Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) είναι σύντομες λανθάνον μη κωδικοποιητική ενιαία RNAs που καταστέλλουν τη γονιδιακή έκφραση μέσω κάθε μεταγραφική καταστολή ή την υποβάθμιση των mRNA στόχου. Η ανόπτηση μεταξύ αγγελιοφόρων RNA και 5 ‘περιοχή του σπόρου miRNAs πιστεύεται ότι είναι απαραίτητη για την ειδική καταστολή της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Κάποιος miRNA μπορεί να έχει πολλές εκατοντάδες διαφορετικούς στόχους σε ένα κύτταρο. Γρήγορα συσσωρεύονται τα στοιχεία δείχνουν ότι πολλά miRNAs που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και κατά συνέπεια παίζουν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εισαγωγή συνθετικών miR-107 ή miR-185 κατέστειλε την ανάπτυξη του οι ανθρώπινοι μη μικροκυτταρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές πνεύμονα. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε αυτά τα miRNAs επάγει μία G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε Η1299 κυττάρων και την καταστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου είναι ισχυρότερη από ότι με Let-7 miRNA. Από το γονίδιο αναλύσεις έκφρασης με μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων, βρίσκουμε εκατοντάδες γονίδια που επηρεάζονται από την επιμόλυνση αυτών των miRNAs. Χρησιμοποιώντας πρόβλεψης miRNA-στόχο αναλύσεις και τα δεδομένα πίνακα, έχουμε παρατίθενται μια σειρά από πιθανούς στόχους του miR-107 και miR-185 για τη σύλληψη του κύκλου G1 κύτταρο και να επικυρώσει ένα υποσύνολό τους χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και ανοσοαποτύπωση για CDK6.

Συμπεράσματα /Σημασία

Εντοπίσαμε ρύθμιση miRNAs, miR-107 και miR-185 νέα του κυτταρικού κύκλου, εντοπίζεται σε μεταβάλλονται συχνά χρωμοσωμικές περιοχές σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα. Ειδικά για miR-107, ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται οι σχολιασμένη με τον όρο οντολογίας γονιδίων «κυτταρικού κύκλου». Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτά τα miRNAs μπορούν να συμβάλλουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα κακοήθεις όγκους

Παράθεση:. Takahashi Υ, Forrest ARR, Maeno Ε, Hashimoto Τ, Πασαλείβω CO, Yasuda J (2009) MiR-107 και MiR -185 μπορεί να προκαλέσει κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε Ανθρώπου μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 4 (8): e6677. doi: 10.1371 /journal.pone.0006677

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24, Ιουνίου του 2009? Αποδεκτές: 17 Ιουλίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 18 Αύγ 2009

Copyright: © 2009 Takahashi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Research Grant για RIKEN Γονιδιωματική Science Center από MEXT να Yoshihide Hayashizaki, Grant για το Σύστημα έρευνας RIKEN Frontier, Λειτουργική έρευνα RNA πρόγραμμα για YH και Grant-in-βοήθειας για την Επιστημονική Έρευνα στην Ι.Υ. ARRF υποστηρίζεται από ένα CJ Martin υποτροφία από την αυστραλιανή NHMRC (ID 428261). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

miRNAs είναι 19 έως 23 βάσεων μακρύ λανθάνον RNAs και μόνο που παίζουν κρίσιμο ρόλο στις βιολογικές διεργασίες [1]. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων των miRNAs συχνά εξελικτικά διατηρημένες μεταξύ πολυκύτταρους οργανισμούς [2]. Τα miRNAs εκφράζονται ως σχήμα φουρκέτα δίκλωνο προ-miRNAs και διαδοχική επεξεργασία από διαφορετικά ένζυμα RNase III, Drosha και Dicer, δημιουργεί ώριμο miRNA [3] .Η ώριμη miRNA συνδέεται με μια σειρά από πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων Agonaute, για να σχηματίσουν ένα miRNA που προκαλείται φίμωση συγκρότημα (miRISC). Η miRISC πιστεύεται ότι κάνει ένα σύμπλοκο με αγγελιοφόρων RNA στόχο και μετα-μεταγραφικά καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων στόχων. Ο μηχανισμός δράσης του miRISC εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενη [4], ωστόσο, υπάρχει μια γενική συναίνεση ότι η πλειοψηφία των αγγελιοφόρων RNA στόχου έχουν θέσεις δέσμευσης για τους miRNAs στην 3 ‘αμετάφραστες περιοχές. Από το δεύτερο με έγδοης βάσεις του 5 ‘άκρου αλληλουχία των miRNA ονομάζεται ακολουθία εκκίνησης και πιστεύεται ότι είναι απαραίτητο για την αναγνώριση των αγγελιοφόρων RNA στόχου με miRNAs.

