Αφηρημένο

Πρόσφατες εργασίες ανέδειξε νλουταμινάσης (GLS) ως βασικού παράγοντα στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων, παρέχοντας γλουταμί προέρχεται άνθρακα και αζώτου σε μονοπάτια που υποστηρίζουν τον πολλαπλασιασμό. Υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για τη στόχευση GLS για θεραπεία του καρκίνου, αν και το γονίδιο δεν είναι γνωστό να μεταλλαχθεί ή ενισχύεται σε όγκους. Ως αποτέλεσμα, ο προσδιορισμός των tractable δείκτες που προβλέπουν εξάρτηση GLS είναι απαραίτητη για τη μετάφραση του GLS αναστολέων στην κλινική. Εδώ έχουμε την επικύρωση ενός μικρού αναστολέα μόριο του GLS και δείχνουν ότι οι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από χαμηλή Ε-καδερίνης και υψηλή βιμεντίνη έκφρασης, χαρακτηριστικά ενός φαινοτύπου μεσεγχυματικών, είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην αναστολή του ενζύμου. Επιπλέον, ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα επάγονται να υποστούν επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) αποκτούν ευαισθησία προς τον αναστολέα GLS. Μεταβολικές μελέτες δείχνουν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα έχουν μειωμένη ικανότητα για την οξειδωτική φωσφορυλίωση και αυξημένη ευπάθεια σε οξειδωτικό στρες, καθιστώντας τα ανίκανα να αντιμετωπίσουν τις διαταραχές που προκαλούνται από την αναστολή GLS. Τα ευρήματα αυτά διαλεύκανση επιλεκτική μεταβολική εξαρτήσεις των μεσεγχυματικών κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και να προτείνει νέες οδούς ως πιθανοί στόχοι σε αυτόν τον επιθετικό τύπο καρκίνου

Παράθεση:. Ulanet DB, Couto Κ, Jha Α, Choe S, Wang Α, Woo Χονγκ Κονγκ, et al. (2014) Τα μεσεγχυματικά Φαινότυπος προδιαθέτει καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σε διαταραχή της διάδοσης των πυρηνικών όπλων και Redox στρες ως απάντηση σε νλουταμινάσης Αναστολή. PLoS ONE 9 (12): e115144. doi: 10.1371 /journal.pone.0115144

Επιμέλεια: Pier Giorgio Petronini, Πανεπιστήμιο της Πάρμα, Ιταλία

Ελήφθη: 16 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 19 του Νοέμβρη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Ulanet et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Όλες οι εργασίες χρηματοδοτήθηκαν από τον Άγιο Pharmaceuticals. Οι χρηματοδότες, μέσω των υπαλλήλων της, οι οποίοι είναι οι συγγραφείς αυτού του χειρογράφου, είχε έναν ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς είναι όλα υπαλλήλους του Αγίου Pharmaceuticals. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Έχει εκτιμηθεί εδώ και 60 χρόνια ότι η γλουταμίνη (Gln) είναι ένα υπό όρους απαραίτητο αμινοξύ για η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργεια [1]. Γλουταμίνη είναι το πιο άφθονο αμινοξύ που κυκλοφορεί στους ανθρώπους σε συγκέντρωση -500 μΜ στον ορό, και πολλές μελέτες δείχνουν ότι Gln είναι μια σημαντική πηγή άνθρακα και αζώτου για καρκινικά κύτταρα [2], [3]. Ένα ένζυμο ειδικότερα, γλουταμινάσης, εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και φαίνεται να είναι κρίσιμη για την είσοδο της γλουταμίνης άνθρακα στον κύκλο τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) σε πολλές καρκινικά κύτταρα [4], [5]. Γλουταμίνη μετατρέπεται σε γλουταμικό και αμμωνία με γλουταμινάσης, και ο άνθρακας γλουταμικού ακολούθως αδιάκοπης στον κύκλο TCA μέσω μετατροπής σε α-κετογλουταρικό (α-KG) με αρκετές διαφορετικές ενζύμων που περιλαμβάνουν αφυδρογονάση γλουταμικού και διάφορα αμινοτρανσφερασών. Θηλαστικά φέρουν δύο γονίδια που κωδικοποιούν μιτοχονδριακή νλουταμινάσης,

GLS1

(ή KGA) και

GLS2

(ή LGA), τα οποία είχαν αρχικά εντοπιστεί σε φυσιολογικό νεφρό και το ήπαρ, αντίστοιχα [6]. Η

GLS1

γονίδιο παράγει δύο κυρίαρχες παραλλαγές ματίσματος που κωδικοποιούν κανονικά GLS1 (επίσης γνωστή ως KGA) και GAC, ωστόσο οι διαφορικές λειτουργίες αυτών των δύο παραλλαγές που δεν είναι καλά κατανοητοί [7].

Αρκετά κομψό μελέτες κατέδειξαν την συμβολή του άνθρακα που λαμβάνεται από Gln στον κύκλο TCA μέσω glutaminolysis [8], [9].

GLS1

έκφρασης έχει επίσης ταυτοποιηθεί ως στόχος του ογκογονιδίου myc [10] και έχει ενοχοποιηθεί ως τελεστής της Rho μεσολάβηση μετασχηματισμό σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [11]. Παρεμβολή με δραστηριότητα GLS μέσω είτε γενετικές ή φαρμακολογική χειραγώγηση έχει αποδειχθεί από έναν αριθμό ομάδων να επηρεάσει αρνητικά την ανάπτυξη επιλεγμένων καρκινικών κυτταρικών σειρών [11] – [13]. Με βάση το σύνολο των δημοσιευμένων στοιχείων σχετικά με τη σημασία της Gln και νλουταμινάσης στον καρκίνο, GLS έχει επισημανθεί ως πιθανός στόχος φαρμάκου για ογκολογικές ενδείξεις [14]. Για τις γνώσεις μας

GLS1

δεν είναι μεταλλαγμένο ή ενισχύεται σε ανθρώπινους καρκίνους. Προκειμένου να διευκολυνθεί η χρήση των αναστολέων GLS1 στην κλινική απαιτείται καλύτερη κατανόηση των γενετικών και φαινοτυπικά πλαίσια που οδηγούν σε εξάρτηση GLS1.

