειράματα σήμανσης έγιναν για κάθε δείγματα όγκων. Σήμανση και υβριδοποίηση διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για τη φασματική Chip ™ 2600. Εξαιρετικά καθαρή απιονισμένο H

2O χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή όλων των αντιδραστηρίων? Promega Male Genomic DNA (Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε ως αναφοράς DNA? Πειράματα με χρωστική αντιστροφή στην οποία 2 μικροσυστοιχίες εκτελέστηκαν για κάθε δείγμα με αμοιβαία επισήμανση της δοκιμής και αναφοράς DNA. Η δοκιμή και αναφορά ΟΝΑ τυχαίας εκκίνησης επισημαίνονται με συνδυασμό 2 μ§ γονιδιωματικού DNA και DDH

2O σε έναν συνολικό όγκο 50 μL και κατεργασίας με υπερήχους σε ανεστραμμένη συσκευή υπερήχων κύπελλο κέρατο για να ληφθούν θραύσματα 600 bp έως 10 kb σε μέγεθος. DNA καθαρισμού πραγματοποιήθηκε με Clean-up Kit Zymo του (Orange, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Το έκλουσης χωρίστηκε εξίσου μεταξύ 2 σωλήνων και, για το καθένα, 20 μί 2,5 × τυχαίων εκκινητών από BioPrime DNA Labeling Kit προστέθηκε Invitrogen του (Carlsbad, CA), αναμίχθηκαν καλά, βρασμένα 5 λεπτά και αμέσως τοποθετήθηκε σε πάγο για 5 λεπτά. Σε κάθε προστέθηκαν 0,5 μL Φασματική Labeling Buffer (Spectral Genomics), 1.5 μL Cy3-dCTP ή 1,5 μL Cy5-dCTP αντίστοιχες σε κάθε πείραμα χρωστική αναστροφής (PA53021, PA55021? Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), και 1 μL Klenow θραύσμα (BioPrime DNA Labeling Kit? Invitrogen). Τα περιεχόμενα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι σωλήνες ακολούθως αναθερμαίνεται σε βρασμό για 5 λεπτά και επιστρέφεται στον πάγο για 5 λεπτά. Ένα άλλο κλάσμα 5 μΙ του ρυθμιστικού διαλύματος επισήμανση προστέθηκε στο μίγμα και οι σωλήνες επωάστηκαν στους 37 ° C για άλλη μία ώρα. Στο τέλος της δεύτερης ώρας, προσθέτοντας 5 μL 0,5 Μ ΕϋΤΑ ρΗ 8.0 και επώαση των σωλήνων σε λουτρό ξηρού για 10 λεπτά στους 72 ° C διακόπτεται η αντίδραση επισήμανσης. μείγματα δειγμάτων και του DNA ελέγχου κατόπιν συνδυάστηκαν εντός του σωλήνα δείγματος, 45 ul του Hyb Ι (μπλοκάρισμα DNA και του φορέα σπέρματος σολομού DNA) προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα και 5 Μ NaCl και 100% ισοπροπανόλης προστέθηκαν στους σωλήνες για να καταβυθιστεί το DNA. σφαιρίδια DNA ξεπλύθηκαν με 70% αιθανόλη Χ1 και στη συνέχεια ξηραίνεται στο σκοτάδι. Μετά την εκ νέου ενυδάτωση των σφαιριδίων με νερό, HYBII (hybrisol) προστέθηκε στο μίγμα και το DNA μετουσιώθηκε για δέκα λεπτά στους 72 ° C και στη συνέχεια προ-υβριδοποιήθηκαν για 30 λεπτά πριν τοποθετηθούν στη συστοιχία και καλύπτεται με μία καλυπτρίδα 24X60mm . Τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε ένα φούρνο 37 ° C.