Έχει γίνει προφανές ότι ορισμένοι miRNAs παίζουν κρίσιμο ρόλο στη η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε συνεργασία με τις ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου (βλέπε ανασκόπηση [5], [6]). Ένα παράδειγμα της ρύθμισης των miRNA κυτταρικού κύκλου είναι η

ας-7

(για

HSA-ας-7α

, MIMAT0000062). Η εισαγωγή του συνθετικού προ-ας-7 προκαλεί τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα [7]. Πολλοί miRNAs είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω γονίδια που σχετίζονται κυτταρικού κύκλου. Το σύμπλεγμα miR-17~92 αναγνωρίστηκε ως το προς τα κάτω του

MYC

ογκογονιδίου [8] και ρυθμίζουν προς τα κάτω παραγόντων μεταγραφής E2F τα οποία είναι γνωστά μεσολαβητές της προόδου του κυτταρικού κύκλου [9] .Another σημαντικό γονίδιο που σχετίζονται όγκου, η

TP53

, επάγουν την έκφραση του miR-34 μέλη της οικογένειας και η υπερέκφραση του miR-34 προκάλεσε τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 [10] – [16]

Εδώ αναφέρουμε. δυναμικό του κυτταρικού κύκλου ρύθμιση miRNAs κατά τη διάρκεια της αναζήτησης της που σχετίζονται με τον καρκίνο miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη επανεξετάσουμε μια σειρά από περιοχές του γονιδιώματος που προσδιορίζονται από τον Zhao

et al

. που είναι ενισχυμένο ή διαγράφονται στους ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα [17]. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, διαπιστώσαμε ότι

miR-107

(MIMAT0000104) και

miR-185

(MIMAT0000455) καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό σε κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Προσπαθήσαμε να χαρακτηρίζει κατάντη αγγελιαφόρο RNA στόχος αυτών των miRNAs με τη χρήση μικροσυστοιχιών προφίλ γονιδιακής οντολογίας αναλύσεις και προβλέψεις TargetScan [18].

Αποτελέσματα

Η έκφραση του miR-31, 107, και 185 στη συλλογή ανθρώπινων ιστών συμπεριλαμβανομένων των γραμμών ιστό καρκίνου του πνεύμονα και κυττάρων

από τις περιοχές που προσδιορίζονται από τον Zhao

et al

. [17], βρήκαμε 13 και 26 σχολιασμένο miRNAs στην ομόζυγο διαγραφεί και ενισχυμένες περιοχές αντίστοιχα (συμπληρωματικό πίνακα S1). Επειδή πολλά από τα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο συμβάλλουν στην κακοήθη μετασχηματισμό σε ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων, εμείς προτεραιότητα miRNAs που έχουν ενοχοποιηθεί σε άλλους ανθρώπινους καρκίνους τύπου ενηλίκων. Στη συνέχεια, εμείς επιλέξαμε τρεις miRNAs: miR-107, miR-185 και miR-31 (MIMAT0000089) [19] – [22]. Προσθέσαμε την αφήσουμε-7α για την κυτταρική ανάπτυξη και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, διότι το miRNA μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων στα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών [23] και να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη HepG2 κυτταρική σειρά [7].

Χρήση Taq-Man ποσοτική τεχνολογία RT-PCR, μετρήσαμε την έκφραση των τεσσάρων miRNAs στο ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549 και Η1299 και σε ένα πάνελ εμπορικώς διαθέσιμων RNAs από φυσιολογικά δείγματα καρκινικού ιστού και των πνευμόνων (Εικ. 1). Τα περισσότερα από τα miRNAs έδειξαν σχετικά πανταχού παρούσα έκφραση μεταξύ υγιών ιστών (Εικ. 1). Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση των αναλυθέντων miRNAs (MIR-107, 185, και αφήστε-7α) ήταν χαμηλότερα στις γραμμές όγκου πνεύμονα και καρκίνο του πνεύμονα από ό, τι στην κανονική του πνεύμονα. Το miR-31 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

επίπεδα έκφρασης miRNA μετρήθηκαν με miRNA TaqMan qRT-PCR σε φυσιολογικό πνεύμονα, του εγκεφάλου, της υπόφυσης, το ήπαρ και τους ιστούς των ωοθηκών, ένα δείγμα όγκου του πνεύμονα και επίσης στις κυτταρικές γραμμές όγκου πνεύμονα, Η1299 και Α549. Ο κάθετος άξονας δείχνει την σχετική έκφραση της κάθε miRNA κανονικοποιούνται με εκείνη του RNU44.