Σε αυτή τη μελέτη επικυρώνει τη δραστηριότητα των κυττάρων που βασίζονται σε στόχο του α που δημοσιεύθηκε αναστολέα GLS1, BPTES (δις-2- (5-φαινυλακεταμιδο-1,2,4-θειαδιαζολ-2-υλο) σουλφίδιο αιθυλ) [15], που δείχνει ότι δρα μέσω ενός ειδικά GLS1 εξαρτώμενη μηχανισμός για την επαγωγή αντι-πολλαπλασιαστική και μεταβολικές διαταραχές στα κύτταρα. Χρησιμοποιούμε BPTES ως μια επικυρωμένη ένωση εργαλείο για τη διαλογή ενός πίνακα γραμμών καρκίνου του πνεύμονα και την ταυτοποίηση ενός υποσυνόλου των γραμμών που εμφανίζουν εξάρτηση GLS και εκφράζουν δείκτες χαρακτηριστική ενός φαινοτύπου μεσεγχυματικών. ΤΟΡ-β μεσολαβούμενη επαγωγή της ΕΜΤ ευαισθητοποιημένων κυττάρων σε GLS αναστολή και συνδέθηκε με εξασθενημένη μιτοχονδριακή αναπνευστική ικανότητα και αυξημένη ευαισθησία σε οξειδωτικό στρες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν μια επιλεκτική ρόλο για GLS σε μεσεγχυματικά κύτταρα NSCLC, τα οποία χρησιμοποιούν GLS για να παρέχει μια πηγή άνθρακα για την οξειδωτική φωσφορυλίωση και να διατηρήσει την ισορροπία που απαιτείται οξειδοαναγωγής για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Αποτελέσματα

Η γραμμή κυττάρων οθόνη του πίνακα και την επικύρωση της BPTES ως εργαλείο ένωση

Για να αποκτήσουν εικόνα για τους γενετικούς καθοριστικούς παράγοντες /φαινοτυπική εξάρτησης GLS, θα προβληθεί ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών με τη δημοσιευμένη GLS1 αναστολέα BPTES [15]. Εστιάσαμε ειδικά σε ένα τύπο όγκου, καρκίνο του πνεύμονα, λόγω του μεγάλου αριθμού των καθιερωμένων μοντέλων κυτταρικής γραμμής διαθέσιμα. Από τις 62 γραμμές του πνεύμονα που επιλέγονται για ανάλυση χρησιμοποιώντας BPTES, 44 έχουν χαρακτηριστεί ως NSCLC (S1 πίνακα στο S2 αρχείου). Σχετική ρυθμούς ανάπτυξης (mu_

BPTES /mu_

DMSO) υπολογίστηκαν μετά από φαρμακευτική αγωγή, προκειμένου να συγκρίνουν τις καλύτερες σχετική ευαισθησία να BPTES μεταξύ κυτταρικές σειρές που μεταβάλλεται στο χρόνο διπλασιασμού. Περίπου το 30% αυτών των 62 γραμμών παρουσίασαν σημαντική ευαισθησία να BPTES όπως ορίζεται από & gt? 40% μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης (Σχήμα 1Α, S1 πίνακα του S2 αρχείου.). Ο βαθμός ευαισθησίας σε BPTES ήταν ιδιαίτερα πλούσιο, με τον κυτταρικό θάνατο που παρατηρείται σε ορισμένες κυτταρικές σειρές (μ

BPTES /μ

DMSO & lt? 0? Π.χ. Α427) και μια σχεδόν πλήρης έλλειψη ανταπόκρισης σε άλλες (π.χ. NCI- H1563). Από CellTiter-Glo (CTG), το οποίο μετρά τα επίπεδα ΑΤΡ, χρησιμοποιήθηκε ως μία ταχεία, υποκατάστατο μέθοδος για τη διαλογή του αριθμού των κυττάρων μετά την αγωγή BPTES, εμείς επικυρωθεί ότι τα αποτελέσματα της αναστολής γλουταμινάσης σε κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ ήταν εκπρόσωπος ανάγνωσης του αριθμού των κυττάρων. Εκτίμηση του αριθμού κυττάρων με περιεχόμενο DNA (Syto60) έδειξε ένα συγκρίσιμο επίδραση της θεραπείας BPTES στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως υποδεικνύεται από CTG σε 72 ώρες τελικό σημείο (S1 Σχήμα σε S1 File).

(Α) Ευαισθησία ενός πάνελ του NSCLC γραμμές για την αναστολή της ανάπτυξης κατά 10 μΜ BPTES σε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού 72 ώρες. Οι ρυθμοί ανάπτυξης (μι) σχεδιάζονται σε σχέση με τον έλεγχο DMSO για κάθε κυτταρική σειρά (mu /max). (B, C) Α427 πατρικά κύτταρα ή κύτταρα που εκφράζουν σταθερά ένα άδειο φορέα ελέγχου (Con), άγριου τύπου GAC (GAC), ή ένα BPTES ανθεκτικό ένζυμο GAC (GAC-BR) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BPTES (Α ) ή το αδρανές ανάλογο BPTES, AGX-4769 (C), σε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού 72 ώρες. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με μέσο όρο και τυπική απόκλιση υποδεικνύεται. (D, Ε) Μέτρηση της isotopomer τίτλο

13C (5) -Glu (D) ή

13C (4) -Asp (Ε) από κύτταρα σε αγωγή για 4 ώρες με BPTES ή με αδρανές ανάλογο AGX-4769. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος των τριών επαναλήψεων με την τυπική απόκλιση που υποδεικνύεται. Υπολογίζονται τιμές p από Student t-test,

* (3 × 10

-8),

** (10

-9),

# (10

-7 ),

## (2 × 10

-6).