πλύσεις μετά τον υβριδισμό έγιναν με κάθε διαφάνεια σε επιμέρους βαθιά τρυβλία Petri σε μια κουνιστή επωαστήρα. Μετά την απομάκρυνση του καλυπτρίδα, τα πλακίδια συντομία εμποτισμένο με 0,5% SDS σε θερμοκρασία δωματίου. Κάθε slide μεταφέρθηκε στη συνέχεια σε 2XSSC, 50% απιονισμένο φορμαμίδιο ρΗ 7.5 για 20 λεπτά? τότε 2XSSC, 0,1% IGEPAL CA-630 ρΗ 7,5 επί 20 λεπτά ακολουθούμενη από 0.2XSSC ρΗ 7.5 για 10 λεπτά, κάθε προ-θερμαίνεται στους 50 ° C και αναδεύονται σε μία συσκευή επώασης στους 50 ° C. Τέλος, κάθε διαφάνεια ήταν εν συντομία ξεπλένονται σε δύο λουτρά της θερμοκρασίας δωματίου αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O και αμέσως φύσημα με πεπιεσμένο Ν

2 και σαρώνεται.

δεδομένων Array ανάλυση

Η σάρωση έγινε με GenePix 4000B μικροσυστοιχιών σαρωτή της Axon (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) και οι εικόνες αναλύθηκαν με GenePix Pro 3.0 για την προετοιμασία αρχεία δεδομένων για ανάλυση οικόπεδο με Spectralware V2.2 λογισμικό. (Spectral Genomics, Houston, ΤΧ). Κηλίδες που ορίζεται από την αυτόματη λειτουργία του δικτύου του λογισμικού και ρυθμίζονται χειροκίνητα όταν είναι απαραίτητο. Κηλίδες που δείχνει κανένα σήμα ή εμφανή ελαττώματα αποκλείστηκαν από την ανάλυση των δεδομένων, των τοπικών φόντο αφαιρέθηκε, και η συνολική ένταση, καθώς και οι αναλογίες ένταση φθορισμού των δύο βαφών, υπολογίστηκαν για κάθε κηλίδα. ανάλυση οικόπεδο έγινε χρησιμοποιώντας την online προσβάσιμη έκδοση του λογισμικού SpectralWare (Spectral Genomics) χρησιμοποιώντας παγκόσμια μέση κανονικοποίηση των δεδομένων. Επιπλέον, τα σύνολα δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Microsoft Excel. Μετά την εκτέλεση παγκόσμια μέση και την παγκόσμια την εξομάλυνση διάμεσος, οι μέσες αναλογίες τέσσερα σήματα φθορισμού (δύο σήματα από τη διπλή κλώνο στη συστοιχία και δύο σήματα από το χρώμα αντίστροφη πείραμα) για κάθε κλώνο υπολογίστηκαν. Όλη η ανάλυση έγινε σε log

2 αναλογίες. Για τη μείωση των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, οι κλώνοι που δείχνουν την αξία αναλογία δοκιμής /αναφοράς υψηλότερο από 1,2 θεωρήθηκαν αποκτήθηκε και οι κλώνοι που δείχνει την αξία αναλογία δοκιμής /αναφοράς χαμηλότερη από 0,8 θεωρήθηκαν χαμένα, αλλά μόνο αν τα αποτελέσματα και των τεσσάρων σημάτων φθορισμού ήταν συνεπής. Οι κλώνοι αποκλείστηκαν από την ανάλυση εάν οι τιμές αναλογία των τεσσάρων υβριδοποιημένων κηλίδων του κάθε κλώνου υπερβεί τις τιμές κατωφλίου (0.8-1.2) σε ένα μη συγκλίνουσες ύλη.

αξιολόγηση Ποσοτική PCR του μήκους των τελομερών

το μήκος των τελομερών εκτιμήθηκε στο DNA των όγκων από όλες ορθού περιπτώσεων καρκίνου και από άτομα με επαρκή φυσιολογικό επιθήλιο του κόλου DNA χρησιμοποιώντας DNA όπως παρασκευάστηκε για τη δοκιμασία CGH array [14 ]. Σε ένα τμήμα των περιπτώσεων, PBL DNA ήταν διαθέσιμο και εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας τις χημείες Gentra AutoPure όπως περιγράφεται παραπάνω.