Η

καταστολή της ανάπτυξης και διακοπή του κυτταρικού κύκλου από την υπερβολική έκφραση των υποψήφιων miRNAs σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Η επίδραση αυτών των miRNAs επί του πολλαπλασιασμού ελέγχθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ με προ-miRNA επιμολυσμένα κύτταρα Η1299 και Α549. Η επιμόλυνση του HSA-miR-107 και HSA-miR-185 μείωσε δραματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2). Στην περίπτωση των Η1299 κυττάρων, τα miRNA let-7α έδειξαν μειωμένη σημαντικά τον πολλαπλασιασμό ενώ τα αποτελέσματα ήταν λιγότερο έντονα σε κύτταρα Α549. Η έκταση της καταστολής της ανάπτυξης των Α549 με let-7α είναι παρόμοια με εκείνη των αναφερθέντων [7]. Το miR-31 έδειξε ελαφρά καταστολή της ανάπτυξης κυττάρου, αλλά τα επίπεδα καταστολής δεν ήταν στατιστικά σημαντικές σε πολλά χρονικά σημεία για τα δύο από τα κύτταρα (Εικ. 2).

Ανάπτυξη καταστολή επίδραση του υποψηφίου miRNA επιμολύνσεων σε Η1299 (αριστερά πίνακας) και Α549 (δεξιός πίνακας), όπως μετράται με ΜΤΤ δοκιμασία. Ο κάθετος άξονας δείχνει τη σχετική αναλογία του A450 nm: ότι από την ημέρα 0 κάθε κυττάρου ως 1. Σημείωση miR-107 και miR-185 καταστέλλει πολλαπλασιασμό σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές

Η

ανάλυση περιεχομένου DNA με. κυτταρομετρία ροής έδειξε την επιμόλυνση του HSA-miR-107 και HSA-miR-185 προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου, σε παρόμοια επίπεδα ως έλεγχος ας-7a ενώ ένα κωδικοποιημένο αρνητικός μάρτυρας δεν το έκανε (Εικ. 3). Δεν παρατηρήσαμε ούτε οποιαδήποτε προφανή αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 στην κυτταρομετρία ροής ή οποιαδήποτε απόπτωση που σχετίζονται μορφολογικές αλλαγές, όπως η πυρηνική διόγκωση και συμπύκνωση, κάτω από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι η καταστολή της ανάπτυξης που επάγεται από HSA-miR-107 και HSA-miR-185 διαμόλυνση προκλήθηκε από την επαγωγή της G1 σύλληψης και όχι απόπτωση.

Τα ιστογράμματα των περιεχομένων DNA που λαμβάνονται με ανάλυση FACS δεικνύονται. Τα ποσοστά κάθε σταδίων του κυτταρικού κύκλου φαίνεται στο ένθετο των ιστογραμμάτων. Δεν υπήρχε πύλη που εφαρμόζονται στα γεγονότα, έτσι ώστε δεν υπήρχε προφανής συσσώρευση των πληθυσμών sub-G1 σε όλα τα πειράματα.

Η

Αναγνώριση των mRNAs υποψήφιος στόχος των miRNAs με γονιδιακή προφίλ ανάλυση

Το προφίλ μικροσυστοιχιών έγινε για να καθορίσει τις παγκόσμιες αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης mRNA σε Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με miRNAs κατασταλτική της ανάπτυξης σε σύγκριση με ένα αρνητικό έλεγχο. Στο HSA-miR-107, HSA-miR-185 και HSA ας-7α-επιμολυσμένα κύτταρα υπήρχαν 561, 646 και 812 μεταγραφές κάτω-ρυθμίζονται και 608, 698 και 949 ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά 1,5 φορές ή μεγαλύτερη, αντίστοιχα. ανάλυση Gene Ontology διεξήχθη επί των γονιδίων ρυθμισμένων προς τα κάτω στις transfectans. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένη όρους GO για τα κάτω γονιδίων που ρυθμίζονται με κάθε miRNA. Οι κορυφαίοι πέντε όροι σε γονίδια κάτω-ρυθμίζονται από HSA-miR-107 ήταν όλα του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται (πίνακας 1). Down-ρυθμιζόμενα γονίδια με τον 7α-ας ήταν ασχολείται κυρίως με τον μεταβολισμό rRNA, ριβοσωμάτων βιογένεση, και τη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου. Τέλος, οι κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια με HSA-miR-185 δεν έδειξε εμπλουτισμού για τους όρους που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, αντί των όρων που σχετίζονται με την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση ήταν εμφανή. Επιπλέον, τα 127 και 33 γονίδια συνήθως ρυθμίζεται προς τα κάτω και προς τα πάνω ρυθμισμένη αντίστοιχα από τα δύο δεν έδειξε miRNAs εμπλουτισμούς γονίδιο οντολογία, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα miRNAs επάγουν αναστολή του κυτταρικού κύκλου με διαφορετικές οδούς σηματοδότησης (πίνακες 2, 3, και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