η

για να επιβεβαιωθεί ότι τα αποτελέσματα της BPTES σε κύτταρα είναι on-στόχο, έχουμε τροποποιημένα κύτταρα Α427 να υπερεκφράζουν cDNA κωδικοποιεί μια περιγράφηκε προηγουμένως BPTES ανθεκτικά μεταλλαγμένα GAC, που ονομάζεται GAC-BR (F318A και F322A) και αξιολόγησε την επίδραση της BPTES στην κυτταρική ανάπτυξη αυτών των κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα που υπερεκφράζουν άγριου τύπου GAC (GAC-WT), ή ένα άδειο φορέα. GAC-BR δεν είναι σε θέση να δεσμεύσει BPTES αλλά διατηρεί καταλυτική δράση [16]. Η υπερέκφραση του GAC-BR κατέστησε τα κύτταρα Α427 ανθεκτικά στα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του BPTES (Εικ. 1Β), ενώ κύτταρα που εκφράζουν κενό φορέα ή GAC-WT διατήρησε σημαντική ευαισθησία να BPTES. Η μέτρια αμβλεία επίδραση της BPTES στην ανάπτυξη της GAC-WT σε σύγκριση με τις γονικές ή κενό εκφράζουν τις γραμμές του φορέα είναι πιθανό να οφείλεται στην αύξηση ~2x στην έκφραση GAC σε αυτό το μοντέλο. Χρησιμοποιήσαμε επίσης αυτό το σύστημα για την αντιμετώπιση των συνεπειών της BPTES on-στόχου στην διαμόρφωση de novo σύνθεση γλουταμικού και ασπαρτικού από γλουταμίνη. S2 Σχήμα (σε S1 File) τονίζει τη ροή του άνθρακα από γλουταμίνη σε γλουταμικό και κατάντη TCA ενδιάμεσα όπως έχει περιγραφεί [8], [9]. Η υπερέκφραση της GAC-BR, αλλά όχι GAC-WT, βελτιώνεται η BPTES προκαλείται από μπλοκ σε γλουταμίνη εισρεύσουν γλουταμινικό και ασπαρτικό (Εικ. 1D, E). Η ελλιπής αποκατάσταση της

13C (5) -ασπαρτικού επίπεδα μπορεί να αντανακλά την ιδιαίτερη ευαισθησία αυτού του μεταβολίτη σε αναστολή GLS, ίσως λόγω της συμβολής των δύο άνθρακα και του αζώτου από γλουταμίνη σε ασπαρτικό βιοσύνθεση ή /και εξαιτίας των συνεπειών από την αναστολή της η ενδογενής δραστηριότητα GLS1. Ένα βιοχημικά αδρανές ανάλογο BPTES, AGX-4769, με μια συντηρητική τροποποίηση (S3 Εικόνα σε S1 File), χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία των ίδιων κυτταρικών γραμμών και δεν είχε επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού ή κατάντη μεταβολίτες (Σχ. 1C-Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα αποτελέσματα της BPTES στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κατάντη μεταβολιτών οφείλεται στην αναστολή της GLS1 και δεν οφείλεται σε off-στόχο επιπτώσεις.

Όπως ακόμη μέσο για την επικύρωση της χρησιμότητας των BPTES ως ένωση εργαλείο στην οθόνη για την εξάρτηση από GLS, εκτελέσαμε siRNA μεσολαβεί knockdown του GLS1 (είτε ολική ή GAC ειδικά) σε μια υποομάδα 6 των γραμμών NSCLC από τον πίνακα. Όλα τα 3 γραμμές που ήταν ευαίσθητα στην BPTES επίσης ευαίσθητα και στα GLS KD, ενώ το 3 που δεν ήταν ευαίσθητα σε BPTES ήταν λιγότερο /δεν είναι ευαίσθητοι (S4 Εικόνα στο S1 αρχείου). Ενώ KD της GAC μόνο, οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης στις ευαίσθητες γραμμές BPTES, KD των συνολικών GLS1 οδήγησε σε μια ακόμη πιο βαθιά δυσλειτουργία δείχνουν ότι και οι δύο ισομορφές της GLS1 (KGA και GAC) συμβάλλουν στην ανάπτυξη /βιωσιμότητα αυτών των κυττάρων.

εξάρτηση GLS1 σε NSCLC με μεσεγχυματικά (EMT) φαινότυπο

με βάση το εύρος των BPTES ευαισθησίας που παρατηρείται σε όλες τις κυτταρικές σειρές 62 (Εικ. 1), ψάξαμε για μεταγραφική δείκτες που σχετίζονται με την ευαισθησία ή αντίσταση χρησιμοποιεί διαθέσιμη στο κοινό σύνολο δεδομένων από το Ινστιτούτο Broad (https://array.nci.nih.gov/caarray/project/golub-00327). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης ούτε GLS1 ούτε GLS2 mRNA συσχετίζονται με την ευαισθησία. Οι πρώτοι 200 ​​ανιχνευτές δείχνουν πιο σημαντική συσχέτιση με την ευαισθησία στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση μονοπάτι GeneGO (https://portal.genego.com/cgi/data_manager.cgi). Σημειώσαμε ότι δεν οδοί του μεταβολισμού που σχετίζονται με συνδέθηκαν στενά με BPTES ανταπόκριση, υποδεικνύοντας ότι οποιεσδήποτε εγγενείς διαφορές στο μεταβολισμό μεταξύ ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα δεν είναι σε γενικές γραμμές αντανακλώνται στο μεταγραφικό επίπεδο (Πίνακας S2 σε File_S2). Είναι ενδιαφέρον, 4 από τους 25 οδοί που σχετίζονται με την EMT (τάξεις 1, 15, 23, 25? Εικ. 2Α). μονοπάτια ανοσολογική απάντηση ήταν επίσης εξαιρετικά εκπροσωπούνται σε αυτή την ανάλυση. Ενώ εμείς επιλέξαμε να εστιάσει τις έρευνές μας για τη σχέση μεταξύ EMT και την εξάρτηση GLS1, είναι αξιοσημείωτο ότι η σχέση μεταξύ της NF-κΒ και της δραστηριότητας νλουταμινάσης έχει καταδειχθεί από άλλους [11], [17].