Δύο κύρια μείγματα αντιδραστηρίων PCR ετοιμάστηκαν, το ένα με το ζεύγος εκκινητών Τ, το άλλο με το ζεύγος S αστάρι. Δεκαπέντε μικρολίτρα του κύριου μίγματος Τ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο δείγματος, ελέγχουν καλά και τυπική καμπύλη φρεάτιο της πρώτης πλάκας και 15 μΙ του κύριου μίγματος S προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο δείγματος, ελέγχουν καλά και τυπική καμπύλη φρεάτιο της δεύτερης πλάκας.

Για κάθε δείγμα αναλύθηκε, τρία πανομοιότυπα δείγματα 5 μΐ του δείγματος DNA (15 ng /κλάσμα) προστέθηκαν σε πλάκα 1 και ένα 3 δείγματα προστέθηκαν στην ίδια θέση και στην πλάκα 2. Για κάθε πρότυπο καμπύλη , ένα δείγμα αναφοράς DNA αραιώθηκε διαδοχικά σε ΤΕ με 1: 2 φορές ανά αραίωση για να παράγουν έξι συγκεντρώσεις DNA κυμαινόμενες από 0,78 έως 25 ng /μl.

Πέντε μικρολίτρα από κάθε συγκέντρωση διανεμήθηκε στα τυποποιημένα φρεάτια καμπύλη σε κάθε πλάκα. Οι πλάκες στη συνέχεια σφραγίζεται με ένα διαφανές συγκολλητικό κάλυμμα, φυγοκεντρήθηκαν εν συντομία σε 800 g και μεταφέρονται επί πάγου στο όργανο ΑΒΙ 7900HT για ανάλυση.

Ο Τ και S PCRs παρασκευάστηκαν με τον ίδιο τρόπο με την εξαίρεση των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Οι τελικές συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων στην PCR ήταν 20 mM Tris-HCl, 0,2 mM κάθε dNTP, 2,0 mM MgCl², 1% DMSO, 150 βαφή ROX ηΜ, 0,2Χ SYBR Green Ι (Molecular Probes), 5 mM DTT, 1.25 U AmpliTaq Gold ϋΝΑ πολυμεράση (Applied Biosystems). Οι τελικές συγκεντρώσεις των τελομερών έναυσμα ήταν τηλ 1β, 600 nm? τηλ 2β 900 nm. Το γονίδιο ελέγχου (Β2-σφαιρίνης στις 11 χρωμόσωμα) συγκεντρώσεις ήταν HBB1 300 nm? HBB2 700 nm. Οι αλληλουχίες των εκκινητών (γραπτή 5 – 3 ‘) ήταν τηλ 1β: CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT?

τηλ 2β: GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT?

HBB1: GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC?

HBB2: CACCAACTTCATCCACGTTCACC.

Όλες οι PCR διεξήχθησαν στο ΑΒΙ Fast Real-Time 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι συνθήκες θερμικού κύκλου και για τα δύο ζεύγη εναρκτήρων ξεκίνησε με επώαση στους 95 ° C για 10 λεπτά για να ενεργοποιηθεί το AmpliTaq Gold DNA πολυμεράση. Για τελομερών PCR, αυτό ακολουθήθηκε από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 54 ° C για 2 λεπτά. Για την HBB PCR, αυτό ακολουθήθηκε από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 60 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Τα δεδομένα στην συνέχεια αναλύθηκαν με το λογισμικό ΑΒΙ SDS για τη δημιουργία της πρότυπης καμπύλης για κάθε πλάκα.

Μεθοδολογία για ΑΒΙ 7900HT χρησιμοποιώντας SYBR Green Dye 1

Το SYBR Green 1 διπλό Stranded Dye δέσμευσης δεσμεύεται μη-ειδικά με dsDNA και δημιουργεί ένα προφίλ εκπομπής διέγερσης. Για την ποσοτική PCR, SYBR Green 1 χρησιμοποιήθηκε με μια βαφή παθητική αναφοράς (ROX). Το όργανο 7900HT ανέλυσε τον κύκλο στην αλλαγή του κύκλου του σήματος φθορισμού, ως αποτέλεσμα της ενίσχυσης κατά τη διάρκεια μιας PCR. Κατά την κανονική ενίσχυση του προϊόντος PCR τρεις περιοχές χαρακτηρίζουν την πρόοδο της PCR.