η

Είμαστε σε σύγκριση τις προβλέψεις στόχο miRNA με το λογισμικό TargetScan [18] για αυτά τα miRNAs στα γονίδια κάτω-ρυθμίζονται στην έκφραση μας προφίλ σύνολα δεδομένων. Και για τις δύο διατηρημένες και μη διατηρημένες τοποθεσίες, βρήκαμε το μεσαίο φορές μεταβολής προβλέψει στόχων ήταν σταθερά χαμηλότερη από αυτή όλων των γονιδίων ανιχνεύθηκαν σε συστοιχίες (Εικ. 4). Υπάρχει μια τάση για πιο έντονα προέβλεψε στόχοι να είναι πιο κάτω-ρυθμιζόμενη από τους αδύναμους προβλέψει στόχους. Ομοίως, οι συντηρημένες στόχοι τείνουν να είναι πιο κάτω ρυθμίζεται από όλες τις προβλεπόμενες στόχους (Εικ. 4).

Target σάρωση προβλέψεις εκχυλίζονται για miRNAs 185, 107 και let7a. Διάμεση σήμα έκφρασης εμφανίζεται μόνο για τα γονίδια θεωρούνται ως ανιχνεύεται από το λογισμικό Agilent. Υ-άξονας δείχνει την μέση μεταβολή φορές για σύνολα προβλέψει γονιδίων στόχων microRNA σε διαφορετικά κατώφλια, σε σύγκριση με όλα τα γονίδια στη μικροσυστοιχία (φαίνεται στο μαύρο). Σε όλες τις περιπτώσεις η διάμεση σήμα της προβλεπόμενης στόχων είναι χαμηλότερη από αυτήν που παρατηρείται όταν χρησιμοποιούνται όλοι οι ανιχνευτές. Όταν το πείραμα έχει επεκταθεί έξω για τρεις ημέρες, παρατηρούμε μικρότερη επίδραση, γεγονός που υποδηλώνει άμεσοι στόχοι επηρεάζονται περισσότερο μέσα στην πρώτη ημέρα.

Η

Στη συνέχεια συμφωνημένα αυτά υπολογιστής-προβλεπόμενη στόχους για τα γονίδια κατάντη ρυθμίζεται περισσότερο από 0,75 φορές σε επίπεδο RNA για να περιορίσετε τις πιθανοί στόχοι αυτών των miRNAs. Βρήκαμε πολλά από αυτά πιθανούς στόχους σχολιάστηκαν με τους όρους «κυτταρικού κύκλου» στην Εηίτεζ Gene σχολιασμούς (πίνακας 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα τρία miRNAs μπορούν να ρυθμίζουν άμεσα την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω αυτών των γονιδίων. Είναι ενδιαφέρον ότι, στο χέρι μας, η 7-ας δεν καταστέλλει την έκφραση του CDK6 (NM_001145306) mRNA, το οποίο καταστέλλεται από την υπερέκφραση των αφήστε-7 στην προηγούμενη μελέτη [7]. Ο Πίνακας 3 δείχνει ότι οι διακριτές ομάδες των γνωστών ογκογόνων μειωτικά από αυτά τα miRNAs.

Από τους καταλόγους αυτούς και άλλη λίστα που περιγράφει υποψήφιο miRNA στόχους σχολιασμένη με την άποψη του κυτταρικού κύκλου, ο καρκίνος του πνεύμονα, ογκογονίδιο ή ογκοκατασταλτικό σε Εηίτεζ Gene σχολιασμούς ( συμπληρωματική S2 πίνακα), επιλέξαμε ένα υποσύνολο των μεταγραφών για την επικύρωση από qRT-PCR από τη σύγκριση με τους καταλόγους στόχων που προβλέπονται από TargetScan [18] και PicTar [24] το λογισμικό (Εικ. 5Α). Για miR-107, επιβεβαιώσαμε mRNA κάτω ρύθμιση του