(Α ) ανάλυση GeneGo δείχνει τέσσερις κορυφαίες υπογραφές μεσεγχυματικών συσχετίζεται με την ευαισθησία BPTES. Οι Ρ-τιμές υπολογίζονται μέσα στο λογισμικό GeneGo χρησιμοποιώντας την εκθετική κατανομή. (Β) Αντι-συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του RNA υψηλής E-cadherin χαμηλό βιμεντίνη και την ευαισθησία στην BPTES. (Γ) Mu /mumax τιμές που απεικονίζονται μετά από θεραπεία 72 ώρες του NSCLC γραμμών με 10 μΜ BPTES. Ίσες ποσότητες πρωτείνης του όγκου εκχυλίσματα κυτταρικής γραμμής ηλεκτροφορήθηκαν, με την ομάδα των πιο ευαίσθητων γραμμών στο αριστερό και λιγότερο ευαίσθητη στα δεξιά, και ανοσοστυπώθηκαν για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. Ιστόνης Η3 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός μέσων επιπέδων πρωτεΐνης GAC σε σχέση με την έκφραση της πρωτεΐνης PC (+/- SEM) σε BPTES ευαίσθητα (n = 7), το ενδιάμεσο (n = 7), και αναίσθητη (n = 7) γραμμές.

P

= 0.03 συγκρίνοντας τα επίπεδα της πρωτεΐνης /Υ GAC σε ευαίσθητες σε σχέση προς τις μη ευαίσθητες γραμμές?

P

= 0.06 συγκρίνοντας ευαίσθητες στο ενδιάμεσο ομάδες (αταίριαστα 2-ουρά t-test).

Η

Για να προσδιορίσει συγκεκριμένους δείκτες πρόβλεψης της ευαισθησίας BPTES, θα ερωτάται ο κατάλογος των σημαντικά συσχετισμένων ανιχνευτές από την παραπάνω ανάλυση για τα επιμέρους γονίδια που σχετίζονται EMT. Ε-καδερίνη και βιμεντίνη θετικά και αρνητικά με ανάπτυξη παρουσία του BPTES (δηλαδή έλλειψη ευαισθησίας σε αναστολή GLS), αντίστοιχα (Εικ. 2Β). Low E-cadherin /υψηλή βιμεντίνη είναι καλά καθορισμένες δεικτών των κυττάρων τα οποία έχουν ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά [18]. Μια σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε επίσης για διάφορες άλλες γονιδίων τυπικά διαμορφώνονται κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ, συμπεριλαμβανομένων claudin4 /7 και ZEB1 (Πίνακας S3 σε File_S2). Μετά την αρχική οθόνη BPTES, επανεξετάστηκε ένα υποσύνολο των 21 από τις γραμμές NSCLC για την ευαισθησία BPTES και αναλύθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης των επιλεγμένων δεικτών που προσδιορίζονται από το μεταγραφικό ανάλυσης των χαρακτηριστικών (σχήμα 2C, D?. Πίνακας S4 στο File_S2). Σε 6/7 των κορυφαίων ευαίσθητες σειρές NSCLC, χαμηλής Ε-καδερίνης και τα επίπεδα πρωτεΐνης υψηλής βιμεντίνης ήταν επαναλήψιμα (Σχ. 2C). Η ομάδα των ευαίσθητων γραμμών επίσης σημειώνονται κατά μέσο όρο υψηλότερη αναλογία της GAC /πυροσταφυλική καρβοξυλάση (PC) επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2C, D?.

P

= 0,03). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν συγκρίνοντας ολικά επίπεδα GLS1 /PC. Εμείς επιλέξαμε να εστιάσουμε στα επίπεδα GAC, καθώς αυτό ισομορφή κυριαρχεί στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα. επίπεδα πρωτεΐνης PC μόνος ήταν σημαντικά αυξημένα στην ευαίσθητη σε σύγκριση με ευαίσθητες σειρές (

P

= 0,02) και τα επίπεδα mRNA συσχετίζεται αρνητικά με την ευαισθησία BPTES στο μεγαλύτερο πάνελ σειρών καρκίνου του πνεύμονα 60+ διαλογή (Pearson συντελεστής συσχέτισης: 0,29 ? Pearson

P

τιμή: 0,03). Από πυροσταφυλική καρβοξυλάση μπορεί να υποκαταστήσει νλουταμινάσης στην παροχή άνθρακα στον κύκλο TCA [19], τη σύνδεση των μεταβάλλονται οι αναλογίες GAC /Υ με ευαισθησία στην αναστολή GLS υποδηλώνει την πιθανότητα ότι εναλλακτικούς τρόπους εισόδου του άνθρακα στην TCA μπορεί να επηρεάσει την εξάρτηση GLS.

Είναι ενδιαφέρον ότι, οι τρεις γραμμές NSCLC που ήταν πιο ευαίσθητα σε BPTES (Α427, LXF289, SW1573), όλα φέρουν την ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε β-κατενίνης (Τ41Α στην Α427 και LXF289, S33F στο SW1573, Πίνακας S4 στο File_S2). Σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης είναι ένα από τα πολλά μονοπάτια που έχουν εμπλακεί στην οδήγηση ΕΜΤ [20]. Ως αποτέλεσμα, χρησιμοποιήσαμε siRNA μεσολαβεί knockdown του β-κατενίνης σε κύτταρα Α427 για να καθοριστεί εάν η απώλεια θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια μεταβολή στην ευαισθησία στο BPTES. Εντυπωσιακά, β-κατενίνης knockdown είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη ευαισθησία σε θεραπεία BPTES (Εικ. 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι η μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης β-κατενίνης συνοδεύτηκε από αύξηση των επιπέδων της Ε-καδερίνης (Εικ. 3Β), όπως έχει προηγουμένως περιγραφεί σε καρκινικά κύτταρα κύστης [21]. Σε περίπτωση απουσίας της θεραπείας BPTES, β-κατενίνης KD οδήγησε σε μια μέτρια. (Μείωση 23%?