τελομερούς ανάλυση μήκους

τελομερούς μήκη μετριέται με PCR συχνά αναφέρεται ως λόγος της τυπικής γονίδιο (S) μετρήσεις (T /S) των τελομερών (Τ) και. Καθώς το μήκος ζεύγος βάσεων είναι διαισθητικά εύκολο να καταλάβει, οι αναλογίες μετατράπηκαν σε μήκος ζεύγος βάσεων χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως επικυρωθεί τύπο που αναφέρθηκαν με την τεχνική με την Cawthon περιγράφεται παραπάνω [14]. Τα αποτελέσματα των στατιστικών ελέγχων συγκρίνοντας ομάδες είναι το ίδιο αν χρησιμοποιούνται αναλογίες του Τ /S ή το μήκος των τελομερών. Καθώς το μήκος ζευγών βάσεων είναι διαισθητικά πιο εύκολο να καταλάβουμε, κηλίδες Southern διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί θραύσμα περιορισμού των τελομερών (TRF) μήκος σε ένα υποσύνολο των συμμετεχόντων (n = 16) και μία γραμμική παλινδρόμηση χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση μήκος TRF με την αναλογία T /S , με αποτέλεσμα την ακόλουθη εξίσωση: bp = [T /S] * 1470,8 + 7674,5 όπου 1470,8 παριστάνει την κλίση της γραμμής σύγκριση της σχετικής αναλογίας Τ /S για τη μέτρηση του μήκους των τελομερών σε ζεύγη βάσεων από τη μέση TRF και 7674.5 είναι η y τομής.

μετάλλαξη p53 ανάλυση

Επαρκείς ποσότητες όγκου DNA ήταν διαθέσιμα από 17 από τους 19 όγκους για να ελέγξετε για σωματικές μεταλλάξεις p53. ενίσχυση

Η PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν συνολικό όγκο 12,5 μΙ που περιείχε 5 ng γενωμικού DNA, κάθε εκκινητή στα 0.2 mM, dNTP στα 0.2 mM, 2.0 mM MgCl

2, 0.5 U Taq πολυμεράσης (AmpliTaq Gold, Applied Biosystems, CA) με ρυθμιστικό διάλυμα αντιδράσεως PCR που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Η μετουσίωση υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (DHPLC) αναλύσεις που ακολουθείται από την άμεση αλληλούχιση των προϊόντων PCR πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (14).

Η κωδικοποιητική αλληλουχία και οι θέσεις σύνδεσης ματίσματος του

ΤΡ53

εξώνια 5-8 ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας 4 ζεύγη ενδονικά εναύσματα ως εξής:

Exon5F 5 ‘GCC GTC TTC CAG TTG CTT 3’

Exon5R 5 ‘ΥΠΑ CCA GCC CTG TCG TCT CT 3’

Exon6F 5 ‘GGG GCT GGA GAG ACG ACA 3’

Exon6R 5 ‘TCC TCC CAG AGA CCC CAG ΤΤ 3’