CCNE1

(NM_001238),

CDK6

,

CDCA4

(NM_017955.3),

RAB1B

(NM_030981.2) και

CRKL

(NM_005207.3), και για το miR-185, επιβεβαιώσαμε ρύθμιση προς τα κάτω των

CCNE1

,

CDK6

,

ΑΚΤ1

(NM_001014431.1),

HMGA2

(NM_003483.4) και

CORO2B

(NM_006091.3) (Εικ. 5Β). Σημειώνουμε ότι και οι δύο miR-107 και miR-185 διαμόλυνση προκαλείται ρύθμιση προς τα κάτω της κυκλίνης Ε1 (CCNE1) και εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 6 επίπεδα (CDK6) mRNA αν και το επίπεδο καταστολής της CDK6 με miR-185 είναι μέτρια (Εικ. 5Β). Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης CDK6 επίσης κάτω-ρυθμίζονται από miR-107, ενώ η έκφραση CDK6 ήταν σχετικά αμετάβλητη από το miR-185 (Εικ. 5C). Επειδή το επίπεδο καταστολής της έκφρασης CDK6 mRNA από miR-185 είναι πολύ μικρή, η επακόλουθη μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης CDK6 στο χρονικό σημείο παρατήρησης (24 ώρες μετά την επιμόλυνση) μπορεί να είναι πολύ λίγο να τηρούνται οι συμβατικές immunoblottings.

Α) Εκπρόσωπος ακολουθία νουκλεοτιδίων αγώνες μεταξύ των πιθανών γονιδίων στόχων και miRNAs. Οι αριθμοί σε παρένθεση υποδεικνύει τις θέσεις των νουκλεοτιδίων στόχου από το κωδικόνιο τερματισμού. Μόνο συμφωνημένα νουκλεοτίδια με αλληλουχίες σπόρους miRNA υποδεικνύονται με τις κάθετες γραμμές. Β) Η ποσοτική RT-PCR ανάλυση των πιθανών στόχων του miR-107 (CCNE1, CDK6, CDCA4, RAB1B και CRKL) και miR-185 (CCNE1, CDK6, ΑΚΤ1, HMGA2, CORO2B) φαίνονται. Ο κάθετος άξονας δείχνει τη σχετική αναλογία έκφραση του κάθε γονιδίου κανονικοποιήθηκε με εκείνο του GAPDH. Γ) Western Blot που δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση των CDK6 πρωτεΐνης με miR-107.

Η

Συζήτηση

Εμείς έτυχε να διαπιστώσετε ότι το miR-107 και miR-185 μπορεί να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα και προκάλεσε μια G1 σύλληψη του κυτταρικού κύκλου. Η έκταση της καταστολής της ανάπτυξης από αυτά τα miRNAs είναι παρόμοια με εκείνη από την κατασταλτική του όγκου miRNA, ας-7. γονιδιακής έκφρασης προφίλ ανάλυσης με την επιμόλυνση αυτών των miRNAs έδειξε ότι μόνο το miR-107 παρουσίασαν σημαντική εμπλουτισμό των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου για τους κατάντη δράστες. Από την άλλη πλευρά, miR-185 δεν καταστέλλει σημαντικά ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου καθώς και ας-7, μία γνωστή κυτταρικού κύκλου ρύθμισης miRNA [6]. Το miR-185, ωστόσο, θα μπορούσε να καταστείλει την έκφραση του mRNA της ρύθμισης γονιδίων όπως CDK6 και ΑΚΤ1 κυτταρικού κύκλου.

Το συνήθως ρυθμίζονται σύνολα γονιδίου από όλους τους miRNAs κατασταλτικός τρία ανάπτυξη δεν είναι τόσο πολλές και όχι τόσο έντονα σχετίζονται με η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι τρεις miRNAs ρυθμίζουν διακριτών οδών κυτταρικής σηματοδότησης. Από miRNA έχει ένα ευρύ φάσμα των στόχων σε ένα κύτταρο (δηλαδή λιγότερο ειδικό) και δεδομένου ότι η έκταση της καταστολής της έκφρασης στόχου από miRNA είναι γενικά μέτρια, η λειτουργία του miRNAs θα πρέπει να θεωρείται ως η «λεπτή ρύθμιση» της γονιδιακής έκφρασης σε θηλαστικά κύτταρα [25]. Η συσσώρευση αυτών των μικρών ρυθμιστικές επιδράσεις μπορούν να προκαλέσουν οι σημαντικές βιολογικές αντιδράσεις στα κύτταρα [5] .Από την άλλη πλευρά, μερικά δυναμικό μόρια-στόχους όπως CCNE1 και CDK6 μπορεί να είναι κρίσιμη για την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από αυτούς miRNAs. Για παράδειγμα, αναγωγή του CCNE1 με siRNA προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος [26]. Στην περίπτωση της CDK6, μείωση CDK6 με siRNA προκάλεσε παρατεταμένη φάση S σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα [27]. Σε γενικές γραμμές, η σημασία των miRNA στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου είναι αρκετά λογικό, διότι οι miRNAs υποτίθεται ότι είναι το κλειδί μόρια για την επαγωγή της διαφοροποίησης των κυττάρων, η οποία συνοδεύει με τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου σε πολλές περιπτώσεις.