P

= 0,02) απομείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων (Εικ. 3Α)

(Α) Α427 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με μη-στόχευσης (ΝΤ) ή β-κατενίνης στόχευση siRNAs και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BPTES (αριστερό πάνελ). Οι ρυθμοί ανάπτυξης ήταν κανονικοποιούνται σε DMSO επεξεργασμένα κύτταρα επιμολυσμένα με NT siRNAs. Το δεξί πάνελ απεικονίζει τα αποτελέσματα των siRNAs β-κατενίνης επί της ανάπτυξης DMSO κατεργασμένων κυττάρων. (Β) Ανοσοστύπωμα εκχυλισμάτων πρωτεΐνης Α427 που συλλέχθηκαν από κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. κύτταρα (C) NCI-H358 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 ng /ml ΤΟΡ-β για 4 εβδομάδες. Επαγωγή της EMT επιβεβαιώθηκε από την απώλεια της E-cadherin και το κέρδος της βιμεντίνης. EMT συνοδεύτηκε από αύξηση της GAC σχέση με τα επίπεδα της πρωτεΐνης PC (αποτελέσματα εκπρόσωπος του 2 ανεξάρτητων πειραμάτων). επίπεδα ακτίνης ενδείκνυται για πρωτεΐνη εξομάλυνση. (D) NCI-H358 γονικών και 6wk κύτταρα επεξεργασμένα ΤΟΡ-β υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις τριπλούν με BPTES για 72 ώρες και την ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με CTG. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων και απεικονίζονται ως μέσοι ρυθμοί ανάπτυξης (+/- SD) σε σύγκριση με DMSO επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

TGFβ-Induced EMT στα κύτταρα NCI-H358 NSCLC οδηγεί σε GLS1 εξάρτηση

για να κατανοήσουμε καλύτερα τη συμβολή των μεσεγχυματικών έναντι επιθηλιακών φαινότυπο σε GLS εξάρτηση, θα αντιμετωπίζονται κύτταρα NCI-H358, που είναι φαινοτυπικά επιθηλιακά (υψηλής E-cadherin /χαμηλή βιμεντίνη) και εμφανίζουν μέτρια ευαισθησία σε BPTES (Εικ. 2C), με TGFβ για να προκληθεί EMT. Όπως έχει αναφερθεί [22], ΤΟΡβ μετατόπισε τη γραμμή NCI-Η358 σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά όπως αποδεικνύεται από μειωμένη Ε-καδερίνης και αυξημένα βιμεντίνη (Σχ. 3C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα επίπεδα πρωτεΐνης GAC επηρεάστηκαν επίσης κατά τη διάρκεια αυτής της μετάβασης, με ένα 2-φορές αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης στην παραλλαγή μεσεγχυματικά (Σχ. 3C). Σε αντίθεση, τα επίπεδα PC ήταν ελαφρώς μειωμένη (μείωση 1.4x) κατά EMT, με αποτέλεσμα μια αυξημένη αναλογία GAC /PC (Σχ. 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι, ταυτόχρονα με την αύξηση στην έκφραση GAC, τα επίπεδα του λιγότερο ευδιάκριτα εκφράζεται KGA ισομορφή μειώθηκε (-40%) κατά EMT. Η ρύθμιση και δυναμικό διαφορική λειτουργία των διαφορετικών ισομορφών GLS1 παραμένει ασαφής. Συνεπής με το μοντέλο που μεσεγχυματικά χαρακτήρας προβλέπει εξάρτηση GLS1, οι ΤΟΡβ επεξεργασμένα μεσεγχυματικά κύτταρα NCI-H358 έδειξαν σημαντικά αυξημένη ευαισθησία σε BPTES σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 3D). Η γραμμή ΤΟΡβ ασθενείς είχαν μία 1,5-2 φορές μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με την γονική γραμμή, αν και από τη μεγαλύτερη ομάδα γραμμών διαλογή, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του ρυθμού ανάπτυξης και την ευαισθησία στην BPTES. Τα στοιχεία αυτά, σε συνδυασμό με την έκφραση αναλύσεις του πίνακα κυτταρική γραμμή, υποστηρίζει σθεναρά ότι τα μεσεγχυματικά πνεύμονα καρκινικά κύτταρα με προδιάθεση για εξάρτηση από το GLS1.

Από νλουταμινάσης χρησιμεύει ως βασικός ρυθμιστής της εισόδου γλουταμίνη άνθρακα στην TCA, εμείς ρώτησε αν η αναστολή της GLS1 επηρεάζει διαφορικά οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) στο επιθηλιακό σε σύγκριση με μεσεγχυματικά (NCI-H358_M) γραμμή. Μιτοχονδριακή κατανάλωση οξυγόνου μετρήθηκε σε πραγματικό χρόνο μετά τη θεραπεία BPTES. Κατά την έναρξη, O

2 ρυθμός κατανάλωσης (OCR) δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο γραμμών (S5A Εικόνα στο S1 αρχείου). Μετά από 2 ώρες κατεργασίας με BPTES, OCR ήταν συγκριτικά μειωμένη στις γραμμές επιθηλιακών και μεσεγχυματικών σε σύγκριση με τα DMSO επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4Α?. S5B σχήμα στο S1 αρχείου). Αξίζει να σημειωθεί ότι, με την αύξηση του χρόνου επεξεργασίας μετα-BPTES, το OCR στο γονική γραμμή σιγά-σιγά ανακτηθεί, ενώ OCR συνέχισε να μειώνεται με το χρόνο στα κύτταρα NCI-H358_M (Εικ. 4Α, S5B σχήμα στο S1 αρχείου). Η μείωση του OCR δεν αντικατοπτρίζουν μείωση του αριθμού των κυττάρων σε αυτό το πρώιμο (20 ώρες) χρονικό σημείο (S5c Εικόνα στο S1 αρχείου). Για να επιβεβαιώσετε ότι αυτή η επίδραση της αναστολής GLS δεν ήταν μοναδικό στα κύτταρα NCI-H358 πραγματοποιήσαμε το ίδιο πείραμα σε ένα πρόσθετο ζεύγος των ευαίσθητων (NCI-H1703) και αναίσθητη κύτταρα (NCI-H1563). Αναστολή της O

κατανάλωση 2 ήταν εξαιρετικά εκλεκτικός για τη γραμμή GLS1 εξαρτάται NCI-H1703 (Εικ. 4Β), υποδεικνύοντας ότι η ανεπάρκεια της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης είναι ένα συστατικό των αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις που προκαλούνται από την αναστολή GLS.