Exon7F 5 ‘CTT GCC ACA GGT CTC CCC AA 3 ‘

Exon7R 5′ ΑΓΓ GGT CAG CGG CAA GCA GA 3 ‘

Exon8F 5′ ΑΑΑ ΤΟΟ GAC AGG TAG GAC 3 ‘

Exon8R 5′ AAG TGA ATC TGA GGC ΑΤΑ AC 3 ‘

Η

Όλα PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα όγκο αντίδρασης 25 μΐ που αποτελείται από 10Χ PCR ρυθμιστικό διάλυμα II (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2 mM MgCl2, 2.5 mM από κάθε dNTP, 10 μΜ από κάθε εκκινητή, 0,75 μονάδες Taq πολυμεράση AmpliGold DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA), και 10 ng του εκμαγείου DNA. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια Tetrad θερμικό κυκλοποιητή (MJ Research, Waltham, ΜΑ) με τις ακόλουθες συνθήκες: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 9 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, (58 ° C για 30 δευτερόλεπτα εξόνια 5,6,7) και (55 ° C για το εξόνιο 8), 72 ° C για 45 δευτερόλεπτα, και τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διέτρεξαν επί πήγματος αγαρόζης 2% έλεγχο. PCR προϊόντα που παρασκευάζονται για αλληλούχηση του DNA όπως ακολουθεί: 5 μΐ προϊόντος PCR με 1 μΙ κάθε εξωνουκλεάση και 10Χ γαρίδας αλκαλική φωσφατάση TUF ρυθμιστικό κατόπιν έτρεξε σε ένα θερμικό ανακυκλωτή Tetrad με τους ακόλουθους όρους: 37 ° C για 15 λεπτά, 80 ° C για 15 λεπτά. 1.6pmol του εκκινητή, μαζί με το πρότυπο αλληλουχήθηκαν στην ™ 3700 DNA Analyzer ΑΒΙ PRISM (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA 94404) στον μηχανισμό Core. Μετάλλαξη Surveyor λογισμικό (SoftGenetics LLC, State College, PA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των αποτελεσμάτων.

Αξιολόγηση της ενεργοποίησης της τελομεράσης στο CRC

δραστηριότητα της τελομεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το τραπέζιο

ανίχνευσης TM τελομεράσης εργαλειοθήκη. (Chemicon International). Macrodissected ιστός του όγκου ομογενοποιήθηκε σε 200 μΙ 1χ ρυθμιστικού λύσης CHAPS, στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά επί πάγου και φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C και 12.000 g για 20 λεπτά. Σε 2,0 μΙ αυτού του υπερκειμένου, 5.0 μΐ 10Χ ρυθμιστικού TRAP, 1,0 μΙ ενός μίγματος 10x d-ΝΤΡ, 1.0 μΙ μείγματος TS εκκινητή και 0,4 μΐ πολυμεράσης TaqDNA προστέθηκε σε ένα συνολικό όγκο 50 μΙ. επέκταση τελομερούς στους 30 ° C για 10 λεπτά ακολουθήθηκε από 30 κύκλους PCR στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα. 10 μΙ του προϊόντος PCR υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 12% και χρωματίστηκαν με SYBR

TM χρυσό (Molecular Probes, Eugene, OR). Η γέλη φωτογραφήθηκε με μια συσκευή υπεριώδους και σκάλα. δράση της τελομεράσης εκφραστεί ως ο λόγος μεταξύ του συγκροτήματος σκάλα του προϊόντος PCR και του εσωτερικού ελέγχου.

Αξιολόγηση της ALT

τελομερή C-Circle DNA είναι μερικώς μονόκλωνο DNA κύκλοι των τελομερών ειδικά για κύτταρα εμφανίζουν ALT [15]. C-κύκλοι εκτιμήθηκαν στο DNA του όγκου χρησιμοποιώντας ισοθερμικές ενίσχυση C-κύκλο συμπληρωματικού κλώνου και υβριδοποίησης με

32Ρ-(CCCTAA)

3 ανιχνευτή από την Capital Βιοεπιστημών (Capital Βιοεπιστημών, Maryland, USA). Ένα δείγμα DNA κλήθηκε ALT + αν ανιχνεύθηκαν C-κύκλους. C-κύκλοι είναι εξωχρωμοσωματικό DNA τελομερικού αποτελείται από εν μέρει διπλού τελομερικού κύκλους έλικας με ένα μερικώς διπλής έλικας του DNA τελομερικού με συνεχή C πλούσια σκέλος και πλούσια ελλιπής G σκέλος. C-κύκλοι συνδέονται στενά με την παρουσία της ALT [15].

Αναλυτική προσέγγιση

Για να αποδείξουν την ιδιότητα CIN βασίζεται σε χρωμοσωμικές κέρδη ή ζημίες, τα δεδομένα αναλύθηκαν στην έρευνα με τη χρήση του πακέτου aCGH από Bioconductor [16].