Όσον αφορά το miR-107 , άλλα στοιχεία υποστηρίζουν ένα ρόλο για αυτό το miRNA στην G1 σύλληψη και την καταστολή της ανάπτυξης. miR-107 μετοχών 7 από τις 8 βάσεις της σειράς σπόρων του με το miR-16 οικογένεια των miRNAs, τα οποία επάγουν G1 σύλληψη με τη στόχευση πολλαπλών κυκλίνες και ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων CDK6 οποία επιβεβαιώθηκε ως στόχο miR-107 [28]. Επιπλέον, μια προηγούμενη μελέτη διαπίστωσε ότι οι συνθετικοί αναστολείς για miR-107 αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Α549, αλλά δεν επηρεάζουν τα κύτταρα HeLa [29] προτείνοντας miR-107 μπορεί πράγματι να διαδραματίσει έναν ιδιαίτερο ρόλο του πνεύμονα σε μείωση του πολλαπλασιασμού. Είναι ενδιαφέρον ότι η miR-107 έδειξε overexpressions σε καρκίνους του παγκρέατος που υποδηλώνει αυτό το miRNA έχει κάποιο θετικό ρόλο σε παγκρεατικά καρκινογένεση [21]. Από την άλλη πλευρά, κατά την προετοιμασία αυτού του χειρογράφου, Lee et al. ανέφεραν ότι η απομεθυλίωση και αποακετυλίωση θεραπείες για την ανθρώπινη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές προκάλεσε την υπερέκφραση του miR-107 και την υπερέκφραση της ανάπτυξης κατέστειλε κυτταρικής miR-107 και την έκφραση του CDK6 στο ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [30]. Η τελευταία αυτή μελέτη είναι συμβατό με τα στοιχεία μας από την άποψη της CDK6 ως υποψήφιος κατάντη στόχου της miR-107. Είναι ενδιαφέρον αν αυτό το miRNA διέθεταν ειδικές κυτταρικές λειτουργίες στα κύτταρα και όχι ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Safdar

et al

. πρότεινε ότι το miR-107 έχει προκληθεί στην άσκηση τετρακέφαλο ποντίκια μύες [31]. Σύμφωνα με την ανασκόπηση από Wilfred et al., Το miR-107 και παραλόγων της, miR-103, μπορεί να λειτουργεί στη ρύθμιση του κυτταρικού μεταβολισμού [32]. Μπορεί να είναι ενδιαφέρουσα δυνατότητα ότι αυτά τα miRNAs ρυθμίζουν τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως μεταβολισμό ή κυτταρικού κύκλου εξέλιξης αντί για τον προσδιορισμό της κυτταρικής διαφοροποίησης.

Ο μηχανισμός διακοπής κύκλου κυττάρου με miR-185 δεν είναι σαφής. Ο αριθμός των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου στα κατάντη καταστολή γονιδίων είναι πολύ χαμηλότερο από το miR-185 από ό, τι με miR-107. Μία ομάδα επιστημόνων πρότεινε ότι αυτό miRNA υπερεκφράζεται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [20]. Στο άλλο χαρτί, Choong ανέφεραν ότι miR-185 έχουν ισχυρή θετική συσχέτιση με την εμφάνιση των επιφανειακών αντιγόνων ερυθροειδών (CD71, CD36, και CD235a) σε ανθρώπινα αιμοκύτταρα ομφαλίου λώρου που διεγείρονται με παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης που επάγεται ερυθροειδών [33]. Σε γενικές γραμμές, η επαγωγή της διαφοροποιήσεως των κυττάρων συνήθως ζευγάρια με την καταστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Λαμβάνοντας υπόψη τις λειτουργίες miRNA σε άλλα μετάζωα, πολλά από τα miRNAs επαγώγιμων με τη διαφοροποίηση των κυττάρων μπορεί να έχει ορισμένες λειτουργίες κατασταλτική κυτταρικού κύκλου. Η miRNA θα πρέπει να έχει άλλες βιολογικές λειτουργίες σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Συνεπώς, είναι ενδιαφέρον να διερευνηθεί κατά πόσο miR-185 έχει οποιαδήποτε διαφοροποίηση λειτουργίες σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Ένα άλλο σημαντικό ζήτημα είναι ότι η miR-185 έδειξε αύξηση κατασταλτική λειτουργίες (σχήματα 2, 3) και μείωση της έκφρασης σε καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα (σχήμα 1), ακόμη και αν η miRNA εντοπίζεται σε μια χρωμοσωμική περιοχή ενισχύθηκε σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου δύο πνεύμονα ([17 ] και συμπληρωματικό πίνακα S1). Αυτά τα αποτελέσματα είναι αντι-διαισθητική. Είναι δυνατόν, ωστόσο, ότι οι καταστολείς όγκου μπορεί να εντοπίζεται σε μία χρωμοσωμική περιοχή που παρουσιάζει ενίσχυση σε κύτταρα όγκου. Ένα παράδειγμα είναι ένας δυνητικός γονίδιο κατασταλτικό του όγκου,