(α) NCI-H358 επιθηλιακών και μεσεγχυματικών γραμμές ή (Β) NCI-H1703 (BPTES ευαίσθητη) και ΝΟΙ-H1563 (αναίσθητη BPTES) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 8 μΜ BPTES και ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) παρακολουθήθηκε επί 20 θεραπεία hr. Δεδομένα ομαλοποιηθεί να OCR στο χρόνο μηδέν (100%) και παρουσιάζονται ως μέσες τιμές +/- SEM.

P

= 0.024 συγκρίνοντας τις αλλαγές στην κατανάλωση οξυγόνου με BPTES στον επιθηλιακό vs γραμμή μεσεγχυματικά?

P

= 0,00017 σύγκριση κύτταρα NCI-H1703 και NCI-H1563. (Γ) OCR μετά από αγωγή με τις υποδεικνυόμενες φάρμακα για διαταράξουν μιτοχονδριακή αναπνοή. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε μέτρηση OCR πριν από ολιγομυκίνη θεραπεία. (Δ) Η προσθήκη του πυροσταφυλικού σε μέσα αποκαθιστά την εξασθενημένη αντίδραση FCCP στη γραμμή μεσεγχυματικά. Μέσες τιμές +/- SEM έδειξε. Αποτελέσματα εκπρόσωπος του 2-3 ​​ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Η διαφορική επίδραση της BPTES στη μιτοχονδριακή αναπνοή στο μεσεγχυματικά έναντι επιθηλιακά γραμμή μας οδήγησε στην ερώτηση κατά πόσο αυτές οι γραμμές θα μπορούσαν να διαφέρουν περισσότερο σε μεγάλο βαθμό την ικανότητά τους να ανταποκριθούν προσαρμοστικά σε μεταβολικής /μιτοχονδριακή στρες. Να διερευνήσει ένα τέτοιο ενδεχόμενο, θα πραγματοποιηθεί διαδοχική θεραπεία των κυττάρων με ολιγομυκίνη (αναστολέας συνθάσης ATP), FCCP (αποσυνδέει αναπνοής από τη σύνθεση του ΑΤΡ, επιτρέπει την εκτίμηση της μέγιστης αναπνοής), και ροτενόνη (αναστέλλει την είσοδο των ηλεκτρονίων σε συγκρότημα Ι) [23]. Εντυπωσιακά, τα κύτταρα NCI-H358_M ήταν ελαττωματικά στην αύξηση O

2 κατανάλωση σε απόκριση FCCP, ενδεικτικές μιας κατώτερης αναπνευστικής ικανότητα αυτών των κυττάρων (Σχ 4C?. S5D σχήμα σε S1 File). Πρόσφατα, καταδείχθηκε ότι πυροσταφυλικό απαιτείται για διέγερση της μέγιστης OCR σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [24]. Είναι ενδιαφέρον ότι, επιπλέον συμπλήρωση του μέσου RPMI (που περιέχει 11 mM γλυκόζη και 2 mM γλουταμίνη) με 2 mM πυροσταφυλικό παρουσία μιτοχονδριακών αναστολέων αποκατέστησε την ικανότητα των κυττάρων NCI-H358_M να ανταποκριθεί σε FCCP με αυξημένο OCR (Εικ. 4D) , υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι σε θέση να χρησιμοποιήσουν αποτελεσματικά τα ενδογενή προμήθειες πυροσταφυλικού /άλλες εναλλακτικές πηγές άνθρακα για να τροφοδοτήσουν επαρκώς απόθεμα χωρητικότητας αναπνευστικό τους. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η μετάβαση σε μια κατάσταση μεσεγχυματικά μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη ικανότητα να ανταποκρίνεται προσαρμοστικά σε αναστολή GLS και ενδεχομένως σε άλλες μιτοχονδριακή καταπονήσεις.

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν εναλλακτικών πηγών άνθρακα θα μπορούσε επίσης να σώσει την διαταραγμένη ανάπτυξη των κυττάρων NCI-H358_M μετά τη θεραπεία BPTES. Η προσθήκη είτε πυροσταφυλικού νατρίου ή ένα διαπερατό κύτταρο ανάλογο της α-KG, διμεθυλο-2-οξογλουταρικό (m-αKG), στο μέσο ανάπτυξης είχε ως αποτέλεσμα τη διάσωση του πολλαπλασιασμού να ~85-90% που παρατηρήθηκε σε κύτταρα αγωγή με φορέα, σε σύγκριση να -45% για ηλεκτρικό διμεθυλεστέρα (Εικ. 5). Σε αντίθεση με αKG και πυροσταφυλικό, ηλεκτρικό προς τη γνώση μας, δεν έχει αναφερθεί ότι έχει αντι-οξειδωτικές ιδιότητες. Από γλουταμικού προέρχεται από γλουταμίνη μπορεί να τροφοδοτεί το γλουταθειόνη (GSH) βιοσυνθετική οδό και συμβάλλουν στη διατήρηση της ισορροπίας οξειδοαναγωγής [25] (όπως επίσης και τροφοδοτώντας την TCA μέσω μετατροπής σε α-KG) εξετάσαμε επίσης την επίδραση του ένα διαπερατό κύτταρο παράγωγο του GSH , γλουταθειόνη μειωμένη αιθυλεστέρα (GSH-ΜΕΕ), και το αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) επί BPTES επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. Τόσο GSH-ΜΕΕ και NAC μόνος αποκατάσταση της ανάπτυξης σε ~75-85% εκείνη των κυττάρων που έλαβαν φορέα, ενώ ο συνδυασμός του πυροσταφυλικού και του NAC αποκατασταθεί πολλαπλασιασμό σε περίπου 95% των κυττάρων που ελέγχου (Εικ. 5). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι βλάβες τόσο οξειδοαναγωγικό στρες και του κύκλου TCA anaplerosis συμβάλλουν στις αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της αναστολής GLS σε αυτά τα κύτταρα.