Στο φιλτράρισμα για την απομάκρυνση unmapped κλώνους, οι κλώνοι χαρτογράφηση στο χρωμόσωμα Υ, και οι κλώνοι που λείπει περισσότερο από το 25% των ατόμων. Στη συνέχεια, το τεκμαρτό λείπει παρατηρήσεις χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση Lowess. Το κλάσμα των συμμετεχόντων με κέρδη ή ζημίες από κάθε κλώνο χαράσσεται με βάση τον αριθμό των χρωμοσωμάτων και την τοποθεσία, με CIN κατάσταση (Σχήμα S1).

Επιπλέον, το τεστ Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της διαφοράς σε CRC μήκος των τελομερών των όγκων μεταξύ: 1) CIN + και δείγματα CIN- καρκίνο του ορθού, 2) ALT + και ALT-, και 3) τελομεράσης + και telomerase- δειγμάτων [17]. Chi-τετράγωνο δοκιμές ή ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της συσχέτισης μεταξύ της κατάστασης της ALT και το καθεστώς CIN, καθώς και μεταξύ της κατάστασης ενεργοποίησης της τελομεράσης και την κατάσταση CIN. Η συσχέτιση Spearman μεταξύ του ορθού όγκων καρκίνου του μήκους των τελομερών και το ποσοστό του κλώνου με κέρδη ή ζημίες υπολογίστηκε.

Αποτελέσματα

array CGH εκδήλωσε εκτεταμένη μεταβολή του αριθμού αντιγράφων του DNA αλλάζει

μελετήσαμε 19 νέους έναρξης MSS του ορθού για ενδείξεις CIN χρησιμοποιώντας aCGH αποτελείται από περίπου 3000 ΠΑ. Δείξαμε ότι υπάρχουν ορθού όγκοι MSS που έχουν πολύ χαμηλά επίπεδα αριθμός αλλαγών αντιγράφων του DNA. Έξι όγκοι (32%) είχαν χαμηλά επίπεδα των χρωμοσωμικών διακοπής με & lt? 1% έως 17% των κλώνων που έχει αριθμό αντιγράφων του DNA αλλαγές και ταξινομήθηκαν ως CIN- με aCGH. Δεκατρείς όγκους (68%) είχαν & gt? 20% των κλώνων που δείχνει τον αριθμό αντιγράφων του DNA αλλαγές και ταξινομήθηκαν ως ομάδα CIN +. MSS CIN- όγκοι είχαν το 0 έως λιγότερα από 5 χρωμοσωμικές τα όπλα που είχαν εντελώς κερδίζεται ή χάνεται, σε σύγκριση με την ομάδα CIN + που είχε 8 έως 18 χρωμοσωμική όπλα που δείχνει πλήρη κέρδους ή ζημίας (Εικόνα S2).

Το ποσοστό των κερδών ή ζημιές στον καρκίνο του ορθού CIN + και CIN-

Το κλάσμα των συμμετεχόντων με κέρδη και ζημίες ανά χρωμοσωμική περιοχή για άτομα με CIN + καρκίνο του ορθού σε σύγκριση με εκείνους με CIN- καρκίνο του ορθού εμφανίζονται στο Σχήμα S1. Οι διαφορές σε κέρδη ή ζημίες που παρατηρήθηκαν σε όλο το γονιδίωμα, με τις πιο έντονες διαφορές στα χρωμοσώματα 13, 17 και 18. CIN + καρκίνο του ορθού είχε περισσότερα κέρδη /ζημίες από CIN- καρκίνου του ορθού (μέση τιμή: 33.1 vs 9,7, p = 0.0007, Πίνακας 1 ).

Η CIN +

CIN-

Η μέση (SD) ή% Μέσος όρος (SD) ή% p-valueFraction κέρδη /ζημίες, σημαίνει (SD) 33.08 (8,76) 9,66 (7,92) 0,0007 το μήκος των τελομερών, σημαίνει (SD) 8211 (308) 9178 (1396) 0.0066Telomerase0.0949 Yes80.0% 25,0% No20.0% 75,0% ALT0.2335 Yes50.0% 100,0% No50.0% 0,0% Yes36 p530.3348 0,4% 66,7% No63.6% 33,3% Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά των CIN + και CIN- καρκίνο του ορθού