GSDMA

(NM_178171.4) [34], είναι εντοπισμένη σε μία χρωμοσωμική περιοχή ενισχύθηκε σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα [35]. Αυτό το γονίδιο μειωτικά στο ανθρώπινο γαστρικών καρκίνων, ακόμη και αν το γονίδιο έδειξε ενίσχυση σε κύτταρα όγκου [35]. Στην περίπτωση του miR-185, επιγενετική αποσιώπηση του miRNA μπορεί να συμβεί πριν από την ενίσχυση του γονιδίου της περιοχής χρωμοσώματος 22q21.1. Περαιτέρω έρευνα χρειάζεται σαφώς να αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα σε βάθος.

Τέλος, αναφέρουμε ότι ο νέος υποψήφιος miRNAs που μπορεί να ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμές. Είναι ακόμα ένα αναπάντητο ερώτημα ότι αν τυχόν σωματικές γενετικές αλλαγές μπορούν να προκαλέσουν την καταστολή αυτών των miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα ή οποιεσδήποτε άλλες κακοήθεις όγκους. Περαιτέρω χαρακτηρισμός του γονιδιακού τόπων αυτών των miRNAs είναι απαραίτητο να γίνει το θέμα σαφές.

Μέθοδοι

Εξόρυξη miRNA θέση

σχολιασμένη miRNA τόπους εξήχθησαν από τις περιοχές των χρωμοσωμικών κέρδος και η απώλεια που προσδιορίζονται από τον Zhao

et al

. [17] σε ένα μεγάλο πάνελ ανθρώπινων καρκινωμάτων του πνεύμονα, χρησιμοποιώντας συστοιχίες SNP. Οι HG16 συντονίζει μετατράπηκαν σε Hg18 τους χρησιμοποιώντας ισοδύναμα με τη χρήση του εργαλείου UCSC Lift-Over (https://genome.ucsc.edu).

Οι κυτταρικές σειρές

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου πνεύμονα , Η1299 και Α549, αγοράστηκαν από την ATCC. Οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση, 100 μg /ml πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη και 292 μg /ml L-γλουταμίνη (Invitrogen, Carlesbad, CA, USA).

RNA παρασκευάσματα και ποσοτικοποίηση των RNAs χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου

Όλη η σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με σύστημα StepOnePlus πραγματικό χρόνο PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) εις τετραπλούν. Ολικό RNA εξήχθη από Η1299 και Α549 κυττάρων με το

mir

κιτ απομόνωσης Βάνα miRNA (Ambion, Austin, TX, USA). Ολικά RNA ανθρώπινων ιστών αγοράσθηκαν από BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA? Αριθμούς Καταλόγου: R1234152-50, R1235152-50, R1234035-50, R1234068-10, R1234149-50, R1234183-50). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των miRNAs, 100 ng του συνολικού RNA αναλύθηκε με TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) Kit (Applied Biosystems) με RNU44 ως έλεγχος φόρτωσης. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των mRNAs, 500 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το PrimeScript II RT Enzyme (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan) και PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR προμίγμα Εχ Taq (Perfect Real Time: Takara Bio, Inc. ) με GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. Όλες οι αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο έγιναν εις τριπλούν.

miRNA επιμόλυνση

Συνθετικά προ-miRNAs και μη ειδικό αρνητικό μάρτυρα (miRIDIAN microRNA Μιμούνται Αρνητικός μάρτυρας # 1) αγοράστηκαν από Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). Οι προ-miRNAs επιμολύνθηκαν σε τελική συγκέντρωση 10 ηΜ με Lipofectamine2000 (Invitrogen), και το μέσο αλλάχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Η κυτταρική ανάπτυξη μέτρηση

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ χρησιμοποιώντας το κιτ μέτρηση κυττάρων-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από 1 ώρα επώαση με τα μέσα που περιέχουν την ένωση τετραζολίου, η απορρόφηση στα 450 nm ανιχνεύτηκε για 0,1 sec με Arvo MX 1420 (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA).