κύτταρα NCI-H358_M υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή 8 μΜ BPTES εις τριπλούν υπό την παρουσία ή απουσία διμεθυλ 2-οξογλουταρικό (μ-α-KG), πυροσταφυλικό νάτριο, ηλεκτρικό διμεθυλεστέρα, γλουταθειόνη μειωμένη αιθυλεστέρα (GSH-ΜΕΕ), ή Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC) για 96 ώρες και την ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε με CTG. Αποτελέσματα εκπρόσωπος του 2 ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι τιμές απεικονίζουν μέσο ποσοστό αύξησης +/- SD σε σχέση προς κύτταρα που κατεργάζονται μόνο με DMSO.

P

τιμές συγκρίνοντας DMSO vs θεραπεία BPTES με τις διάφορες συνθήκες διάσωσης:

P

= 0,0001 (δεν διάσωσης),

P

= 0.04 (m-α-KG),

P

= 0.001 (2 mM πυροσταφυλικού),

P

= 0,0003 (m-ηλεκτρικό),

P

= 0.01 (GSH-ΜΕΕ),

P

= 0,003 (NAC),

P

= 0,06 (πυροσταφυλικό + NAC).

η

για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο μηχανισμός βασίζεται η διαφορετική ευαισθησία των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών NCI- Η358 κύτταρα να GLS αναστολή, πραγματοποιήσαμε μια μεταβολική ανάλυση αυτών των κυττάρων, εξετάζοντας τα πρότυπα της γλουταμίνης και της χρησιμοποίησης της γλυκόζης (GLC) (GLC σχηματικό επισήμανση που απεικονίζεται στο S6 σχήμα (σε S1 File) και τα αποτελέσματα της αναστολής GLS. Επιβεβαιώσαμε καταρχάς ότι BPTES ήταν συγκριτικά αναστολή GLS και στις δύο από τις γραμμές με παρακολούθηση

13C (5) -Gln και

13C (5) τα επίπεδα -Glu με LCMS σε κύτταρα τρέφονται με ομοιόμορφα επισημασμένο

13C-Gln (U-

13C-Gln). Χρησιμοποιώντας

13C (5) -Glu /

13C (5) -Gln επίπεδα σαν ανάγνωση για δραστικότητα GLS, αποδείξαμε αποτελεσματική (97%) αναστολή της δραστικότητας της GLS τόσο επιθηλιακών και μεσεγχυματικών γραμμές (Σχ. 6Α? S7 Εικόνα στο S1 αρχείου). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η συντριπτική πλειοψηφία των μετατροπή Gln σε Glu σε αυτές τις κυτταρικές σειρές καταλύεται από GLS1 και όχι GLS2 ή άλλα ένζυμα που χρησιμοποιούν Gln. Μια πιθανή υπόθεση για να εξηγήσουν τη διαφορά της ευαισθησίας των δύο γραμμών ήταν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν κατά προτίμηση γλουταμίνη για να τροφοδοτήσει την TCA. Παραδόξως, μία τροφοδοσία 4 ώρες των κυττάρων με U-

13C-Gln αποδειχθεί ουσιαστική συμβολή της γλουταμίνης προς κιτρικά πισίνες τόσο στην επιθηλιακά (63%) και τα μεσεγχυματικά (49%) της γραμμής (Σχ. 6Β). Σύμφωνα με την εξέχουσα συμβολή της γλουταμίνης για να κιτρικό πισίνες, 20 ώρες BPTES θεραπεία μείωσε τα συνολικά επίπεδα των μεταβολιτών TCA, περιλαμβανομένων των α-KG και κιτρικό (Fig.6C? S7 σχήμα στο S1 αρχείου). Μικρή ή καθόλου επίδραση του φαρμάκου επί των αριθμών των κυττάρων παρατηρήθηκε σε αυτό το χρονικό διάστημα της θεραπείας BPTES σε αυτά (Σχήμα S5c σε S1 File) και άλλες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (S1 Σχήμα σε S1 File). Παρά το γεγονός ότι η γλουταμίνη συνέβαλαν περισσότερο ευδιάκριτα στην κιτρική πισίνες στην επιθηλιακή γραμμή σε σύγκριση με μεσεγχυματικά (Εικ. 6Β), κιτρικό επίπεδα μειώθηκαν περισσότερο δραματικά και να χαμηλώσει (61%) συνολικά επίπεδα στο BPTES επεξεργασμένα κύτταρα NCI-H358_M. Σε συνδυασμό με την αυξημένη πτώση O

2 κατανάλωση από BPTES στην μεσεγχυματικά σύγκριση με επιθηλιακή γραμμή, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν μία δυνητική βλάβη στην ικανότητα της γραμμής μεσεγχυματικών να προσαρμοστούν σε ένα μπλοκ της ροής Gln στο TCA, ίσως λόγω σε διαφορική ικανότητα να χρησιμοποιούν εναλλακτικές πηγές άνθρακα σε αυτή τη ρύθμιση.

NCI-H358 επιθηλιακά (Ε) και γραμμές μεσεγχυματικά (Μ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 8 μΜ BPTES για 20 ώρες. Τα κύτταρα είτε μη επισημασμένη ή U-

13C-Glc ή U-

ετικέτες 13C-Gin συμπεριλήφθηκαν για τις τελευταίες 4 ώρες της θεραπείας από τα ναρκωτικά και τα επίπεδα της κεντρικής μεταβολιτών του άνθρακα μετρήθηκαν με LCMS. (Α) Αναστολή της δραστηριότητας GLS με BPTES. (Β) Ποσοστό του κιτρικού πισίνα που είναι είτε μη επισημασμένη ή περιέχουν άνθρακα που προέρχεται από U-

13C-Gin (DMSO επεξεργασμένων κυττάρων). (C) μεταβολίτη TCA και μεγέθη πισίνα γλουταθειόνης +/- BPTES. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν εις τριπλούν ή τετραπλούν από 3 ανεξάρτητα πειράματα (για την α-KG και κιτρικό) και απεικονίζονται ως μέσος όρος των επιπέδων +/- SD σε σχέση με το NCI-H358 DMSO επεξεργασμένα κύτταρα? τιμές ομαλοποιήθηκαν για τον αριθμό των κυττάρων?