παχέος όγκους του καρκίνου αξιολογείται με array CGH είχαν ταξινομηθεί ως 1) CIN- αν & lt?. 20% των κλώνων έδειξε αντιγράφων του DNA αριθμό αλλαγών, είτε 2) CIN + αν ≥ 20% των κλώνων έδειξε DNA αντιγραφή αριθμό αλλαγών. CIN + CRC είχαν υψηλότερο αριθμό περιπτώσεων που εμφάνισαν κέρδη και οι ζημίες ανά χρωμοσωμική περιοχή σε σύγκριση με εκείνες των CIN- CRC. CIN + CRC έχει σημαντικά μικρότερη τελομερή όγκου (8211 bp) από CIN- CRC (9178 bp? P = 0.0066). CIN + όγκοι ήταν πιο πιθανό να παρουσιάσουν την ενεργοποίηση της τελομεράσης από ήταν CIN- CRC, αν και δεν υπήρχε καμία συσχέτιση με την κατάσταση CIN ενός όγκου και πόσο συχνά ένας όγκος που χρησιμοποιείται εναλλακτική επιμήκυνση των τελομερών ως μηχανισμός διατήρησης των τελομερών (p = 0,2335). Η παρουσία των μεταλλάξεων ρ53 δεν συσχετίζονται με την κατάσταση CIN του όγκου (p = 0,3348). CSV Λήψη CSV

το μήκος των τελομερών σε CIN + και CIN- καρκίνο του ορθού

ορθού καρκίνου του μήκους των τελομερών σχετίζεται σημαντικά με την ιδιότητα του CIN, έτσι ώστε CIN- καρκίνου του ορθού είχαν πλέον τελομερή από CIN + ορθού (p = 0.0066, Φιγούρα 1). το μήκος των τελομερών επίσης συσχετίστηκε σημαντικά με το ποσοστό των κλώνων με κέρδη ή ζημίες (r = -0.50, p = 0,0310).

Πίνακας Α: Το μήκος των τελομερών του DNA στο χρωμόσωμα του όγκου σε σταθερή καρκίνου του ορθού (CIN-) είναι σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των χρωμοσωμικά ασταθών καρκίνου (CIN +) ορθού (p = 0,0066). κατάσταση CIN προσδιορίζεται ως CIN- αν από & lt? 20% των κλώνων δείχνουν DNA κέρδη ή ζημίες αριθμό αντιγράφων. Ορθού είναι CIN + εάν περισσότερο από το 20% των κλώνων έχουν κέρδη ή ζημίες.

Πίνακας Β: Ενεργοποίηση της τελομεράσης (τελομεράση +) στον καρκίνο του ορθού συσχετίζεται με μικρότερο μήκος των τελομερών των όγκων από ό, τι σε όγκους που δεν χρησιμοποιούν τελομεράσης (τελομεράση -), ως μηχανισμός συντήρησης τελομερούς (p = 0,0040)

Μεταξύ των όγκων CIN-, τελομερή ήταν πλέον στο DNA του όγκου σε σύγκριση με το αντίστοιχο φυσιολογικό κύτταρο DNA τους επιθηλιακά. Σε αντίθεση, τα τελομερή στο DNA του όγκου CIN + ήταν μικρότερη από εκείνες στις αντίστοιχο φυσιολογικό DNA επιθήλιο. (Ρ = 0,0039).