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου

τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 72 ώρες και σταθεροποιήθηκαν σε 70% παγωμένης αιθανόλης και ακολουθείται από κατεργασία RNAse Α, χρωματίστηκαν με 50 μg /ml του ιωδιούχου προπιδίου για την ανάλυση του περιεχομένου του DNA με κυτταρομετρία ροής ανάλυση σε ένα σύστημα FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin, NJ, USA). Τα δεδομένα συλλέγονται και υφίστανται επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης FlowJo FACS (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Έκφραση προφίλ χρησιμοποιώντας ποικιλία έκφρασης Agilent Gene

Ο ανιχνευτής cRNA δημιουργήθηκε από ολικό RNA (500 ng) με το χαμηλό Input RNA γραμμική ενίσχυση & amp? κιτ επισήμανσης (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Cy3-επισημασμένο cRNA (1.65 μg) κατόπιν κατακερματισμένη και σχετική έκφραση μετρήθηκε με υβριδισμό με 4 × 44K ολόκληρο μικροσειρά ανθρώπινη ολιγο (Agilent). Χαρακτηριστικό Εξαγωγή ver. 9.1 λογισμικό (Agilent) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της εικόνας της μικροσυστοιχίας. Οι αναλύσεις μικροσυστοιχίας διεξήχθησαν εις διπλούν. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αναφέρονται στο χειρόγραφο περιγράφεται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MIAME και τα δεδομένα έχουν κατατεθεί στο CIBEX (Κέντρο για τη γονιδιακή Πληροφορίες Βιολογίας έκφρασης) βάση δεδομένων [36] στο Κέντρο Βιολογίας Πληροφοριών και DNA Τράπεζα Δεδομένων της Ιαπωνίας (ϋϋΒΙ), Εθνική Ινστιτούτο Γενετικής (Mishima, Ιαπωνία). Ο αριθμός ένταξης για το σύνολο δεδομένων είναι CBX79.

μικροσυστοιχιών και Gene οντολογία ανάλυση

δεδομένα μικροσυστοιχιών οπτικοποιήθηκε και κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας Genespring GX 7,3 λογισμικού (Agilent). Τιμές κάτω από 0,01 τέθηκαν σε 0,01. Για κάθε τσιπ κάθε μέτρηση χωρίστηκε από το 50ο εκατοστημόριο όλων των μετρήσεων για αυτό το τσιπ. Στη συνέχεια, για κάθε ιχνηλάτη οι μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν με τις μετρήσεις αρνητικό μάρτυρα. Λόγω του περιορισμού των πόρων, η στατιστική

σ

-τιμή μπορεί να μην ισχύουν τα κριτήρια για την επιλογή του γονιδίου του συνόλου δεδομένων μας. Ως εκ τούτου, για την ανάλυση του γονιδίου οντολογία, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια ορίστηκαν ως ≥1.5 διπλώνουν πάνω ή κάτω σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα επί την αντίστοιχη ημέρα. Γονιδιακή Οντολογία όρος εμπλουτισμό σε πάνω και κάτω ρυθμίζονται σύνολα γονιδίων εκτιμήθηκαν με τη χρήση του διαδικτυακού εργαλείου GOstat [37]. Το διαδικτυακό εργαλείο GOstat παρέχει μια τιμή p για το αν ο κατάλογος γονίδιο που παρέχονται είναι σημαντικά εμπλουτισμένη για τα γονίδια σημειώνονται με ένα συγκεκριμένο γονίδιο Οντολογία. Αυτό υπολογίζεται με βάση το πόσο πολλά γονίδια στο σύνολο γονίδιο σημειώνονται με το δεδομένο οντολογία, και πόσα γονίδια σε ολόκληρο μικροδιάταξη (φόντο) επισημειώνονται με την ίδια οντολογία. Ορίσαμε το φόντο ως το σύνολο των γονιδίων ανιχνευθεί σε τουλάχιστον ένα από τα πειράματα συστοιχίας.

Αντισώματα και ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Αντισώματα προς την α-τουμπουλίνης (Sigma) και CDK6 (Santa Cruz- βιοτεχνολογία, Σάντα-Κρουζ, CA) χρησιμοποιήθηκαν. Καλλιεργημένα κύτταρα (5,0 χ 105 κύτταρα /φρεάτιο) αναπτύχθηκαν σε φρεάτια πλάκας 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με miRNAs. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Immobilon (Millipore, Billerica, ΜΑ) με ηλεκτροκηλίδωση. Ανοσοσυμπλέγματα εντοπίστηκαν από ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Perkin Elmer) και οπτικοποιούνται με LAS 3000 αναλυτή εικόνας (φιλμ Fuji, Tokyo, Japan).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0006677.s001

(0,03 MB XLS)

Πίνακας S2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0006677.s002

(0,27 MB XLS)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Mses. Satomi Fujiwara, Asami Hirakiyama, και Κανά Nakamura για τεχνική βοήθεια τους.