P

= * 1 × 10

-5? ** 4 × 10

-6? *** 9 × 10

-8 ποσοστά (D) Citrate isotopomer από

13C (6) -Glc σημασμένα κύτταρα αντιμετωπίζονται +/- BPTES. *

P

= 0.001, **

P

= 0.002 συγκρίνοντας% κιτρικό m + 2 σε DMSO ή BPTES αντιμετωπίζονται E vs κύτταρα Μ, αντίστοιχα. (Ε) Μεταβολές σε σχετικές αναλογίες DHAP και 3PG επίπεδα σε κύτταρα EvsM +/- BPTES.

P

τιμές για τη σύγκριση των επιπέδων των μεταβολιτών +/- BPTES: * 0,1, ** 0.57,

# 0.04,

## 0.07. Αποτελέσματα εκπρόσωπος του 2 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, η παρακολούθηση της ροής της γλυκόζης στο TCA χρησιμοποιώντας ένα U-

13C-Glc ζωοτροφών (S7 Εικόνα στο S1 File), αποκάλυψε τη συμβολή της γλυκόζης στο 28% και 37% του συνόλου κιτρικού πισίνα σε επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα, αντίστοιχα? κατά την αγωγή BPTES, αυτή η σχετική συνεισφορά μειώθηκε στο 15% στην επιθηλιακά και 3% στη γραμμή μεσεγχυματικά (Σχήμα 6D?. S7 σχήμα στο S1 File), ενδεικτική μιας επιλεκτικής μπλοκ στη ροή της γλυκόζης στο TCA με τη θεραπεία BPTES στο μεσεγχυματικά γραμμή. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, η εξέταση των γλυκολυτικό ενδιάμεσα μεγέθη πισίνα αποκάλυψε αυξημένη DHAP και μειωμένη 3-PG επίπεδα (Σχήμα 6Ε?. S7 σχήμα στο S1 αρχείου) με τη θεραπεία BPTES στη γραμμή μεσεγχυματικά, υποδεικνύοντας ένα μπλοκ στη ροή σε αυτό το βήμα στην γλυκόλυση.

επίπεδα

Εκτός από τις διαφορές σε μεταβολίτες που εμπλέκονται στην βιοενεργητική /βιοσυνθετικές οδούς, τα κύτταρα NCI-H358_M είχαν χαμηλότερη ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) τόσο στην βασική και BPTES αντιμετωπίζονται ρύθμιση σε σχέση με το επιθηλιακό παραλλαγή (Σχ 6C.? S7 Εικόνα στο S1 αρχείου). Σε 6 επιπλέον γραμμές NSCLC που εξετάστηκαν, υπήρχε μια παρόμοια τάση μεταξύ βαθμού πτώση της GSH πισίνες με ευαισθησία BPTES (S8A Εικόνα στο S1 File), μας οδηγεί να ερευνήσει τις επιπτώσεις της θεραπείας BPTES στα επίπεδα ROS.

Διαμόρφωση του οξειδωτικού στρες με αναστολή GLS σε μεσεγχυματικά κύτταρα NSCLC συσχετίζεται με την ευαισθησία

για να ελεγχθεί αν η ευαισθησία στην αναστολή GLS συσχετίζεται με αυξημένο οξειδωτικό στρες κατά την κατεργασία BPTES, μετρήσαμε τα επίπεδα αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) με τη χρήση CM-H2DCFDA σε η επιθηλιακών και μεσεγχυματικών ζευγάρι NCI-H358, καθώς ένα άλλο ζευγάρι των BPTES ευαίσθητα (NCI-H1703) /ευαίσθητο γραμμές (NCI-H838). Η γραμμή NCI-H838 επιλέχθηκε για εξέταση, δεδομένου ότι, παρόμοια με την γραμμή NCI-H358, παρουσιάζει μικρή ευαισθησία προς BPTES παρά τη σημαντική συνεισφορά της Gln στις πισίνες TCA άνθρακα (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Ενώ η αναστολή GLS οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα ROS σε όλες τις τέσσερις γραμμές που εξετάστηκαν, οι ευαίσθητες σειρές παρουσίασαν μεγαλύτερο μέγεθος αύξησης των ROS από BPTES (7.4 vs 4.4-φορές σε NCI-H358_M σύγκριση με τη μητρική? 15.9-φορές έναντι 4,6 φορές στην NCI -H1703 σύγκριση με τα κύτταρα NCI-H838? Εικ. 7Α). Είναι ενδιαφέρον, έχει δειχθεί ότι το οξειδωτικό στρες μπορεί να βλάψει την ροή υδατανθράκων μέσω γλυκόλυσης μέσω απενεργοποίησης των ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων GAPDH [26]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα προτείνουν ένα μοντέλο στο οποίο αυξημένη παραγωγή ROS μετά την αναστολή GLS στην μεσεγχυματικά κύτταρα ευαισθητοποιεί να GLS αναστολή εν μέρει μέσω αναστολής της ροής γλυκόζης σε TCA, με αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα κιτρικού και OXPHOS (Εικ. 7C).

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με BPTES επί 20 ώρες και τα επίπεδα ROS μετρούμενη με CM-H2DCFDA χρωστική. Αποτελέσματα αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων? δεδομένα παρίστανται γραφικώς σαν επίπεδα ROS σχέση με τη θεραπεία DMSO από κάθε κυτταρική γραμμή (μέση τιμή +/- SD)?

P

= 0.01 συγκρίνοντας την επαγωγή των ROS από BPTES στις 2 ζεύγη ευαίσθητων /αναίσθητη γραμμές. (Β) NCI-H358 επιθηλιακών και μεσεγχυματικών γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή με BSO ή H

20

2 σε μια δοκιμασία CTG 72 ώρες. Αποτελέσματα αντιπροσωπευτικών 2-3 ανεξάρτητων πειραμάτων και σημειώνονται σαν μέσος όρος +/- SD. (C) Μοντέλο για την ευαισθησία των μεσεγχυματικών κυττάρων NSCLC να GLS αναστολή. Αναστολή της μετατροπής Gln → Glu από BPTES μειώνει τη ροή του άνθρακα από Gln στο ΤΚΑ και στις δύο γραμμές.