αξιολογηθεί περαιτέρω εάν οι διαφορές στο μήκος των τελομερών ή την κατάσταση CIN μπορεί να σχετίζεται με την ενεργοποίηση της τελομεράσης ή ALT. Παρατηρήσαμε ότι οι όγκοι με μικρότερα τελομερή ήταν πιο πιθανό να έχουν ενεργοποίηση της τελομεράσης (p = 0,0040? Σχήμα 1, Πίνακας Β) αλλά το μήκος των τελομερών όγκου δεν συσχετίζεται με την παρουσία του ALT (p = 0,4923? Πίνακας 2). CIN + όγκοι ήταν πιο πιθανό να παρουσιάσουν την ενεργοποίηση της τελομεράσης από ήταν CIN- όγκους (p = 0,0949? Πίνακα 1], αλλά δεν υπήρχε διαφορά στα κέρδη /ζημίες μεταξύ CRC με την ενεργοποίηση της τελομεράσης και CRC χωρίς ενεργοποίηση της τελομεράσης (p = 0,3168? Πίνακα 1 .) Το αντίστροφο ήταν αλήθεια σε σχέση με ALT CIN- όγκοι ήταν τόσο πιθανό όσο CIN + όγκων να παρουσιάζουν ενδείξεις ALT (p = 0,2335?. πίνακα 1) αν οι όγκοι που ήταν ALT- είχε περισσότερα κέρδη /ζημίες από ALT + CRC (μέση : 39.3 vs 22.6, p = 0,0091? Σχήμα 2, Πίνακας 2) όγκοι που επιμηκυνθεί τελομερών μέσω παρουσίασαν σχηματισμό C-Circle δεν εμφανίζονται στο ALT- όγκους (Σχήμα 3)

Η τελομερούς Μήκος

κλάσμα κέρδη.. /Ζημιές

Η μέση (SD)

p-value

Μέση (SD)

p-value

CIN Status0.00660.0007 CIN + 8211 (308) 33.1 (8.8) CIN- 9178 (1396) 9,7 (7,9) Telomerease0.00400.3168 Yes8193 (295) 28,8 (14,3) No9307 (1512) 19,2 (16,4) ALT0.49230.0091 Yes8676 (1208) 19,6 (13,5) No8226 (397) 38,7 (7,9) p530.54140.7726 Yes8443 (370) 26,3 (17,0) No8676 (1281) 22,9 (12,0) Πίνακας 2. τελομερούς μήκος και το κλάσμα του κλώνου κέρδη /ζημίες από τα χαρακτηριστικά του όγκου.

ορθού καρκινικούς όγκους αξιολογήθηκε με array CGH είχαν ταξινομηθεί ως 1) CIN- αν & lt ? 20% των κλώνων έδειξε DNA αντιγραφή αριθμό αλλαγών, είτε 2) CIN + αν ≥ 20% των κλώνων έδειξε DNA αντιγραφή αριθμό αλλαγών. Όγκοι με μικρότερα τελομερή ήταν πιο πιθανό να είναι CIN + (p = 0,0066) και να έχει ενεργοποιηθεί τελομεράσης (p = 0,0040). Ούτε η παρουσία εναλλακτικών επιμήκυνση των τελομερών (ALT) (p = 0,4923), ούτε η παρουσία της κατάστασης μετάλλαξης ρ53 συσχετίζεται με το μήκος των τελομερών του όγκου (p = 0,5414). CIN + καρκίνο του ορθού είχαν υψηλότερο ποσοστό των κλώνων που εμφάνισαν κέρδη και ζημίες από CIN- όγκους (p = 0,0007). Οι όγκοι με ή χωρίς ενεργοποίηση της τελομεράσης δεν έχουν σημαντικά διαφορετικό μέρος των κερδών ή ζημιών των κλώνων (p = 0,3168). Ωστόσο, για όγκους που παρουσιάζουν ALT το κλάσμα των κερδών και ζημιών των κλώνων ήταν χαμηλότερη από εκείνη των όγκων χωρίς ALT αποδείξεις (p = 0,0091) .Δεν διαφορά παρατηρείται στο κλάσμα του κλώνου κέρδη ή ζημιές μεταξύ των όγκων με ή χωρίς μεταλλάξεις p53 ( p = 0,7726). CSV Λήψη CSV

Οι όγκοι που ήταν ALT- εμφάνισαν σημαντικά περισσότερα χρωμοσωμικές κέρδη /ζημίες από ALT + καρκίνο του ορθού (p = 0,0091).

Η

Πίνακας Α αιματοξυλίνη και τομές ιστού Ηωσίνη από ένα MSS CIN- , ALT +, καρκίνο του ορθού Telomerase- (αριστερά) και από την MSS CIN +, ALT-, τελομεράση + καρκίνο του ορθού. Και οι δύο είναι μετρίως διαφοροποιημένων αδενοκαρκινώματα.